豬肺炎支原體疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含豬肺炎支原體(M.hyo)全細(xì)胞制備物的可溶性部分，其中M.hyo制備物的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)抗原與免疫球蛋白結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。
【專利說(shuō)明】豬肺炎支原體疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae(M.hyopneumoniae或 M.hyo))。更具體地，本發(fā)明涉及M.hyo全細(xì)胞制備物的可溶性部分以及它在用于保護(hù)豬抵 抗地方性動(dòng)物病肺炎的疫苗中的應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 豬中的地方性動(dòng)物病肺炎，也被稱為支原體肺炎，是由M.hyo引起的。該疾病是一 種慢性的、非致命性的疾病，影響各種年齡的豬。受感染的豬僅僅表現(xiàn)出咳嗽和發(fā)燒的輕微 癥狀，但是這種疾病對(duì)經(jīng)濟(jì)有重要的影響，因?yàn)轱暳限D(zhuǎn)化效率降低并且體重增長(zhǎng)減少。地方 性動(dòng)物病肺炎由受感染豬的肺排出的空氣傳播微生物通過(guò)鼻道在豬之間傳播。M.hyo的初 次感染可能跟隨著其它支原體物種（豬鼻支原體（Mycoplasmahyorhinis)和絮狀支原體 (MycoplasmafIocculare))以及其它細(xì)菌病原體的繼發(fā)感染。
[0004] M.hyo是小的原核微生物，能夠自由生活地存在，雖然它經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)與真核細(xì)胞相 聯(lián)系，因?yàn)樗鼘?duì)外源留醇和脂肪酸有絕對(duì)需求。這些需求通常需要在含血清的培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)。M.hyo由細(xì)胞膜而不是細(xì)胞壁包被。
[0005] 支原體和宿主細(xì)胞表面的物理結(jié)合是地方性動(dòng)物病肺炎發(fā)生和持續(xù)存在的基礎(chǔ)。 M.hyo感染豬的呼吸道，在氣管、支氣管、細(xì)支氣管建群。支原體產(chǎn)生纖毛停滯因子，其導(dǎo)致 呼吸道內(nèi)側(cè)的纖毛停止運(yùn)動(dòng)。最終纖毛退化，使豬易于受到次級(jí)病原體的感染。在感染動(dòng) 物中觀察到紫色到灰色的實(shí)變區(qū)域的典型病灶。對(duì)屠宰動(dòng)物的調(diào)查揭示在30-80%的豬中 存在病灶。來(lái)自13個(gè)州的37個(gè)畜群的結(jié)果表明99%的畜群有符合地方性動(dòng)物病肺炎典型 特征的肺炎病灶。因此，對(duì)有效預(yù)防和治療措施的需求很大。
[0006] 抗生素如硫姆林、甲氧芐氨嘧啶、四環(huán)素和林可霉素有一些益處，但是價(jià)格昂貴并 且需要長(zhǎng)期使用。此外，抗生素尚未被證明有效消除M.hyo的傳播或二次感染。通過(guò)維持無(wú) 病原體畜群來(lái)預(yù)防有時(shí)是可行的，但是經(jīng)常發(fā)生M.hyo的再次引入。由于豬肺炎的嚴(yán)重的 經(jīng)濟(jì)后果，已經(jīng)在尋找針對(duì)M.hyo的疫苗。含有在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的支原體生物體制 備物的疫苗已進(jìn)入市場(chǎng)，但是引起了對(duì)于免疫物質(zhì)中存在的血清組分（例如免疫復(fù)合物或 非免疫原性特異性蛋白）誘導(dǎo)的副反應(yīng)的關(guān)注。提供M.hyo疫苗的其它嘗試已有成功者， 但是這種疾病仍然廣泛流行。
[0007] Ehyo和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)是豬產(chǎn)業(yè)中遇到的兩種最為普遍的病原體。被 PCV2感染的豬表現(xiàn)出通常被稱為斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS)的綜合征。PMWS的臨 床特征是衰弱、皮膚蒼白、瘦弱、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸（icterus)和黃疸（jaundice)。除了 PMWS之外，PCV2與幾種其它的感染相關(guān)，包括假狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)、格雷 舍氏?。℅lasser'sdisease)、鏈球菌腦膜炎、沙門氏菌病、斷奶后大腸桿菌病、飲食肝病和 化膿性支氣管肺炎。M.hyo與地方性動(dòng)物病肺炎相關(guān)，而且已被顯示是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病 (PCVAD)的發(fā)生中的主要輔因子。
[0008] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)由動(dòng)脈炎病毒引起，該病毒與巨噬細(xì)胞，特別是存在 于肺中的巨噬細(xì)胞（肺泡巨噬細(xì)胞）有特別的親和力。這些巨噬細(xì)胞攝取并除去入侵的細(xì) 菌和病毒，但在PRRS病毒的情況中并非如此。在PRRS病毒的情況中，它在巨噬細(xì)胞內(nèi)部繁 殖，產(chǎn)生更多的病毒并殺死巨噬細(xì)胞。一旦PRRSV進(jìn)入畜群，它便會(huì)無(wú)限期地存在并有活 性。高達(dá)40%的巨噬細(xì)胞被破壞，這使得細(xì)菌和其它病毒增殖并進(jìn)行破壞。這種事件的一 個(gè)常見(jiàn)的實(shí)例是在幼年/老年團(tuán)體（grower/finisherunits)中，當(dāng)它們受到PRRS病毒感 染時(shí)，地方性動(dòng)物病肺炎的嚴(yán)重程度顯著增加。超過(guò)一半的斷奶期PRRS病毒陰性的豬在進(jìn) 入市場(chǎng)之前被感染。
[0009] 所需要的是針對(duì)豬支原體感染的改進(jìn)的疫苗。優(yōu)選地，M.hyo疫苗將與其它豬抗 原（如PCV2和PRRS病毒）相容，不論它們是作為單獨(dú)的單次疫苗同時(shí)給予還是以即用型 疫苗的形式組合給予。提供即用型、單次劑量（single-dose)的M.hyo/PCV2組合疫苗將會(huì) 是非常合乎需要的。
[0010] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0011] 本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含豬肺炎支原體（M.hyo)全細(xì)胞制備物的可溶 性部分，其中M.hyo制備物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白 結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。在一個(gè)方面，M.hyo全細(xì)胞制備物的可溶性部分在被加入到免疫 原性組合物之前已用蛋白-A或蛋白-G進(jìn)行處理。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，M.hyo制備物的可溶性部分包含至少一種M.hyo蛋白抗原。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，M.hyo制備物的可溶性部分包含兩種或更多種M.hyo蛋白抗原。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物進(jìn)一步包含至少一種其它抗原。在 一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種其它抗原針對(duì)在豬中可能引起疾病的微生物提供保護(hù)。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包括細(xì)菌、病毒或原生動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微 生物選自但不限于下列種類：豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV)、 豬細(xì)小病毒（PPV)、副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis)、多殺巴斯德菌（Pasteurella multocida)、豬鏈球菌（Streptococcumsuis)、豬葡萄球菌（Staphylococcushyicus)、胸 膜肺炎放線桿菌（Actinobacillluspleuropneumoniae)、支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙門氏菌（Salmonellacholeraesuis)、腸炎沙門氏菌 (Salmonellaenteritidis)、豬紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrixrhusiopathiae)、豬鼻 支原體（Mycoplamahyorhinis)、豬滑液支原體（Mycoplasmahyosynoviae)、鉤端螺旋體 細(xì)菌、胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsoniaintracellularis)、豬流感病毒（SIV)、大腸桿菌抗原、豬 痢疾短螺旋體（Brachyspirahyodysenteriae)、豬呼吸道冠狀病毒、豬流行性腹瀉（PED) 病毒、輪狀病毒、細(xì)環(huán)病毒（TTV)、豬巨細(xì)胞病毒、豬腸病毒、腦心肌炎病毒、奧杰士基氏病 (Aujesky'sDisease)、典型性豬瘟（CSF)的致病原和豬傳染性腸胃炎的致病原，或其組合。
[0015] 在特定的實(shí)施方案中，至少一種其它抗原是豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)抗原，PRRS病 毒抗原或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在豬中引發(fā)針對(duì)M.hyo和PCV2二者的保護(hù)性 免疫反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在豬中引發(fā)針對(duì)M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保護(hù) 性免疫反應(yīng)。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2抗原是嵌合1型-2型圓環(huán)病毒的形式，嵌合病毒包含滅 活的表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的重組豬圓環(huán)病毒1型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2抗 原是重組0RF2蛋白的形式。在又一個(gè)實(shí)施方案中，重組0RF2蛋白從桿狀病毒載體表達(dá)。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑選 自，但不限于下列種類：水包油佐劑，聚合物和水佐劑，油包水佐劑，氫氧化鋁佐劑，維生素E佐劑及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體。
[0018] 在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物當(dāng)以單次劑量給藥的形式進(jìn)行給藥時(shí)，弓丨 發(fā)針對(duì)Ehyo的保護(hù)性免疫反應(yīng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，組合物當(dāng)以單次劑量給藥的形 式進(jìn)行給藥時(shí)，引發(fā)針對(duì)M.hyo和至少一種能在豬中引起疾病的其它微生物的保護(hù)性免疫 反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物當(dāng)以兩次劑量給藥的形式進(jìn)行給藥時(shí)，引發(fā)針對(duì) M.hyo和至少一種能在豬中引起疾病的其它微生物的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
[0019] 本發(fā)明還提供免疫豬以抵抗M.hyo的方法。該方法包括給豬施用包含M.hyo全細(xì) 胞制備物的可溶部分的免疫原性組合物，其中M.hyo制備物的可溶性部分基本上不含（i) IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥組合物 的M.hyo制備物的可溶部分包含至少一種M.hyo蛋白抗原。
[0020] 在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物被肌內(nèi)，皮內(nèi)，經(jīng)皮或皮下給藥。在本發(fā) 明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物以單次劑量的形式給藥。在本發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施 方案中，組合物以兩次劑量的形式給藥。
[0021] 在本發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，組合物與至少一種其它抗原共同給藥，所述 至少一種其它抗原提供針對(duì)能在豬中引起疾病的微生物，例如上述的一種或多種微生物的 保護(hù)。這種其它抗原可以與M.hyo組合物同時(shí)給予（即作為單獨(dú)的單次疫苗）或者組合制 成即用型疫苗的形式。
[0022] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，組合物被給藥給具有來(lái)自母體的Ehyo抗體的豬。在又 一個(gè)實(shí)施方案中，組合物被給藥給具有來(lái)自母體的針對(duì)M.hyo和至少一種能在豬中引起疾 病的其它微生物的抗體的豬。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物被給藥給3周齡或更大的豬。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供試劑盒。該試劑盒含有包含免疫原性組合物的瓶。該免疫原性 組合物包含豬肺炎支原體（M.hyo)全細(xì)胞制備物的可溶性部分，其中M.hyo制備物的可溶 性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包括含有免疫原性組合物給藥信息的使用說(shuō)明書。
[0025] 此外，本發(fā)明提供制備根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物的方法。該方法包括i)在合 適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)M.hyo18-144小時(shí)的時(shí)間；ii)隨后滅活M.hyo培養(yǎng)物；iii)收獲滅活 的培養(yǎng)液，其中滅活的培養(yǎng)液包含M.hyo全細(xì)胞制備物，所述全細(xì)胞制備物包含可溶性液 體級(jí)分和不可溶細(xì)胞物質(zhì)；iv)從不可溶細(xì)胞物質(zhì)分離可溶性液體級(jí)分；以及V)從分離的 可溶性液體級(jí)分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫復(fù)合物。
[0026] 附圖簡(jiǎn)述
[0027] 圖1是顯示用進(jìn)行不同處理的M.hyo抗原制備的M.hyo單價(jià)疫苗（實(shí)施例3中描 述的T02-T10)相對(duì)于安慰劑（TOl)的效力的圖。結(jié)果表示為％肺損傷最小平方平均值 LungLesionLeastSquareMeanvalues)〇
[0028] 圖2是顯示與滅活的PCVI型-2型嵌合病毒組合的M.hyo疫苗的PCV2抗原功效 結(jié)果（PCV2抗原ELISA)的圖。組合物中包含的嵌合病毒的初始水平是大約1. 6彡RP。每 個(gè)樣品的狀態(tài)表示為相對(duì)功效（RP)。
[0029] 圖3是顯示用使用不同佐劑平臺(tái)的PCV/M.hyo疫苗制劑觀察到的PCV2病毒血癥 結(jié)果（PCV2定量PCR)的圖。
[0030] 圖4是顯示在攻毒第1、20和42天，用使用不同佐劑平臺(tái)的PCV/M.hyo疫苗制劑 觀察到的PCV2抗體ELISA(S/P)血清學(xué)結(jié)果的圖。
[0031] 圖5是顯示實(shí)施例7中所述的T02-T04處理相對(duì)于安慰劑（TOl)獲得的PCV2糞 便脫落的圖。結(jié)果表示為PCV2DNA拷貝數(shù)/ml。
[0032] 圖6是顯示實(shí)施例7中所述的T02-T04處理相對(duì)于安慰劑（TOl)獲得的PCV2鼻 脫落的圖。結(jié)果表示為PCV2DNA拷貝數(shù)/ml。
[0033] 圖7 (A&B)是顯示測(cè)定PCV2-特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫（CMI)應(yīng)答的干擾 素-Y(IFN-γ)檢測(cè)結(jié)果的圖。接種后/攻毒前的結(jié)果顯示于圖7A，接種后/攻毒后的結(jié) 果顯示于圖7B。5xIO6個(gè)細(xì)胞的刺激被認(rèn)為是顯著的。
[0034] 圖8顯示SP-油中的PCV2/M.hyo試驗(yàn)性疫苗制劑的M.hyo效力。使用M.hyo處 理T02-T08的制劑相對(duì)于安慰劑（TOl)的肺部評(píng)分以圖解顯示在圖8A中。圖8B中的表顯 示了處理T02-T08與安慰劑的對(duì)比。
[0035] 圖9是顯示用于制備PCV2-相容的蛋白-A處理的M.hyo抗原的制造過(guò)程的一個(gè) 實(shí)施方案的流程圖。
[0036] 圖10是顯示針對(duì)PRRS病毒的殺病毒活性的佐劑評(píng)價(jià)的表。
[0037] 序列簡(jiǎn)述
[0038] SEQIDNO: 1是編碼來(lái)自M.hyo的P-5722株的p46的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)施方 案；
[0039] SEQIDNO:2是來(lái)自Mhyo的P-5722株的p46的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0040] SEQIDNO:3是編碼來(lái)自M.hyo的P-5722株的p97的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)施方 案；
[0041] SEQIDNO:4是來(lái)自M.hyo的P-5722株的p97的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0042] SEQIDNO:5是編碼嵌合PCV1-2病毒的基因組序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0043] SEQIDN0:6是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0044] SEQIDNO:7是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0045] SEQIDN0:8是編碼嵌合PCV1-2病毒的基因組序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0046] SEQIDN0:9是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0047] SEQIDNO: 10是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0048] SEQIDNO: 11是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0049] SEQIDNO: 12是編碼SEQIDNO: 11的氨基酸序列的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0050] SEQIDNO: 13是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0051] SEQIDNO: 14是編碼SEQIDNO: 13的氨基酸序列的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0052] SEQIDNO: 15是相應(yīng)于豬圓環(huán)病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一個(gè)實(shí)施方案；
[0053] SEQIDN0:16是被稱為P129的北美PRRS病毒分離物的非-強(qiáng)毒性形式的基因組 序列的一個(gè)實(shí)施方案；以及
[0054] SEQIDNO: 17是相應(yīng)于被稱為ISU-55的PRRS病毒分離物的0RF2至0RF5的核苷 酸序列的一個(gè)實(shí)施方案。
[0055] SEQIDNO: 18是相應(yīng)于被稱為ISU-55的PRRS病毒分離物的0RF6和0RF7的核苷 酸序列的一個(gè)實(shí)施方案。
[0056] 發(fā)明詳述
[0057] 本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含豬肺炎支原體（Ehyo)全細(xì)胞制備物的可溶 性部分，其中M.hyo制備物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白 結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。 申請(qǐng)人:令人驚訝地發(fā)現(xiàn)M.hyo全細(xì)胞培養(yǎng)物的不可溶級(jí)分是無(wú)免 疫原性的。相反，不含IgG的M.hyo可溶性制備物是有免疫原性的，并能有效與來(lái)自其它病 原體，如PCV2的抗原組合，而在抗原之間沒(méi)有分析干擾或免疫干擾。這使得本發(fā)明的M.hyo 可溶性制備物成為多價(jià)疫苗，包括單瓶，即用型制劑的有效平臺(tái)。 申請(qǐng)人:還令人驚訝地發(fā)現(xiàn) 除去免疫球蛋白和不可溶細(xì)胞碎片增強(qiáng)了免疫原性組合物的安全性。
[0058] 如說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)引 用，除非上下文另外明確規(guī)定。例如，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)蛋白抗原"包括多個(gè)蛋白抗原，包括其混合 物。
[0059] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"包含"是指組合物和方法包括所述及的要素，但不排除其 它要素。
[0060] 如本文所定義的，M.hyo全細(xì)胞培養(yǎng)物的可溶性部分指在分離了不可溶物質(zhì)并基 本上去除了IgG和抗原結(jié)合的免疫復(fù)合物之后的M.hyo全細(xì)胞培養(yǎng)物的可溶性液體級(jí)分。 M.hyo可溶性部分在文本中還可以被稱為上清級(jí)分，培養(yǎng)物上清等等。它包含已從不可溶 蛋白，全細(xì)菌和其它不可溶M.hyo細(xì)胞物質(zhì)通過(guò)傳統(tǒng)方法（如離心、過(guò)濾或沉淀）分離的 M.hyo-表達(dá)的可溶性蛋白（M.hyo蛋白抗原）。除了包含M.hyo-特異的可溶性蛋白，M.hyo 全細(xì)胞培養(yǎng)物的可溶性部分還包含異源蛋白，例如那些M.hyo發(fā)酵使用的培養(yǎng)基中含有的 異源蛋白。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"抗原"指能在動(dòng)物中刺激產(chǎn)生抗體或T-細(xì)胞應(yīng)答或二者的化合物、組合物 或免疫原性物質(zhì)，包括給動(dòng)物注射或被動(dòng)物吸收的組合物。免疫反應(yīng)可以針對(duì)整個(gè)分子或 者針對(duì)分子的一部分（例如表位或半抗原）產(chǎn)生。
[0062] 如本文所定義的，"免疫原性或免疫組合物"，指包含至少一種抗原的組合物，所述 抗原在宿主中引發(fā)對(duì)感興趣的組合物或疫苗發(fā)生細(xì)胞和/或抗體-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致 的免疫反應(yīng)。
[0063] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)"指在動(dòng)物中引發(fā)的反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以指細(xì)胞免疫 (CMI);體液免疫或者可以包括二者。本發(fā)明還考慮限于免疫系統(tǒng)一部分的反應(yīng)。通常，"免 疫反應(yīng)"包括，但不限于，下述效果的一種或多種：特異性針對(duì)感興趣的組合物或疫苗中所 包含的一種或多種抗原的抗體，B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/ 或ydT細(xì)胞的產(chǎn)生或激活。優(yōu)選地,宿主將會(huì)顯示出治療性或保護(hù)性免疫反應(yīng),從而增強(qiáng) 對(duì)新的感染的抗性和/或減輕疾病的臨床嚴(yán)重程度。這種保護(hù)將通過(guò)受感染宿主通常表現(xiàn) 出的癥狀的減少或消失、更快的恢復(fù)時(shí)間和/或受感染宿主中更低的病毒滴度來(lái)證明。 [0064] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"免疫原性"指能夠在宿主動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原 的免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)構(gòu)成由疫苗引發(fā)的針對(duì)特定的感染性生物體的保護(hù)性免疫的基 礎(chǔ)。
[0065] 本文使用的"佐劑"指包含一種或多種增強(qiáng)對(duì)抗原免疫反應(yīng)的物質(zhì)的組合物。佐 劑的作用機(jī)理還不完全清楚。認(rèn)為一些佐劑通過(guò)緩慢釋放抗原增強(qiáng)免疫反應(yīng)，而其它佐劑 自身具有強(qiáng)的免疫原性，并被認(rèn)為是通過(guò)協(xié)同作用發(fā)揮功能。
[0066] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"多價(jià)"指包含來(lái)自于同一個(gè)物種（即豬肺炎支原體的不同 分離物）或是來(lái)自不同的物種（即來(lái)自溶血性巴斯德菌（Pasteurellahemolytica)和多殺 巴斯德菌（Pasteurellamultocida)二者的分離物）的超過(guò)一種抗原的疫苗，或者包含來(lái) 自不同屬的抗原的組合的疫苗（例如，包含來(lái)自多殺巴斯德菌（Pasteurellamultocida)、 沙門氏菌（Salmonella)、大腸桿菌（Escherichiacoli)、睡眠嗜血桿菌（Haemophilus somnus)和梭菌（Clostridium)的抗原的疫苗）。
[0067] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"豬"或"小豬"指豬起源的動(dòng)物，而"母豬"指處于生育年齡并具 有生育能力的雌性。"小母豬"指從未懷孕的雌性豬。
[0068] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"毒性的"指保留了其在動(dòng)物宿主中感染能力的分離物。
[0069]"滅活疫苗"指包含不再能復(fù)制或生長(zhǎng)的感染性生物體或病原體的疫苗組合物。病 原體的來(lái)源可以是細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物或真菌。滅活可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，包括凍融、化 學(xué)處理（例如用硫柳汞或福爾馬林處理）、超聲、輻射、熱或任何其它足以防止該生物體復(fù) 制或生長(zhǎng)但保留其免疫原性的慣用方法。
[0070] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"變體"指多肽或編碼多肽的核酸序列，其具有一個(gè)或多個(gè)保守氨 基酸的變化或其它微小的修飾，以使得相應(yīng)的多肽與野生型多肽相比具有基本上相同的功 能。
[0071]"保守變化"表示用另一個(gè)生物學(xué)相似的殘基替換氨基酸殘基，或者替換核酸序列 中的核苷酸以使得編碼的氨基酸殘基不變或者是另一個(gè)生物學(xué)相似的殘基。保守變化的實(shí) 例包括將一個(gè)疏水性殘基（如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸）取代為另一個(gè)疏水性 殘基，或者一個(gè)極性殘基的取代，例如精氨酸取代為賴氨酸，谷氨酸取代為天冬氨酸，或谷 氨酰胺取代為天冬酰胺，等等。術(shù)語(yǔ)"保守變化"還包括用取代的氨基酸代替未取代的親本 氨基酸，條件是用取代的多肽激發(fā)的抗體也能與未取代的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0072] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)可接受的載體"和"藥學(xué)可接受的媒介物"可以互換使用， 指可以被注射到宿主中且沒(méi)有副作用的包含疫苗抗原的液體媒介物。本領(lǐng)域已知的合適的 藥學(xué)可接受的載體包括但不限于無(wú)菌水、鹽水、葡萄糖、右旋糖或緩沖液。載體可以包括助 齊U，包括但不限于稀釋劑、穩(wěn)定劑（即糖和氨基酸）、防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、PH緩沖劑、粘 度增強(qiáng)添加劑、染料等。
[0073] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"疫苗組合物"包括在藥學(xué)可接受媒介物中的至少一種抗原或 免疫原，用于在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。疫苗組合物可以劑量形式并通過(guò)醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的技術(shù)給藥，并考慮這些因素：年齡，性別，體重，物種和受體動(dòng)物的條件，以及 給藥方式。給藥方式可以是經(jīng)皮，經(jīng)粘膜給藥（例如口服，經(jīng)鼻，經(jīng)肛門，經(jīng)陰道）或者通過(guò) 腸胃外方式（皮內(nèi)，經(jīng)皮，肌內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)）。疫苗組合物可以單獨(dú)給藥，或者 可以與其它治療或療法共同給藥或順序給藥。給藥的形式可以包括混懸劑，糖漿劑或酏劑， 以及用于腸胃外，皮下，皮內(nèi)，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥（例如注射給藥）的制備物，如無(wú)菌混懸液 或乳液。疫苗組合物可以作為噴霧或混合在食物和/或水中給藥，或者與合適的載體、稀 釋劑、或賦形劑（如無(wú)菌水、生理鹽水、葡萄糖等）混合給藥。組合物可以包含輔助性物質(zhì) (例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、膠凝及或粘度增強(qiáng)添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料 等），這取決于給藥方式和所希望的制備物?？梢詤⒖紭?biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)文獻(xiàn)，例如"Remington's PharmaceuticalSciences, 〃1990制備合適的制備物，而無(wú)需過(guò)度的試驗(yàn)。
[0074] "北美PRRS病毒"指具有與北美PRRS病毒分離物相關(guān)的遺傳特征的任何PRRS 病毒，例如，但不限于1990年代早期左右在美國(guó)首次分離的PRRS病毒（參見(jiàn)，例如， Collins,J.E.，etal.，1992,J.Vet.Diagn.Invest. 4:117-126);北美PRRS病毒分離 物MN-Ib(Kwang,J.etal.，1994,J.Vet.Diagn.Invest. 6:293-296);PRRS病毒的魁北克 LAF-exp91 株（Mardassi，H.etal·，1995,Arch.Virol. 140:1405-1418);和北美PRRS病毒 分離物VR2385 (Meng，X.-Jetal·，1994,J.Gen.Virol. 75:1795-1801)。北美PRRS病毒株 的其它實(shí)例在本文中描述。遺傳特征指北美PRRS病毒株之間的基因組核苷酸序列相似性 和氨基酸序列相似性。中國(guó)PRRS病毒株通常與北美豬顯示出大約80-93%的核苷酸序列相 似性。
[0075] "歐洲PRRS病毒"指具有與1991年左右在歐洲首次分離的PRRS病毒相關(guān)的遺傳 特征的任何PRRS病毒株（參見(jiàn)，例如，Wensvoort,G.，etal·，1991，Vet.Q. 13:121-130)。 "歐洲PRRS病毒"在本領(lǐng)域中有時(shí)還指"萊利斯塔德病毒（Lelystadvirus)"。歐洲PRRS 病毒株的其它實(shí)例在本文中描述。
[0076] 如果基因修飾的病毒比未修飾的親本株毒性較小，則它是"減毒的"。如果毒株 在確定疾病嚴(yán)重性的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)上表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著降低，則該毒株為"毒性較小 的"。這種參數(shù)可以包括病毒血癥的水平、發(fā)熱、呼吸窘迫的嚴(yán)重性、繁殖癥狀的嚴(yán)重性或肺 損傷的數(shù)量或嚴(yán)重性等。
[0077] "感染性克隆"是病原體（例如病毒）的分離的或克隆的基因組，其能在實(shí)驗(yàn)室被 特定地和有目的地改造，然后用于再生產(chǎn)活體的基因修飾的生物體。從感染性克隆產(chǎn)生的 活體的基因修飾的生物體可以用在活體病毒疫苗中?；蛘?，可以通過(guò)用滅活劑如福爾馬林 或疏水溶劑，酸等，通過(guò)紫外線或X-射線輻射，通過(guò)加熱等處理來(lái)自感染性克隆的活病毒 制備滅活的病毒疫苗。
[0078] 所有目前可獲得的M.hyo疫苗都是用滅活的全細(xì)胞支原體制備物（菌苗）制造 的。相反，本發(fā)明使用豬肺炎支原體（M.hyo)全細(xì)胞制備物的可溶性部分，其中M.hyo制備 物的可溶部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。
[0079]Ehyo對(duì)于外源留醇和脂肪酸有絕對(duì)需求。這些需求通常需要在含血清的培養(yǎng)基， 例如豬血清中生長(zhǎng)M.hyo。從M.hyo全細(xì)胞制備物的可溶性蛋白分離不可溶物質(zhì)（例如通 過(guò)離心，過(guò)濾或沉淀）并不會(huì)去除豬IgG或免疫復(fù)合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用蛋 白-A或蛋白-G處理M.hyo可溶性部分以基本上除去培養(yǎng)物上清中包含的IgG和免疫復(fù)合 物。在該實(shí)施方案中，應(yīng)當(dāng)理解蛋白A處理發(fā)生在M.hyo發(fā)酵之后。在本文中這也可以被稱 為下游蛋白A處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的上游蛋白A處理（即 在M.hyo發(fā)酵之前）。蛋白A與IgG的Fc部分結(jié)合。蛋白G優(yōu)先與IgG的Fc部分結(jié)合，但 是也可以和Fab區(qū)域結(jié)合。從粗蛋白混合物，如組織培養(yǎng)物上清，血清和腹水中純化/除去 總IgG的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0080] 在一些實(shí)施方案中，M.hyo制備物的可溶性部分包含至少一種M.hyo蛋白抗原。在 其它實(shí)施方案中，M.hyo制備物的可溶性部分包含兩種或更多種M.hyo蛋白抗原。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方案中，M.hyo上清級(jí)分包含一種或多種下述M.hyo特異性蛋白抗原： 大約46kD(p46)、64kD(p64)和97kD(p97)分子量的M.hyo蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上清 級(jí)分至少包含p46、p64和p97M.hyo蛋白抗原。本文中大約64kD的M.hyo蛋白（p64)也可 以被稱為M.hyo的p65 表面抗原，由Kimetal. [Infect.Immun. 58 (8) : 2637-2643 (1990)] 和美國(guó)專利No. 5, 788, 962描述。
[0082]Futoetal.描述了M.hyo的46kD表面蛋白的克隆和表征，其可以用在本發(fā)明 的組合物中[J.Bact177:1915-1917(1995)]。在一個(gè)實(shí)施方案中，Ehyo培養(yǎng)物上清包含 P46,它的來(lái)自P-5722株的相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列分別如SEQIDN0:1和2所示。進(jìn) 一步考慮的是，這種p46的變體可以用在本發(fā)明的組合物中，如下文所述。
[0083]Zhangetal.描述了M.hyo的p97粘附素蛋白的表征[11^01:· Immun. 63:1013-1019, 1995]。此夕卜，Kingetal?描述 了來(lái)自Ehyo的P-5722 株 的被稱為Mhpl的124kD蛋白，并給出數(shù)據(jù)表明Mhpl和p97是同一個(gè)蛋白[Vaccine 15:25-35 (1997)]。這種p97蛋白可以用在本發(fā)明的組合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，M.hyo培 養(yǎng)物上清包括P97,它的來(lái)自P-5722株的相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列分別如SEQIDN0:3 和4所示。進(jìn)一步考慮的是，這種p97的變體可以用在本發(fā)明的組合物中，如下文所述。
[0084]M.hyo培養(yǎng)物上清可以進(jìn)一步包含M.hyo的特定蛋白抗原，例如但不限于大約 411^)&41)、421^)&42)、891^)&89)和651^)(口65)的蛋白。參見(jiàn)，01?1(1&6七31.，2000，1￥6七· MedB47:527-533和Kimetal·，1990,Infect.Immun. 58(8) :2637-2643。此外，Ehyo培養(yǎng) 物上清可以包含大約102kD(pl02)和216kD(p216)的M.hyo的特定蛋白抗原。參見(jiàn)Minnion etal的美國(guó)專利Nos. 6, 162, 435 和 7, 419, 806。
[0085] 可以使用任何M.hyo株作為起始材料產(chǎn)生本發(fā)明的M.hyo制備物的可溶性部分。 合適的M.hyo株可以從商業(yè)來(lái)源或?qū)W術(shù)來(lái)源獲得，包括保藏機(jī)構(gòu)如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心（ATCC) (Manassas,Va.)和NRRL培養(yǎng)物保藏中心（AgriculturalResearchService,U. S.DepartmentofAgriculture，Peoria，Ill·)。ATCC單獨(dú)列出了下面六個(gè)M.hyo株用于 出售：Μ·hyoATCC25095，M.hyoATCC25617，M.hyoATCC25934，M.hyoATCC27714，Μ· hyoATCC27715和M.hyoATCC25934D。用于本發(fā)明實(shí)施方案的優(yōu)選的M.hyo株被認(rèn)為是 P-5722-3株，ATCC#55052, 1990年5月30日按照美國(guó)專利商標(biāo)局的要求的可獲得性規(guī)則進(jìn) 行了保藏?？紤]到疾病的廣泛傳播，還可以通過(guò)從受到在豬中引起支原體肺炎的已知株感 染的豬的肺分泌物或組織回收M.hyo獲得毒株。
[0086] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解M.hyo序列的變體可以被用在本發(fā)明的組合物中。這種 變體在序列同一性上可以有多達(dá)10-20%的變化，且仍然保留使其能夠用在免疫組合物中 的抗原特性。優(yōu)選地，M.hyo變體與野生型M.hyo株的全長(zhǎng)基因組序列具有至少80%、優(yōu)選 至少85 %、更優(yōu)選至少90 %、更優(yōu)選至少95 %的序列同一性。免疫組合物的抗原特性可以， 例如通過(guò)實(shí)施例中提供的攻毒試驗(yàn)進(jìn)行估計(jì)。而且，當(dāng)修飾的抗原提供與野生型M.hyo蛋 白相比至少70 %、優(yōu)選80 %、更優(yōu)選90 %的保護(hù)性免疫時(shí)，則修飾的M.hyo抗原的抗原特性 仍然保留。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施方案中，M.hyo可溶性p46抗原被包含在本發(fā)明的組合物中，其終濃度 為大約1. 5μg/ml至大約10μg/ml，優(yōu)選為大約2μg/ml至大約6μg/ml。應(yīng)當(dāng)注意p46 是用于M.hyo功效檢測(cè)的蛋白（參見(jiàn)下文的實(shí)施例部分）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，M.hyo抗 原可以以最終量為M.hyo全細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白A處理的上清的大約5. 5%至大約35%的量被 包含在組合物中。
[0088] 本發(fā)明的M.hyo可溶性制備物是安全的并且對(duì)于M.hyo是有效的，且適合于單次 劑量給藥。此外， 申請(qǐng)人:令人驚訝地發(fā)現(xiàn)M.hyo可溶性制備物可以有效地與來(lái)自其它病原 體的抗原組合，而在抗原之間沒(méi)有免疫干擾。這使得本發(fā)明的M.hyo可溶性制備物成為多 價(jià)疫苗的有效平臺(tái)。其它抗原可以與M.hyo組合物同時(shí)給藥（即作為單獨(dú)的單次疫苗）或 者組合成即用型疫苗的形式。
[0089] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種M.hyo可溶性抗原和 至少一種其它抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種其它抗原針對(duì)能在豬中引起疾病的微生 物提供保護(hù)。
[0090] 在一些實(shí)施方案中，至少一種其它抗原組分針對(duì)已知感染豬的細(xì)菌、病毒或原 生動(dòng)物提供保護(hù)。這種微生物的實(shí)例包括，但不限于下述種類：豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、 豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬細(xì)小病毒（PPV)、副豬嗜血桿菌（HaemophiIus parasuis)、多殺巴斯德菌（Pasteurellamultocida)、豬鏈球菌（Streptococcum suis)、豬葡萄球菌（Staphylococcushyicus)、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支氣管炎博德特菌（Bordetellabronchiseptica)、豬霍亂沙門 氏菌（Salmonellacholeraesuis)、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis)、豬紅斑 丹毒絲菌（Erysipelothrixrhusiopathiae)、豬鼻支原體（Mycoplamahyorhinis)、豬 滑液支原體（Mycoplasmahyosynoviae)、鉤端螺旋體細(xì)菌、胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia intracellularis)、豬流感病毒（SIV)、大腸桿菌抗原、豬痢疾短螺旋體（Brachyspira hyodysenteriae)、豬呼吸道冠狀病毒、豬流行性腹瀉（PED)病毒、輪狀病毒、細(xì)環(huán)病毒 (TTV)、豬巨細(xì)胞病毒、豬腸病毒、腦心肌炎病毒、奧杰士基氏病、典型性豬瘟（CSF)的致病 原和豬傳染性腸胃炎的致病原，或其組合。
[0091] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫組合物包含至少一種M.hyo可溶性抗原（例如 兩種或更多種）和PCV2抗原的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在豬中引發(fā)針對(duì)M.hyo 和PCV2二者的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的M.hyo/PCV2組合疫苗以單次劑量、單瓶即用型 疫苗的形式提供。這種即用型組合疫苗不需要混合單獨(dú)的疫苗，因此沒(méi)有污染的風(fēng)險(xiǎn)，沒(méi)有 混合工作所伴隨的額外勞動(dòng)，并且沒(méi)有在幾小時(shí)之內(nèi)使用混合物的要求。而且，單瓶M.hyo/ PCV2組合疫苗使廢料和冰箱儲(chǔ)存空間減半。而且，單次劑量給藥減少了對(duì)動(dòng)物進(jìn)行第二次 劑量給藥所伴隨的勞動(dòng)。應(yīng)當(dāng)注意，雖然PCV2/M.hyo組合疫苗目前已有，但它們是以兩次 劑量、即用型疫苗的形式（Circumvent?.PCVM)，或者需要同時(shí)進(jìn)行單獨(dú)疫苗的給藥的 單次劑量，2瓶疫苗的形式（例如IngeIvacCircoFLEX?:和IngeivacMycoFLEX?: )提供。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的M.hyo/PCV2組合與其它抗原（例如PRRS病毒抗原）相容， 從而使得所有抗原可以在單次劑量中給藥。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，M.hyo/PCV2組合疫苗的PCV2抗原組分是嵌合1型-2型圓 環(huán)病毒的形式。嵌合病毒包括滅活的表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的重組豬圓環(huán)病毒1 型。嵌合豬圓環(huán)病毒及其制備方法在WO03/049703A2還有美國(guó)專利Nos. 7, 279, 166和 7, 575, 752中描述，通過(guò)引用的方式將其全文合并入本文。
[0094] 在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合PCV1-2病毒的基因組的全長(zhǎng)DNA序列相應(yīng)于SEQID NO: 5或其變體，如下所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合PCV1-2病毒的免疫原性0RF2衣殼 基因相應(yīng)于SEQIDNO: 6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由嵌合PCV1-2病毒表達(dá)的免疫原性0RF2 蛋白的氨基酸序列相應(yīng)于SEQIDNO:7。
[0095]在又一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合PCV1-2病毒的基因組的全長(zhǎng)DNA序列相應(yīng)于SEQID N0:8。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合PCV1-2病毒的免疫原性0RF2衣殼基因相應(yīng)于SEQIDN0:9。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，由嵌合PCV1-2病毒表達(dá)的免疫原性0RF2蛋白的氨基酸序列相應(yīng)于 SEQIDNO:10。
[0096] 但是，嵌合PCV1-2病毒的PCV2 0RF2DNA和蛋白不限于上述序列，因?yàn)樵赑CV2分 離物中，PCV2 0RF2DNA和蛋白是高度保守的區(qū)域。
[0097] 在一些實(shí)施方案中，M.hyo/PCV2組合疫苗的PCV2抗原組分是重組0RF2蛋白的形 式。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組0RF2蛋白從桿狀病毒載體中表達(dá)?；蛘?，可以使用其它已知 的表達(dá)載體，例如包括，但不限于副痘病毒載體。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方案中，重組PCV2 0RF2蛋白的序列為SEQIDN0:11，其由SEQID N0:12(GenBankAccessionNo.AF086834)編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組0RF2蛋白的序 列為SEQIDNO: 13,其由SEQIDNO: 14編碼。在又一個(gè)實(shí)施方案中，重組0RF2蛋白相應(yīng) 于SEQIDN0:15。在再一個(gè)實(shí)施方案中，重組PCV2 0RF2蛋白相應(yīng)于SEQIDN0:7。在再 一個(gè)實(shí)施方案中，重組PCV2 0RF2蛋白相應(yīng)于SEQIDN0:10。
[0099] 但是，本發(fā)明不限于上述的特定的0RF2DNA和蛋白。因?yàn)樵赑CV2分離物中，PCV2 0RF2DNA和蛋白是高度保守的區(qū)域，任何PCV2 0RF2作為PCV2 0RF2DNA和/或多肽的來(lái) 源用在嵌合PCV1-2病毒中或重組PCV2蛋白中都極有可能是有效的。
[0100] 用于產(chǎn)生PCV2 0RF2DNA和蛋白序列的合適的PCV2分離物的實(shí)例是PCV2分離物 編號(hào)40895(2001年12月7日保藏于八了0：，指定的4了0：專利保藏命名為？了4-3914)。？(^2 分離物編號(hào)40895的基因組（核苷酸）序列可以從GenBank序列號(hào)AF264042獲得。用于 產(chǎn)生PCV2 0RF2DNA和蛋白序列的其它合適的PCV2分離物包括，但不限于下列種類：Imp. 9 99,Imp. 1010-Stoon,Imp. 1011-48121 和Imp. 1011-48285。相應(yīng)于這些PCV2 分離物的基因 組序列的GenBank序列號(hào)分別是AF055391,AF055392,AF055393 和AF055394。
[0101]PCV2 0RF2蛋白的免疫原性部分以某些形式被用做組合物中的抗原組分。例如， PCV2 0RF2蛋白的截短和/或取代形式可以用在本發(fā)明的組合物中。
[0102] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解PCV2序列的變體可以用在本發(fā)明的組合物中。這種變 體在序列同一性上可以有多達(dá)10-20%的變化，且仍然保留使其能夠用于免疫組合物中的 抗原特性。優(yōu)選地，PCV2變體與野生型PCV2分離物的全長(zhǎng)基因組序列具有至少80%、優(yōu)選 至少85 %、更優(yōu)選至少90 %、更優(yōu)選至少95 %的序列同一性。免疫組合物的抗原特性可以， 例如通過(guò)實(shí)施例中提供的攻毒試驗(yàn)進(jìn)行估計(jì)。而且，當(dāng)修飾的抗原提供與野生型PCV2 0RF2 蛋白相比至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%的保護(hù)性免疫時(shí)，則修飾的PCV2抗原的抗原特 性仍然保留。
[0103] 免疫原性組合物中提供的PCV2抗原組分以有效誘導(dǎo)所希望的免疫反應(yīng)，即減少 由PCV2感染導(dǎo)致的臨床癥狀的發(fā)病率或減輕其嚴(yán)重性的抗原包含水平存在。
[0104] 在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合PCV1-2病毒以至少1. 0 <RP< 5. 0的水平被包含在本發(fā) 明的組合物中，其中RP是由相對(duì)于參考疫苗進(jìn)行的ELISA抗原定量測(cè)定（體外功效檢測(cè)） 確定的相對(duì)功效單位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合PCV1-2病毒以大約0. 5 %至大約5 %的 20-倍（20X)濃縮體積的大量PCV1-2抗原的終濃度被包含在本發(fā)明的組合物中。
[0105] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2 0RF2重組蛋白以至少0. 2μg抗原/ml最終免疫原性 組合物的水平（yg/ml)被包含在本發(fā)明的組合物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2 0RF2重 組蛋白包含水平為大約〇. 2至大約400yg/ml。在又一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2 0RF2重組蛋白 包含水平為大約〇. 3至大約200yg/ml。在再一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2 0RF2重組蛋白包含水 平為大約〇. 35至大約100μg/ml。在再一個(gè)實(shí)施方案中，PCV2 0RF2重組蛋白包含水平為 大約0. 4至大約50μg/ml。
[0106] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種M.hyo可溶性抗原 (例如兩種或更多種）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)抗原和PRRS病毒抗原的組合。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，組合物在豬中引發(fā)針對(duì)M.hyo，PCV2和PRRS病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
[0107] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的M.hyo/PCV2/PRRS組合疫苗以單次劑量、2瓶疫 苗的形式提供。例如，在一些實(shí)施方案中，M.hyo/PCV2組合以第一瓶中的穩(wěn)定液體組合物 的形式提供，PRRS病毒以第二瓶中的凍干狀態(tài)提供。在一些實(shí)施方案中，其它的豬抗原可 以被加入到第一瓶或第二瓶中。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，PRRS病毒組分以凍干的、基因修飾的活病毒的形式提供。在 給藥之前，第一瓶中的M.hyo/PCV2液體形式可以被用來(lái)使第二瓶中的PRRS病毒再水化，以 使所有三種抗原可以以單次劑量給藥給動(dòng)物。應(yīng)當(dāng)注意，雖然PCV2/M.hyo/PRRS組合疫苗 目前已有，它們是以需要同時(shí)進(jìn)行三個(gè)單獨(dú)疫苗的給藥的單次劑量、3-瓶疫苗的形式提供 (例如IngelvacCircoFLEX?,IngelvacMycoFLEX?和Ingelvac?PRRSMLV)。
[0109]PRRS病原體首次在荷蘭被分離出來(lái)，并被命名為萊利斯塔德病毒。這種病毒在WO 92/21375(StichtingCentraalDiegeneeskundigInstituut)中描述，歐洲PRRS病毒的分 離物保藏在巴黎巴斯德研究院，保藏號(hào)為1-1102。北美類型幾乎是在歐洲類型病毒分離的 同時(shí)被分離出來(lái)，并在W0-93/03760(Collinsetal.)中描述，北美類型病毒的分離物包藏 在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)，保藏號(hào)為VR-2332。
[0110] 從歐洲和北美病毒類型中均分離出不同的毒株。WO93/07898(Akzo)描述了歐 洲毒株以及源自于它的疫苗，保藏在CNCM(巴斯德研究院），保藏號(hào)為1-1140。而且，WO 93/14196 (Rhone-Merieux)描述了在法國(guó)分離出的一種新毒株，保藏在CNCM(巴斯德研究 院），保藏號(hào)為1-1153。而且，EP0595436Bl(Solvay)描述了一種新的北美類型的毒株，t匕 最初描述的那種毒性更強(qiáng)，以及它的疫苗。該毒株已保藏于ATCC，但是在專利申請(qǐng)中沒(méi)有說(shuō) 明保藏編號(hào)。此外，ES2074950BA(CyanamidIberica)以及它的同族GB2282811B2描述 了一種所謂的"西班牙毒株"，其不同于其它的歐洲和北美毒株。這種"西班牙毒株"已被保 藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（EACCC)，保藏號(hào)為V93070108。
[0111] 用于本發(fā)明的M.hyo/PCV2/PRRS組合物中的合適的PRRS病毒抗原包括北美PRRS 病毒分離物、中國(guó)PRRS病毒株和歐洲PRRS病毒株，以及這些分離物/毒株的基因修飾版 本。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的組合物中的PRRS病毒抗原組分是北美PRRS病 毒。
[0112] 在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的組合物中的PRRS病毒抗原組分是被稱為P129 的北美PRRS病毒分離物或者它的活的、基因修飾的版本。優(yōu)選地，基因修飾的PRRS病毒不 能產(chǎn)生致病感染，但是能夠引發(fā)有效的針對(duì)野生型PRRS病毒感染的免疫保護(hù)反應(yīng)。
[0113] 用于本發(fā)明組合物的基因修飾的PRRS病毒可以從感染性克隆產(chǎn)生。被稱為P129 的北美PRRS病毒分離物的感染性cDNA克隆的制備在美國(guó)專利No. 6, 500, 662中描述，通 過(guò)引用將其完全合并入本文。P129cDNA的序列在Genbank序列號(hào)AF494042和美國(guó)專利 No. 6, 500, 662 中公開(kāi)。
[0114] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的P129的非-毒性形式的核苷酸序列由 SEQIDNO: 16表示。但是本發(fā)明不限于該序列。該序列和P129的其它非-毒性形式的序 列在2011年11月9日提交的國(guó)際申請(qǐng)NO.PCT/IB2011/055003中描述，通過(guò)引用將其全文 內(nèi)容（包括基于該國(guó)際申請(qǐng)?zhí)峤坏娜魏蚊绹?guó)國(guó)家階段申請(qǐng)）合并入本文。優(yōu)選地，PRRS病 毒被改造以防止干擾素-介導(dǎo)功能的下游調(diào)控。
[0115] 在其它實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物中的PRRS病毒抗原組分是被稱為ISU-55 的PRRS病毒分離物。ISU-55分離物保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)，保藏號(hào)為 VR2430。ISU-55分離物的0RF2至0RF5基因的核苷酸序列由SEQIDN0:17表示。ISU-55 分離物的0RF6和0RF7基因的核苷酸序列由SEQIDNO: 18表示。
[0116] 可以用在組合物中的另一種適合的北美PRRS病毒是ISU-12,其被保藏在ATCC， 保藏號(hào)為VR2385[3x空斑純化]和VR2386[無(wú)空斑純化]。還有其它可用在本發(fā)明組合物 中的適合的北美PRRS病毒分離物是下列的那些：ISU-51，ISU-3927,ISU-1894,ISU-22和 ISU-79,它們被保藏在ATCC，保藏號(hào)分別為VR2498,VR2431,VR2475,VR2429 和VR2474。這些 ISU分離物任一種的基因修飾版本可以用在本發(fā)明的組合物中。這些ISU分離物和ISU-55 分離物在下述Paul,etal的美國(guó)專利中進(jìn)行了詳細(xì)描述：US5,695,766,6,110,467,6,25 1, 397, 6, 251, 404, 6, 380, 376, 6, 592, 873, 6, 773, 908, 6, 977, 078, 7, 223, 854, 7, 264, 802, 7 ，264, 957,和7, 517, 976,通過(guò)引用的方式將所有這些專利的全文合并入本文。
[0117] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，用在根據(jù)本發(fā)明的組合物中的PRRS病毒抗原組分是 保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)，保藏號(hào)為VR-2332的北美類型或其基因修飾 版本。例如，PRRS病毒可以是基于被確定為ATCCVR2332的分離物的改造的活病毒， 其被用在BoehringerIngelheimVetmedica,Inc的INGEL/VAC?PRRSATP和 INGELVAC?PRRSMLV中。
[0118] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，用在本發(fā)明組合物中的PRRS病毒抗原是歐洲PRRS病毒分 離物或萊利斯塔德病毒或其基因修飾版本。適合的PRRS病毒株的實(shí)例被確定為上述的保 藏號(hào)1-1102。相應(yīng)于1-1102保藏物的核苷酸和氨基酸序列在Wensvoortetal的美國(guó)專 利no. 5, 620, 691中描述，通過(guò)引用將其完全合并入本文。歐洲PRRS病毒分離物或萊利斯 塔德病毒的感染性克隆的制備在美國(guó)專利No. 6, 268, 199中描述，通過(guò)引用將其完全合并 入本文。
[0119] 適合的PRRS病毒分離物的其它實(shí)例包括但不限于上述的那些。而且，PRRS病毒 分離物的活的、基因修飾的版本可以用在本發(fā)明組合物中。感染性克隆可以被用于再生產(chǎn) 這種活的基因修飾的生物體。
[0120] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，PRRS病毒序列的變體可以被用在本發(fā)明的組合物中。 這種變體在序列同一性上可以有多達(dá)10-20%的變化，且仍然保留使其能夠用于免疫組合 物中的抗原特性。優(yōu)選地，PRRS病毒變體與野生型PRRS病毒分離物的全長(zhǎng)基因組序列具 有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%的序列同一性。免疫組合 物的抗原特性可以，例如通過(guò)實(shí)施例中提供的攻毒試驗(yàn)進(jìn)行估計(jì)。而且，當(dāng)修飾的抗原提供 與野生型PRRS病毒抗原相比至少70 %、優(yōu)選80 %、更優(yōu)選90 %的保護(hù)性免疫時(shí)，則修飾的 PRRS病毒抗原的抗原特性仍然保留。
[0121] 在一個(gè)實(shí)施方案中，PRRS病毒抗原組分是基因修飾的活病毒，其以至少 2.I<TCID5tl < 5. 2的水平被包含在本發(fā)明的組合物中，其中TCID5tl是通過(guò)抗原定量測(cè)定 (體外功效檢測(cè)）確定的50 %組織培養(yǎng)物感染劑量。
[0122] 本發(fā)明的M.hyo/PCV2/PRRS組合物的PCV2抗原組分可以是嵌合1型-2型圓環(huán)病 毒的形式，嵌合病毒包括滅活的表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的重組豬圓環(huán)病毒1型。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的M.hyo/PCV2/PRRS組合物的PCV2抗原組分是重組0RF2蛋白 的形式。
[0123] 用于M.hyo/PCV2/PRRS組合物的適合的PCV2抗原可以是來(lái)自于任何上述的PCV2 分離物，以及其它PCV2分離物。用在本發(fā)明組合物中的適合的PCV2抗原包括，但不限于上 述的PCV2序列及其變體。
[0124] 本發(fā)明的疫苗可以遵循公認(rèn)的慣例進(jìn)行配制，以包含可接受的用于動(dòng)物，包括人 (如果適用的話）的載體，例如標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，穩(wěn)定劑，稀釋劑，防腐劑，和/或增溶劑，并且可 以配制成利于緩釋的形式。稀釋劑包括水，鹽水，右旋糖，乙醇，甘油等。等張?zhí)砑觿┯绕浒?括氯化鈉，右旋糖，甘露醇，山梨醇，乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白。其它合適的疫苗媒介物 和添加劑，包括那些特別用于配制修飾的活疫苗的，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的或 是顯而易見(jiàn)的。參見(jiàn)，例如，Remington'sPharmaceuticalScience, 18thed.，1990，Mack Publishing,其通過(guò)引用被合并入本文。
[0125] 本發(fā)明的疫苗可以進(jìn)一步包含尤其是一種或多種其它的免疫調(diào)節(jié)組分，例如佐劑 或細(xì)胞因子。用在本發(fā)明組合物中的合適的佐劑包括下述種類：水包油佐劑，聚合物和水 佐劑，油包水佐劑，氫氧化鋁佐劑，維生素E佐劑及其組合。佐劑的一些特定的實(shí)例包括，但 不限于，完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑，短小棒桿菌，卡介苗，氫氧化鋁凝膠，葡聚糖，硫酸 葡聚糖，氧化鐵，海藻酸鈉，Bacto-佐劑，特定的合成聚合物例如聚氨基酸和氨基酸共聚物， 嵌段共聚物（CytRx,Atlanta,Ga.)，QS_21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMass·)， SAF-M(Chiron,EmeryvilleCalif·)，AMPH丨GEN?佐劑，阜苷，QuilA或其它阜苷 級(jí)分，單磷酰脂質(zhì)A和阿夫立定（Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑（N,N-雙十八燒基-Ν'，Ν' 一二 (2-羥甲基）-丙二酰胺），〃REGRESSIN〃 (Vetr印harm,Athens,Ga.)，石蠟油，RIBI佐劑系統(tǒng) (RibiInc.，Hamilton,Mont.)，胞壁醜二膚等等。
[0126] 可用于本發(fā)明疫苗的水包油乳液包括改良的SEAM62和SEAM1/2制劑。改 良的SEAM62 是含有 5%(v/v)角鯊烯（Sigma)，1%(v/v)SPAN?85 去垢劑（ICI Surfactants)，0.7 % (v/v)TWEEN? 80 去垢劑（ICISurfactants)，2.5 % (v/v)乙 醇，ZOOygAilQuilAaOOyg/ml膽固醇，和0. 5% (v/v)卵磷脂的水包油乳液。改良的 SEAM1/2 是含有 5% (v/v)角鯊烯，1% (v/v)SPAN?85 去垢劑，0.7% (v/v)Tween80 去垢劑，2. 5% (v/v)乙醇，100yg/mlQuilA，和50yg/ml膽固醇的水包油乳液。
[0127] 可用于本發(fā)明組合物的佐劑的另一個(gè)實(shí)例是SP-油。如說(shuō)明書和權(quán)利要求中所 使用的，術(shù)語(yǔ)"SP油"是指包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，角鯊烯，聚氧乙烯山梨醇 酐單油酸酯，和緩沖鹽溶液的油狀乳液。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是表面活性劑， 幫助懸浮固體和液體組分。這些表面活性劑作為商品名為Pluronic?的聚合物是商業(yè) 可獲得的。優(yōu)選的表面活性劑是泊洛沙姆401，其是商業(yè)可獲得的，商品名為Pluronic? L-121。通常SP油乳液是免疫刺激佐劑混合物，其包含大約1-3%vol/vol的嵌段共聚物， 大約2-6%￥〇1八〇1的角藍(lán)烯，更特別是大約3-6%的角藍(lán)烯和大約0.1-0.5%￥〇1八〇1的 聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，其余為緩沖鹽溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，SP-油乳液在最終組 合物中以大約1 %至25%、優(yōu)選大約2%至15%、更優(yōu)選大約5%至12%v/v的量（v/v)存 在。
[0128] 用在本發(fā)明組合物中的合適佐劑的又一個(gè)實(shí)例是AMPHIGEN?佐劑，其由溶解在油 (通常是輕質(zhì)液體石蠟）中的脫脂卵磷脂組成。
[0129] 可用在本發(fā)明組合物中的其它佐劑的實(shí)例是下述的專有佐劑：Microsol DiluvacForte?，雙乳液佐劑系統(tǒng)，Emunade佐劑和Xsolve佐劑。Emunade和Xsolve佐劑 都是水包輕礦物油的乳液，但是Emunade還包含錯(cuò)膠,而d,l-α-生育酚乙酸酯是XSolve 佐劑的一部分。用在本發(fā)明組合物中的合適佐劑的又一個(gè)實(shí)例是ImpranFLEX?佐劑（油 包水佐劑）。合適佐劑的又一個(gè)實(shí)例是基于Carbomer(Carb〇p〇l?)的佐劑。優(yōu)選的Carbopol?佐劑包括Carbopol?934聚合物和Carbopol?941聚合物。
[0130] 在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑或佐劑混合物以每劑量大約100μg至大約IOmg的量被 加入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑/佐劑混合物以每劑量大約200μg至大約5mg的量被加 入。在又一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑/佐劑混合物以每劑量大約300μg至大約Img的量被加入。
[0131] 本發(fā)明疫苗組合物中典型存在的佐劑或佐劑混合物的量（v/v)為大約1 %至 25%，優(yōu)選大約2%至15%，更優(yōu)選大約5%至12%v/v。
[0132] 疫苗中可以包含的其它"免疫調(diào)節(jié)劑"包括，例如一種或多種白介素，干擾素或其 它已知的細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑可以是環(huán)糊精衍生物或聚陰離子聚合物，例如 美國(guó)專利No. 6, 165, 995和6, 610, 310中分別描述的。
[0133] 另一個(gè)方面涉及制備根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物的方法。該方法包括i)在合 適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)M.hyo 18-144小時(shí)的時(shí)間；ii)隨后滅活M.hyo培養(yǎng)物；iii)收獲滅活 培養(yǎng)液，其中滅活培養(yǎng)液包含M. hyo全細(xì)胞制備物，所述全細(xì)胞制備物包含可溶性液體級(jí) 分和不可溶細(xì)胞物質(zhì)；iv)從不可溶細(xì)胞物質(zhì)分離可溶性液體級(jí)分；以及V)從分離的可溶 性液體級(jí)分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫復(fù)合物。
[0134] 用于培養(yǎng)M.hyo的合適的培養(yǎng)基的實(shí)例是PPLO肉湯（支原體肉湯基礎(chǔ)），當(dāng)其添 加了營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化物質(zhì)時(shí)，可以用于分離和培養(yǎng)支原體。
[0135] 在一些實(shí)施方案中，M.hyo培養(yǎng)物生長(zhǎng)直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，然后培養(yǎng)物被滅活。在 一些其它的實(shí)施方案中，通過(guò)提高pH(例如達(dá)到大約7. 8)滅活培養(yǎng)物。通過(guò)將產(chǎn)生的培養(yǎng) 物暴露于滅活試劑，如二乙烯亞胺（BEI)使滅活發(fā)生。在生產(chǎn)培養(yǎng)物中L-溴乙胺氫溴酸鹽 (BEA)的溫育過(guò)程中原位生成BEI。隨后，滅活培養(yǎng)物的pH被中和，例如通過(guò)加入等量的中 和溶液中滅活試劑的試劑。在一些實(shí)施方案中，滅活試劑是BEI，中和試劑是硫代硫酸鈉。 在一個(gè)實(shí)施方案中，滅活培養(yǎng)物的pH通過(guò)加入硫代硫酸鈉被調(diào)節(jié)至大約7. 4。
[0136] 在一些實(shí)施方案中，使用傳統(tǒng)方法從不可溶細(xì)胞物質(zhì)分離M.hyo全細(xì)胞制備物的 可溶性液體級(jí)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種分離是通過(guò)過(guò)濾步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這 種分離是通過(guò)離心步驟。在又一個(gè)實(shí)施方案中，這種分離是通過(guò)沉淀步驟。
[0137] 在一個(gè)實(shí)施方案中，滅活的、中和的M.hyo全細(xì)胞制備物用蛋白A樹脂進(jìn)行處理以 基本上除去其中的IgG和抗原/免疫球蛋白免疫復(fù)合物。在其它實(shí)施方案中，蛋白G樹脂 可被用于基本上除去可溶性液體級(jí)分中含有的IgG和抗原/免疫球蛋白免疫復(fù)合物。用蛋 白A或蛋白G樹脂除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫復(fù)合物的方法是本領(lǐng)域公知的。
[0138] 根據(jù)另一個(gè)方面，制備根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物（例如疫苗）的方法包括制 備上述的可溶性M.hyo抗原，并將其與合適的佐劑和一種或多種藥學(xué)可接受的載體混合。 該方法任選地包括加入至少一種其它豬抗原，例如上述的PCV2抗原和/或PRRS病毒抗原。
[0139] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及試劑盒。"試劑盒"指組合在一起的多個(gè)組分。在一個(gè)實(shí) 施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括一個(gè)瓶（或其它合適的容器），其含有包含豬肺炎支原 體（Ehyo)全細(xì)胞制備物的可溶性部分的免疫原性組合物，其中Ehyo全細(xì)胞制備物的可 溶性部分基本不含（i)IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。任選地， 試劑盒可以進(jìn)一步包括使用說(shuō)明書。使用說(shuō)明書包括免疫原性組合物的給藥信息。
[0140] 在一些實(shí)施方案中，含有M.hyo全細(xì)胞制備物的可溶性部分的瓶進(jìn)一步包含PCV2 抗原。在一些實(shí)施方案中，瓶中的M.hyo/PCV2組合以即用型液體組合物的形式提供。
[0141] 在其它實(shí)施方案中，試劑盒包括第二個(gè)瓶，其包含PRRS病毒抗原。在一些實(shí)施方 案中，PRRS病毒抗原是基因修飾的活病毒的形式，其以凍干的狀態(tài)被提供。在這種例子中， 使用說(shuō)明書將會(huì)包含用含有M.hyo/PCV2組合的瓶中的液體內(nèi)容物使PRRS病毒再水化的說(shuō) 明。使用說(shuō)明書還將包含獲得的M.hyo/PCV2/PRRS三價(jià)制劑的給藥信息。
[0142] 在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物被給藥給具有源自母體的針對(duì) M.hyo的抗體的豬。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物被給藥給具有源自母體的 針對(duì)M.hyo和至少一種能在豬中引起疾病的其它微生物的抗體的豬。
[0143] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物，例如單價(jià)或多價(jià)疫苗，被給藥給3 周齡或更大的小豬。但是，所考慮的是，根據(jù)本發(fā)明的單價(jià)或多價(jià)疫苗還可以用于給配種前 的小母豬進(jìn)行再接種。如本領(lǐng)域所知道的，小母豬是從未懷孕過(guò)的雌性豬。接種的小母豬 會(huì)通過(guò)初乳將母體的抗體傳給哺乳期的新生幼崽。
[0144] 進(jìn)一步考慮的是，本發(fā)明的單價(jià)或多價(jià)疫苗可以用于每年給種豬群進(jìn)行再接種。 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的單價(jià)或多價(jià)疫苗以單次劑量被給藥給豬（例如小豬或小母豬）。在一 個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多價(jià)疫苗不需要在給藥前混合單獨(dú)的單價(jià)疫苗，即它以即用 型制劑的形式被提供。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)制劑需要將第一個(gè)瓶中包含的二價(jià)疫苗 和第二個(gè)瓶中包含的單價(jià)疫苗混合。任選地，其它的抗原可以被加入到這些瓶中的任一個(gè) 中。
[0145] 在一些實(shí)施方案中，免疫力的開(kāi)始是在用根據(jù)本發(fā)明的單價(jià)或多價(jià)疫苗組合物接 種后2-3周。在其它實(shí)施方案中，免疫力的持續(xù)時(shí)間為用根據(jù)本發(fā)明的單價(jià)或多價(jià)疫苗組 合物接種后大約17-23周。
[0146] 下述實(shí)施例描述了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選材料和程序。但是，應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例僅 以舉例說(shuō)明的方式被提供，其中任何內(nèi)容都不應(yīng)視為是對(duì)發(fā)明整個(gè)范圍的限制。 實(shí)施例
[0147] 實(shí)施例I:PCV2可組合M.hyo抗原的豬肺炎支原體產(chǎn)生方法
[0148]M.hyo發(fā)酵和滅活
[0149] 種子規(guī)模和抗原生產(chǎn)的培養(yǎng)基按下述制備。按照制造商的說(shuō)明（即21g/L)制備 豬心衍生的胸膜肺炎樣生物體（PPLO)肉湯（BDBiosciences目錄No. 21498)，并將酵母提 取物制備成21g/L，在USP中。然后將酵母提取物溶液以6. 25%的濃度加入到PPLO中，力口 熱至121°C并> 30分鐘使混合物滅菌。將鹽酸半胱氨酸制備成90g/L并過(guò)濾滅菌。在每 升USP水中加入450g右旋糖，然后加熱滅菌，制備右旋糖溶液。為了制備最終的培養(yǎng)基， 向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 %的豬血清，然后加入0.01 %的半胱氨酸和1.0 %的右旋糖。培 養(yǎng)基用10%v:v的豬肺炎支原體（P-5722-3株）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物接種。將培養(yǎng)物置于 37°C，并將pH和d0分別保持在7. 0和25%。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期，通過(guò)二乙烯亞胺（binary ethylenimine，ΒΕΙ)，一種由2-溴乙胺氫溴酸鹽產(chǎn)生的氮雜環(huán)丙烷化合物滅活使培養(yǎng)物滅 活。具體地，通過(guò)加入2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA)至終濃度為4mM并溫育24小時(shí)，將pH提高 至7.8來(lái)使滅活發(fā)生。通過(guò)以1:1的摩爾比加入硫代硫酸鈉并再溫育24小時(shí)來(lái)中和BEI。 滅活的培養(yǎng)液置于2-8°C直至進(jìn)一步處理。
[0150] 實(shí)施例2 :嵌合豬圓環(huán)病毒（cPCV) 1-2產(chǎn)生方法
[0151] 通過(guò)將致病性豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)的免疫原性衣殼基因克隆到非致病性豬圓 環(huán)病毒1型（PCVl)的基因組骨架中構(gòu)建CPCV1-2。嵌合DNA克隆的構(gòu)建過(guò)程例如在美國(guó) 專利No. 7, 279, 166中描述，通過(guò)引用將其全文合并入本文。嵌合病毒的感染性貯存物從 Dr.X.J.MengjVirginiaPolytechnicInstituteandStateUniversity,Blacksburg,VA 處獲得，并用于感染在添加了 〇. 05 %乳白蛋白水解物（LAH)，30μg/mL硫酸慶大霉素和5 % 胎牛血清的最小必需培養(yǎng)基（MEM)中生長(zhǎng)的豬腎（PK)-15細(xì)胞。得到的cPCVl-2感染的 PK-15細(xì)胞使用相同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基通過(guò)連續(xù)傳代4次進(jìn)行擴(kuò)增，除了培養(yǎng)基中含有2-3%胎 牛血清。第五次傳代被冷凍、融化和過(guò)濾，得到的裂解物被用于制備前主種子（pre-master seed)和后續(xù)的主種子。
[0152] 用于生產(chǎn)病毒種子的培養(yǎng)基與生產(chǎn)病毒貯存物中使用的一樣。對(duì)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基， MEM、0ptiMEM或等同物是可用于培養(yǎng)PK-15細(xì)胞系進(jìn)行生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可 以添加最多10%的牛血清，最多0. 5%的乳白蛋白水解物，最多0. 5%的牛血清白蛋白和最 多30μg/mL的慶大霉素。對(duì)于病毒繁殖培養(yǎng)基，使用MEM，OptiMEM或等同物。病毒繁殖培 養(yǎng)基可以添加最多〇. 5%的乳白蛋白水解物，最多2 %的牛血清，最多0. 5 %的牛血清白蛋 白和最多30μg/mL的慶大霉素。最多5g/L的葡萄糖和最多5mmol/L的L-谷氨酰胺可以 根據(jù)需要被加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基和/或病毒繁殖培養(yǎng)基中以維持細(xì)胞。
[0153]cPCVl-2主種子病毒被加入到PK-15細(xì)胞的細(xì)胞懸液中并吸附最多3小時(shí)。種子 病毒在生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中被稀釋以提供0. 1-0. 0001的感染復(fù)數(shù)（MOI)。
[0154]PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物在細(xì)胞種植時(shí)，或在細(xì)胞達(dá)到大約20%至50%匯合時(shí)用工作種 子病毒進(jìn)行最初的接種。這種最初的傳代可以被稱為"一步感染法"，用于產(chǎn)生抗原貯存物， 或者可以被進(jìn)一步用于連續(xù)傳代。對(duì)于連續(xù)傳代，cPCVl-2感染的PK-15細(xì)胞通過(guò)以1:5-20 的比例連續(xù)分裂被進(jìn)一步擴(kuò)增到第7代以進(jìn)行病毒繁殖。含有來(lái)自于上一代的感染細(xì)胞 懸液的培養(yǎng)物培養(yǎng)基作為下一代的種子物。每一代的cPCVl-2感染的細(xì)胞在36±2°C溫育 3-14天直至細(xì)胞達(dá)到彡90%匯合。在病毒復(fù)制過(guò)程中，cPCVl-2病毒引起可觀察到的細(xì)胞 病性改變。收獲時(shí)，觀察到細(xì)胞變圓以及相當(dāng)多的漂浮的碎片。還觀察到培養(yǎng)物被細(xì)菌或 真菌污染的可見(jiàn)證據(jù)。cPCV抗原的收獲之間的溫育時(shí)間在下述的表1中提供：
[0155]表1收獲cPCV抗.原的最fa.和最長(zhǎng)時(shí)間
【權(quán)利要求】
1. 一種免疫原性組合物，其包含豬肺炎支原體（M. hyo)全細(xì)胞制備物的可溶性部分， 其中所述M.hyo制備物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原與免疫球蛋白結(jié)合 形成的免疫復(fù)合物。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述可溶性部分在被加入到所述免疫原性組合物中之前 已用蛋白-A或蛋白-G進(jìn)行處理。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中所述M. hyo制備物的可溶性部分包含至少 一種M. hyo蛋白抗原。
4. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述M. hyo制備物的可溶性部分包含兩種或更多種 M. hyo蛋白抗原。
5. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種其它抗原。
6. 權(quán)利要求5的組合物，其中所述至少一種其它抗原針對(duì)能在豬中引起疾病的微生物 提供保護(hù)。
7. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述微生物包含細(xì)菌、病毒或原生動(dòng)物。
8. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述微生物選自豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁 殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬細(xì)小病毒（PPV)、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)、多殺巴斯德菌（Pasteurella multocida)、豬鏈球菌（Streptococcum suis)、豬葡萄球菌（Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙門 氏菌（Salmonella choleraesuis)、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis)、豬紅斑 丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、豬鼻支原體（Mycoplama hyorhinis)、豬 滑液支原體（Mycoplasma hyosynoviae)、鉤端螺旋體細(xì)菌、胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia intracellularis)、豬流感病毒（SIV)、大腸桿菌抗原、豬痢疾短螺旋體（Brachyspira hyodysenteriae)、豬呼吸道冠狀病毒、豬流行性腹瀉（PED)病毒、輪狀病毒、細(xì)環(huán)病毒 (TTV)、豬巨細(xì)胞病毒、豬腸病毒、腦心肌炎病毒、奧杰士基氏病、典型性豬瘟（CSF)的致病 原和豬傳染性腸胃炎的致病原，或其組合。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述至少一種其它抗原是豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)抗原、 PRRS病毒抗原或其組合。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物引發(fā)針對(duì)M. hyo和PCV2的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
11. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物在豬中引發(fā)針對(duì)M. hyo、PCV2和PRRS病毒 的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
12. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述PCV2抗原是嵌合1型-2型圓環(huán)病毒的形式，所述 嵌合病毒含有滅活的表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的重組豬圓環(huán)病毒1型。
13. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述PCV2抗原是重組0RF2蛋白的形式。
14. 權(quán)利要求13的組合物，其中所述重組0RF2蛋白從桿狀病毒載體表達(dá)。
15. 權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含佐劑。
16. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述佐劑選自水包油佐劑、聚合物和水佐劑、油包水佐 齊?、氫氧化鋁佐劑、維生素 E佐劑及其組合。
17. 權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體。
18. 權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物當(dāng)以單次劑量給藥的形式進(jìn)行 給藥時(shí)，引發(fā)針對(duì)M. hyo的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
19. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物當(dāng)以單次劑量給藥的形式進(jìn)行給藥時(shí)，引發(fā) 針對(duì)M. hyo和至少一種能在豬中引起疾病的其它微生物的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
20. -種免疫豬抵抗豬肺炎支原體（M. hyo)的方法，包括給豬施用權(quán)利要求1的組合 物。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述組合物被肌內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮或皮下給藥。
22. 權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物以單次劑量的形式給藥。
23. 權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)的方法，其中所述M. hyo制備物的可溶性部分含有至少一 種M. hyo蛋白抗原。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述組合物與至少一種其它抗原共同給藥，所述至少一 種其它抗原針對(duì)能在豬中引起疾病的微生物提供保護(hù)。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述微生物選自豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁 殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬細(xì)小病毒（PPV)、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)、多殺巴斯德菌（Pasteurella multocida)、豬鏈球菌（Streptococcum suis)、豬葡萄球菌（Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙門 氏菌（Salmonella choleraesuis)、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis)、豬紅斑 丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、豬鼻支原體（Mycoplama hyorhinis)、豬 滑液支原體（Mycoplasma hyosynoviae)、鉤端螺旋體細(xì)菌、胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia intracellularis)、豬流感病毒（SIV)、大腸桿菌抗原、豬痢疾短螺旋體（Brachyspira hyodysenteriae)、豬呼吸道冠狀病毒、豬流行性腹瀉（PED)病毒、輪狀病毒、細(xì)環(huán)病毒 (TTV)、豬巨細(xì)胞病毒、豬腸病毒、腦心肌炎病毒、奧杰士基氏病、典型性豬瘟（CSF)的致病 原和豬傳染性腸胃炎的致病原，或其組合。
26. 權(quán)利要求20至25任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物被給藥給具有來(lái)自母體的M. hyo 抗體的豬。
27. 權(quán)利要求24的方法，其中所述組合物被給藥給具有來(lái)自母體的針對(duì)M. hyo和至少 一種能在豬中引起疾病的其它微生物的抗體的豬。
28. 權(quán)利要求20至27任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物被給藥給3周齡或更大的豬。
29. -種試劑盒，其包含： 含有免疫原性組合物的瓶，所述免疫原性組合物包含豬肺炎支原體（M. hyo)全細(xì)胞制 備物的可溶性部分，其中所述M. hyo制備物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗 原與免疫球蛋白結(jié)合形成的免疫復(fù)合物。
30. 權(quán)利要求29的試劑盒，進(jìn)一步包括含有免疫原性組合物給藥信息的使用說(shuō)明書。
31. -種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括： i) 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)M. hyo 18-144小時(shí)的時(shí)間； ii) 隨后滅活所述M. hyo培養(yǎng)物； iii) 收獲滅活的培養(yǎng)液，其中所述滅活的培養(yǎng)液包含M. hyo全細(xì)胞制備物，所述全細(xì) 胞制備物包含可溶性液體級(jí)分和不可溶細(xì)胞物質(zhì)； iv) 從不可溶細(xì)胞物質(zhì)分離可溶性液體級(jí)分； V)從分離的可溶性液體級(jí)分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫復(fù)合物。
【文檔編號(hào)】A61K39/12GK104271154SQ201380023655
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月4日
【發(fā)明者】J·E·高爾文, G·P·尼采爾, J·K·加勒特, J·R·Ii·庫(kù)拉維克, T·L·里克, M·M·斯馬茨爾 申請(qǐng)人:碩騰有限責(zé)任公司