開(kāi)口箭在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了開(kāi)口箭在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭能阻滯S-180細(xì)胞生長(zhǎng)周期，抑制其增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)EMSA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭能減少NF-κB的表達(dá)和抑制NF-κB的活性，對(duì)S-180細(xì)胞具有抑制作用；開(kāi)口箭能減少S-180細(xì)胞接種的荷瘤小鼠模型瘤體組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)，同時(shí)還能抑制荷瘤小鼠模型瘤體組織內(nèi)NF-κB的活性，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。通過(guò)急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)證實(shí)開(kāi)口箭對(duì)昆明種小鼠肝腎功能和血糖值無(wú)影響，對(duì)昆明小鼠的臟器無(wú)損傷。表明開(kāi)口箭具有安全、有效的抗腫瘤作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
【專利說(shuō)明】開(kāi)口箭在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及開(kāi)口箭在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤、心臟病以及腦血管疾病是21世紀(jì)危害人類健康和生命的三大疾病。惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢(shì)，關(guān)于腫瘤的防治也是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的重要課題。通過(guò)長(zhǎng)期大量的臨床實(shí)踐得知，傳統(tǒng)的中草藥在抗惡性腫瘤方面具有其獨(dú)特療效，通常作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)，能較好的改善腫瘤患者的臨床癥狀、體征，減輕放化療后不良反應(yīng)，提聞患者免疫力和延長(zhǎng)壽命等。在臨床治療中，放化療以及手術(shù)治療方式已經(jīng)是腫瘤治療的基本手段，但存在不良反應(yīng)大、長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，中藥治療惡性腫瘤可以減輕患者不良反應(yīng)，提高患者的免疫力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究機(jī)構(gòu)寄希望于價(jià)格低廉、安全性高、不良反應(yīng)少等的中藥能應(yīng)用在抗腫瘤方面。
[0003]開(kāi)口箭錄屬于百合科鈴蘭簇植物，主產(chǎn)三峽庫(kù)區(qū)和神農(nóng)架林區(qū)，長(zhǎng)期以來(lái)為少數(shù)民族民間用藥。取其根莖入藥，味苦，辛，性寒，有毒，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕，散瘀止痛等功效，主要治療咽喉腫痛、白喉，胃痛，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷，癰腫瘡毒，毒蛇咬傷等。
[0004]NF-κΒ是在成熟B細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白，因其與B細(xì)胞免疫球蛋白上的K B輕鏈基因增強(qiáng)子κ B序列特異結(jié)合而得名。NF-κ B在炎癥、腫瘤、哮喘、胃腸道、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中有廣泛的表達(dá)，成為為近20年來(lái)研究的重要靶點(diǎn)。NF-κ B蛋白家族包括 Rel (cRel)、p65 (RelA, NF-κ B3)、RelB 和 p50 (NF-κ Bl),p52 (NF-κ B2) 5 個(gè)亞單位;其中p65、cRel和RelB分別 含有N端Rel同源區(qū)(RHD)和C端的反式激活結(jié)構(gòu)域(TD)，在RHD的C末端有一個(gè)核定位區(qū)域(NLS)，負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合、二聚體化和核易位，而TD則與轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)。P50和p52只有RHD，缺乏TD，因此二者不能激活基因轉(zhuǎn)錄，只是作為一種抑制分子而存在，在細(xì)胞內(nèi)二者通常以各自前體P105和plOO存在。兩個(gè)亞基形成的二聚體與靶基因上- κ B位點(diǎn)結(jié)合調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄，不同的NF-K B 二聚體在選擇結(jié)合序列時(shí)稍有差異，這是NF-κ B通過(guò)不同的二聚體的形式對(duì)不同基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的一種方式，最常見(jiàn)的NF- κ B 二聚體是p65與p50組成的異二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF- κ B與其抑制物(IkB)形成復(fù)合體，以無(wú)活性形式存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受刺激后，NF-κ B 二聚體從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κ B主要激活途徑因其家族參與主導(dǎo)成員不同分為兩條:經(jīng)典途徑和旁路路徑。經(jīng)典途徑主要與RelA-p50有關(guān)，在腫瘤壞死因子(TNF-α )、白細(xì)胞介素I (IL-1)、病毒、微生物等刺激后激活I(lǐng) κ B激酶復(fù)合體(ΙΚΚ)，使其活化將I κ B特定絲氨酸殘基磷酸化，而導(dǎo)致NF- κ B暴露核定位位點(diǎn)，游離的NF- κ B迅速移位至細(xì)胞核，與特異性κ B序列結(jié)合而誘導(dǎo)一系列相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄；旁路途徑主要與RelB-pl05/100有關(guān)，在各種因子的刺激下激活I(lǐng)KK，導(dǎo)致plOO磷酸化后被蛋白酶降解，最終引起RelB-p50/p52核轉(zhuǎn)移并與DNA結(jié)合。
[0005]活化的NF-κ B進(jìn)入到細(xì)胞核后，與其靶基因中的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子共有的κ B序列“GGGRNNYYCC”結(jié)合從而誘導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄。NF- κ B調(diào)控的下游基因包括TNF、IL-1、C0X2、ΜΜΡ9等促進(jìn)腫瘤發(fā)生的基因，VEGF, TNF等與腫瘤血管生成有關(guān)的基因，ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，bcl_2、cIAP、TRAF等與腫瘤抗調(diào)亡有關(guān)的基因。許多證據(jù)表明，NF-κ B與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。NF-κ B的激活不僅存在于造血系統(tǒng)來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中，也存在于實(shí)體瘤來(lái)源的細(xì)胞中，然而在正常的細(xì)胞中卻很少發(fā)現(xiàn)有NF- κ B的激活。NF- κ B的激活既存在于腫瘤細(xì)胞中，也存在于一些腫瘤組織中如多發(fā)性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、前列腺癌和乳腺癌。更重要的是，在這些腫瘤標(biāo)本中抑制NF-κ B的活化會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞周期的停滯并誘導(dǎo)凋亡，表明NF-kB在腫瘤細(xì)胞的增殖存活中起著重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)民間用藥開(kāi)口箭新的用途，提供開(kāi)口箭在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的還在于提供一種安全、有效的含開(kāi)口箭抗腫瘤藥物。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]MTT法檢測(cè)開(kāi)口箭對(duì)S-180細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭能夠抑制S-180細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S-180細(xì)胞DNA含量及其周期發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭阻滯S-180細(xì)胞生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的變化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)EMSA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭能減少NF- κ B的表達(dá)和抑制NF- κ B的活性，對(duì)S-180細(xì)胞具有抑制作用，且在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)具有量效；建立荷瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭能減少S-180細(xì)胞接種的荷瘤小鼠模型瘤體組織內(nèi)NF- κ B的表達(dá)，同時(shí)還能抑制荷瘤小鼠模型瘤體組織內(nèi)NF- κ B的活性，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。通過(guò)EMSA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭能減少NF- κ B的表達(dá)和抑制NF- κ B的活性，對(duì)S-180細(xì)胞具有抑制作用，且在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)具有量效。開(kāi)口箭短時(shí)間大劑量服用對(duì)昆明小鼠肝腎功能和血糖值無(wú)影響，對(duì)昆明小鼠的臟器組織無(wú)病理性損傷。開(kāi)口箭長(zhǎng)期服用對(duì)昆明小 鼠的肝腎功能和空腹血糖值亦無(wú)影響，對(duì)昆明小鼠的臟器組織無(wú)病理性損傷。通過(guò)急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)證實(shí)開(kāi)口箭對(duì)昆明種小鼠肝腎功能和血糖值無(wú)影響，對(duì)昆明小鼠的臟器無(wú)損傷。
[0010]上述結(jié)果表明開(kāi)口箭通過(guò)抑制NF- K B的活性，降低NF- κ B在瘤體組織的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有安全、有效的抗腫瘤作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
[0011]一種抗腫瘤藥物，包含開(kāi)口箭或開(kāi)口箭提取物。
[0012]所述的開(kāi)口箭提取物的制備優(yōu)選包括如下步驟:將開(kāi)口箭或開(kāi)口箭飲片用水清洗后浸泡，再用蒸餾水進(jìn)行熬制，將熬制的溶液煎熬濃縮，待濃縮液冷卻后過(guò)濾即得到開(kāi)口箭提取物。
[0013]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭具有抑制腫瘤細(xì)胞的功能，并揭示了其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的靶向機(jī)制(開(kāi)口箭通過(guò)抑制NF-κ B的活性，降低NF- κ B在瘤體組織的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖)。由于開(kāi)口箭對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)毒副作用，可開(kāi)發(fā)成一種安全、有效的抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0014]圖1是開(kāi)口箭對(duì)S-180細(xì)胞抑制增殖的時(shí)效圖。
[0015]圖2是電鏡下各組實(shí)體瘤超微結(jié)構(gòu)圖；其中，A:生理鹽水組(X5000) ;B:CTX組(X4000 ；C:高劑量組(2g/mg，X3000) ；D:中劑量組(lg/mg，X4000) ；E:低劑量組(0.5g/mg, X 4000)ο
[0016]圖3是EMSA檢測(cè)S-180細(xì)胞NF-κ B活性結(jié)果圖；其中，A:突變探針?lè)磻?yīng)組，B:探針?lè)磻?yīng)組，C:空白對(duì)照組，D:高劑量組，E:中劑量組，F(xiàn):低劑量組，G:陰性對(duì)照組，H:環(huán)磷酰胺組。
[0017]圖4是EMSA檢測(cè)S-180細(xì)胞接種的荷瘤小鼠腫瘤組織中NF-κ B活性結(jié)果圖；其中，A:突變探針?lè)磻?yīng)組，B:探針?lè)磻?yīng)組，C:空白對(duì)照組，D:高劑量組，E:中劑量組，F(xiàn):低劑量組，G:陰性對(duì)照組，H:環(huán)磷酰胺組。
[0018]圖5是S-180細(xì)胞NF-κ B擴(kuò)增倍數(shù)結(jié)果圖；其中，A:5_氟尿嘧啶組，B:高劑量組，C:中劑量組，D:低劑量組。
[0019]圖6是S-180細(xì)胞接種的荷瘤小鼠腫瘤組織中NF-κ B擴(kuò)增倍數(shù)結(jié)果圖；其中，A:環(huán)磷酰胺組，B:高劑量組，C:中劑量組，D:低劑量組。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021 ] 實(shí)施例1開(kāi)口箭藥物制備
[0022]稱取開(kāi)口箭飲片(神農(nóng)架產(chǎn)區(qū)，渦陽(yáng)縣源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司)0.5kg，首先用自來(lái)水將開(kāi)口箭飲片清洗兩遍，再用自來(lái)水將其浸泡30min，更換蒸餾水1.5L熬制40~50分鐘，將得到的溶液倒入事先準(zhǔn)備的干凈燒杯中，逐漸放置至冷卻，再次往開(kāi)口箭飲片中加入750mL蒸餾水熬制40~50分鐘，然后將溶液倒入同一個(gè)燒杯中冷卻，倒掉藥渣，將兩次所收集的開(kāi)口箭藥物的溶液放入藥罐中煎熬濃縮至250mL，分煎兩次得濃度為2.0g/mL溶液，冷卻后用無(wú)菌紗布過(guò)濾兩次，分瓶置4°C保存，使用時(shí)可用蒸餾水將其稀釋到0.04g/mL和1.0g/mL,在要進(jìn)行體內(nèi)灌胃時(shí)提前30min移至室溫。
[0023]實(shí)施例2MTT法檢測(cè)開(kāi)口箭對(duì)S-180細(xì)胞增殖的影響
[0024]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S-180細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活力:將細(xì)胞懸液作適當(dāng)稀釋，與0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液以9:1 (體積比)混勻，取少許溶液滴入清潔計(jì)數(shù)板，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，根據(jù)活細(xì)胞拒染呈無(wú)色透明狀，死細(xì)胞被染成明顯藍(lán)色計(jì)算細(xì)胞活力:活細(xì)胞率(％)=活細(xì)胞數(shù)/ (活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))X 100%。
[0025]選取活細(xì)胞率> 96%的S-180細(xì)胞用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),根據(jù)細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4X 10000計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，根據(jù)該細(xì)胞生長(zhǎng)特性將細(xì)胞稀釋成4X IOVmL以100 μ L/孔細(xì)胞懸 液轉(zhuǎn)板至96孔板中，周圍36孔用蒸餾水填充以防止蒸發(fā)現(xiàn)象影響測(cè)定結(jié)果。再將開(kāi)口箭分別稀釋至0、20、40、80、160、320yg/mL的濃度梯度以100 μ L/孔加入到每孔中混勻，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,將培養(yǎng)板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h取出一塊培養(yǎng)板進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)試驗(yàn)孔以20 μ L/孔加入5mg/mLMTT溶液，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育4h，再以150 μ L/孔加入DMSO溶結(jié)晶，并置搖床80rpm、IOmin加速結(jié)晶的溶解，最后用酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為570nm測(cè)量各孔的吸光值，按照抑瘤率=(對(duì)照組值一治療組值)/對(duì)照組值X 100% (對(duì)照組即5-氟尿嘧啶組，治療組即開(kāi)口箭組)，計(jì)算各組的抑瘤率和IC50值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖1和表1所示。
[0026]活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臜，該結(jié)晶的量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)。圖1顯示:從干預(yù)時(shí)間上看，24h、48h、72h均有不同程度的抑制S-180細(xì)胞增殖作用，48h各個(gè)濃度的OD值均低于24h，72h的OD值高于48h，與24h比較無(wú)明顯規(guī)律性，說(shuō)明開(kāi)口箭抑制S-180細(xì)胞增殖的最佳時(shí)間是給藥后48h。
[0027]根據(jù)檢測(cè)OD值統(tǒng)計(jì)分析顯示，當(dāng)藥物濃度在0-320 μ g/mL之間，隨著藥物濃度的增加OD值越小，抑瘤率越大，說(shuō)明開(kāi)口箭在0-320 μ g/mL之間存在量效關(guān)系；各濃度OD值有顯著性差異(P=0.000, P〈0.01)，給藥時(shí)間與濃度梯度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=l.000，P>0.05)，如表1所示。
[0028]表1開(kāi)口箭對(duì)S-180細(xì)胞抑制增殖表
【權(quán)利要求】
1. 開(kāi)口箭在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.開(kāi)口箭提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的開(kāi)口箭提取物的制備包括如下步驟:將開(kāi)口箭或開(kāi)口箭飲片用水清洗后浸泡，再用蒸餾水進(jìn)行熬制，將熬制的溶液煎熬濃縮，待濃縮液冷卻后過(guò)濾即得到開(kāi)口箭提取物。
4.一種抗腫瘤藥物，其特征在于包含開(kāi)口箭。
5.一種抗腫瘤藥物，其特征在于包含開(kāi)口箭提取物。
【文檔編號(hào)】A61K36/896GK103520445SQ201310514604
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】張瑩雯 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)