鈍頂螺旋藻cpd光修復(fù)酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶及其應(yīng)用。該CPD光修復(fù)酶具有SEQIDNO:2所示的多肽序列，或在SEQIDNO:2所示氨基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加1～10個氨基酸殘基所形成的具有CPD光修復(fù)酶活性的多肽序列。而用以編碼所述鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的多聚核苷酸可具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或者與SEQIDNO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能夠編碼光修復(fù)酶活性蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明優(yōu)化并首次人工合成了適于原核表達(dá)的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶基因，并成功將其克隆到表達(dá)載體中，獲得大量鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶，當(dāng)將該CPD光修復(fù)酶應(yīng)用到化妝品、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域時，能夠主動修復(fù)由紫外線引起的皮膚病癥，產(chǎn)生巨大社會效益和經(jīng)濟(jì)價值，意義重大。
【專利說明】鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶及其應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明具體涉及鈍頂螺旋藻platens is")中CPD光修復(fù)酶、其優(yōu)化后的編碼基因，以及鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的DNA損傷修復(fù)活性，涉及生物學(xué)領(lǐng)域。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]對每一種生物而言，基因組的準(zhǔn)確和完整都是保證其自身存活及機(jī)體功能正常執(zhí)行的重要基礎(chǔ)。源于生物體內(nèi)部及外界環(huán)境的基因毒性物質(zhì)侵害、DNA復(fù)制過程中發(fā)生的各類錯誤以及DNA自身固有生化性質(zhì)導(dǎo)致的不穩(wěn)定，每個細(xì)胞每天大約需要承受50，000到500，000次的DNA分子損傷。
[0005]紫外線是最主要的環(huán)境DNA損傷劑，盡管臭氧層吸收了太陽紫外線中最危險的部分(紫外線C)，但強(qiáng)烈陽光中剩余的紫外線A和紫外線B仍能在一小時內(nèi)對被照射細(xì)胞產(chǎn)生約十萬次的DNA損傷。生物體中DNA的四種堿基在近紫外波段(紫外線B)有強(qiáng)吸收，進(jìn)而誘發(fā)DNA同一條鏈內(nèi)相鄰的胸腺嘧啶堿基產(chǎn)生嘧啶二聚體光化學(xué)產(chǎn)物，其中最主要(約90%)的光產(chǎn)物是環(huán)丁燒嘧唳二聚體(Cyclobutane Pyrimidine Dimer, CPD)，還包括(6-4)光產(chǎn)物(6-4 PhotoProduct, 6-4 PP)等其他光產(chǎn)物破壞DNA結(jié)構(gòu)，引發(fā)基因突變和基因組畸變，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡或者癌變。對人體的皮膚細(xì)胞而言，受紫外線損傷的DNA如果不能夠被及時和正確的修復(fù)，將造成皮膚炎癥及黑色素沉積，甚至引發(fā)皮膚癌和黑瘤病。
[0006]在病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物、無脊椎動物及部分脊椎動物細(xì)胞內(nèi)存在一類DNA光修復(fù)酶，可在30(T600nm波長的光照射下將原本受紫外線照射而在DNA中形成的嘧啶二聚體分解成原來的非聚合狀態(tài)，使DNA恢復(fù)正常。由于人體內(nèi)缺乏該類DNA光修復(fù)酶,皮膚細(xì)胞中只能采用效率較低的核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)方式消除6-4 PP，而環(huán)丁烷嘧啶二聚體(PD則會被積累下來并導(dǎo)致一系列的負(fù)面效應(yīng)的發(fā)生，如皮膚炎癥、免疫抑制、皮膚腫瘤，甚至皮膚癌。現(xiàn)有研究結(jié)果表明(PD光修復(fù)酶可以主動修復(fù)皮膚細(xì)胞因紫外線照射而產(chǎn)生的基因損傷，抑制由此引起的紅斑、皮膚炎癥等發(fā)生；抑制DNA損傷引起的代謝免疫功能異常，有效抵制細(xì)菌、寄生蟲的侵蝕，延緩衰老，增強(qiáng)皮膚新陳代謝而使細(xì)胞保持活力；并且還能預(yù)防紫外線損傷引起的皮膚癌。
[0007]鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis),是絲狀不形成異型胞的藍(lán)藻,原產(chǎn)于非洲乍得Aranguadi湖，國內(nèi)主要分布在海南、廣東、云南等地。鈍頂螺旋藻是世界上廣泛推行的優(yōu)良螺旋藻品種，由于其具有營養(yǎng)成分高且易于吸收的特點，已被人類廣泛采集食用了幾百年。作為安全的食用藻類，每個鈍頂螺旋藻中僅含有10-20個(PD光修復(fù)酶分子，這使得直接進(jìn)行天然鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶的分離純化和體外應(yīng)用極為困難。因此有必要對長期生存于強(qiáng)紫外線輻射條 件下的鈍頂螺旋藻進(jìn)行深入研究，利用基因工程手段克隆重組其CPD光修復(fù)酶，實現(xiàn)過量表達(dá)和純化。[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的多肽序列，或在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加所形成的具有CPD光修復(fù)酶活性的多肽序列。
[0010]作為可行的實施方案之一，所述鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶具有在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中取代和/或缺失和/或添加I~10個氨基酸殘基所形成的多肽序列。
[0011]本發(fā)明的目的之二在于提供一種編碼所述鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的多聚核苷酸。
[0012]進(jìn)一步的,所述多聚核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者與SEQ IDNO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能夠編碼光修復(fù)酶活性蛋白的核苷酸序列。
[0013]本發(fā)明的目的之三在于提供一種導(dǎo)入了前述多聚核苷酸的原核或真核表達(dá)載體。
[0014]進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體中還導(dǎo)入了選擇性標(biāo)記基因，其可包括但不限于:可在表達(dá)菌株中產(chǎn)生顏色變化的酶的基因、或發(fā)光化合物的基因、或具有抗生素標(biāo)記物的基因、或具有營養(yǎng)缺陷抗性的基因。
[0015]本發(fā)明的目的之四在于提供包含前述多核苷酸或前述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明的目的之 五在于提供鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶在制備防曬產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下有益效果:優(yōu)化并首次人工合成了適于原核表達(dá)的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶基因，并成功將其克隆到表達(dá)載體中，獲得大量鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶，當(dāng)將該CPD光修復(fù)酶應(yīng)用到化妝品等相關(guān)領(lǐng)域時，能夠主動修復(fù)由紫外線引起的皮膚細(xì)胞DNA損傷，產(chǎn)生巨大社會效益和經(jīng)濟(jì)價值，意義重大。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶重組表達(dá)鑒定及純化結(jié)果鑒定SDS-PAGE電泳圖； 圖2是鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶紫外及可見光吸收光譜掃描結(jié)果；
圖3是鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶酶催化動力學(xué)參數(shù)擬合曲線。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明旨在通過優(yōu)化得到適于原核表達(dá)的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶編碼基因，然后將其優(yōu)化后的編碼基因克隆到表達(dá)載體中，得到其編碼產(chǎn)物，驗證其CPD光修復(fù)酶活性，并將編碼產(chǎn)物合理應(yīng)用到化妝品、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域，從而消除上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
[0021]而相應(yīng)的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括:
1.提供了一種鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶，如(a)或(b)所述的蛋白質(zhì):
(a)其如SEQID NO:2所示的氨基酸序列；
(b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一至十個氨基酸殘基且具有(PD光修復(fù)酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0022](b)所述的蛋白質(zhì)，例如在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的N端添加His His HisHis His His六個氨基酸、或在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的N端添加His His His HisHis His His His八個氨基酸等，以上修飾均不改變蛋白活性，且由(a)衍生，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023]2.提供了鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的編碼基因。
[0024]鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶優(yōu)化后的編碼基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列?；蛘?，與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且編碼光修復(fù)酶活性蛋白的核苷酸序列，能夠編碼(b)所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。例如，將鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶氨基酸序列中天冬酰胺(Asn)的對應(yīng)編碼基因由最優(yōu)密碼子AAC替換為AAT;將鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶氨基酸序列中脯氨酸(Ρro)的對應(yīng)編碼基因由最優(yōu)密碼子CCG替換為CCT、CCC或者CCA ;或針對將SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中的氨基酸N端添加六個氨基酸，SEQ ID NO:1所示的核苷酸3’端添加18個核苷酸。
[0025]3.提供了鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的表達(dá)載體
該表達(dá)載體包括:導(dǎo)入了鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶優(yōu)化后的編碼基因而能夠編碼如(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。
[0026]本發(fā)明提供的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的表達(dá)載體中，還可以加入選擇性標(biāo)記基因，包括但不限于:可在表達(dá)菌株中產(chǎn)生顏色變化的酶的基因、或發(fā)光化合物的基因、或具有抗生素標(biāo)記物的基因、或具有營養(yǎng)缺陷抗性的基因。
[0027]更具體的講，本發(fā)明首先從GeneBank數(shù)據(jù)庫中查詢得到鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始cDNA序列，經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)密碼子優(yōu)化后得到優(yōu)化后的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶編碼基因。通過化學(xué)合成得到該全長編碼基因，同時，根據(jù)該基因片段序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增優(yōu)化后的全長鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶基因并將該基因克隆到原核克隆載體pET28上(由pET28a(+)改造的載體，去除了 pET28a(+)中His_tag前的凝血酶酶切位點及一些限制性酶切位點)，進(jìn)行測序驗證。將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中表達(dá)。最終經(jīng)過Ni親和層析、凝膠排阻及離子交換層析得到純化蛋白。為了方便過量表達(dá)菌株的鑒定和篩選，可對表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物基因(如GFP基因、突光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素標(biāo)記物及營養(yǎng)缺陷標(biāo)記物。
[0028]( I)鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶基因編碼序列的原核表達(dá)系統(tǒng)密碼子優(yōu)化
從GeneBank數(shù)據(jù)庫中查詢得到鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始cDNA序列(Gene ID:15162397)，按照大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)tRNA豐度數(shù)據(jù)，將鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始編碼基因中的稀有三聯(lián)體密碼子替換為大腸桿菌細(xì)胞中tRNA豐度最高的相應(yīng)密碼子核苷酸，最終獲得適于大腸桿菌原核表達(dá)的鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶優(yōu)化基因編碼序列。該優(yōu)化過程中鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始cDNA序列中有367個核苷酸被替換調(diào)整，占編碼序列的25%。
[0029](2)鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原核表達(dá)編碼基因的獲得
按照優(yōu)化后的基因序列全基因化學(xué)合成全長雙鏈鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原核表達(dá)編碼基因。
[0030](3)鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶表達(dá)載體構(gòu)建
根據(jù)優(yōu)化后的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶基因完整序列設(shè)計引物:
CPDF: CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG
CPDR: GACA CTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGCPCR反應(yīng)條件為:98 °C預(yù)變性10min，98°C變性50s，55°C退火50s，72。。延伸2min,反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)；將光修復(fù)酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至原核表達(dá)載體pET28，得到重組質(zhì)粒；將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3),測序鑒定得到重組菌株Rosetta(DE3)/ pET28/phr。
[0031](4)鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的純化和蛋白檢測
將重組菌Rosetta (DE3) / pET28/phr接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，加入IPTG，收集菌體；經(jīng)過Ni親和層析、凝膠排阻及陰離子交換層析，得到目的蛋白。
[0032]取上述誘導(dǎo)表達(dá)的Rosetta (DE3)/ pET28/phr菌體和純化的目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE恒壓電泳，電泳結(jié)束后將凝膠用聚丙烯酰胺凝膠染色液染色。
[0033]本發(fā)明通過密碼子優(yōu)化及重組表達(dá)、純化技術(shù)，獲得了鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶，其能夠主動修復(fù)由紫外線引起的皮膚細(xì)胞DNA損傷，適用于化妝品等相關(guān)領(lǐng)域。例如，現(xiàn)有防曬產(chǎn)品主要通過將皮膚與紫外線隔離開來的方式起作用，對已經(jīng)產(chǎn)生的紫外傷害無法起到修復(fù)治愈作用；而將本發(fā)明的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶蛋白作為高級護(hù)膚品的功能成分時，其主動修復(fù)由紫外線 引起的紅斑、皮膚炎癥以及基因損傷，顯著提高防曬產(chǎn)品的防護(hù)效果，而若作為皮膚細(xì)胞DNA修復(fù)保健品，其還可以清除皮膚細(xì)胞中日常累積的DNA損傷，起到延緩皮膚衰老的作用。
[0034]為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0035]下述實施例中所使用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，詳見《分子克隆實驗指南(第四版)》，科學(xué)出版社，2013年I月I日出版，ISBN:9787030386069。
[0036]實施例1鈍頂螺旋藻Spirulina platensis CPD光修復(fù)酶原核表達(dá)優(yōu)化編碼基因的獲得
從GeneBank數(shù)據(jù)庫中查詢得到鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始cDNA序列(Gene ID:15162397)，按照大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)tRNA豐度數(shù)據(jù)，將鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始編碼基因中的稀有三聯(lián)體密碼子替換為大腸桿菌細(xì)胞中tRNA豐度最高的相應(yīng)密碼子核苷酸，最終獲得適于大腸桿菌原核表達(dá)的鈍頂螺旋藻(PD光修復(fù)酶優(yōu)化基因編碼序列。該優(yōu)化過程中鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶原始cDNA序列中有367個核苷酸被替換調(diào)整，占編碼序列的25%，其具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
[0037]實施例2鈍頂螺旋藻Spirulina platensis CPD光修復(fù)酶表達(dá)載體構(gòu)建
1、根據(jù)優(yōu)化后的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶基因完整序列設(shè)計引物:
正向引物:CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG
反向引物:GACACTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGC
PCR反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性10min，98°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸2min，反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶，其特征在于，它具有SEQ ID N0:2所示的多肽序列，或在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加所形成的具有CPD光修復(fù)酶活性的多肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶，其特征在于，它具有在SEQID NO: 2所示氨基酸序列中取代和/或缺失和/或添加I~10個氨基酸殘基所形成的多肽序列。
3.編碼權(quán)利要求1-2中任一項所述鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶的多聚核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多聚核苷酸，其特征在于，具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能夠編碼光修復(fù)酶活性蛋白的核苷酸序列。
5.導(dǎo)入了權(quán)利要求3-4中任一項所述多聚核苷酸的原核或真核表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體中還導(dǎo)入了選擇性標(biāo)記基因。
7.權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述選擇性標(biāo)記基因包括:可在表達(dá)菌株中產(chǎn)生顏色變化的酶的基因、或發(fā)光化合物的基因、或具有抗生素標(biāo)記物的基因、或具有營養(yǎng)缺陷抗性的基因。
8.包含權(quán)利要求3-4中任一項所述多核苷酸或權(quán)利要求5-7中任一項所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-2中任一項所述鈍頂螺旋藻CPD光修復(fù)酶在制備防曬產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K8/66GK103966193SQ201310731604
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】李旭, 沈輝, 王虹 申請人:安徽邦業(yè)生物工程有限公司