一種制備三維多孔支架復合層的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備三維多孔支架復合層的方法，屬于生物材料【技術(shù)領域】。為防止支架由于力學作用有碎屑掉落而引起炎癥反應，需要在多孔陶瓷支架表面形成一層包覆膜，羥基磷灰石粉末的加入填補了支架表層的空隙缺陷，從而增強支架強度。采用多孔磷酸鈣陶瓷支架，分別用加入了羥基磷灰石的聚乳酸溶液和載入生長因子的水凝膠溶液對多孔陶瓷支架進行復合。水凝膠中負載的生長因子可以在自身擴散作用及高分子水凝膠的緩慢降解的共同作用下緩慢釋放到人體所需要的部位，促進組織血管內(nèi)皮化生長和成骨細胞的增殖分化，支架也逐漸降解，最終轉(zhuǎn)化成骨。主要用于制備三維多孔支架復合層。
【專利說明】一種制備三維多孔支架復合層的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料【技術(shù)領域】，尤其是骨修復材料和骨組織工程材料復合層及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磷酸鈣陶瓷由于和人體的硬組織的無機成分相似，具有良好的生物相容性和生物活性、骨誘導性、可降解性，當其植入體內(nèi)后能與周圍的骨組織形成良好的骨性鍵合，而被廣泛用作骨修復材料。在臨床上它們可以普遍用于非承力和承力部位的骨缺損修復，故良好的力學性能是陶瓷支架的一個基本要求。但是研究結(jié)果表明致密磷酸鈣陶瓷不能夠有效誘導新骨組織的形成，只有多孔結(jié)構(gòu)的磷酸鈣陶瓷才具有骨誘導能力，因此，陶瓷支架還應具備多孔結(jié)構(gòu)且孔道有良好的貫通性，以有利于組織的長入?；诖耍延休^多相關文獻對其進行了研究，但是大多支架的制備方法都是以磷酸鈣粉體為原料，加入堆積顆粒作為造孔劑。從粉料的合成至支架的產(chǎn)出，工序較為繁瑣，往往為了得到高力學強度，就必須犧牲支架的孔隙率，孔道的貫通性也無法有效保證。
[0003]新型理想的人工骨組織工程支架材料除了應具備優(yōu)良的生物相容性、生物活性以及良好的孔隙結(jié)構(gòu)和力學性能外，還應該具備進一步促進細胞的黏附、增殖和分化的能力，促進骨組織的再生，縮短骨修復過程的時間。[0004]水凝膠作為一種重要的組織工程支架材料，含水量豐富，與人體組織極為相似，具有良好的生物相容性和親和性。生長因子是一種可以刺激細胞生長活動的細胞因子，通過與特異性的、高親和的細胞膜受體結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)細胞的生長和蛋白的表型表達。藥物緩釋系統(tǒng)是指一種可以通過控制藥物的釋放速度和將藥物定向釋放以達到其最佳效果的技術(shù)。而藥物緩釋體系主要是通過一系列化學或物理方法把特定的藥物包埋在高分子水凝膠再通過注射或其他方式進入體內(nèi)。水凝膠中負載的藥物可以在自身擴散作用及高分子水凝膠的緩慢降解的共同作用下緩慢釋放到人體所需要的部位，并且可以保持長久而平穩(wěn)的藥效。此外，可以通過控制凝膠材料的相對分子質(zhì)量來適當調(diào)節(jié)和控制支架材料的降解速率，從而有效達到控制釋放的目的。鑒于現(xiàn)有的技術(shù)的缺點，有必要研究制備一種可降解的生長因子緩釋的三維多孔磷酸鈣陶瓷支架的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備三維多孔支架復合層的方法，它能有效地實現(xiàn)生長因子緩釋，促進血管和內(nèi)皮化生長以及骨細胞的增殖分化。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種制備三維多孔支架復合層的方法，采用如下的步驟:
[0007]步驟一:取用界面法制備出的三維多孔支架，清洗、烘干，備用；
[0008]步驟二:聚乳酸層的復合，將聚乳酸溶于丙酮中，配成質(zhì)量體積比為10%溶液，再加入10%的羥基磷灰石粉末，超聲分散后棄去底部沉淀，把清洗后的三維多孔支架浸沒于聚乳酸溶液中，一分鐘后取出并甩干，備用；
[0009]步驟三:用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，將它們按體積比為9/1~5/5混合，得到水凝膠溶液，在該溶液中加入5~10ng/mL濃度的生長因子和包覆生長因子的海藻酸鈉微球，迅速攪拌混合均勻；
[0010]步驟四:將復合了聚乳酸的三維多孔支架浸入水凝膠溶液中，盡快使其包覆均勻，取出后去除表面多余的水凝膠并進行冷凍干燥，得到生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0011]所述的復合層為表面雙層復合，并且可以完全降解。
[0012]所述的水凝膠為氧化海藻酸鈉和N-琥珀酰殼聚糖的混合物。
[0013]所述的氧化海藻酸鈉為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列接枝后的氧化海藻酸鈉。
[0014]所述的水凝膠和氧化海藻酸鈉微球中都包覆了生長因子。
[0015]所述的生長因子至少為血管內(nèi)皮生長因子、細胞分化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子中的一種。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點和效果:采用聚乳酸對三維多孔陶瓷支架進行復合，聚乳酸本身具有良好的生物相容性，復合之后在支架表面形成一層保護薄膜且不影響其孔道的貫通性，以達到固定支架表面顆粒的目的，從而防止支架在植入過程中有碎屑掉入體內(nèi)組織，引起炎癥反應。與其他支架包覆方法相比，本發(fā)明在聚乳酸溶液分散了羥基磷灰石粉末，一方面羥基磷灰石具有骨誘導和骨傳導性，與支架的成分一致，另一方面羥基磷灰石的加入一定程度上提高的支架力學性能并且具有生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。
[0017]本發(fā)明創(chuàng)新還在于，對聚乳酸復合后的三維多孔支架再次復合了載入生長因子的水凝膠，并且在水凝膠中加入了包覆生長因子的海藻酸鈉微球進行改性。海藻酸鈉微球載入的生長因子主要在骨修復后期發(fā)揮作用，海藻酸鈉包覆后有利于防止生長因子的提前釋放，而失去作用。隨著水凝膠和海藻酸鈉在生物體內(nèi)的降解，實現(xiàn)生長因子的分步釋放，促進組織血管和內(nèi)皮化生長和成骨細胞的分化增殖，縮短骨修復過程的時間，并且可以完全降解，最終完全轉(zhuǎn)化成骨。因此，本發(fā)明無疑提供了性能更加優(yōu)良的生長因子緩釋的雙層復合三維多孔支架的制備方法，這也將成為更優(yōu)良的骨組織工程的支架材料和骨修復材料。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】如下:
[0019]圖1為本發(fā)明的制備工藝流程
[0020]圖2為本發(fā)明海藻酸鈉微球的掃描電子顯微鏡照片
[0021]圖3為本發(fā)明掃描電子顯微鏡照片
[0022]其中(A)復合之前的支架照片；(B)聚乳酸復合的支架照片；(C)聚乳酸和水凝膠雙層復合的支架照片(放大倍數(shù)為50倍)
[0023](D)、(E)、(F)分別為上述支架對應部位的照片(放大倍數(shù)為1000倍)
[0024]圖4為本發(fā)明植入實驗動物體內(nèi)4周后，骨修復對比情況不同倍數(shù)照片
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明的制備工藝流程如圖1所示，除特別申明的外，所用原料均為化學純，下面用實施例詳細表述本發(fā)明:[0026]實施例1:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，再加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀。將備用三維多孔支架置于該溶液中，一分鐘后取出甩干；用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液。滅菌后將9mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和ImL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，并快速攪拌均勻。將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入該混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0027]實施例2:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將備用三維多孔支架置于該溶液中，一分鐘后取出甩干；用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液。滅菌后將9mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和ImLRGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入10ng/mL濃度的VEGF165 (血管內(nèi)皮生長因子)、10ng/HiL濃度的BMP-2 (細胞分化生長因子)和IOmg載入TGF_beatl (轉(zhuǎn)化生長因子)海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入該混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0028]實施例3:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將多孔支架置于分散液中，一分鐘后取出甩干；用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，滅菌后將8mLN-琥珀酰殼聚糖溶液和2mL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入10ng/mL濃度的VEGF165、10ng/mL濃度的BMP-2和IOmg載入TGF-beatl海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0029]實施例4:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將多孔支架置于分散液中，一分鐘后取出甩干；用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，滅菌后將7mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和3mL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入10ng/mL濃度的VEGF165、IOng/mL濃度的BMP-2和IOmg載入TGF-beatl海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0030]實施例5:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將多孔支架置于分散液中，一分鐘后取出甩干；用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，滅菌后將6mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和4mL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入I Ong/mL濃度的VEGF165、I Ong/mL濃度的BMP-2和IOmg載入TGF-beatl海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。[0031]實施例6:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將三維多孔支架置于分散液中，一分鐘后取出甩干；用PH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的R⑶接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，滅菌后將5mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和5mL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入I Ong/mL濃度的VEGF165、I Ong/mL濃度的BMP-2和IOmg載入TGF-beatl海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0032]實施例7:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將多孔支架置于分散液中，一分鐘后取出甩干；用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，滅菌后將8mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和2mL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入5ng/mL濃度的VEGF165、5ng/mL濃度的BMP-2和IOmg載入TGF-beatl海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0033]實施例8:稱取2.0g聚乳酸溶于20mL配成質(zhì)量體積比為10%的溶液，加入質(zhì)量分數(shù)10%的羥基磷灰石干粉，超聲分散后棄去底層沉淀，將三維多孔支架置于分散液中，一分鐘后取出甩干；用PH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的R⑶接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，滅菌后將8mL N-琥珀酰殼聚糖溶液和2mL RGD接枝氧化海藻酸鈉溶液混合，加入7.5ng/mL濃度的VEGF165、7.5ng/mL濃度的BMP-2和IOmg載入TGF-beatl海藻酸鈉微球并快速攪拌均勻，將之前復合了聚乳酸的三維多孔支架放入混合溶液中，快速包覆均勻后，去除表面多余水凝膠；冷凍干燥后得到具有生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
[0034]其他實施例與上述步驟類似，只是加入生長因子的劑量不同。通過比較N-琥珀酰殼聚糖和RGD接枝氧化海藻酸鈉體積配比從9/1到5/5的復合水凝膠發(fā)現(xiàn)，當配比為8/2時得到的N-琥珀酰殼聚糖/氧化海藻酸鈉水凝膠的壓縮強度為最高，且水凝膠的形貌也最為均勻。
[0035]附圖3中可為看出，復合之前的三維多孔支架表面較粗糙，磷酸鈣陶瓷顆粒裸露在表面，復合了聚乳酸之后，支架表面包覆有一層薄膜，表面也變得相對平整。復合了載入生長因子的水凝膠之后，明顯可以看出三維多孔支架表面緊密完整的包覆了水凝膠，并且支架本身的顆粒以及微球很好的固定在三維多孔支架上。
[0036]附圖4中可以看出，在水凝膠中載入促進骨誘導增殖分化和促進血管化的生長因子制備的雙層復合三維多孔支架，植入動物體內(nèi)8周后，骨缺損部位已經(jīng)修復完整，并且促進血管化生長效果顯著，而未載入生長因子支架的骨缺損部位仍然有缺損，且有較多的材料仍存在于缺損部位。
【權(quán)利要求】
1.一種制備三維多孔支架復合層的方法，其特征在于: 步驟一:取用界面法制備出的三維多孔支架，清洗、烘干，備用； 步驟二:聚乳酸層的復合，將聚乳酸溶于丙酮中，配成質(zhì)量體積比為10%溶液，再加入10%的羥基磷灰石粉末，超聲分散后棄去底部沉淀，把清洗后的三維多孔支架浸沒于聚乳酸溶液中，一分鐘后取出并甩干，備用； 步驟三:用pH=7.4的磷酸緩沖溶液配制質(zhì)量體積比為10%的RGD接枝的氧化海藻酸鈉溶液和2.5%的N-琥珀酰殼聚糖溶液，將它們按體積比為9/1~5/5混合，得到水凝膠溶液，在該溶液中加入5~10ng/mL濃度的生長因子和包覆生長因子的氧化海藻酸鈉微球，迅速攪拌混合均勻； 步驟四:將復合了聚乳酸的三維多孔支架浸入水凝膠溶液中，盡快使其包覆均勻，取出后去除表面多余的水凝膠并進行冷凍干燥，得到生長因子緩釋的三維多孔支架復合層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備三維多孔支架復合層的方法，其特征在于，所述的復合層為表面雙層復合，并且可以完全降解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備三維多孔支架復合層的方法，其特征在于，所述的水凝膠為氧化海藻酸鈉和N-琥珀酰殼聚糖的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備三維多孔支架復合層的方法，其特征在于，所述的氧化海藻酸鈉為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列接枝后的氧化海藻酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備三維多孔支架復合層的方法，其特征在于，所述的水凝膠和氧化海藻酸鈉微球中都包覆了生長因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種制備三維多孔支架復合層的方法，其特征在于，所述的生長因子至少為血管內(nèi)皮生長因子、細胞分化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子中的一種。
【文檔編號】A61L27/56GK103691001SQ201310747234
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】汪建新, 閆浩然, 陳太軍, 劉霞, 翁杰, 馮波, 魯雄, 周紹兵, 屈樹新, 段可, 盧曉英, 智偉 申請人:西南交通大學