一種納米顆粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：1）將聚陽離子高分子溶于超純水或無RNase酶水配制成聚陽離子溶液,將核酸藥物溶解于超純水或者無RNase酶水配制成核酸溶液；2）將所述聚陽離子溶液加入到所述核酸溶液中，反復(fù)吹打均勻，室溫下孵育，得到polyplexes；3）將嵌段高分子溶解于超純水或無RNase酶水中配制成嵌段高分子溶液，將所述嵌段高分子溶液緩慢加入至所述步驟2）制備的polyplexes顆粒中，吹打均勻，靜置，使其充分包裹，即可制得由嵌段高分子包裹的納米顆粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的納米顆粒可以排除陽離子顆粒在體內(nèi)循環(huán)的障礙，提高體內(nèi)循環(huán)效率，同時(shí)，還可接枝靶向基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)病變細(xì)胞靶向，并有效提高靶向效果。
【專利說明】一種納米顆粒的制備方法
[0001]本申請是申請?zhí)枮?01210163285.1、發(fā)明創(chuàng)造名稱為“一種嵌段高分子及其合成方法和納米顆粒的制備方法”、申請日為2012年5月23日的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種嵌段高分子及其合成方法和納米顆粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003]siRNA是一段21 — 25個(gè)堿基對的RNA分子，發(fā)現(xiàn)于單細(xì)胞生物抵御病毒侵襲的機(jī)制。單細(xì)胞生物針對入侵病毒的mRNA序列合成出一段與之互補(bǔ)的siRNA，主動(dòng)結(jié)合mRNA，從而阻斷病毒的復(fù)制。這種與病原體基因一一對應(yīng)的干擾策略如果用來開發(fā)治療人類疾病的藥物，將從根本上改變目前傳統(tǒng)的新藥發(fā)現(xiàn)模式，帶來藥物治療技術(shù)的革命。siRNA因其獨(dú)特的靶點(diǎn)特異性、結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性和代謝安全性，成為科學(xué)界普遍看好的下一代革命性新藥的第一候選。然而，至目前為止，一個(gè)高效的體內(nèi)輸送載體的缺乏，卻導(dǎo)致 siRNA 的成藥性受到了限制(Castanotto, D.&Rossi, J.J.The promises and pitfallsof RNA-1nterference-based therapeutics.Nature 457,426-433(2009).)? 而目前用于核酸物質(zhì)輸送的載體多集中在以下幾類:(1)物理導(dǎo)入:物理導(dǎo)入法是最先應(yīng)用的基因?qū)敕椒?，即采用電穿孔或粒子轟擊技術(shù)等，將目的基因直接輸送至體內(nèi)或靶位的方法。這些方法無需使用基因載體，但是轉(zhuǎn)染效率普遍很低、操作復(fù)雜，對組織的損傷也比較大。(2)病毒載體:目前對于病毒載體研究較多的是慢病毒載體、腺病毒載體，病毒載體雖然有較高的體外轉(zhuǎn)染活性，然而，其免疫原性與易導(dǎo)致突變的缺點(diǎn)為體內(nèi)輸送帶來了巨大的安全隱患。(3)非病毒載體:非病毒載體的優(yōu)勢主要在于，在保證預(yù)期的轉(zhuǎn)染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帶來的免疫原性與諸多炎癥反應(yīng)，其一般為以下幾種載體設(shè)計(jì):(a)陽離子脂 質(zhì)體；(b)聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主要集中于聚陽離子基因載體與陽離子脂質(zhì)體的修飾，使之適用于基因物質(zhì)的靶向輸送。陽離子脂質(zhì)體具有較高的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性，然而，由于表面的正電荷影響其體內(nèi)的正常分布，同時(shí)，由于選用陽離子脂質(zhì)，免疫原性與炎癥反應(yīng)在動(dòng)物試驗(yàn)中也成為不可避免的缺點(diǎn)之一(Gao, K.&Huang, L.Nonviral methods for siRNA delivery.Molecular pharmaceutics6,651-658(2008).)。聚陽離子基因載體目前發(fā)展已經(jīng)較為成熟，在諸多文獻(xiàn)中已有詳盡的報(bào)道。此外，在基因輸送載體中，較為成功的實(shí)例CALAND0 Pharmaceuticals公司采用的R0NDEL?技術(shù)，以與陽離子基因載體連接的環(huán)糊精、十二金剛烷為載體材料，以轉(zhuǎn)鐵蛋白為靶向基團(tuán)對基因物質(zhì)進(jìn)行包裹遞送，以系統(tǒng)給藥治療實(shí)體瘤，目前正在臨床I期試驗(yàn)中。然而，在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中難以保證靶向基團(tuán)在結(jié)構(gòu)的表面，而環(huán)糊精可以減低毒性，但是此結(jié)構(gòu)增多會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性，存在一個(gè)毒性與轉(zhuǎn)染活性的自身設(shè)計(jì)矛盾，同時(shí)，其連接難以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)無毒化降解(Davis，M.E.The first targeted delivery of siRNA in humansvia a self-assembling, cyclodextrin polymer-based nanoparticle:from concept toclinic.Molecular pharmaceutics6, 659-668(2009) ? X
[0004]用于治療的核酸藥物載體須以盡可能簡單的結(jié)構(gòu)完成以下五個(gè)步驟:A)核酸的凝聚、B)核酸對病變細(xì)胞的靶向、C)核酸的內(nèi)吞逃逸、D)核酸在病變細(xì)胞漿的釋放以及E)載體自身的無毒化代謝?，F(xiàn)有技術(shù)中，運(yùn)用人體內(nèi)源性單體和安全性已知的藥物代謝物構(gòu)建的pH響應(yīng)性可降解聚陽離子以及其簡單的結(jié)構(gòu)高效實(shí)現(xiàn)了上述步驟中的A、C、D、E0但是面對病變細(xì)胞的多樣性(步驟B)，其通用性卻大為折扣。Polyplex顆粒表面膜的自組裝是一項(xiàng)尚未妥善解決的難題。中性磷脂沒有吸附于Polyplex表面的化學(xué)驅(qū)動(dòng)力。Huang等人1990年代中葉報(bào)道的單價(jià)負(fù)電荷磷脂構(gòu)建的Lipopolyplex (LPD 一 II)表面膜的物理穩(wěn)定性欠佳。其最近報(bào)道的兩價(jià)負(fù)電荷磷脂構(gòu)建的Lipopolyplex雖然大幅改善了表面膜物理穩(wěn)定性，外表面過多的負(fù)電荷可能影響納米顆粒對于病變細(xì)胞的附著。同樣，很多研究提出聚陽離子載體與PEG共價(jià)連接可使得聚陽離子基因納米顆粒表面正電荷有效屏蔽，然而，共價(jià)連接PEG后，對基因的復(fù)合能力卻明顯受到影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一目的在于提供一種嵌段高分子，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的Polyplex顆粒表面膜的外表面存在過多的正電荷從而影響Polyplex顆粒對于病變細(xì)胞的附著，且靶向效果差的技術(shù)性問題。
[0006]本發(fā)明的第二目的在于提供一種嵌段高分子的合成方法。
[0007]本發(fā)明的第三目的在于提供一種納米顆粒的制備方法。
[0008]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]一種嵌段高分子，包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。
[0010]優(yōu)選地，所述第一嵌段`可選自PEG或PE0。
[0011]優(yōu)選地，所述第二嵌段可選自聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)或聚己內(nèi)酯(PCL)的一種。
[0012]優(yōu)選地，所述第三嵌段選自能提供負(fù)電荷的分子或通過化學(xué)反應(yīng)可與能提供負(fù)電荷的分子共價(jià)連接的化合物。
[0013]優(yōu)選地，所述通過化學(xué)反應(yīng)可與能提供負(fù)電荷的分子共價(jià)連接的化合物包括多羥基分子，所述多羥基分子可選自甘油、乙二醇、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖醇的一種。
[0014]優(yōu)選地，所述能提供負(fù)電荷的分子包括多羧基化合物，所述多羧基化合物可選自蘋果酸或檸檬酸。
[0015]優(yōu)選地，還包括靶向基團(tuán)或熒光分子，所述靶向基團(tuán)或所述熒光分子與所述第一嵌段連接。
[0016]優(yōu)選地，所述靶向基團(tuán)可選自蛋白、多肽、抗體或小分子靶向基團(tuán)的一種或幾種。
[0017]優(yōu)選地，所述蛋白可選自轉(zhuǎn)鐵蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可選自RGD或胰島素；所述小分子靶向基團(tuán)可選自葉酸、生物素或半乳糖的一種。
[0018]優(yōu)選地，所述熒光分子可選自羅丹明、FITC、NBD、cy5.5或FAM的一種。
[0019]一種嵌段高分子的合成方法，包括以下步驟:[0020]I)以PEG為引發(fā)劑，在Sn(Oct)2的催化下，在80~140°C條件下于無水甲苯中引發(fā)開環(huán)聚合，加入己內(nèi)酯，反應(yīng)進(jìn)行6~24h，合成PEG-PCL嵌段；
[0021]2)以草酰氯為連接劑，先將所述步驟I)中合成的PEG-PCL嵌段溶于無水二氯甲烷中，再將PEG-PCL嵌段溶液緩慢逐滴加至草酰氯中，滴加溫度為冰浴，滴加完成后恢復(fù)至室溫，2~12h后抽除溶劑及過量的草酰氯，獲得中間產(chǎn)物:羥基端經(jīng)過酰氯活化的PEG-PCL，而后將中間產(chǎn)物溶解于無水二氯甲烷，再將中間產(chǎn)物溶液逐滴加入由DMF溶解的大量麥芽三糖中，滴加溫度為冰浴，滴加完成后恢復(fù)至室溫，2~12h后減壓抽除溶劑，用截留分子量為1000~10000的透析袋透析除去麥芽三糖，透析時(shí)間為12~48h，預(yù)凍，凍干得到PEG-PCL-MaItotriose 嵌段高分子。
[0022]一種納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0023]I)將聚陽離子高分子溶于超純水或無RNase酶水配制成聚陽離子溶液，將核酸藥物溶解于超純水或者無RNase酶水配制成核酸溶液；
[0024]2)將所述聚陽離子溶液加入到所述核酸溶液中，反復(fù)吹打均勻，室溫下孵育，得到polyplexes ；
[0025]3)將上述的嵌段高分子溶解于超純水或無RNase酶水中配制成嵌段高分子溶液，將所述嵌段高分子溶液緩慢加入至所述步驟2)制備的polyplexes顆粒中，吹打均勻，靜置，使其充分包裹，即可制得由嵌段高分子包裹的納米顆粒。
[0026]優(yōu)選地，所述核酸藥物為DNA或RNA。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的嵌段高分子可以有效的屏蔽聚陽離子基因復(fù)合物顆粒等陽離子顆粒表面的電荷，排除陽離子顆粒在體內(nèi)循環(huán)的障礙，提高體內(nèi)循環(huán)效率，同時(shí)，還可接枝靶向基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)病變 細(xì)胞靶向，并有效提高靶向效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明的嵌段高分子結(jié)構(gòu)及合成方法示意圖；
[0029]圖2為本發(fā)明的嵌段高分子的核磁譜圖；
[0030]圖3為本發(fā)明的嵌段高分子的核磁譜圖；
[0031]圖4為本發(fā)明的納米顆粒的制備示意圖；
[0032]圖5為本發(fā)明的納米顆粒的制備示意圖；
[0033]圖6為本發(fā)明的納米顆粒的熒光共定位法結(jié)構(gòu)驗(yàn)證的示意圖；
[0034]圖7為本發(fā)明的納米顆粒粒徑與Zeta電位變化圖(其中ABC指未經(jīng)羧化的嵌段高分子，ABCH指末端經(jīng)過羧化的嵌段高分子)；
[0035]圖8為本發(fā)明的嵌段高分子的細(xì)胞毒性檢測示意圖；
[0036]圖9為本發(fā)明的納米顆粒的體內(nèi)毒性與循環(huán)結(jié)果示意圖；
[0037]圖10為本發(fā)明的嵌段高分子的腫瘤靶向性效果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程。但所舉實(shí)施例并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0039]本發(fā)明對嵌段高分子與polyplexes所形成的納米顆粒的理化性質(zhì)表征方法包括:透射電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射和zeta點(diǎn)位測試。按本方案制備的納米顆粒的細(xì)胞攝取、基因轉(zhuǎn)染和小動(dòng)物活體成像觀察選用的DNA為綠色熒光蛋白質(zhì)粒；相關(guān)的毒性試驗(yàn)選用的細(xì)胞是H印G2細(xì)胞、Hela細(xì)胞、BRL-3A細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞；體內(nèi)分布選用的動(dòng)物是BALB/c 裸鼠。
[0040]實(shí)施例1嵌段高分子PEG-PCL-maltotriose-COOH的合成方法
[0041]嵌段高分子PEG-PCL-maltotriose-COOH的合成路線如圖1所示。整個(gè)反應(yīng)在無水無氧的環(huán)境中進(jìn)行，取一定量的PEG、聚己內(nèi)酯、辛酸亞錫至三頸瓶中，加入現(xiàn)制的無水甲苯，于120°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)完成后加入乙醚沉淀，而后加入二氯甲烷溶解，再用乙醚沉淀，反復(fù)三次，得到PEG-PCL嵌段高分子。
[0042]而后將PEG-PCL溶解于二氯甲烷中，加入過量草酰氯于反應(yīng)瓶中，在無水無氧冰浴的條件下將PEG-PCL溶液逐滴加入到反應(yīng)瓶中，滴加完成后恢復(fù)至室溫，攪拌，12h后減壓抽除剩余的草酰氯，而后加入二氯甲烷溶解末端經(jīng)過酰氯活化的PEG-PCL，冰浴下將末端經(jīng)過酰氯活化的PEG-PCL溶液逐滴緩慢的加入過量的麥芽三糖中(溶于少量DMF),反應(yīng)在無水無氧的條件下進(jìn)行，滴加完成后恢復(fù)到室溫，12h后減壓抽除溶劑，于截留分子量7000的透析袋中，透析24小時(shí)除去未反應(yīng)的麥芽三糖。預(yù)凍，而后于凍干機(jī)中凍干得到白色粉末。
[0043]將制得的白色粉末溶解于無水二氯甲烷中，加入到過量的草酰氯中，在冰浴中緩慢滴加，滴加完成后恢復(fù)至室溫，攪拌反應(yīng)，結(jié)束后減壓除去過量草酰氯，而后加水水解，于截留分子量為3500的截留離心管中離心除去少量小分子片段，凍干得到終產(chǎn)品。
[0044]其1H-NMR圖譜如圖2、3所示:在1H-NMR圖譜(DMS0_d6，400MHz):其峰歸屬見圖2、圖3，其中，化學(xué)位移在4-6區(qū)間為麥芽三糖羥基氫的峰，而糖環(huán)上的骨架氫的峰在化學(xué)位移3-4之間，被高分子的峰所掩蓋，所以以麥芽三糖的羥基峰作為合成結(jié)果的判定。經(jīng)過羧化的嵌段高分子麥芽三糖的羥基峰部分消失或減弱，指示部分羥基被羧基取代。
[0045]實(shí)施例2納米顆粒的制備
[0046]取一定量的聚陽離子高分子(以PEI為例)與質(zhì)粒DNA，由于考察納米顆粒結(jié)構(gòu)與電荷屏蔽情況，故選用質(zhì)量比1:5 (pDNA:PEI)制備成polyplexes樣品，而后加入嵌段高分子，充分復(fù)合。具體步驟見圖4、5。
[0047]實(shí)施例3納米顆粒的表征
[0048]按照上述的制備方法制備的納米顆粒，通熒光共定位對其進(jìn)行表征，具體做法如下，將PEI與FITC通過共價(jià)鍵連接，并同時(shí)用nile red標(biāo)記嵌段高分子的疏水PCL嵌段，將制備的熒光顆粒固定在PVA水凝膠中，并通過反復(fù)“冷凍-室溫”循環(huán)進(jìn)行交聯(lián)固化，限制顆粒在水平面上的二維運(yùn)動(dòng)。觀察結(jié)果見圖6，紅色(nile red)和綠色(FITC)在相同位置出現(xiàn)并重合，驗(yàn)證了納米顆粒的形成。
[0049]實(shí)施例4納米顆粒的粒徑與表面電位的表征
[0050]通過粒徑與電位的測定對納米顆粒結(jié)果進(jìn)行表征，電位的變化，經(jīng)過包裹后電位在OmV左右，同時(shí)，未經(jīng)過羧化的高分子電位沒有明顯降低，由此可以直觀證明本發(fā)明的嵌段高分子材料可以屏蔽電荷，并且粒徑分布比較均勻，結(jié)果見圖7。
[0051]實(shí)施例5嵌段高分子的細(xì)胞毒性的考察[0052]采用MTT法測定細(xì)胞毒性，選用IfepG2、HeLa、BRL-3A、SMMC-7721細(xì)胞考察細(xì)胞毒性，以8000個(gè)/孔的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)96孔細(xì)胞板，置于37°C 5%細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。配制
l、2、3、4、6、8mg/mL的系列不同濃度的嵌段高分子溶液，每孔加入100 y L，稀釋介質(zhì)是DMEM高糖培養(yǎng)基(無血清無酚紅)，從培養(yǎng)箱中取出96孔細(xì)胞板，吸去培養(yǎng)液，每孔用100 y L磷酸鹽緩沖溶液沖洗一次，再棄去磷酸鹽緩沖溶液，將不同濃度的嵌段高分子溶液依次加入到細(xì)胞板中，平行測定6個(gè)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4小時(shí)。然后，吸去培養(yǎng)液，每孔用100 u L磷酸鹽緩沖溶液沖洗一次，再棄去磷酸鹽緩沖溶液，每孔加入100 U L DMEM高糖培養(yǎng)基(無血清無酚紅)和25 ii L MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。6小時(shí)之后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入IOOy L 二甲基亞砜，放置充分溶甲贊，采用多功能酶標(biāo)儀測定樣品在570nm和630nm處的吸光度值(以630nm處為對照)。經(jīng)過測試可知,嵌段高分子材料毒性較低，在微克級基本無毒，結(jié)果見圖8。
[0053]實(shí)施例6體內(nèi)循環(huán)考察
[0054]按照前述方法制備的納米顆粒，分別將polypi exes與經(jīng)過包裹后的納米顆粒經(jīng)小鼠尾靜脈注射，單劑量給予lmg/kg體重的pDNA質(zhì)粒的復(fù)合物，其復(fù)合比例與方法同前所述，將嵌段高分子用突光染料rhodamine共價(jià)連接標(biāo)記,經(jīng)過尾靜脈注射后,polyplexes組的小鼠均發(fā)生急性死亡，而對于注射經(jīng)過所設(shè)計(jì)的嵌段高分子包裹后的納米顆粒的小鼠生命體征平穩(wěn)，經(jīng)過24小時(shí)候，頸椎脫白處死小鼠，分別取心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行冰凍切片觀察，以注射等體積生理鹽水組為空白對照，經(jīng)過熒光顯微鏡觀察，可以看到在肝、脾、肺處均出現(xiàn)了部分顆粒的聚集，結(jié)果見圖9，證明經(jīng)過包裹后，polyplexes表面電荷得到了有效的中和，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)循環(huán)。
[0055]實(shí)施例1嵌段高分子的腫瘤靶向考察
[0056]選擇生物素為靶向基團(tuán)與嵌段高分子進(jìn)行共價(jià)連接，考察其腫瘤靶向性，將5周齡的BALB/c裸鼠在SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)一周，而后以SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行皮下腫瘤接種，待腫瘤長至200mm3后，單劑量注射pDNA的基因復(fù)合物，劑量lmg/kg體重，制備方法與比例同前，分別制備無靶向基團(tuán)連接的嵌段高分子包裹的納米顆粒與以生物素為靶向基團(tuán)的高分子包裹的基因顆粒，并以rhodamine共價(jià)連接的熒光嵌段高分子進(jìn)行熒光體內(nèi)示蹤，以同體積的生理鹽水組為空白對照，進(jìn)行腫瘤靶向性考察。經(jīng)小鼠尾靜脈注射給藥，分別于給藥后4h、12h、24h觀察小鼠腫瘤部分熒光量的蓄積，考察所制備的顆粒在腫瘤組織的靶向效果，經(jīng)過靶向基團(tuán)連接后的基因顆粒在腫瘤部位的蓄積量明顯高于未經(jīng)連接組，具體結(jié)果見圖10。
[0057]以上公開的僅為·本申請的幾個(gè)具體實(shí)施例，但本申請并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng)落在本申請的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將聚陽離子高分子溶于超純水或無RNase酶水配制成聚陽離子溶液，將核酸藥物溶解于超純水或者無RNase酶水配制成核酸溶液； 2)將所述聚陽離子溶液加入到所述核酸溶液中，反復(fù)吹打均勻，室溫下孵育，得到polyplexes ； 3)將嵌段高分子溶解于超純水或無RNase酶水中配制成嵌段高分子溶液，將所述嵌段高分子溶液緩慢加入至所述步驟2)制備的polyplexes顆粒中，吹打均勻,靜置,使其充分包裹，即可制得由嵌段高分子包裹的納米顆粒；所述嵌段高分子包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。
2.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述核酸藥物為DNA或RNA。
【文檔編號】A61K47/34GK103656679SQ201310613693
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月23日
【發(fā)明者】袁偉恩, 金拓, 吳飛, 葛雪梅 申請人:上海交通大學(xué)