基于氧化石墨烯材料的造影劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于氧化石墨烯材料的造影劑及其制備方法，具體地，本發(fā)明提供了一種造影劑，所述的造影劑具有式I結(jié)構(gòu)。式中，A為氧化石墨烯，R為釓金屬絡(luò)合物，B為橋聯(lián)分子，且A、B、R之間通過化學(xué)鍵互相結(jié)合。本發(fā)明的造影劑具有弛豫率高，穩(wěn)定性好，非特異性等特征。A-(B-R)n
(I)。
【專利說明】基于氧化石墨烯材料的造影劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用納米材料領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種具有優(yōu)越磁共振造影性 能的功能化氧化石墨烯材料，及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 石墨烯由碳原子以Sp2雜化連接的單原子層構(gòu)成，其基本結(jié)構(gòu)單元為有機(jī)材料中 最穩(wěn)定的苯六元環(huán)。近兩年來石墨烯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速。特別是石墨烯最重 要的衍生物之一，氧化石墨烯，由于其良好的生物相容性，超高的比表面積，能夠化學(xué)功能 化修飾，在生物醫(yī)學(xué)上可廣泛應(yīng)用于靶向藥物輸運(yùn)、細(xì)胞成像、生物檢測、腫瘤治療等方面 (Liu, Z. ; Robinson, J. T. ; Sun, X. ; Dai, H. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 10876. Zhang, L. ; Xia, J. ;Zhao, Q. ;Liu, L. ; Zhang, Z. Small. 2010, 6, 537. Gongalves, G. ;Vila, M. ;Portoles, M. T .;Vallet-Regi, M. ;Gracio, J. ;Marques, P. A. Adv. Healthcare Mater. 2013,2, 1072. ) 〇
[0003] 磁共振成像是利用磁共振現(xiàn)象，借助計算機(jī)技術(shù)和二維圖像重建方法進(jìn)行成像， 是一種無創(chuàng)的影像手段。其具有無電離輻射、可實現(xiàn)多核、多參數(shù)成像等優(yōu)點(diǎn)。醫(yī)學(xué)臨床上 需要得到精確的診斷學(xué)圖像和數(shù)據(jù)，但人體的某些病變組織有時與正常組織之間的信號差 異不大，故需要使用造影劑幫助得到對比度清晰的磁共振圖像。有報告顯示至2009年全球 各類造影劑銷售額已超過180億美元，且以每年6-8%的速度在全球范圍內(nèi)增長。根據(jù)有關(guān) 數(shù)據(jù)顯示，在中國國內(nèi)醫(yī)藥市場上，各種造影劑每年以25-30%的速率遞增。
[0004] 目前市場上的造影劑主要是DTPA-Gd，但其存在著弛豫率偏低，在體內(nèi)代謝快，存 留時間短，穩(wěn)定性差等問題。因此，本領(lǐng)域尚缺乏一種弛豫率高，體內(nèi)代謝慢，存留時間長， 穩(wěn)定性好的造影劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種弛豫率高，穩(wěn)定性好的造影劑及其制備方法。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種造影劑，所述的造影劑具有式I結(jié)構(gòu)：
[0007] A-(B-R)n (I)
[0008] 式中，A為氧化石墨烯，或被功能化基團(tuán)修飾的氧化石墨烯；
[0009] R為釓金屬絡(luò)合物，所述釓金屬絡(luò)合物由絡(luò)合分子Ra與釓金屬絡(luò)合形成；
[0010] B為橋聯(lián)分子，所述的橋聯(lián)分子通過化學(xué)鍵與所述的氧化石墨烯表面相連，并通過 化學(xué)鍵與所述的釓金屬絡(luò)合物相連；
[0011] 〃-〃表示化學(xué)鍵；
[0012] η 大于 1。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的功能化基團(tuán)選自下組：羧基、磺酸基、羥基、葉酸等基團(tuán)或 分子，或其組合。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的釓金屬絡(luò)合物包括絡(luò)合分子和與所述的絡(luò)合分子絡(luò)合的 釓離子。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的氧化石墨烯包括經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的氧化石墨烯。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的經(jīng)修飾的氧化石墨烯可以是表面修飾有靶向基團(tuán)或靶向 分子的氧化石墨烯。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的靶向分子包括蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物選自下組：葉酸、乳糖酸，或其組合。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的靶向分子包括抗體、配體、葉酸。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的橋聯(lián)分子選自下組：雙官能團(tuán)分子、多官能團(tuán)分子，或其 組合。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的雙/多官能團(tuán)分子選自下組：官能團(tuán)化的聚乙二醇、官 能團(tuán)化的聚乙烯亞胺、官能團(tuán)化的樹狀大分子、透明質(zhì)酸、殼聚糖、葡聚糖、聚乳酸-羥基乙 酸，或其組合；和/或
[0022] 所述的絡(luò)合分子選自下組：二乙三胺五乙酸（DTPA)或其衍生物，1，4, 7，10_四氮 雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（DOTA)或其衍生物，或其組合。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的官能團(tuán)選自下組：輕基、氣基、竣基、醒基、疏基、置氣基、 異氰酸基、硅烷基、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺碳酸酯、琥珀酰亞胺乙酸酯、琥珀酰亞胺丙酸 酯、琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺戊酸酯，或其組合。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述酯為與取代或未取代的C1-C20烷基或C3-C20的環(huán)烷基所 形成的酯。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的橋聯(lián)分子是生物相容性分子。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的橋聯(lián)分子上還修飾有能夠特異性地與細(xì)胞相互作用的基 團(tuán)。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的二乙三胺五乙酸衍生物或1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二 烷-1，4, 7, 10-四乙酸衍生物選自下組：二乙三胺五乙酸-雙二甲酰胺（DTPA-BDMA)、二乙 三胺五乙酸-雙（異煙肼）（DTPA-BIN)、二乙三胺五乙酸-雙甲酰胺（DTPA-BMA)、1，4,7， 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7-三乙酸（D03A)、10-(2-羥丙基）-1，4,7, 10-四氮雜環(huán)十二 烷-1，4,7-三乙酸（HPD03A)、2-甲基_1，4,7, 10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4,7, 10-四乙酸 (MCTA)、（a，a，，α 〃，α 〃，）-四甲基-1，4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10_四乙 酸（DOTM)等，或其組合。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，在所述的造影劑中，所述的橋聯(lián)分子與石墨烯的質(zhì)量比為1 : 0· 2 ?5〇
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑是可用于細(xì)胞成像的造影劑。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑是非靶向性造影劑。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑具有以下性能：
[0032] 在11. 7Τ磁場強(qiáng)度下，弛豫率Γι測定為SmT1S4彡弛豫率Γι彡ZOmT 1S4 ;較佳地 為Smrt1彡弛豫率A彡UmT1S^1 ;和/或
[0033] 在生理性溶液中無聚沉現(xiàn)象出現(xiàn)。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的生理性溶液選自下組：胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，或其 組合。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的"無聚沉現(xiàn)象"指，將本發(fā)明造影劑與生理性溶液混合后 形成濃度為0. 25mM的溶液，在室溫下放置48小時后，發(fā)生聚沉的造影劑比例< 2wt% (較 佳地< lwt% )，按造影劑的總重量計。
[0036] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的造影劑的制備方法，所 述的方法包括以下步驟：
[0037] (i)提供一表面連接有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯A-(B)m，其中所述橋聯(lián)分子B通過 化學(xué)鍵連于氧化石墨烯A的表面；
[0038] (ii)用絡(luò)合分子Ra與所述的表面連接有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯A-(B)m進(jìn)行反 應(yīng)，形成表面連接有絡(luò)合分子的、式Ia所示的氧化石墨烯；
[0039] A-(B-Ra)n (Ia)
[0040] (iii)將式Ia所示的表面連接有絡(luò)合分子的氧化石墨烯與釓鹽和/或釓鹽溶液進(jìn) 行絡(luò)合反應(yīng)，得到如本發(fā)明第一方面所述的式I所示的造影劑；
[0041] 其中，A、B、R、n的定義如上文所述；
[0042] Ra為絡(luò)合分子，m大于1。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，η彡m。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，對所述步驟（ii)和（iii)還包括透析步驟。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的透析步驟用于去除未反應(yīng)的釓離子、釓金屬絡(luò)合物、橋聯(lián) 分子等反應(yīng)物。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯通過包括以下步驟的 方法制備：
[0047] (a)提供一氧化石墨烯；
[0048] (b)將橋聯(lián)分子與所述的氧化石墨烯反應(yīng)，得到表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石墨 烯。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括以下特征：
[0050] 所述的釓鹽為水溶性釓鹽，較佳地選自下組：氯化釓、硝酸釓，或其組合；
[0051] 所述的橋聯(lián)分子選自下組：官能團(tuán)化的聚乙二醇、官能團(tuán)化的聚乙烯亞胺、官能團(tuán) 化的樹狀大分子、透明質(zhì)酸、殼聚糖、葡聚糖、聚乳酸-羥基乙酸，或其組合。
[0052] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種造影劑組合物，所述的造影劑包括稀釋劑以及如 本發(fā)明第一方面所述的造影劑。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑是磁共振成像造影劑。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑組合物為溶液形式。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還包括選自下組的藥物組分：治療性藥物、示蹤性 分子，或其組合；和/或
[0056] 所述組合物還包括選自下組的組分：釓離子、錳離子、釓納米粒子、錳納米粒子、小 尺寸四氧化三鐵納米粒子，或其組合。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述的治療性藥物選自下組：阿霉素、喜樹堿、易瑞沙、血根堿 等，或其組合。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述的示蹤性分子選自下組：異硫氰酸熒光素、羅丹明、Cy系列 染料、AlexaFluor系列染料、阿霉素，或其組合。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的小尺寸四氧化三鐵納米粒子的粒徑d為1彡d彡5nm。
[0060] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種造影方法，所述方法包括步驟：
[0061] 將本發(fā)明第一方面或本發(fā)明第三方面所述的造影劑組合物施用于待造影的對象 或樣品，并進(jìn)行造影。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影方法是非診斷和非治療性的。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣品是細(xì)胞樣品。
[0064] 在另一優(yōu)選例中，所述造影條件為在0. 5-20T磁場強(qiáng)度下測定，優(yōu)選在0. 5-3T磁 場強(qiáng)度下測定。
[0065] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括：
[0066] (i)如本發(fā)明第一方面所述的造影劑，所述造影劑作為藥物載體；
[0067] (ii)負(fù)載于所述造影劑上的藥物活性成分；和（iii)藥學(xué)上可接受的其他載體。 [0068] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑為靶向性藥物運(yùn)載體。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物通過吸附方式與所述的造影劑結(jié)合。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物活性成分選自下組：治療性藥物、示蹤性分子，或其 組合。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述的治療性藥物選自下組：阿霉素、喜樹堿、易瑞沙、血根堿， 或其組合。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述的示蹤性分子選自下組：異硫氰酸熒光素、羅丹明、Cy系列 染料、AlexaFluor系列染料、阿霉素，或其組合。
[0073] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種造影劑中間體，所述的造影劑中間體具有式Ia結(jié) 構(gòu)：
[0074] A-(B-Ra)n (Ia)
[0075] 式中，A為氧化石墨烯，或被功能化基團(tuán)修飾的氧化石墨烯；
[0076] Ra為絡(luò)合分子，所述絡(luò)合分子可與釓金屬形成絡(luò)合物；
[0077] B為橋聯(lián)分子，所述的橋聯(lián)分子通過化學(xué)鍵與所述的石墨烯表面相連，并通過化學(xué) 鍵與所述的絡(luò)合分子相連；
[0078] 〃-〃表示化學(xué)鍵；
[0079] η 大于 1。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述的功能化修飾的氧化石墨烯選自下組：羧基修飾的氧化石 墨烯、磺酸基修飾的氧化石墨烯、葉酸修飾的氧化石墨烯，或其組合。
[0081] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種本發(fā)明第六方面所述的造影劑中間體用于制備如 本發(fā)明第一方面所述的造影劑的用途。
[0082] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0083] 圖1是本發(fā)明的基于氧化石墨烯的造影劑的制備示意圖；
[0084] 圖2是本發(fā)明的磁共振成像造影劑增強(qiáng)成像效果圖；
[0085] 圖3是本發(fā)明的磁共振成像造影劑用于細(xì)胞成像效果圖；
[0086] 圖4a是本發(fā)明的磁共振成像造影劑用于負(fù)載藥物的紫外-可見光譜圖；
[0087] 圖4b是本發(fā)明的磁共振成像造影劑負(fù)載藥物后作用于癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率圖。

【具體實施方式】
[0088] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，通過在氧化石墨烯上共價修飾二 乙三胺五乙酸-釓，可以制備得到非特異性的磁共振成像造影劑。所述的磁共振成像造影 劑成像效果好，適用范圍廣，穩(wěn)定性好?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0089] 術(shù)語
[0090] 如本文所用，術(shù)語"雙官能團(tuán)分子"指分子內(nèi)具有兩個功能性基團(tuán)的分子，所述的 功能性基團(tuán)是可以共價連接氧化石墨烯或二乙三胺五乙酸的基團(tuán)。所述的兩個功能性基團(tuán) 可相同或不同。
[0091] 術(shù)語"取代"是指基團(tuán)上的氫原子被一個或多個選自下組的取代基取代：鹵素、苯 基、Cl?C4烷基；其中所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3個選自羥基、Cl?C3烷 基、齒素的取代基的取代苯基。
[0092] 術(shù)語"C1-C20烷基"指具有1-20個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙 基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、或類似基團(tuán)。
[0093] 術(shù)語"C3-C20環(huán)烷基"指具有3-20個碳原子的環(huán)烷基，例如環(huán)丙烷基、甲基環(huán)丙烷 基、或類似基團(tuán)。
[0094] 釓金屬絡(luò)合物
[0095] 如本文所用，術(shù)語"釓金屬絡(luò)合物"指絡(luò)合分子以及與所述的絡(luò)合分子絡(luò)合的釓離 子，較佳地，所述的絡(luò)合是螯合形式。
[0096] 所述的釓金屬絡(luò)合物可以單獨(dú)作為造影劑使用，在本發(fā)明中，所述的釓金屬絡(luò)合 物通過化學(xué)鍵連接方式與氧化石墨烯表面修飾的橋聯(lián)分子連接。其中，所述的化學(xué)鍵連接 方式包括共價鍵，配位鍵等。
[0097] 特別地，所述的釓金屬絡(luò)合物通過非物理吸附方式與橋聯(lián)分子修飾的氧化石墨烯 連接。
[0098] 橋聯(lián)分子
[0099] 如本文所用，術(shù)語"橋聯(lián)分子"指用于連接石墨烯表面與釓金屬絡(luò)合物的分子，所 述的橋聯(lián)分子通過化學(xué)鍵與所述的石墨烯表面相連。
[0100] 特別地，所述的橋聯(lián)分子通過共價結(jié)合、配位鍵結(jié)合等化學(xué)鍵連接方式與釓金屬 絡(luò)合物相連。
[0101] 所述的橋聯(lián)分子一般為具有兩個或兩個以上功能性基團(tuán)的分子，如雙端具有官能 團(tuán)的聚乙二醇分子等。
[0102] 在另一優(yōu)選例中，所述的橋聯(lián)分子是生物相容性分子。
[0103] 在另一優(yōu)選例中，所述的橋聯(lián)分子上還修飾有能夠特異性地與細(xì)胞相互作用的基 團(tuán)。如氨基酸、肽、抗體、核酸、單糖、多糖、維生素。
[0104] 磁共振成像造影劑
[0105] 本發(fā)明提供了一種造影劑，所述的造影劑具有以下結(jié)構(gòu)：
[0106] A-(B-R)n (I)
[0107] 式中，A為氧化石墨烯，或被功能化基團(tuán)修飾的氧化石墨烯；
[0108] R為釓金屬絡(luò)合物，所述釓金屬絡(luò)合物由絡(luò)合分子Ra與釓金屬絡(luò)合形成；
[0109] B為橋聯(lián)分子，所述的橋聯(lián)分子通過化學(xué)鍵與所述的氧化石墨烯表面相連，并通過 化學(xué)鍵與所述的釓金屬絡(luò)合物相連；
[0110] 〃-〃表示化學(xué)鍵；
[0111] η 大于 1。
[0112] 在另一優(yōu)選例中，在所述的造影劑中，所述的R可以直接與石墨烯表面相連，也可 以通過所述的橋聯(lián)分子B與石墨烯表面連接，優(yōu)選通過所述的橋聯(lián)分子B與石墨烯表面連 接。
[0113] 在另一優(yōu)選例中，所述的氧化石墨烯可以是表面修飾有靶向基團(tuán)或靶向分子的氧 化石墨烯，以改善造影劑與目標(biāo)細(xì)胞系的結(jié)合。所述的氧化石墨烯也可以是未經(jīng)修飾有靶 向基團(tuán)或靶向分子的氧化石墨烯，以得到非特異性的造影劑。
[0114] 所述的靶向分子可以是任何能夠增加造影劑和細(xì)胞系的結(jié)合的靶向分子，如蛋 白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物等。
[0115] 在另一優(yōu)選例中，所述的靶向分子包括抗體、配體、葉酸。
[0116] 所述的絡(luò)合分子可以是任意能夠與釓離子絡(luò)合，且能夠與橋聯(lián)分子修飾的氧化石 墨烯通過化學(xué)鍵（如配位鍵或共價鍵）相連。較佳地，所述的絡(luò)合分子選自下組：二乙三 胺五乙酸以及其衍生物、1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸以及其衍生物，或 其組合。其中，所述的衍生物指二乙三胺五乙酸-雙二甲酰胺（DTPA-BDMA)、二乙三胺五乙 酸-雙（異煙肼）（DTPA-BIN)、二乙三胺五乙酸-雙甲酰胺（DTPA-BMA)、1，4, 7, 10-四氮雜環(huán) 十二烷-1，4, 7-三乙酸（D03A)、10- (2-羥丙基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7-三乙 酸（冊003八）、2-甲基-1，4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10-四乙酸（皿(^)、（〇，。， [1 "，α 四甲基-1,4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4, 7, 10-四乙酸（DOTMA)等，或其組 合。
[0117] 所述的造影劑可以單獨(dú)作為造影劑使用，也可以和其他組分共同作為造影劑使 用。在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑還包括選自下組的組分：釓離子、錳離子、釓納米粒 子、錳納米粒子、小尺寸四氧化三鐵納米粒子，或其組合。其中，所述的小尺寸指粒徑d為 I < d < 5nm。
[0118] 特別地，所述的造影劑可以用作細(xì)胞內(nèi)造影劑，用于進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)成像和檢測。
[0119] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑還可以與其他組分共同使用，如負(fù)載藥物共同用 于人體或體外組織等。上述的藥物可以是治療性藥物或示蹤性分子等，如阿霉素、喜樹堿、 易瑞沙、血根堿、紫杉醇、異硫氰酸熒光素、羅丹明、Cy系列染料、AlexaFluor系列染料等， 或其組合。
[0120] 所述的藥物與所述的造影劑以吸附方式結(jié)合，由于所述造影劑中，釓金屬絡(luò)合物 以化學(xué)鍵方式與修飾的氧化石墨烯表面結(jié)合，因此，本發(fā)明的造影劑可以提供較大的吸附 量。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物遞送載體的載藥率為> 50%，較佳地為> 60%，更佳地為 ^ 70%〇
[0121] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑還可以用于制備藥物組合物，所述的藥物組合物 包括：
[0122] (i)如本發(fā)明第一方面所述的造影劑，所述造影劑作為藥物載體；
[0123] (ii)負(fù)載于所述造影劑上的藥物活性成分；和
[0124] (iii)藥學(xué)上可接受的其他載體。
[0125] 在另一優(yōu)選例中，所述的造影劑為藥物遞送載體。
[0126] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物通過吸附方式與所述的造影劑結(jié)合。
[0127] 所述的藥物沒有特別限制，可以是阿霉素、喜樹堿、易瑞沙、血根堿、紫杉醇等。
[0128] 造影劑的制備
[0129] 本發(fā)明所述的造影劑可以通過以下方法制備：
[0130] (i)提供一表面連接有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯A-(B)m，其中所述橋聯(lián)分子B通過 化學(xué)鍵連于氧化石墨烯A的表面；
[0131] (ii)用絡(luò)合分子Ra與所述的表面連接有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯A-(B)m進(jìn)行反 應(yīng)，形成表面連接有絡(luò)合分子的、式Ia所示的氧化石墨烯；
[0132] A- (B-Ra) n (Ia)
[0133] (iii)將式Ia所示的表面連接有絡(luò)合分子的氧化石墨烯與釓鹽和/或釓鹽溶液進(jìn) 行絡(luò)合反應(yīng)，得到如本發(fā)明第一方面所述的式I所示的造影劑；
[0134] 其中，A、B、R、η的定義如本發(fā)明第一方面所述；
[0135] Ra為絡(luò)合分子，m大于1。
[0136] 在另一優(yōu)選例中，n <m。
[0137] 在另一優(yōu)選例中，對所述步驟（ii)和（iii)還包括透析步驟。
[0138] 所述的表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯可以通過市售途徑獲得，或通過常規(guī)方 法制備。在另一優(yōu)選例中，所述的表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯可以通過包括以下步 驟的方法制備：
[0139] (a)提供一氧化石墨烯；
[0140] (b)用橋聯(lián)分子與所述的氧化石墨烯反應(yīng)，得到表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石墨 烯。
[0141] 所述的釓鹽為水溶性釓鹽，較佳地選自下組：氯化釓、硝酸釓，或其組合。
[0142] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0143] (1)提供了一種適用于制備磁共振成像造影劑的材料，本發(fā)明所制備的磁共振成 像造影劑具有良好的生物相容性，且與現(xiàn)有的同類型磁共振成像造影劑馬根維顯相比，具 有更好的成像效果。
[0144] (2)相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的造影劑不僅顯著改善了造影效果，而且適用于多種 人體組織或細(xì)胞的成像，不需要根據(jù)相應(yīng)的組織或細(xì)胞進(jìn)行特殊加工，能夠非特異性地或 廣泛地適用于多種不同的人體組織或細(xì)胞。
[0145] (3)本發(fā)明的造影劑體內(nèi)循環(huán)時間長，并適合用于進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)成像。
[0146] (4)本發(fā)明的造影劑易于負(fù)載藥物，且載藥率高，可達(dá)到70%或更高。
[0147] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0148] 實施例1磁共振成像造影劑的制備
[0149] 本實施例中，磁共振成像造影劑的制備分為三個步驟，包括氧化石墨烯的制備，聚 乙二醇分子修飾氧化石墨烯，共價連接二乙三胺五乙酸以絡(luò)合釓離子，具體步驟如下：
[0150] 第一步，氧化石墨烯的制備：
[0151] 將Ig片狀石墨、0. 5g過硫酸鉀、0. 5g五氧化二磷溶于I. 5mL濃硫酸中，加熱至 80°C反應(yīng)6小時，冷卻到室溫后，再用水將其洗成中性，自然干燥成粉末。將上述粉末加入 到23mL事先預(yù)冷至0°C的濃硫酸中，邊攪拌邊加入3g高錳酸鉀，保持溫度在20°C以下。將 混合物的溫度升至35°C，攪拌2h后，加入46mL三次水，攪拌15min。為中止氧化反應(yīng)，加入 HOmL三次水和2mL濃度為30%的過氧化氫。將混合物用250mL10%的鹽酸離心清洗，以除 去溶液中的金屬離子。將上述氧化石墨用超聲2h，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30min到lh，上清液 即為氧化石墨烯，進(jìn)一步超聲可制備出納米尺度的氧化石墨烯。
[0152] 第二步，聚乙二醇分子修飾的氧化石墨烯的制備：
[0153] 取第一步反應(yīng)中得到的氧化石墨烯5mL預(yù)先超聲半小時，充分分散后，調(diào)pH值約 為8,加入聚乙二醇分子（PEG)水溶液lmL，在室溫攪拌下，加入EDACO. 15mL，繼續(xù)攪拌，再次 加入EDACO. 35mL，攪拌過夜。隨后透析得到PEG修飾的氧化石墨烯。
[0154] 第三步，氧化石墨烯-二乙三胺五乙酸-釓體系的制備及應(yīng)用：
[0155] 將第二步反應(yīng)中得到的聚乙二醇修飾的氧化石墨烯分散到有機(jī)相中，取5mL并加 入二乙三胺五乙酸酸酐0. lg，再加入EDAClmL，之后攪拌過夜。得到的產(chǎn)物經(jīng)透析分散到水 相中。隨后加入GdCl3溶液，攪拌4小時候除去未反應(yīng)的GdCl 3，即得到所需的造影劑。
[0156] 造影效果測試：
[0157] 該造影劑的制備示意圖如圖1所示，其與市售馬根維顯相比，能顯著增強(qiáng)造影效 果（圖2所示），在11. 7T場強(qiáng)下約2. 4倍，為KXSmT1S'
[0158] 穩(wěn)定性測試：
[0159] 該造影劑水溶液（濃度為0. 5mM)與生理性溶液(分別為胎牛血清、和DMEM細(xì)胞培 養(yǎng)液）等體積比混合后，形成濃度為〇. 25mM的溶液，肉眼均未見明顯沉淀。其中，與胎牛血 清混合24h后留存在石墨烯上的釓離子濃度為該混合液的初始濃度（完成混合時）的90% 以上。
[0160] 細(xì)胞內(nèi)成像測試：
[0161] 將H印G2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，分別加入不同濃度梯度的造影劑材料，共同 孵育24小時后，消化收集細(xì)胞，并用瓊脂糖溶液固定細(xì)胞，在11. 7T磁場強(qiáng)度下進(jìn)行細(xì)胞成 像測試（結(jié)果如圖3所示）。
[0162] 負(fù)載藥物測試：
[0163] 將阿霉素配置成濃度為lmg/mL的水溶液，將其等體積加入上述制備的造影劑溶 液中，調(diào)節(jié)溶液PH值，避光攪拌約4小時后，透析除去多余的阿霉素。結(jié)果顯示，本發(fā)明的 造影劑能夠負(fù)載阿霉素（圖4a所示），載藥率可達(dá)到70%，并能有效地殺傷癌細(xì)胞（圖4b 所示）。
[0164] 實施例2磁共振成像造影劑的制備
[0165] 步驟一、步驟二同實施例1。
[0166] 第三步，氧化石墨烯-(1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸）-釓體系 的制備及應(yīng)用：
[0167] 將第二步反應(yīng)中得到的聚乙二醇修飾的氧化石墨烯分散到有機(jī)相中，在5ml聚乙 二醇修飾的氧化石墨烯分散液中，加入Iml濃度為100mg/mL的1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二 烷-1，4, 7, 10-四乙酸溶液，再加入EDAClml，攪拌過夜，透析出去未反應(yīng)的分子。之后加入 氯化釓鹽溶液，攪拌4小時后，透析除去未反應(yīng)的Gd離子，即得到所需的造影劑。
[0168] 結(jié)果顯示，制得的造影劑與市售馬根維顯相比能顯著增強(qiáng)造影效果，在11. 7T下 提高2-3倍。
[0169] 上述具體的制備工藝僅是作為示例給出，其中所提到的修飾氧化石墨烯的分 子不僅僅局限于上述例子中所提到的聚乙二醇、二乙三胺五乙酸、釓離子，也可以選用 其它分子，如聚乙烯亞胺、樹狀大分子、透明質(zhì)酸、殼聚糖、葡聚糖、聚乳酸-羥基乙酸、 1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸、錳離子、錳納米粒子、小尺寸四氧化三鐵納 米粒子或其組合。
[0170] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種造影劑，其特征在于，所述的造影劑具有式I結(jié)構(gòu)： A- (B-R) n (I) 式中，A為氧化石墨烯，或被功能化基團(tuán)修飾的氧化石墨烯； R為釓金屬絡(luò)合物，所述釓金屬絡(luò)合物由絡(luò)合分子Ra與釓金屬絡(luò)合形成； B為橋聯(lián)分子，所述的橋聯(lián)分子通過化學(xué)鍵與所述的氧化石墨烯表面相連，并通過化學(xué) 鍵與所述的釓金屬絡(luò)合物相連； 〃-"表示化學(xué)鍵； n大于1〇
2. 如權(quán)利要求1所述的造影劑，其特征在于，所述的橋聯(lián)分子選自下組：雙官能團(tuán)分 子、多官能團(tuán)分子，或其組合。
3. 如權(quán)利要求1所述的造影劑的制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟： (i) 提供一表面連接有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯A-(B)m，其中所述橋聯(lián)分子B通過化學(xué) 鍵連于氧化石墨稀A的表面； (ii) 用絡(luò)合分子Ra與所述的表面連接有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯A-(B)m進(jìn)行反應(yīng)，形 成表面連接有絡(luò)合分子的、式la所示的氧化石墨烯； A_(B_Ra)n (la) (iii) 將式la所示的表面連接有絡(luò)合分子的氧化石墨烯與釓鹽和/或釓鹽溶液進(jìn)行絡(luò) 合反應(yīng)，得到如權(quán)利要求1所述的式I所示的造影劑； 其中，A、B、R、n的定義如權(quán)利要求1所述； Ra為絡(luò)合分子，m大于1。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石 墨烯通過包括以下步驟的方法制備： (a) 提供一氧化石墨??； (b) 將橋聯(lián)分子與所述的氧化石墨烯反應(yīng)，得到表面修飾有橋聯(lián)分子的氧化石墨烯。
5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，還包括以下特征： 所述的釓鹽為水溶性釓鹽，較佳地選自下組：氯化釓、硝酸釓，或其組合； 所述的橋聯(lián)分子選自下組：官能團(tuán)化的聚乙二醇、官能團(tuán)化的聚乙烯亞胺、官能團(tuán)化的 樹狀大分子、透明質(zhì)酸、殼聚糖、葡聚糖、聚乳酸-羥基乙酸，或其組合。
6. -種造影劑組合物，其特征在于，所述的造影劑包括稀釋劑以及權(quán)利要求1所述的 造影劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的造影劑組合物，其特征在于，所述的組合物還包括選自下組的 藥物組分：治療性藥物、示蹤性分子，或其組合；和/或 所述組合物還包括選自下組的組分：釓離子、錳離子、釓納米粒子、錳納米粒子、小尺寸 四氧化三鐵納米粒子，或其組合。
8. -種造影方法，其特征在于，包括步驟： 將權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的造影劑組合物施用于待造影的對象或樣品，并進(jìn)行 造影。
9. 一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括： (i)如權(quán)利要求1所述的造影劑，所述造影劑作為藥物載體； (ii)負(fù)載于所述造影劑上的藥物活性成分；和（iii)藥學(xué)上可接受的其他載體。
10. 如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物活性成分選自下組：治 療性藥物、示蹤性分子，或其組合。
11. 一種造影劑中間體，其特征在于，所述的造影劑具有式la結(jié)構(gòu)： A_(B_Ra)n (la) 式中，A為氧化石墨烯，或被功能化基團(tuán)修飾的氧化石墨烯； Ra為絡(luò)合分子，所述絡(luò)合分子可與釓金屬形成絡(luò)合物； B為橋聯(lián)分子，所述的橋聯(lián)分子通過化學(xué)鍵與所述的石墨烯表面相連，并通過化學(xué)鍵與 所述的絡(luò)合分子相連； 〃-"表示化學(xué)鍵； n大于1〇
12. -種權(quán)利要求11所述的造影劑中間體的用途，其特征在于，用于制備權(quán)利要求1所 述的造影劑。
【文檔編號】A61K49/12GK104436221SQ201310435341
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張智軍, 張萌欣 申請人:中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所