專利名稱：一種攜帶Neuritin基因的Ⅱ型腺相關(guān)病毒及其在修復(fù)視神經(jīng)損傷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和神經(jīng)損傷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶Neuritin基因的
II型腺相關(guān)病毒及其在修復(fù)視神經(jīng)損傷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
視神經(jīng)損傷是許多眼部疾病和外傷，如青光眼、視神經(jīng)缺血、鈍挫傷、視神經(jīng)管骨折等，導(dǎo)致視功能損害共同的作用環(huán)節(jié)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成患者視神經(jīng)的萎縮和失明。盡管對(duì)視神經(jīng)損傷的治療開展了大量研究工作，但其臨床實(shí)際療效不盡人意，按照目前的醫(yī)療技術(shù)水平難以讓患者恢復(fù)視力。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)的內(nèi)在再生能力低下，是視神經(jīng)損傷后再生失敗導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮和失明的關(guān)鍵因素，如何進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)治療一直是眼科界面臨的難題之一。近期的研究表明，找準(zhǔn)靶點(diǎn)增強(qiáng)受損RGC內(nèi)在再生能力，能促進(jìn)視神經(jīng)長期、活躍的再生并到達(dá)上丘和外側(cè)膝狀體(參見文獻(xiàn)[l]Sun F, Park KK, BelinS，et al.Sustained axon regeneration induced by co-deletion of PTENand S0CS3.Nature.2011;480 (7377):372-5.； [2]Kurimoto T，Yin Yj Omura K，etal.Long-distance axon regeneration in the mature optic nerve:contributions ofoncomodulin，cAMP，and pten gene deletion.J Neurosc1.2010;30(46):15654-63.)，并有一定程度的功能恢復(fù)(參見文獻(xiàn)[3]de Lima S，Koriyama Y，KurimotoT，et al.Ful1-length axon regeneration in the adult mouse optic nerveand partial recovery of simple visual behaviors.Proc Natl Acad SciUSA.2012;109(23):9149-54.)，但應(yīng)用于臨床尚遠(yuǎn)，仍需尋找可應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵性因子。Neuritin 又名可塑性相關(guān)候選基因 15 (candidate plasticity-related gene15，CPG15)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的新成員。Neuritin主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，Neuritin具有獨(dú)特的神經(jīng)營養(yǎng)作用，能維持神經(jīng)元細(xì)胞的存活(參見文獻(xiàn)[4]Putz U, Harwell C andNedivi E.Soluble CPG15 expressed during early development rescues corticalprogenitors from apoptosis.Nat Neurosc1.2005; 8 (3): 322-31.)、促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(參見文獻(xiàn)[5]Cappelletti G，Galbiati M，Ronchi C，et al.Neuritin (cpgl5)enhances the differentiating effect of NGF on neuronal PC12 cells.JNeurosci Res.2007;85(12):2702-13.；[6]Nedivi Ej Wu GY and Cline HT.Promotionof dendritic growth by CPG15，an activity-1nduced signaling molecule.Science.1998; 281 (5384): 1863-6.)和突觸成熟(參見文獻(xiàn)[7]Cantallops IjHaas Kand Cline HT.Postsynaptic CPGI5 promotes synaptic maturation and presynapticaxon arbor elaboration in viv0.Nat Neurosc1.2000; 3 (10): 1004-11.)，調(diào)節(jié)突觸可塑性(參見文獻(xiàn)[8]Wibrand K, Messaoudi Ej Havik B，et al.1dentification of genesco-upregulated w ith Arc during BDNF—induced long-term potentiation in adultrat dentate gyrus in viv0.Eur J Neurosc1.2006; 23 (6): 1501-11.)，并且是神經(jīng)營養(yǎng)因子(參見文獻(xiàn)[9]Naeve GSj Ramakrishnan Mj Kramer Rj et al.Neuritin: a geneinduced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis.ProcNatl Acad Sci USA.1997; 94 (6):2648-53.; [10] Lee KHj Ryu CJ，Hong HJj et al.CDNAmicroarray analysis of nerve growth factor-regulated gene expression profilein rat PC12 cells.Neurochem Res.2005; 30 (4): 533-40.)和神經(jīng)活動(dòng)(參見文獻(xiàn)[11]Nedivi E，F(xiàn)ieldust S，Theill LEj et al.A set of genes expressed in response tolight in the adult cerebral cortex and regulated during development.Proc NatlAcad Sci USA.1996;93 (5):2048-53.； [12]Lee WC and Nedivi E.Extended plasticityof visual cortex in dark-reared animals may result from prolonged expressionof cpgl5_like genes.J Neurosc1.2002;22(5):1807-15.； [13]Harwell Cj BurbachBj Svoboda K，et al.Regulation of cpgl5 expression during single whiskerexperience in the barrel cortex of adult mice.J Neurobiol.2005;65(I):85-96.)發(fā)揮作用的共同下游因子，介導(dǎo)雄激素和電剌激促進(jìn)神經(jīng)再生的必須和關(guān)鍵分子(參見文獻(xiàn)[14]Sharma N, Marzo SJj Jones KJj et al.Electrical stimulation andtestosterone differentially enhance expression of regeneration-associatedgenes.Exp Neurol.2010 ; 223 (I): 183-91.； [15]Marron TUj Guerini V，Rusmini P，etal.Androgen-1nduced neurite outgrowth is mediated by neuritin in motorneurones.J Neurochem.2005; 92 (I): 10-20.)。大鼠缺血性腦損傷(參見文獻(xiàn)[16]HanY，Chen X，Shi F，et al.CPG15，anew factor upregulated after ischemic brain injury,contributes toneuronal network re-establishment after glutamate-1nduced injury.JNeurotrauma.2007;24(4):722-31.; [17]Rickhag M，Teilum M and Wieloch T.Rapid andlong-term induction of effector immediate early genes (BDNF，Neuritin and Arc)in peri—infarct cortex and dentate gyrus after ischemic injury in rat brain.Brain Res.2007; 1151:203-10.)，大鼠腦彌漫性軸索損傷(參見文獻(xiàn)[18]賀亞龍，賀曉生，章翔，等.候選可塑性相關(guān)基因15在大鼠腦彌漫性軸索損傷中的表達(dá).中華神經(jīng)外科雜志.2010; 26 (2): 186- 188.)等腦內(nèi)Neuritin的表達(dá)上調(diào)，提示Neuritin在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)修復(fù)重建過程中起著重要作用。席紹松等在急性脊髓損傷的模型中，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注入重組人Neuritin，能促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷(改良Alien打擊法)后傷區(qū)軸突再生相關(guān)蛋白神經(jīng)絲蛋白200及生長相關(guān)蛋白43 (GAP-43)的表達(dá)，并能促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)(參見文獻(xiàn)[19]席紹松，劉維鋼，張紅，et al.Neuritin蛋白對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)元軸突再生的作用.中國修復(fù)重建外科雜志.2009:23(10):1219-1223.)。這些都提示Neuritin在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟、創(chuàng)傷修復(fù)、病變發(fā)生和治療中起著重要作用，應(yīng)用前景廣泛。2001年，Krishnamoorthy等釆用剛出生I天的大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ψ2 ElA病毒建立的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞系(RGC5)(參見文獻(xiàn)[20] Krishnamoorthy RRj AgarwalP，Prasanna Gj et al.Characterization of a transformed rat retinal ganglion cellline.Brain Res Mol Brain Res.2001; 86 (1-2): 1-12.)，自建立細(xì)胞系以來，由于其生長活力旺盛，易于培養(yǎng)，被人們廣泛應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)也是研究視神經(jīng)損傷及修復(fù)的最佳工具。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道Neuritin基因與修復(fù)視神經(jīng)損傷相關(guān)，也未見有文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體來治療視神經(jīng)損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明的另一目的在于提供該攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體在制備治療修復(fù)視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在Krishnamoorthy等采用剛出生I天的大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ψ2Ε1Α病毒建立的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞系(RGC5)基礎(chǔ)上，首次采用丙烯酰胺損傷RGC5，以模擬體內(nèi)的視神經(jīng)損傷模型。本發(fā)明人在大鼠視神經(jīng)的基因芯片中發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)損傷后7天，視神經(jīng)內(nèi)的Neuritin表達(dá)下調(diào)5倍；對(duì)視神經(jīng)夾傷9秒后分別取不同的時(shí)間點(diǎn)觀察視網(wǎng)膜neuritin的表達(dá)變化，初步觀察到 損傷后短時(shí)間內(nèi)3天和7天表達(dá)下調(diào)明顯，13天表達(dá)上調(diào)，到28天逐漸接近正常水平但仍較正常水平低。視神經(jīng)損傷早期Neuritin的表達(dá)下調(diào)，提示在視神經(jīng)損傷早期給予Neuritin重組蛋白或Neuritin重組病毒治療可能會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活產(chǎn)生保護(hù)作用并有利于視神經(jīng)的再生。本發(fā)明的技術(shù)方案，主要是構(gòu)建Neuritin的II型腺相關(guān)病毒載體，并在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系RGC5的丙烯酰胺損傷模型中，利用Neuritin的II型腺相關(guān)病毒載體感染節(jié)細(xì)胞，體外觀察并探討Neuritin基因治療修復(fù)RGC5的作用及機(jī)制。建立大鼠視神經(jīng)損傷模型，行眶內(nèi)玻璃體注射攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒，在體觀察并探討Neuritin基因修復(fù)視神經(jīng)損傷的作用及機(jī)制。Neuritin基因，以下也稱NRNl基因或Nrnl基因。本發(fā)明的第一方面，是提供一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體，該腺相關(guān)病毒載體是攜帶如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。所述的II型腺相關(guān)病毒載體選用AAV三質(zhì)粒系統(tǒng)，由AAV載體pAOV-CAG-eGFP、包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper組成。目的基因NRNl由CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)，具有神經(jīng)特異性的表達(dá)性質(zhì)。NRNl基因插入時(shí)可選擇在eGFP N端或C端或3XFlag C端插入，也可選擇將eGFP替換，或eGFP-3XFlag同時(shí)替換。當(dāng)?shù)鞍撞迦朐趀GFP N端時(shí)，eGFP和NRNl基因之間有GTGGGGSG的柔性短肽相互連接。本發(fā)明的第二方面，提供了一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下:1.Neuritin基因II型腺相關(guān)病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)Neuritin (NRNl)基因(GenBank:BC002683.2)設(shè)計(jì)并合成如下 PCR 引物:NRNl-正向引物:5’ -CGACGCGTATGGGACTTAAGTTGAAC-3’(SEQ ID NO:2);NRNl-反向引物:5’ -TTTGCGGCCGCTCAGAAGGAAAGCCA-3’(SEQ ID NO:3);使用PCR方法從含有NRNl基因cDNA (1551 bp,如SEQ ID NO:1所示)克隆模板中擴(kuò)增NRNl基因CDS區(qū)；將II型腺相關(guān)病毒載體和目的基因分別雙酶切，純化酶切產(chǎn)物后與NRNl基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行定向連接或重組，通過連接反應(yīng)將上述酶切片段準(zhǔn)確連接到pAOV表達(dá)載體的Kpn I / Sal I位點(diǎn)上，獲得pAOV-Neuritin表達(dá)載體，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，對(duì)生長出的克隆進(jìn)行Nrnl基因PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的克隆，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對(duì)PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和分析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，鈣轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，36-48小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白eGFP。2.Neuritin基因腺相關(guān)病毒包裝制備包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper，與Neuritin基因II型腺相關(guān)病毒表達(dá)載體pAOV-Neuritin-eGFP共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8小時(shí)更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集富含II型腺相關(guān)病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的II型腺相關(guān)病毒濃縮液，感染Hela細(xì)胞后米用倍比稀釋法檢測病毒滴度。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)II型腺相關(guān)病毒滴度的要求不同，生產(chǎn)過程中可過濃縮得到不同滴度的II型腺相關(guān)病毒顆粒。本發(fā)明的第三方面，是提供上述的攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體在制備治療修復(fù)視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。用本發(fā)明構(gòu)建的攜帶Neuritin基因II型腺相關(guān)病毒治療損傷的RGC5:首先采用Neuritin基因II型腺相關(guān)病毒感染RGC5細(xì)胞系，再應(yīng)用丙烯酰胺致RGC5損傷，觀察Neuritin基因過表達(dá)后對(duì)損傷后RGC5的作用及機(jī)制。采用Neuritin蛋白對(duì)損傷后RGC5的存活具有保護(hù)作用，通過抑制Caspase 3的活性減少細(xì)胞的早期及晚期凋亡。
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攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體在制備治療修復(fù)視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用，Neuritin II型腺相關(guān)病毒可轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞，臨床上，具體可采用玻璃體注射該藥物轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以進(jìn)行視神經(jīng)損傷的基因治療。腺相關(guān)病毒載體AAV是一種無包膜的單鏈線狀缺損型DNA病毒，AAV被公認(rèn)為是最安全的病毒載體，AAV的DNA能以dsDNA的形式整合入宿主的染色體中，保持一種穩(wěn)定的潛伏狀態(tài)、宿主范圍廣，穩(wěn)定性好。本發(fā)明人前期以慢病毒為載體，構(gòu)建了 Neuritin慢病毒，發(fā)現(xiàn)其對(duì)節(jié)細(xì)胞的感染率較低，主要是感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，可能主要是通過Neuritin的旁分泌實(shí)現(xiàn)其對(duì)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。而II型腺相關(guān)病毒在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞中的感染率可高達(dá)90%，通過構(gòu)建攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體，可以更好地發(fā)揮Neuritin對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。本發(fā)明基于Neuritin獨(dú)特的神經(jīng)營養(yǎng)作用及其在神經(jīng)創(chuàng)傷、疾病中的表達(dá)變化和作用，以Neuritin為靶標(biāo)對(duì)RGC5損傷進(jìn)行基因治療，以增強(qiáng)RGC的內(nèi)在再生能力，改善其存活及再生情況。并推測其對(duì)RGC5的存活和再生這一視神經(jīng)損傷和疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有明顯的作用，從而達(dá)到甚至超過給予多種NTF、或多種治療方法保護(hù)視網(wǎng)膜RGC和促進(jìn)視神經(jīng)再生的療效，為臨床治療視神經(jīng)損傷提供有力的手段和理論依據(jù)。視神經(jīng)由于其特殊的結(jié)構(gòu)和生理特性，實(shí)際上是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一部分。故研究視神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生，也對(duì)CNS疾病和損傷的治療有著重要意義。


圖1是星狀孢子堿(Staurosporine)誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系，其中A為未誘導(dǎo)的RGC5 ；B為星狀孢子堿(Staurosporine)誘導(dǎo)分化后的RGC5(采用星狀孢子堿(StauiOsporine)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，使其為成熟的神經(jīng)元樣細(xì)胞。)標(biāo)尺=50 μ m。圖2是不同濃度的丙烯酰胺損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系其中A為相差顯微鏡下的照片，顯示不同濃度丙烯酰胺對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞系(RGC5)損傷24h的作用；B為不同濃度丙烯酰胺對(duì)RGC5損傷后最長突起的的變化，0.2mM對(duì)RGC5最長突起已有明顯損傷作用；(:為不同濃度丙烯酰胺對(duì)RGC5的存活的影響，0.2mM損傷后RGC5存活影響不顯著。因此，本發(fā)明擬選用0.2mM的丙烯酰胺以模擬體內(nèi)的視神經(jīng)損傷模型，該濃度對(duì)突起有明顯的損傷作用，而對(duì)節(jié)細(xì)胞存活影響較小。標(biāo)尺=20 μ m。圖3是CCK8法測重組人Neuritin對(duì)損傷后RGC5的存活的保護(hù)作用。圖4是流式細(xì)胞術(shù)測凋亡其中A為正常組；B為單純損傷組；C為Neuritin治療組；D為CNTF陽性對(duì)照組。早期凋亡和晚期凋亡均顯示Neuritin治療組可減少損傷后RGC5的凋亡，保護(hù)作用最明顯，優(yōu)于CNTF陽性對(duì)照組。圖5是II型腺相關(guān)病毒AAV2_eGFP轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞其中A顯示AAV2_eGFP成功轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；B顯示AAV2_eGFP標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突；標(biāo)尺=50 μ m。圖6是Neuritin II型腺相關(guān)病毒表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建圖。圖7是II型腺相關(guān)病毒eGFP質(zhì)粒和Neuritin II型腺相關(guān)病毒表達(dá)質(zhì)粒載體的線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1:1.Neuritin基因II型腺相關(guān)病毒表達(dá)載體構(gòu)建(I) II型腺相關(guān)病毒表達(dá)載體及目的基因的酶切采用pAOV-CAG-eGFP載體(購自Addgene公司)，使用Not 1、Mlu I進(jìn)行酶切，酶切后的載體準(zhǔn)備載體構(gòu)建時(shí)使用。以NRNl基因CDS區(qū)的cDNA克隆為模板采用PCR擴(kuò)增NRNl基因片段，產(chǎn)物使用Not 1、Mlu I進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收載體及目的基因DNA。(2)連接反應(yīng)將酶切后的II型腺相關(guān)病毒載體和NRNl基因的PCR產(chǎn)物按照表I中的反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)。 表1:連接反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，該II型腺相關(guān)病毒載體是攜帶如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，所述的II型腺相關(guān)病毒載體選用AAV三質(zhì)粒系統(tǒng)，由AAV載體pAOV-CAG-eGFP、包裝質(zhì)粒PAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper組成；目的基因NRNl由CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)；NRN1基因插入時(shí)選擇在eGFP N端或C端或3XFlag C端插入，或者選擇將eGFP替換，或者eGFP_3XFlag同時(shí)替換；當(dāng)?shù)鞍撞迦朐趀GFP N端時(shí)，eGFP和NRNl基因之間有GTGGGGSG的柔性短肽相互連接。
3.—種如權(quán)利要求2所述的攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下: A)Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)并合成PCR引物如下: NRNl-正向引物如SEQ ID N0:2所示; NRNl-反向引物中SEQ ID NO:3所示; 使用PCR方法從含有如SEQ ID NO:1所示的NRNl基因cDNA克隆模板中擴(kuò)增NRNl基因CDS區(qū)；將II型腺相關(guān)病毒載體和目的基因分別雙酶切，純化酶切產(chǎn)物后與NRNl基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行定向連接或重組，通過連接反應(yīng)將上述酶切片段準(zhǔn)確連接到PAOV表達(dá)載體的KpnI/ Sal I位點(diǎn)上，獲得pAOV-Neuritin表達(dá)載體，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，對(duì)生長出的克隆進(jìn)行Nrnl基因PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的克隆，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體；再對(duì)PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和分析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體；將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，鈣轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，36-48小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白eGFP ； B)Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒包裝 制備包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper，與Neuritin基因II型腺相關(guān)病毒表達(dá)載體pAOV-Neuritin-eGFP共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8小時(shí)更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集富含II型腺相關(guān)病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的II型腺相關(guān)病毒濃縮液，感染Hela細(xì)胞后采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。
4.一種如權(quán)利要求1或2所述的 攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒載體在制備治療修復(fù)視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和神經(jīng)損傷技術(shù)領(lǐng)域，視神經(jīng)損傷是許多眼部疾病和外傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成患者視神經(jīng)的萎縮和失明，目前臨床實(shí)際療效不盡人意。本發(fā)明提供了一種攜帶Neuritin基因的Ⅱ型腺相關(guān)病毒及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還進(jìn)一步地提供了攜帶Neuritin基因的Ⅱ型腺相關(guān)病毒在制備治療修復(fù)視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103224956SQ201310182950
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者許家軍, 曹文珞, 劉芳, 藺海燕 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)