用于胰腺癌患者的dna疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及含編碼VEGF受體蛋白的重組DNA分子的減毒的沙門氏菌突變菌株。特別地，本發(fā)明涉及所述減毒的沙門氏菌突變菌株在癌癥免疫療法中的使用。
【專利說明】用于胰腺癌患者的DNA疫苗

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及含編碼VEGF受體蛋白質(zhì)的重組DNA分子的減毒的沙門氏菌的突變菌 株。特別地，本發(fā)明涉及所述減毒的沙門氏菌突變菌株在癌癥免疫療法中的應用。

【背景技術】
[0002] 沙門氏菌的減毒衍生物是用于將異種抗原，例如腫瘤抗原或腫瘤基質(zhì)抗原，遞送 至哺乳動物免疫系統(tǒng)的有吸引力的載體。可潛在地通過免疫的粘膜路線，如經(jīng)口或經(jīng)鼻地， 遞送沙門氏菌菌株，這相對于腸胃外給藥提供了簡單和安全的優(yōu)勢。此外，沙門氏菌菌株在 全身和粘膜的隔室的水平上引起強烈的體液和細胞免疫反應。批量制備成本相對較低且活 菌疫苗的配方是高度穩(wěn)定的?？赏ㄟ^包括毒性、調(diào)控和代謝基因的多種基因的缺失實現(xiàn)減 毒。
[0003] 通過aro突變減毒的多種鼠傷寒沙門氏菌菌株已顯示是動物模型中的異種抗原 的安全有效的遞送載體。
[0004] WO 03/073995中描述了通過活的減毒的鼠傷寒沙門氏菌菌株將編碼抗原特別 是VEGF受體蛋白質(zhì)的DNA構建體遞送至小鼠革El細胞的方法。Niethammer等人（Nature Medicine 2002,8(12),1369)描述了含編碼小鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR-2或 FLK-1)的表達載體的減毒的鼠傷寒沙門氏菌aroA菌株SL7207和它作為癌癥疫苗的用途。
[0005] 然而，僅有一種減毒的腸道沙門氏菌血清型菌株，即血清型腸道傷寒沙門氏菌 Ty21a(簡稱：傷寒沙門氏菌Ty21a)已被接受用于人類。
[0006] 這種抗傷寒癥的耐受性良好、活的口服疫苗是由野生型致命細菌隔離種群鼠傷寒 沙門氏菌Ty2的化學誘變衍生而來并在galE基因中包含功能缺失突變，和其它較少定義的 突變。在實地測試中顯示有效和安全后，它在許多國家已被批準作為傷寒疫苗。
[0007] 血管生成有助于實性腫瘤生長和轉移?；衔锶缲惙慰梗╞evacizumab)和其 它的化合物，例如小分子如專門針對腫瘤新生血管的舒尼替尼和阿西替尼，已顯示對一 系列腫瘤指征有效（Powles 等人，Br J Cancer 2011，104(5) :741-5 ;Rini 等人，Lancet 2011，378:1931-1939)。
[0008] 腫瘤新生血管內(nèi)襯過度表達血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR) 2且易通過血流 可進入的內(nèi)皮細胞。這些細胞的遺傳穩(wěn)定性和它們的每個內(nèi)皮細胞支持數(shù)百個腫瘤 細胞的能力使它們成為抗腫瘤治療的主要靶標，通過抗體、酪氨酸激酶抑制劑或疫苗 (Augustin, Trends Pharmacol Sci 1998,19:216 - 222)。最近，基于 T 細胞的免疫療法已 在前列腺癌癥中取得了一些臨床的成功并證實了抗癌疫苗的可能性，這往往在臨床前表現(xiàn) (Sharma等人，Nat Rev Cancer 2011,11:805-812)。激活抗癌細胞的免疫系統(tǒng)面臨多重挑 戰(zhàn)。例如，癌性病變通常為多細胞系的且癌細胞具有突變的傾向?？乖禺惎煼ㄍǔＶ粚?致選擇攜帶非抗原的細胞。進一步的障礙包括腫瘤包膜（tumor encapsulation)和MHC分 子的損失或下調(diào)。以腫瘤新生血管為靶向的接種疫苗方法應在理論上克服這些障礙。
[0009] 發(fā)明目的
[0010] 鑒于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的一個目的是提供新型的安全的口服的靶向VEGF受體的 癌癥疫苗。這樣的靶向VEGF受體的癌癥疫苗將提供增加癌癥患者治療選擇的主要優(yōu)勢。
[0011] 發(fā)明概沐
[0012] 本發(fā)明使抗血管生成治療和使用新型疫苗（VXMOl)靶向VEGFR-2的疫苗接種 相結合，所述新型疫苗（VXMOl)是含編碼VEGF受體蛋白2的質(zhì)粒的減毒的和重組的 (reengineered)傷寒沙門氏菌菌株Ty21a菌株。
[0013] VXMOl代表不靶向存在于腫瘤細胞的抗原，而是靶向由腫瘤新生血管的非惡性內(nèi) 皮細胞過度表達的、存在于腫瘤基質(zhì)的抗原的新型策略。
[0014] 通過靶向遺傳穩(wěn)定和易于進入的內(nèi)皮細胞，本產(chǎn)品旨在克服直接以腫瘤細胞為靶 向的疫苗先前所遇到的限制，如腫瘤細胞異質(zhì)性、MHC損失、細胞水平的免疫抑制、腫瘤包膜 和生理屏障如血腦屏障。此外，由于所述治療靶標獨立于腫瘤類型，所述疫苗可潛在地具 有抗多種不同實體惡性腫瘤活性。所述產(chǎn)品代表獨立于患者的、現(xiàn)成的（off-the-shelf) 口服疫苗，其可被儲存和分配給臨床站點以供使用。而抗血管生成治療，無論是通過小 分子或抗體，已被證明是有效的。根據(jù)本發(fā)明的方法的顯著不同在于激活患者自身抗 腫瘤新生血管的免疫系統(tǒng)并照此潛在地產(chǎn)生提供長期功效的T細胞記憶效應。用貝伐 單抗在結腸癌和卵巢癌方面的研宄表明，需要持續(xù)的抗血管生成的壓力以保持長期有 益的治療作用（Allegra 等人，J Clin Oncol 2011，29:11-16 ;Burger 等人，N Engl J Med2011,365:2473-2483 ;Perren et al·，N Engl J Med 2011,365:2484-2496)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明人的知識，這是第一次口服癌癥疫苗的臨床試驗。此外，所述疫苗具有 有效抗多個腫瘤類型的潛能。
[0016] 所述第一次臨床試驗已顯示，根據(jù)本發(fā)明的疫苗（VXMOl)在激發(fā)顯著影響患者腫 瘤生長的免疫響應方面是非常有效的。值得注意的和令人驚奇的是該免疫響應可由口服 非常低劑量的VXMOl引發(fā)。所述疫苗在以IX IO5或IX 10 6至IX 10 7菌落形成單位（CFU) 的起始劑量是有效的。首次結果表明，用VXMOl的疫苗接種可導致現(xiàn)有的腫瘤血管破壞 (breakdown)且可支持針對增殖內(nèi)皮細胞的免疫記憶的發(fā)展。
[0017] 所述疫苗在單獨治療中以及在與標準的化療劑、放療和/或生物癌癥治療的聯(lián)合 治療中是有效的。
[0018] 在目前的臨床實驗中，IV期患者被提前和/或與化療劑吉西他濱和VXMOl同時治 療。然而，用VXMOl的治療也是有效的，如果所述患者已形成對化學療法的抗性（化療難治 性患者）。
[0019] 在一個方面，本發(fā)明涉及作為疫苗使用的，含至少一個拷貝的、包含編碼VEGF受 體蛋白的表達組件的重組DNA分子的減毒的傷寒沙門氏菌突變菌株。
[0020] 在特別的實施方案中，所述VEGF受體蛋白選自由人類VEGFR-2和與其具有至少約 80%同源性的其同族體組成的組。
[0021] 在特別的實施方案中，所述VEGF受體蛋白是具有如SEQ ID NO 1的氨基酸序列的 人類 VEGFR-2。
[0022] 在另一方面，本發(fā)明涉及含本發(fā)明的減毒的傷寒沙門氏菌的突變菌株的DNA疫 苗。
[0023] 在特別的實施方案中，所述減毒的傷寒沙門氏菌突變菌株為傷寒沙門氏菌Ty2la。
[0024] 在特別的實施方案中，所述表達組件為真核表達組件。
[0025] 在特別的實施方案中，本發(fā)明的所述DNA疫苗用于癌癥免疫療法中。
[0026] 在特別的實施方案中，所述DNA疫苗包含由含編碼SEQ ID NO 1的VEGFR-2蛋白 的DNA的質(zhì)粒轉化的減毒的傷寒沙門氏菌菌株Ty21a。
[0027] 在特別的實施方案中，所述DNA疫苗用在抗血管生成的癌癥免疫療法中。
[0028] 在特別的實施方案中，所述質(zhì)粒為如在圖2中描述的7580bp pVAXIO. VR2-1并具 有如在SEQ ID NO 3中提供的序列且所述DNA疫苗表示為VXM01。
[0029] 在特別的實施方案中，所述癌癥為胰腺癌。
[0030] 在特別的實施方案中，所述胰腺癌為IV期或局部晚期胰腺癌。
[0031 ] 在特別的實施方案中，所述癌癥包括轉移性腫瘤。
[0032] 在特別的實施方案中，通過化學療法和/或放射療法完成所述治療。
[0033] 在特別的實施方案中，所述化療劑為吉西他濱。
[0034] 在特別的實施方案中，在所述化學療法治療周期內(nèi)實施用所述疫苗的所述免疫治 療。
[0035] 在特別的實施方案中，所述疫苗是口服施用的。
[0036] 在特別的實施方案中，所述疫苗的單次劑量為lx 105、lxl06、lxl07、lxl08、lxl0 9、 IxlOici或1x10 11菌落形成單位（CFU)。
[0037] 在特別的實施方案中，所述疫苗的單次劑量少于1x109CFU。在特別的實施方案中， 所述疫苗的單次劑量為從Ixio 8至Ixio 9CFU。
[0038] 在特別的實施方案中，所述疫苗的單次劑量少于1x108CFU。在特別的實施方案中， 所述疫苗的單次劑量為從Ixio 5至Ixio 8CFU,更特別地，所述疫苗的單次劑量為從IxlO6至 IxlO7CFU0
[0039] 在特別的實施方案中，所述單次劑量包含從約IO5至約10 11，特別地從約IO6至約 101°,更特別地從約IO 6至約10 9,更特別地從約IO6至約10 8,最特別地從約IO6至約10 7菌 落形成單位（CFU)。
[0040] 在另一方面，本發(fā)明涉及所述DNA疫苗VXM01，其包含由含編碼SEQ ID NO 1的 VEGFR-2蛋白的DNA的質(zhì)粒轉化的減毒的傷寒沙門氏菌菌株Ty21a，其中所述質(zhì)粒為7580bp 質(zhì)粒DNA并包含在CMV啟動子控制下的VEGFR-2的cDNA、卡那霉素抗性基因和pMBlori，并 被表示為 pVAXIO. VR2-1。
[0041] 發(fā)明詳沐
[0042] 可參考下面本發(fā)明的詳細描述和其中包括的實施例更容易地理解本發(fā)明。
[0043] 在一個方面，本發(fā)明涉及含至少一個拷貝的、包含編碼VEGF受體蛋白的表達組件 的重組DNA分子的的減毒的傷寒沙門氏菌突變菌株。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，所述減毒的傷寒沙門氏菌突變菌株作為含編碼VEGF受體蛋白的表 達組件的重組DNA分子的細菌載體起作用，用于將所述重組DNA分子輸送至靶細胞。
[0045] 在本發(fā)明的情況下，術語"減毒的"是指相對于親本細菌菌株毒性下降的細菌菌 株，不包含所述減毒突變。減毒的細菌菌株優(yōu)選已喪失它們的毒性但保持它們的誘導保護 性免疫的能力?？赏ㄟ^多種基因包括毒性、調(diào)控和代謝基因的缺失完成所述減毒。減毒的 細菌可天然存在或它們可在實驗室中人工產(chǎn)生，例如通過適應新的介質(zhì)或細胞培養(yǎng)或它們 可通過重組DNA技術產(chǎn)生。
[0046] 在本發(fā)明的情況下，術語"突變菌株"指在它的基因組中含突變的菌株。在該情況 下，術語"突變"指核酸序列的變化，包括點突變、插入、缺失、易位和倒位。
[0047] 在本發(fā)明的情況下，術語"包含（comprises) "或"包含（comprising) "意思是"包 含，但不限于"。所述術語規(guī)定為開放式的，以列舉任何闡明特征、元素、整數(shù)、步驟或組件 的存在，但不是為了排除一種或多種其它特征、元素、整數(shù)、步驟、組件或它的組的存在或添 加。術語"包含"因此包括更限制性的術語"由…組成（consisting of)"和"基本由…組 成（essentially consisting of)"。在一個實施方案中，在整個申請中和特別是在權利要 求中所用的術語"包含"可被術語"由…組成（consisting of)"替代。
[0048] 在本發(fā)明的情況下，術語"重組DNA分子"指工程化的DNA構建體，優(yōu)選由不同來 源的DAN片段組成。所述重組DNA分子可為線性核酸，或優(yōu)選地，通過將編碼VEGF受體蛋 白的開放讀碼框引入表達載體質(zhì)粒而產(chǎn)生的環(huán)狀重組DNA質(zhì)粒。
[0049] 在本發(fā)明的情況下，術語"表達組件"指在在控制其表達的調(diào)控序列的控制下至少 包含VEGF受體蛋白的核酸單元。包含在減毒的沙門氏菌突變菌株中的所述表達組件可優(yōu) 選介導所包括的編碼VEGF受體蛋白的開放讀碼框在靶細胞中的轉錄。表達組件通常包括 啟動子、至少一個開放讀碼框和轉錄終止信號。
[0050] VEGF受體蛋白是可被配體受血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)結合的內(nèi)皮細胞特異性受 體酪氨酸激酶，所述配體VEGF導致它們二聚化并通過轉磷酸作用激活。生長因子的VEGF 家族包括6個家族成員，VEGF-A (也稱為VEGF)至E和PLGF (胎盤生長因子，也稱為PGF或 PIGF-2)。VEGF生長因子調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)，特別是血管和淋巴管的多個組分的生長和分化。 VEGFR 有三個主要的子類型，VEGFR-I (或 FLTl)，VEGFR-2 (或 KDR、FLKl)和 VEGFR-3 (或 FLT4)。膜結合的VEGF受體具有由7個免疫球蛋白樣結構域組成的胞外部分、單一的跨膜 區(qū)和含分離的酪氨酸激酶結構域的細胞內(nèi)部分。VEGFR轉錄本也產(chǎn)生編碼可溶的VEGF受體 蛋白的選擇性剪接變體。
[0051] VEGFR-2,也稱為含激酶插入結構域的受體（KDR)，似乎介導幾乎所有已知的對 VEGF的細胞響應。例如，在血管生成中VEGF的作用似乎通過該蛋白質(zhì)與VEGFR-2的相 互作用介導。VEGFR-2是一個1356個氨基酸長、200-230kDa分子量的VEGF和VEGF-C和 VEGF-D的高親和受體。通過酪氨酸蛋白激酶受體的內(nèi)皮細胞cDNA的篩選在人類中的鑒定， VEGFR-2與先前發(fā)現(xiàn)的小鼠胎肝激酶I (Flk-I)具有85%的序列一致性。VEGFR-2在內(nèi)皮和 造血前體細胞內(nèi)，以及在內(nèi)皮細胞、新生的造血干細胞和臍帶基質(zhì)內(nèi)正常表達。然而，在靜 態(tài)成人血管中，VEGFR-2mRNA出現(xiàn)下調(diào)。
[0052] VEGFR-2的胞外域包含18個潛在的N-連接的糖基化位點。VEGFR-2被初始合成 為150kDa蛋白質(zhì)并被快速糖基化為200kDa的中間體，然后以較低速率進一步糖基化為在 細胞表面表達的成熟的230kDa蛋白質(zhì)。
[0053] 克隆入pVAXIO. VR2-1質(zhì)粒的編碼人類VEGFR-2的氨基酸序列的cDNA序列顯示在 圖1中。
[0054] 在特別的實施方案中，本發(fā)明的所述傷寒沙門氏菌的減毒的突變菌株作為藥劑使 用。
[0055] 在特別的實施方案中，本發(fā)明的所述傷寒沙門氏菌的減毒的突變菌株作為疫苗使 用。
[0056] 在本發(fā)明的情況下，術語"疫苗"指能夠在實施后在受試者體內(nèi)誘導免疫響應的 劑。疫苗可優(yōu)選預防、減輕或治療疾病。根據(jù)本發(fā)明的疫苗包含傷寒沙門氏菌的減毒的突 變菌株，優(yōu)選傷寒沙門氏菌Ty21a。本發(fā)明的疫苗進一步包含至少一個拷貝的、含表達組件 的重組DNA分子，所述表達組件優(yōu)選真核表達組件，其編碼VEGF受體蛋白，優(yōu)選選自人類 VEGFR-2或與其具有至少80%序列一致性的蛋白質(zhì)。
[0057] 含編碼VEGF受體蛋白的重組DNA分子的根據(jù)本發(fā)明的所述活的減毒的沙門氏菌 突變菌株可用作為口服遞送該重組DNA分子的載體。這樣的含編碼異種抗原例如VEGF受 體蛋白的DNA分子的遞送載體被稱作DNA疫苗。
[0058] 基因免疫相對于傳統(tǒng)接種疫苗可能是有利的。所述靶DNA可在相當長的時間內(nèi)被 檢測，因此充當抗原庫。在一些質(zhì)粒中的序列基序，如GpC島，是免疫刺激的并可作為由LPS 和其他細菌成分的免疫刺激促進的佐劑起作用?；罴毦d體產(chǎn)生它們自己的免疫調(diào)節(jié)因 子，例如原位脂多糖（LPS)，其可構成相對于其它施用形式的例如微型膠囊的優(yōu)勢。此外，天 然進入途徑的使用證明是有益的，因為多種細菌，例如沙門氏菌，通過派伊爾氏淋巴集結的 M細胞從腸腔出來并最終移入淋巴結和脾，從而允許疫苗對免疫系統(tǒng)的誘導位點的靶向。
[0059] 此外，腸道沙門氏菌的減毒的衍生物作為哺乳動物免疫系統(tǒng)異種抗原的遞送載體 是有吸引力的，因為腸道沙門氏菌菌株可潛在地通過粘膜路徑，即經(jīng)口或經(jīng)鼻地，遞送，這 提供相對于腸胃外施用的簡單和安全的優(yōu)勢。此外，沙門氏菌菌株在全身和粘膜隔室的水 平上引起強的體液和細胞免疫響應。
[0060] 在特別的實施方案中，傷寒沙門氏菌的減毒的突變菌株為傷寒沙門氏菌Ty21a。所 述疫苗株Ty21a迄今為止已被證實具有優(yōu)異的安全性。當通過M細胞從腸腔中出來時，所述 細菌被吞噬細胞如巨噬細胞和樹突細胞吞噬。這些細胞被病原體激活并開始分化，并可能 移動，至淋巴結和脾。由于減毒突變，傷寒沙門氏菌Ty21a菌株不能在這些吞噬細胞中存活 而是死在這個時間點。所述重組DNA分子被釋放并隨后轉至所述吞噬免疫細胞的胞液中， 通過特定的運輸系統(tǒng)或通過胞內(nèi)吞體泄漏（endosomal leakage)。最后，所述重組DNA分子 進入細胞核，在這里它們被轉錄，引起在吞噬細胞的胞液中的VEGF受體表達。通過活化抗 原遞呈細胞（APCs)誘導針對VEGFR受體蛋白的特異性細胞毒性T細胞。
[0061] 迄今為止沒有可表明傷寒沙門氏菌Ty21a能夠進入全身血流的數(shù)據(jù)。所述活的減 毒的傷寒沙門氏菌Ty21a疫苗菌株因此允許所述免疫系統(tǒng)的特異性靶向，同時顯示出優(yōu)異 的安全性。
[0062] 在特定的實施方案中，所述VEGF受體蛋白選自由人類VEGFR-2和與其具有至少約 80%同源性的其同族體組成的組。
[0063] 關于這點，術語"約（about) "或"大約（approximately) "指在80%至120%內(nèi)， 或者在90%至110%內(nèi)，包括在95%至105%內(nèi)的一給定值或范圍。
[0064] 在本發(fā)明的上下文中，術語"與人類VEGFR-2具有至少約80%序列一致性的蛋白 質(zhì)"指在氨基酸序列和/或編碼人類VEGFR-2氨基酸序列的核酸序列方面不同的蛋白質(zhì)。 所述蛋白質(zhì)可為天然來源的，例如不同物種的VEGFR-2的同族體，或工程蛋白，例如工程化 的VEGFR-2衍生物。已知物種間的密碼子的使用是不同的。因此，當在靶細胞中表達異種 蛋白時，使所述核酸序列適應靶細胞的密碼子的使用可能是必需的，或至少是有用的。定義 或構造給定蛋白質(zhì)的衍生物的方法是本領域任一個普通技術人員已知的。
[0065] 與人類VEGFR-2具有至少約80%序列一致性的蛋白質(zhì)可包含一種或多種突變，所 述突變包含一個或多個氨基酸的增加、缺失和/或替換。根據(jù)本發(fā)明的教導，所述缺失、增 加和/或替換的氨基酸可為連續(xù)的氨基酸和/或散布于所述與人類VEGFR-2具有至少約 80%序列一致性的蛋白質(zhì)的整個氨基酸序列長度中。根據(jù)本發(fā)明的教導，多個氨基酸可被 增加、缺失和/或替換，只要與人類VEGFR-2的序列一致性為至少約80%。在特定的實施方 案中，所述與人類VEGFR-2的序列一致性為至少約80%，至少約85%，至少約90%，或最特 別地至少約95%。包括對比親代蛋白質(zhì)和相對于親代序列具有缺失、增加和/或替換的其 衍生物的用于確定序列一致性的方法和算法是本領域普通技術人員從業(yè)者已知的。在DNA 水平，編碼與人類VEGFR-2具有至少約80%序列一致性的蛋白質(zhì)的核酸序列可能在很大程 度上不同，由于遺傳密碼的簡并性。
[0066] 在特定的實施方案中，所述VEGF受體蛋白是具有如在SEQ ID NO 1中提供的氨基 酸序列的人類VEGFR-2。
[0067] 在另一方面，本發(fā)明涉及含本發(fā)明的所述傷寒沙門氏菌的減毒的突變菌株的DNA 疫苗。
[0068] 在特定的實施方案中，所述傷寒沙門氏菌的減毒的突變菌株為傷寒沙門氏菌 Ty21a。所述減毒的傷寒沙門氏菌Ty21a菌株為Typhoral ?Λ又名Vivotifw (由Berna生 物技術股份有限公司制造，Crucell公司，瑞士）的活性成分。這是目前唯一被批準的抗傷 寒癥的活的口服疫苗。所述疫苗已被廣泛測試并被證明對于患者毒性和至第三方的傳遞是 安全的（Wahdan 等人，J. Infectious Diseases 1982,145:292-295)。所述疫苗在 40 多個 國家被批準。Typhoral L? 的上市授權號碼（marketing authorization number)為 PL 15747/0001，授權上市日期1996年12月16號。疫苗的一個劑量包含至少2xl09個活的傷 寒沙門氏菌Ty2Ia菌落形成單位和至少5xIO9個無活性傷寒沙門氏菌Ty2Ia細胞。
[0069] 所述傷寒沙門氏菌Ty21a菌株的生化特性之一為它無代謝半乳糖能力。所述減毒 的突變菌株也不能將硫酸鹽還原為亞硫酸鹽，這使其與野生型沙門氏菌Ty2菌株相區(qū)分。 關于它的血清學特性，所述傷寒沙門氏菌Ty21a菌株包含為細菌外膜的多糖的09-抗原且 不含為鼠傷寒沙門氏菌特性組成的05-抗原。該血清學特征支持包括用于批次釋放的鑒定 試驗組中的各試驗的基本原理。
[0070] 在特別的實施方案中，所述表達組件為真核表達組件。在本發(fā)明的背景下，術語 "真核表達組件"是指允許在真核細胞中表達開放讀碼框的表達組件。已顯示誘導充分的免 疫響應所需的異種抗原的數(shù)量對于所述細菌可能是有毒的并可導致細胞死亡、所述異種抗 原的表達的過度衰減或喪失。使用不在細菌載體中表達而僅在靶細胞中表達的真核表達組 件可克服該毒性問題且所表達的蛋白質(zhì)可表現(xiàn)出真核細胞的糖基化模式。
[0071] 真核表達組件包含能控制開放讀碼框在真核細胞中表達的調(diào)控序列，優(yōu)選為啟動 子和多腺苷酸化信號。本發(fā)明的沙門氏菌減毒突變菌株包含的重組DNA分子中包括的啟 動子和多腺苷酸化信號優(yōu)選選為在有待被免疫的受試者的細胞中是起作用的。合適的啟 動子，尤其是用于人類DNA疫苗的生產(chǎn)的啟動子的實例包括但不僅限于來自巨細胞病毒 (CMV)的啟動子，例如強的CMV即刻早期啟動子，來自猿猴病毒40 (SV40)、鼠乳腺腫瘤病毒 (MMTV)、人類免疫缺陷病毒（HIV)的啟動子，如HIF長末端重復（LTR)啟動子，來自莫洛尼 氏病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV)，的啟動子和來自勞斯氏肉瘤病毒（RSV)的啟動子和 來自人類基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肌fe和人金屬硫蛋白的啟動 子。在特定的實施方案中，所述真核表達組件包含所述CMV啟動子。在本發(fā)明的背景下，術 語"CMV啟動子"指強的即刻早期巨細胞病毒啟動子。
[0072] 合適的多腺苷酸化信號，尤其是用于產(chǎn)生人類DNA疫苗的多腺苷酸化信號的實例 包括但不限于牛生長激素（BGH)多腺苷酸化位點、SV40多腺苷酸化信號和LTR多腺苷酸化 信號。在特定的實施方案中，本發(fā)明的沙門氏菌減毒突變菌株包含的重組DNA分子中包括 的真核表達組件包含所述BGH多腺苷酸化位點。
[0073] 除了 VEGF受體蛋白表達所需的調(diào)控元件，如啟動子和多腺苷酸化信號外，其它元 件也可包含在所述重組DNA分子中。該附加元件包括增強子。所述增強子可為，例如，人 肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肌酸的增強子和病毒增強子例如來自CMV、RSV和 EBV的那些。
[0074] 調(diào)控序列和密碼子通常是物種依賴的，因此為了使蛋白質(zhì)產(chǎn)量最大化，所述調(diào)控 序列和密碼子優(yōu)選為在有待被免疫的物種中是有效的。本領域的技術人員可生產(chǎn)在給定的 受試者物種中起作用的重組DNA分子。
[0075] 在特定的實施方案中，本發(fā)明的DNA疫苗用在癌癥免疫療法中。
[0076] 在特定的實施方案中，所述DNA疫苗包含由含編碼SEQ ID NO 1的VEGFR-2蛋白 質(zhì)的DNA的質(zhì)粒轉化的減毒的傷寒沙門氏菌菌株Ty21a。
[0077] 在特定的實施方案中，所述DNA疫苗用在抗血管生成的癌癥免疫療法中。
[0078] 在特定的實施方案中，所述重組DNA分子包含抗卡那霉素抗生素抗性基因、 pMBlOri，和編碼人類VEGFR-2或與其具有至少80%序列同源性的蛋白質(zhì)的真核表達組件， 在CMV啟動子的控制下。在特定的實施方案中，人類VEGFR-2具有如在SEQ ID NO 2中提 供的核酸序列。
[0079] 所述真核巨細胞病毒（CMV)即刻早期啟動子確保VEGFR-2蛋白質(zhì)在宿主細胞內(nèi)的 有效翻譯，且所述原核復制起點（ori)介導在細菌宿主內(nèi)的增殖。
[0080] 在特定的實施方案中，所述重組DNA分子源自可商購的pVAXl?表達質(zhì)粒 (Invitrogen，圣迭戈，加利福尼亞）。通過用pBR322的低拷貝pMBl復制起點取代高拷貝 PUC復制起點修飾所述表達載體。低拷貝修飾是為了減少代謝負擔和形成更穩(wěn)定的構建體。 圖2描述了詳細的質(zhì)粒pVAXIO. VR2-1構建體。產(chǎn)生的表達載體骨架命名為pVAXlO。將如 在SEQ ID NO 2中提供的核酸序列的人類VEGFR-2插入至該表達載體骨架中產(chǎn)生所述表達 質(zhì)粒 pVAXIO. VR2-1。
[0081] 圖2示意描述了所述表達質(zhì)粒pVAXIO. VR2-1。在特定的實施方案中，所述質(zhì)粒為 如在圖2中描述的7580bp pVAXIO. VR2-1并具有SEQ ID NO 3中提供的序列且所述DNA疫苗 命名為VXMO1。VXMO1為由帶有至少一個拷貝的，編碼人血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR-2) 的真核表達組件的質(zhì)粒DNA pVAXIO. VR2-1的血清型腸道傷寒沙門氏菌減毒菌株Ty21a組 成的口服疫苗。
[0082] 在特定的實施方案中，所述癌癥為胰腺癌。
[0083] 在特定的實施方案中，所述胰腺癌為IV期或局部晚期胰腺癌。
[0084] 在特定的實施方案中，所述癌癥包括轉移性腫瘤。
[0085] 在特定的實施方案中，癌癥免疫療法進一步包括施用一種或多種進一步減毒的沙 門氏菌突變菌株，所述進一步減毒的沙門氏菌突變菌株包含至少一個拷貝的、含編碼腫瘤 抗原和/或腫瘤基質(zhì)抗原的表達組件的重組DNA分子。在特定的實施方案中，所述一種或 多種進一步減毒的沙門氏菌突變菌株為含真核表達組件的傷寒沙門氏菌Ty21a。在特定的 實施方案中，所述一種或多種進一步的沙門氏菌菌株包含編碼人WTl的減毒的沙門氏菌突 變菌株。
[0086] 將本發(fā)明的減毒的沙門氏菌的突變菌株與含編碼第二腫瘤基質(zhì)抗原或腫瘤抗原 的DNA分子的第二減毒的突變菌株結合可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。特別地，腫瘤和腫瘤基 質(zhì)的同時靶向可使腫瘤逃逸的風險最小化。將基于VEGFR-2的免疫療法和基于WTl的癌癥 免疫療法結合可能證明特別有效，因為過表達WTl的人體細胞和腫瘤血管同時被攻擊。
[0087] 在特定的實施方案中，所述減毒的沙門氏菌突變菌株與一種或多種進一步減毒的 沙門氏菌突變菌株共同施用。
[0088] 在本發(fā)明的背景下，術語"共同施用（co-administration) "或"共同施用 (co-administer) "意思是兩種不同的減毒的沙門氏菌突變菌株在連續(xù)三天內(nèi)施用，更特別 地在連續(xù)兩天內(nèi)，更特別地在同一天內(nèi)，更特別地在12h內(nèi)施用。最特別地，在本發(fā)明的背 景下，術語"共同施用"指同時施用兩種不同的減毒的沙門氏菌突變菌株。
[0089] 在特定的實施方案中，所述治療伴隨有化學療法和/或放射療法和/或生物癌癥 治療。為治愈癌癥，徹底根除癌癥干細胞可能是必要的。為了最大的功效，不同治療方法的 組合可能是有利的。
[0090] 在本發(fā)明的背景下，術語"生物癌癥治療"或"癌癥免疫療法"指刺激患者免疫系 統(tǒng)以攻擊惡性腫瘤細胞或所述腫瘤基質(zhì)。生物癌癥治療方法包括遞送腫瘤抗原，遞送治療 抗體作為藥物，施用免疫刺激性細胞因子和施用免疫細胞。
[0091] 可與本發(fā)明的減毒的沙門氏菌突變菌株結合使用的化學治療劑可為，例如：氨 磷?。╝mifostine)(阿米福汀（ethyol))、卡巴他賽、順鉬、氮稀挫胺（DTIC)、更生霉素、 多西他賽、二氯甲基二乙胺、鏈脲菌素、環(huán)磷酰胺、卡氮芥（carrnustine) (BCNU)、羅氮芥 (CCNU)、阿霉素（阿霉素）、阿霉素脂質(zhì)體（阿霉素脂質(zhì)體）、亞葉酸、吉西他濱（健擇）、道 諾霉素、道諾霉素脂體（枸櫞酸柔紅霉素脂質(zhì)體）、甲基芐肼、酮康唑（ketokonazole)、絲裂 霉素、阿糖胞苷、足葉乙甙、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶（5-FU)、長春花堿、長春新堿、博來霉素、 紫杉醇（紫杉醇）、多西他賽（泰索帝）、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、克拉屈濱、 喜樹喊、CPT-11、10-輕基-7-乙基-喜樹喊（SN38)、氮稀挫胺、氟尿苷、氟達拉濱、輕基脈、 異環(huán)磷酰胺、伊達比星、美司鈉、干擾素 α、干擾素 β、伊立替康、米托蒽醌、拓撲替康、亮丙 瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、奧沙利鉑、普卡霉素、米托坦、天門冬酰胺酶、噴司他丁、哌 血生、普卡霉素、鏈脲菌素、他莫昔芬、替尼泊苷，睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、長 春瑞濱、苯丁酸氮芥及其組合。
[0092] 根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選的與VXM01結合的化學治療劑為卡巴他賽、卡鉑、奧沙利鉑、 順鉑、環(huán)磷酰胺、多西他賽、吉西他濱、阿霉素、紫杉醇（紫杉醇）、伊立替康、長春新堿、長春 花堿、長春瑞濱（vinorelbin)、亞葉酸、5-氟尿喃啶和博來霉素，尤其是吉西他濱。
[0093] 在特定的實施方案中，所述化學治療劑為吉西他濱。
[0094] 根據(jù)可能發(fā)生的副作用包括用抗生素或抗炎藥治療可能也是有利的。
[0095] 如果不良反應發(fā)生，類似由組胺、白細胞三烯或細胞因子調(diào)控的過敏性反應，那么 對于發(fā)熱、過敏反應、血壓不穩(wěn)、支氣管痙攣和呼吸困難的治療選擇是可供使用的。在不需 要的T細胞衍生的自動進攻情況下的治療選擇是來自在干細胞移植后應用的在急性和慢 性移植物抗宿主疾病中的標準治療方案。環(huán)孢菌素和糖皮質(zhì)激素被推薦為治療選擇。
[0096] 在不太可能的全身傷寒沙門氏菌Ty21a類型感染下，建議適當?shù)目股丿煼?，?如使用氟喹諾酮類包括環(huán)丙沙星或氧氟沙星。使用相應的藥劑如利福昔明治療胃腸道的細 菌感染。
[0097] 在特定的實施方案中，在化學療法或放射療法治療周期中或在生物癌癥治療中施 用減毒的沙門氏菌突變菌株。在特定的實施方案中，在化學療法治療周期中實施使用疫苗 的免疫治療。
[0098] 在特定的實施方案中，在化學療法或放射療法治療周期之前或在生物癌癥治療之 前施用減毒的沙門氏菌突變菌株。該方法可具有化學療法或放射療法可在增強的癌癥免疫 力的情況下實施的優(yōu)勢。
[0099] 在特定的實施方案中，在化學療法或放射療法治療周期之后或在生物癌癥治療之 后施用減毒的沙門氏菌突變菌株。
[0100] 在特定的實施方案中，口服施用所述疫苗。口服施用比腸胃外施用更簡單、安全和 舒適。通過本發(fā)明的DNA疫苗的口服施用可克服腸胃外、皮下或皮內(nèi)施用的副作用。然而， 本發(fā)明的減毒的沙門氏菌突變菌株也可通過任何其它合適的方式施用。優(yōu)選地，施用于受 試者治療上有效的劑量，且該劑量取決于特定的應用，惡性腫瘤的類型，受試者的體重、年 齡、性別和健康狀況，施用的方式和配方等。根據(jù)需要可單次或多次施用。
[0101] 可以溶液、懸浮液、凍干態(tài)或其他任何合適的形式提供本發(fā)明的減毒的沙門氏菌 突變菌株。也可與藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑結合提供。也可包括用于調(diào) 節(jié)PH值的試劑、緩沖劑、用于調(diào)節(jié)毒性的試劑等等。在本發(fā)明的背景下，術語"藥學上可接 受的"指生理學可容忍的且當施用于哺乳動物（例如人類）時通常不產(chǎn)生不良反應的藥學 組合物的分子實體和其他成分。術語"藥學上可接受的"也可指由聯(lián)邦監(jiān)管機構或州政府 批準的或列在美國藥典或其他公認的藥典中的用于哺乳動物，和，更特別的，用于人類的。
[0102] 本發(fā)明的疫苗在相對低的劑量令人驚奇地有效。在特定的實施方案中，所述疫苗 的單次劑量為約Ix 1〇5,約lxio6,約lxio7,約lxio8,約lxio 9,約lxl01C1，或約IxlO11菌落形 成單位（CFU)。該活細菌疫苗的低劑量的施用使排泄的風險和因此傳遞給第三方的風險最 小化。
[0103] 在該背景下，術語"約（about) "或"大約（approximately) "指在給定值或范圍的 3倍內(nèi)，或者2倍內(nèi)，包括1.5倍內(nèi)。
[0104] 在特定的實施方案中，所述疫苗的單次劑量為小于約1x109CFU。在特定的實施方 案中，所述疫苗的單次劑量為從IxlO 8至1x10 9CFU。
[0105] 在特定的實施方案中，所述疫苗的單次劑量為小于約1x108CFU。在特定的實施 方案中，所述疫苗的單次劑量為從IxlO 5至1x10 8CFU,更特別地所述疫苗的單次劑量為從 IxlO6至 1x10 7CFU0
[0106] 在特定的實施方案中，所述單次劑量包含從約IO5至約10 11，特別地從約IO6至約 101°,更特別地從約IO6至約10 9,更特別地從約IO6至約10 8,最特別地從約IO6至約10 7菌 落形成單位（CFU)。
[0107] 在特定的實施方案中，所述減毒的沙門氏菌突變菌株用在個體化癌癥免疫療法 中。個體化癌癥免疫療法可包含評估患者的腫瘤基質(zhì)抗原表達模式和/或腫瘤抗原表達模 式的步驟。個體化癌癥免疫療法還可包含評估針對腫瘤基質(zhì)抗原或腫瘤抗原的預免疫響應 步驟，優(yōu)選針對VEGFR-2的預免疫響應。根據(jù)此，預先存在的針對VEGFR-2的免疫響應顯示 與VXMOl的陽性臨床響應的強相關，特別地與腫瘤灌注的減少的強相關。
[0108] VXMOl可單獨或與含真核表達系統(tǒng)的其它基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗結 合使用，用于治療多種癌癥類型。在特定的實施方案中，VXMOl可用于個體化患者的具體癌 癥的治療。對于那個目的，可在第一步驟中評估患者的基質(zhì)和/或腫瘤抗原表達模式，例如 通過以患者具體基質(zhì)和/或腫瘤抗原模式為靶向的伴隨診斷?；蛘?，可評估針對基質(zhì)和/ 或腫瘤抗原的預先存在的免疫響應。根據(jù)患者的基質(zhì)和/或腫瘤抗原表達模式，VMXOl可 單獨或與一種或多種合適的含真核表達系統(tǒng)的其它基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗 結合施用。然而，VXMOl與一種或多種其它基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗的組合可 作為固定組合施用。這些結合兩種或多種基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗的組合物 (cocktail)可由單獨的現(xiàn)成產(chǎn)品組成。所述組合物，固定的或個體化的，可包含VXMOl作為 抗血管生成基礎治療。
[0109] 在另一個方面，本發(fā)明涉及所述DNA疫苗VXM01，其包含由含編碼SEQ ID NO 1 的VEGFR-2蛋白質(zhì)的DNA的質(zhì)粒轉化的減毒的傷寒沙門氏菌菌株Ty21a，其中所述質(zhì)粒 為7580bp質(zhì)粒DNA并包含在CMV啟動子控制下的VEGFR-2的cDNA、卡那霉素抗性基因和 pMBlori，并表示為 pVAXKX VR2-1。
[0110] 圖表說明
[0111] 圖1 :克隆至質(zhì)粒pVAXIO. VR2-1中的VEGFR-2cDNA的氨基酸序列
[0112] 圖 2 :pVAX10. VR2-1 的質(zhì)粒圖譜
[0113] 圖3 :疫苗VXMOl的劑量遞增設計
[0114] 圖4:整體研宄方案
[0115] 圖5 :VXM01特異性T細胞響應
[0116] 圖6 :VXM01對腫瘤灌注的影響
[0117] 圖7 :VXMO1對VEGF A血清水平的影響
[0118] 圖8 :VXM01對IV型膠原血清水平的影響
[0119] 圖9 :VXM01對血壓的影響
[0120] 圖10 :VXMOl誘導的抗載體免疫
[0121] 圖11 :VXM01排泄的級聯(lián)分析
[0122] 圖 12:VXMOl 排泄
[0123] 表1:患者選擇標準
[0124] 表2 :VMX01特異性T細胞響應

【具體實施方式】
[0125] 實施例1傷寒沙門氏菌Ty21a菌株的制備和質(zhì)粒的制備
[0126] 制備研宄種批（RSL)的第一步驟包括分離減毒的傷寒沙門氏菌Ty21a菌株，然后 用質(zhì)粒DNA(pVAX10. VR2-1)轉化所述減毒的細菌。
[0127] 用傷寒沙門氏菌Ty21a分離株接種液體培養(yǎng)基，然后將所述液體培養(yǎng)基涂至瓊脂 培養(yǎng)基上以分離單個細菌菌落。單個菌落被分離并在液體培養(yǎng)基中生長。然后將兩種培養(yǎng) 物，即VAX.Ty21-l和VAX.Ty21-2,用甘油配制，分裝（ImL)并在-75°C ±5°C下儲存?zhèn)溆谩?所述兩種培養(yǎng)物的各自的特性被進一步證實。
[0128] 質(zhì)粒合成的原理是基于具有下面步驟的雙鏈體外基因合成：
[0129] -7. 58kb的整個pVAX10-VR2· 1質(zhì)粒序列被細分（通過軟件分析）為約I. 5kb的5 個部分。各部分被細分為40-50bp寡核苷酸，各寡核苷酸在兩個鏈的寡核苷酸間具有重疊 區(qū)；
[0130] -然后通過用T4多核苷酸激酶孵育對體外合成的寡核苷酸進行磷酸化；
[0131] -在合適的條件下對重疊的寡核苷酸進行退火處理后，Taq DNA連接酶連接對齊的 寡核苷酸；
[0132] -在連接步驟完成時，用在外面的位置退火的引物實施PCR，以增加連接的質(zhì)粒片 段（?I. 5kb)的產(chǎn)量；
[0133] -實施預備的瓊脂糖凝膠電泳以分離所述PCR產(chǎn)物；
[0134] -所述分離的PCR產(chǎn)物被克隆至TOPO載體（Invitrogen，K#4575-40)中，并被轉 化入Τ0Ρ10大腸桿菌細胞用于增殖；
[0135] -在TOPO質(zhì)粒分離后，實施限制和序列核實；
[0136] -通過重疊 PCR將分離的對齊的碎片組裝。該過程后線性組裝所述pVAXIO. VR2-1 質(zhì)粒；
[0137] -在XhoI限制性內(nèi)切消化（單個限制位點存在于pVAX10.VR2-l質(zhì)粒中，參見圖 2)和通過T4連接酶共價結合后，用環(huán)狀質(zhì)粒轉化大腸桿菌用于增殖；
[0138] -在最終質(zhì)粒序列核實后，將所述pVAXIO. VR2-1質(zhì)粒轉化至所述傷寒沙門氏菌 Ty21a細菌菌株。
[0139] 由此成功合成所述質(zhì)粒pVAXIO. VR2-1 (相應于參考序列無偏差）。所述質(zhì)粒進一 步用于轉化所述傷寒沙門氏菌Ty2Ia細菌菌株。
[0140] 實施例2VXM01-I期臨床試驗；研宄描述
[0141] 該I期臨床試驗研宄安全性，耐受性，和對VXMOl的免疫學和臨床響應。這種隨機 的、以安慰劑為對照的、雙盲劑量遞增研宄包括45名局部晚期或IV期胰腺癌患者。所述患 者除作為標準治療的吉西他濱外還接受四個劑量的VXMOl或安慰劑。本研宄評估了劑量為 從IO 6CFU至IOltlCFU的VXM01。劑量遞增的決策涉及獨立的數(shù)據(jù)安全監(jiān)測委員會（DSMB)。 除了安全作為主要端點外，也評估了 VXMOl特異性免疫反應和臨床響應參數(shù)。
[0142] 臨床前功效評估
[0143] 所述方法在動物內(nèi)的功效和安全性已被
【發(fā)明者】多次證實。
【發(fā)明者】進一步的實驗顯 示該疫苗在兩種不同的胰腺癌模型中的活性。
[0144] 本試驗中所用的疫苗VXMOl是先前在小鼠內(nèi)測試的抗VEGFR-2疫苗的人源化版 本。它編碼人類全長VEGFR-2并使用批準的傷寒沙門氏菌菌株Ty2Ia代替鼠源傷寒沙門氏 菌作為載體。假定所述疫苗在派伊爾氏集合淋巴結內(nèi)通過腸道M細胞進入VXMOl后導致 VEGFR-2蛋白在單核細胞和樹突狀細胞內(nèi)的表達，并由抗原遞呈細胞內(nèi)在化然后翻譯所編 碼的DNA。
[0145] 臨床前安全評估
[0146] 在小鼠內(nèi)的臨床前毒性研宄包括，但不限于在小鼠內(nèi)的單次劑量毒性研宄，用人 類疫苗VXMOl進行。由于VXMOl對人類宿主是特異的，人疫苗在小鼠內(nèi)的研宄集中在過程 相關雜質(zhì)的可能效應和可能與心血管、呼吸道、或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害相關的相關體征和癥 狀。為了研宄抗VEGFR-2T細胞響應的毒性屬性，用在小鼠內(nèi)誘導劑量依賴性T細胞響應的 VXMOl鼠類模擬構建體實施多次劑量毒性研宄。根據(jù)本發(fā)明人先前的觀察，在整個這些研宄 中，沒有觀察到治療相關的死亡和毒理學上重要的臨床體征，這是根據(jù)良好的實驗室實踐 (GLP)實施的。
[0147] 這里使用的載體傷寒沙門氏菌Ty21a是允許口服遞送疫苗VXMOl的活的、減毒的 細菌載體。它本身是被批準的抗傷寒癥的疫苗（Viv〇tif K;, Crucell，原名Berna生物技術 股份有限公司瑞士），其已被廣泛試驗并已被證明關于患者毒性和傳遞給第三方的安全性 (Wahdan 等人，J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295)。VXMOl 被歸類為基因轉移藥 用產(chǎn)品并經(jīng)受相應的指導和監(jiān)管。
[0148] 研究描沭和目的
[0149] 所實施的研宄是實驗性疫苗VXMOl在不能手術或IV期胰腺癌患者內(nèi)的單中心的、 以安慰劑為對照的、雙盲劑量遞增研宄。所述疫苗作為對標準治療吉西他濱治療的附加被 給予。
[0150] 所述目的是為了檢驗研宄性抗VEGFR-2疫苗VXMOl的安全性和耐受性，和免疫和 臨床響應，和為了鑒定VXMOl的最大耐受劑量（MTD)。所述MTD被定義為多達六個患者中的 少于兩個在VXMOl治療下經(jīng)歷劑量限制性毒性（DLT)的最高劑量水平。
[0151] 安全性和耐受性的主要端點如下：定義為與研宄藥物相關的任何不良事件（AE) 的DLT的數(shù)量，所述不良事件為4級或更高，或3級或更高的胃腸瘺、腹瀉、胃腸道穿孔、多 器官衰竭、過敏性反應、任何自身免疫性失調(diào)、細胞因子釋放綜合征、腸出血、腎衰竭，蛋白 尿、血栓栓塞事件、中風、心臟衰竭、或血管炎，根據(jù)國家癌癥研宄所常用不良事件術語標準 (CTCAE)〇
[0152] 評估所述實驗性疫苗引起對VEGFR-2特異的免疫響應的功效的第二端點，包括免 疫陽性患者的數(shù)量。
[0153] 進一步的第二端點是臨床響應：根據(jù)在實體腫瘤中的響應評估標準（RECIST)的 腫瘤分期，整體響應速率，無進展生存率，整體生存率和腫瘤灌注方面的變化。通過動態(tài)增 強磁共振成像（DCE-MRI)在I. 5Tesla系統(tǒng)（磁共振成像面積，Siemens，埃朗根，德國）上 確定腫瘤灌注。
[0154] 已根據(jù)良好制造實踐（GMP)制造了 VXMOl，且在緩沖溶液中提供VXMOl。所述安慰 劑對照由等張氯化鈉溶液組成。
[0155] 患者詵擇和臨床研究設計
[0156] 所述研宄包括患有局部晚期、或不能手術或IV期胰腺癌的最多45個患者。表1 中概括了合格標準。
[0157] 表 1

【權利要求】
1. 含至少一個拷貝的、包含編碼VEGF受體蛋白的表達組件的重組DNA分子的減毒的傷 寒沙門氏菌突變菌株，特別地VEGF受體蛋白選自由人類VEGFR-2和與其具有至少約80%同 源性的其同族體組成的組，特別地其中人類VEGF-2受體蛋白具有如在SEQ ID NO 1中提供 的氨基酸序列，用作疫苗。
2. 含權利要求1所述的減毒的傷寒沙門氏菌突變菌株的DNA疫苗，其中所述減毒的傷 寒沙門氏菌突變菌株為傷寒沙門氏菌Ty21a，和其中所述表達組件為真核表達組件，用在癌 癥免疫療法中。
3. 根據(jù)權利要求2所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含由含編碼SEQ ID NO 1的 VEGFR-2蛋白的DNA的質(zhì)粒轉化的減毒的傷寒沙門氏菌菌株Ty21a，用在抗血管生成癌癥免 疫療法中。
4. 根據(jù)權利要求3所述的DNA疫苗，其中所述質(zhì)粒為如在圖2中描述的7580bp pVAXIO. VR2-1并具有如在SEQ ID NO 3中提供的序列且所述DNA疫苗表示為VXM01。
5. 根據(jù)權利要求2-4任一項所述的DNA疫苗，其中所述癌癥為胰腺癌。
6. 根據(jù)權利要求5的DNA疫苗，其中所述胰腺癌為IV期或局部晚期的胰腺癌。
7. 根據(jù)權利要求2-6任一項所述的DNA疫苗，其中所述癌癥包括轉移性腫瘤。
8. 根據(jù)權利要求2-7任一項所述的DNA疫苗，其中所述治療伴隨有化學療法和/或放 射療法。
9. 根據(jù)權利要求8所述的DNA疫苗，其中化療劑為吉西他濱。
10. 根據(jù)權利要求8或9所述的DNA疫苗，其中在化學療法治療周期中實施使用所述疫 苗的免疫療法治療。
11. 根據(jù)權利要求2-10任一項所述的DNA疫苗，其中所述疫苗口服施用。
12. 根據(jù)權利要求2-11任一項所述的DNA疫苗，其中所述疫苗的單次劑量為Ix 10 5、 Ixl06、lxl07、lxl08、lxlO 9、IxlOici或 1x10 11 菌落形成單位（CFU)。
13. 根據(jù)權利要求9的供使用的DNA疫苗，其中所述疫苗的單次劑量少于1x10 9CFU,特 別地其中所述疫苗的單次劑量為從IxlO8至1x10 9CFU。
14. 根據(jù)權利要求9的供使用的DNA疫苗，其中所述疫苗的單次劑量少于1x10 8CFU,特 別地其中所述疫苗的單次劑量為從IxlO5至1x10 8CFU,更特別地其中所述疫苗的單次劑量 為從 IxlO6至 1x10 7CFU。
15. 根據(jù)權利要求2-14任一項所述的DNA疫苗，其中所述單次劑量包含從約10 5至約 1011，特別地從約IO6至約10 1(1，更特別地從約IO6至約10 9,更特別地從約IO6至約10 8,最特 別地從約IO6至約10 7菌落形成單位（CFU)。 16. DNA疫苗VXM01，其包含由含編碼SEQ ID NO 1的VEGFR-2蛋白的DNA的質(zhì)粒轉化 的減毒的傷寒沙門氏菌菌株Ty21a，其中所述質(zhì)粒為7580bp質(zhì)粒DNA并包含在CMV啟動子 控制下的VEGFR-2的cDNA、卡那霉素抗性基因和pMBlori，并被表示為pVAXIO. VR2-1。
【文檔編號】A61K39/00GK104519908SQ201380035905
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權日:2012年7月5日
【發(fā)明者】海因茨·尤貝瑙諾 申請人:萬科斯蒙股份有限公司