一種h3n8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗中含有由SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所述核苷酸序列用昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)表達后所得的重組病毒樣顆粒蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑。本發(fā)明的重組病毒樣顆粒與天然病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)類似，具有良好的免疫原性，由其制備得到的疫苗免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的保護性免疫反應(yīng)，且沒有活病毒的任何危險，同時還能夠區(qū)分自然感染者和免疫者，不干擾流行病學(xué)調(diào)查，因此，本發(fā)明的一種H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒疫苗可以作為預(yù)防和治療馬流感的候選疫苗。
【專利說明】一種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種馬流感疫苗及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]馬流感(Equine influenza，EI)是由正黏病毒科、流感病毒屬A型流感病毒中的馬流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起的馬屬動物一種嚴(yán)重的上呼吸道急性高度接觸性傳染疾病，多呈暴發(fā)性流行，傳播迅速而且廣泛，給養(yǎng)馬業(yè)及賽馬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。OIE規(guī)定馬流感為法定報告動物疫病，我國將其列為三類傳染病。
[0003]近幾年來EI在全世界頻繁暴發(fā)，我國也不例外，在2007-2008年間我國多個省市均暴發(fā)了 EI疫情，時值臨近奧運會的舉辦，我國從國外進口 EI疫苗進行緊急接種。EIV不僅可以感染馬和驢等馬屬動物，甚至可以感染犬，EIV的跨種傳播，因此也給公共衛(wèi)生帶來極大的安全隱患。目前，EIV在各種壓力下正加速變異，危害嚴(yán)重。2012年8月在我國貴州省又暴發(fā)了 EI疫情，對賽事造成了很大的影響。因此對EI進行監(jiān)測和防控是本病的重點工作。而我國目前還沒有具有自主知識產(chǎn)權(quán)的并針對我國EI流行株的用于防控EI的有效疫苗。而疫苗接種被認(rèn)為是防控EI的有效策略，EI疫苗的廣泛應(yīng)用使EI疫情在全球得到了有效地控制，而我國絕大多數(shù)馬匹未接種過EI疫苗，因此極易受到EIV的危害。
[0004]疫苗免疫在一定情況下也不能避免EI的暴發(fā)，這是由于EIV呈多元化進化，導(dǎo)致HA蛋白抗原性不同的多 個譜系病毒株的出現(xiàn)，當(dāng)疫苗株與流行株屬于不同譜系時就不能產(chǎn)生完全的免疫保護。
[0005]對我國EIV的分子流行病學(xué)調(diào)查研究表明:我國EIV和國外進口疫苗株在進化上分屬于Florida分支2和Kentucky分支兩個不同的譜系,這給我們提出一個警示:進口疫苗能否對我國EI疫情提供有效防控？尚有待于實踐檢驗。而研制符合我國國情的EI疫苗則是解決問題的根本。本研究將我國EI代表流行株的HA和Ml基因重組到桿狀病毒載體中，在昆蟲細(xì)胞中進行HA和Ml蛋白的表達，并對蛋白生物學(xué)特性進行了檢測，為EI亞單位疫苗的研制提供了技術(shù)儲備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種能夠用于預(yù)防和治療由H3N8亞型馬流感病毒引起的EI的重組病毒樣顆粒疫苗；
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供一種制備所述重組病毒樣顆粒疫苗的方法；
[0008]本發(fā)明的目的之三是提供所述的重組病毒樣顆粒疫苗在制備防治H3N8亞型馬流感藥物中的應(yīng)用。
[0009]為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為:
[0010]本發(fā)明的一種用于預(yù)防和治療由H3N8亞型馬流感病毒引起的EI的重組病毒樣顆粒疫苗，含有由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列用昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)表達后所得的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑。所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白，是將EIVA/Equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)(簡寫為XJ3)(該毒株已記載在文獻:H3N8亞型EIV HA基因在昆蟲細(xì)胞中的表達及生物學(xué)特性分析，劉春國等，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2013年11期中，現(xiàn)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存，提供。)的囊膜糖蛋白HA和基質(zhì)蛋白Ml基因共插入到桿狀病毒雙表達載體中，構(gòu)建的重組桿狀病毒表達的HA和Ml在細(xì)胞中組裝成病毒樣顆粒，作為保護性抗原。插入的EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，插入的EIV基質(zhì)蛋白Ml基因具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，以及與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡并性的序列，或者它們的片段。
[0011]具體的，本發(fā)明所述的一種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒，其特征在于通過以下方法制備得到:將SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列或與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡并性的核苷酸序列克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，所得的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組桿粒，重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，并使其表達H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白，純化，即得。
[0012]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為桿狀病毒雙表達載體，更優(yōu)選的，所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為pFastBac Dual。
[0013]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒，通過以下方法制備得到:
[0014](I)將SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual的BamH I和Hind III酶切位點之間，得到重組載體pFBD-XJ3_HA ；
[0015](2)將SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列克隆入步驟(1)得到的重組載體PFBD-XJ3-HA的Xhol I和Nhe I酶切位點之間，得到重組載體pFBD-XJ3_HA+Ml ；
[0016](3)將重組載體pFBD-XJ3-HA+Ml按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)說明書轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，與Bacmid進行重組，得到重組桿粒rBac-XJ3_HA+Ml ；
[0017](4)將重組桿粒rBac-XJ3_HA+Ml轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞病變達到80%后收集上清，連續(xù)傳代1-5次后得到重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml ；
[0018](5)將得到的重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml接種Sf9細(xì)胞，使其表達H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白，純化，即得。
[0019]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(5)是按照以下步驟進行:將得到的重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml接種Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心IOmin去除細(xì)胞碎片，將上清進行超速離心，38000r/min離心2h，然后用20%、30%和60%蔗糖墊進行密度梯度離心，將30%和60%蔗糖墊之間的蛋白收集后進行脫糖，沉淀用TNE重懸，即為純化的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒。
[0020]研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備得到的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒與H3N8亞型馬流感病毒的天然病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)類似，具有良好的免疫原性，本發(fā)明的EI重組病毒樣顆粒的基本特征:1、透射電鏡觀察到所得的病毒樣顆粒具有與真正的流感病毒相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)；2、所得的病毒樣顆粒具有良好的血凝活性；3、細(xì)胞免疫組化和Western blot實驗表明表達的HA蛋白和Ml蛋白可被小鼠抗EIV血清所特異性識別，具有良好的免疫活性。
[0021]因此，進一步的，本發(fā)明還提出了以上任一項所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒在制備預(yù)防或治療H3N8亞型馬流感藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述的藥物為H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗。
[0022]本發(fā)明的一種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗，含有以上任一項所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒以及藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑。
[0023]將制備的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗經(jīng)后肢肌肉免疫小鼠后，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的HI抗體和中和抗體，產(chǎn)生良好的保護性免疫反應(yīng)，并能夠?qū)τH本強毒株XJ3的攻擊提供100%的臨床和病毒學(xué)保護，且沒有活病毒的任何危險，并能夠區(qū)分自然感染者和免疫者，不干擾流行病學(xué)調(diào)查，由此可見，本發(fā)明的一種H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒疫苗可以作為預(yù)防和治療馬流感的候選疫苗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例1中表達EIV HA和Ml重組桿狀病毒rBV-XJ3_HA+Ml的制備流程圖；
[0025]圖2是本發(fā)明實施例2中EIV HA和Ml蛋白表達的細(xì)胞免疫組化檢測圖；
[0026]圖2A為未感染的Sf9細(xì) 胞；圖2B為rBV-XJ3_HA+Ml感染的Sf9細(xì)胞；圖2C為wtBV感染的Sf9細(xì)胞；
[0027]圖3是本發(fā)明實施例2中EIV HA和Ml蛋白表達的Western blot檢測圖；
[0028]1.預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2和3.rBV-XJ3-HA-Ml感染的Sf9細(xì)胞；4.wtBV感染的Sf9細(xì)胞對照；
[0029]圖4是本發(fā)明實施例3中H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后的HI抗體圖；
[0030]圖5是本發(fā)明實施例3中H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后的中和抗體圖；
[0031]圖6是本發(fā)明實施例3中H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠攻毒后的體重變化圖。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0033]實施例1本發(fā)明表達EIV HA和Ml蛋白的重組桿狀病毒rBV-XJ3_HA+Ml的構(gòu)建
[0034]表達EIV HA和Ml重組桿狀病毒rBV-XJ3_HA+Ml的制備流程圖如圖1所示。
[0035]1、EIV XJ3HA 和 Ml 基因的 RT-PCR 擴增
[0036]使用華舜柱式病毒RNA提取試劑盒提取EIV XJ3(該毒株已記載在文獻:H3N8亞型EIV HA基因在昆蟲細(xì)胞中的表達及生物學(xué)特性分析，劉春國等，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2013年11期中，現(xiàn)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存，提供。)的RNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以A型流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Un1-12:5’ -AGCAAAAGCAGG-3’為反轉(zhuǎn)錄引物制備 XJ3cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系如下:DEPC Η2019.0 μ L、XJ3RNA5.0 μ L、AMV RT buffer8.0 μ L、
2.5mmol/L dNTP mixture4.0 μ L、Un1-12 通用引物 2.0 μ L、RNase Inhibitorl.0 μ L 和AMV Reverse Transcriptasel.0yL,總體積40.0 μ L。將上述反轉(zhuǎn)錄體系混勻，室溫靜置IOmin后，放于42°C水浴鍋中反轉(zhuǎn)錄lh，然后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物立即冰浴靜置2min，隨后使用或置于-20°C保存。以XJ3cDNA為模板，分別采用HA基因的特異性引物以及Ml基因的特異性引物進行PCR擴增。
[0037]HA基因的特異性引物為:
[0038]XJ3-HAF:5， -CCGGATCCATGAAGACAACC-3’
[0039]XJ3-HAR:5’ -CCCAAGCTTCTATCAGTTTAC-3’
[0040]Ml基因的特異性引物為:
[0041]XJ3-M1F:5， -CCCTCGAGATGAGCCTTCTTAC-3，
[0042]XJ3-M1R:5， -ATTGCTAGCTCACTTGAACCGCT-3’
[0043]PCR 反應(yīng)體系為:10 XPCR buffer 10.0 μ L、Ex Taq 酶 0.5 μ L、2.5mmol/L dNTPmixture2.0yL, IOpmoI/L HA 基因上、下游引物各 1.0 μ L、cDNA 模板 2.0 μ L 和 ddH2083.5 μ L，總體積100.0 μ L。PCR反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min、94°C變性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C后延伸lOmin，共計30個循環(huán)。同時設(shè)無模板的陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小。結(jié)果可見大小為1.7kb左右的HA基因片段和0.Skb的Ml基因片段，與預(yù)期的相符。
[0044]2、重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBD-XJ3-HA+Ml的構(gòu)建
[0045]HA和Ml基因的純化:將EIV1.7kb的HA基因片段和0.8kb的Ml基因片段從瓊脂糖凝膠上切下來，置于離心管中進行純化，具體試驗方法參見試劑盒說明書進行。
[0046]HA基因以及pFastBac Dual載體的酶切:將純化后的HA基因和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual 分別用 BamH I 和 Hind III進行雙酶切。體系如下:ddH2013.0 μ L/33.0 μ L、HA/pFastBac Dual30.0 μ L/10.0 μ L、10 X K Buffer5.0 μ L、BamH I 和 Hind III各 1.0 μ L 和石蠟油50.0 μ L，總體積100.0 μ L。37°C水浴2h后，HA基因酶切產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進行純化；PFastBaC Dual質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定完全切開后，用膠回收試劑盒進行純化。
[0047]HA與載體的連接和轉(zhuǎn)化:在T4DNA連接酶作用下，將經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的HA基因與線性化的pFastBac Dual進行連接，體系如下HA (Hind III +BamH I Δ) 10.0 μ L>pFastBac Dual (Hind III +BamH I Δ)5.0 μ LU0XT4DNA 連接酶 Buffer2.0 μ L、T4DNA 連接酶1.0 μ L和dd H202.0 μ L，總體積20.0 μ L。上述連接反應(yīng)混合物置于16°C水浴鍋中連接過夜。將連接產(chǎn)物加入到TOPlO感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴30min，42°C熱激90sec，立即冰浴2min，加入800 μ LSOC培養(yǎng)基，于37°C搖床內(nèi)，震蕩培養(yǎng)45min ;取出后于4000r/min離心2min ;棄去大部分上清，留200 μ L重懸培養(yǎng)物,涂布于含氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板上，37 °C溫箱過夜培養(yǎng)。
[0048]HA基因重組質(zhì)粒的鑒定:將菌落PCR初步鑒定為陽性的菌液分別接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)過夜。每個樣品分別取1.5mL菌液提取質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并設(shè)有PFastBac Dual質(zhì)粒作為陰性對照。將進一步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往北京華大基因公司測序鑒定。利用DNASTAR軟件中Seqman程序進行序列拼接比對，結(jié)果表明重組質(zhì)粒PFBD-XJ3-HA構(gòu)建成功，HA基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0049]Ml基因以及pFBD-XJ3-HA質(zhì)粒的酶切:將純化后的Ml基因和重組質(zhì)粒PFBD-XJ3-HA 分別用 Xhol I 和 Nhe I 進行雙酶切。體系如下:ddH2013.0 μ L/33.0 μ L、M1/PFBD-XJ3-HA30.Ομ L/10.Ομ LUOXM Buffer5.0 μ L.Xhol I 和 Nhe I 各 1.Ομ L和石蠟油50.0 μ L，總體積100.0 μ L。37°C水浴2h后，Ml基因酶切產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進行純化；PFBD-XJ3-HA質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定完全切開后，用膠回收試劑盒進行純化。
[0050]Ml基因與載體的連接和轉(zhuǎn)化:在T4DNA連接酶作用下，將經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的Ml基因與線性化的pFBD-XJ3-HA進行連接，體系如下HA (Xhol I +Nhe I Λ) 10.0 μ L、PFBD-XJ3-HA (Xhol I +Nhe I Δ) 5.Ομ LU0XT4DNA 連接酶 Buffer2.0 μ L、T4DNA 連接酶
1.0 μ L和dd Η202.0 μ L，總體積20.0 μ L。連接轉(zhuǎn)化方法與HA基因的類似。
[0051]Ml基因重組質(zhì)粒的鑒定:見上述HA基因的鑒定方法。結(jié)果表明重組質(zhì)粒PFBD-XJ3-HA+M1構(gòu)建成功，Ml基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0052]3、重組轉(zhuǎn)座子rBac-XJ3_HA+Ml的構(gòu)建
[0053]將pFBD-XJ3-HA+Ml按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)說明書轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，與Bacmid進行重組。篩選重組桿粒rBac-XJ3-HA+Ml，并利用M13通用引物進行PCR鑒定。結(jié)果可分別 擴增出約5.0kb (陽性)和300bp (陰性)的片段，與預(yù)期的相符。
[0054]4、重組桿狀病毒rBV-XJ3_HA+Ml的制備
[0055]將rBac-XJ3_HA+Ml和Bacmid按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。待細(xì)胞病變達到約80%后收集上清作為第I代種毒，經(jīng)過4次連續(xù)傳代后獲得含有HA基因的重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml的第4代以及第5代毒和野生型桿狀病毒(wtBV)。
[0056]實施例2本發(fā)明重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml表達EIV HA和Ml蛋白的鑒定
[0057]1、細(xì)胞免疫組化法檢測蛋白的表達:
[0058]將實施例1獲得的第4代rBV-XJ3_HA+Ml和wtBV分別接種培養(yǎng)于6孔板中的Sf9細(xì)胞進行免疫組織化學(xué)實驗檢測(劉春國等，自然科學(xué)進展，2009，19 (8):812-818.)。主要步驟如下，病毒接種后3d棄去上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，然后用4%的福爾馬林固定lOmin。以小鼠抗H3N8亞型EIV特異性多克隆血清(1:200)作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP(1:2000)為二抗，DAB顯色后，顯微鏡下觀察結(jié)果可見rBV-XJ3-HA+Ml感染的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)陽性棕黃色染色，而wtBV接種的Sf9細(xì)胞未見染色，結(jié)果如圖2所示。
[0059]2> Western blot 分析:
[0060]將第4代rBV-XJ3-HA+Ml和wtBV分別接種Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物進行SDS-PAGE，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印于NC膜上。經(jīng)5%脫脂乳封閉，以小鼠抗H3N8亞型EIV多克隆血清為一抗,羊抗鼠IgG-HRP為二抗,按常規(guī)方法進行western blot鑒定(劉春國等，中國生物工程雜志，2009，29 (10):38-43)。結(jié)果可見rBV-XJ3_HA+Ml表達的72kuHA蛋白和24ku Ml蛋白可被抗H3N8亞型EIV的小鼠血清識別，而wtBV感染的Sf9細(xì)胞未呈現(xiàn)反應(yīng)條帶，結(jié)果如圖3所示。
[0061 ] 3、重組蛋白的血凝活性檢測[0062]分別取實施例1獲得的第5代rBV-XJ3_HA+Ml和wtBV感染Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72h后分別收獲細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后超聲裂解，然后用0.5%的雞紅細(xì)胞對細(xì)胞培養(yǎng)上清和裂解的細(xì)胞進行紅細(xì)胞凝集試驗。結(jié)果表明rBV-XJ3-HA+Ml感染的Sf9細(xì)胞的上清以及細(xì)胞裂解物均具有血凝活性，效價分別達到51og2和91og2，而wtBV感染的Sf9細(xì)胞的上清以及細(xì)胞裂解物均不具有血凝活性。
[0063]4、病毒樣顆粒的電鏡觀察
[0064]將第5代rBV-XJ3-HA+Ml和wtBV分別感染Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心30min后，取上清10000r/min離心30min,棄去上清，沉淀用IOOyL PBS重懸，2%磷鎢酸負(fù)染后，采用透射電鏡觀察病毒樣顆粒形態(tài)。結(jié)果表明rBV-XJ3-HA+Ml感染Sf9細(xì)胞獲得的重組蛋白可以觀察到表面具有纖突的囊膜狀病毒樣顆粒，與完整的病毒粒子相似，而wtBV感染的Sf9細(xì)胞裂解蛋白中未見病毒樣顆粒形成。
[0065]實施例3本發(fā)明的重組病毒樣顆粒疫苗的制備及對小鼠的免疫保護實驗
[0066]1、病毒樣顆粒的純化
[0067]將實施例1獲得的第4代重組桿狀病毒rBV-XJ3_HA+Ml接種Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心10min去除細(xì)胞碎片，將上清進行超速離心，38000r/min (100000 Xg)離心2h，然后用20%、30%和60%蔗糖墊進行密度梯度離心，將30%和60%蔗糖墊之間的蛋白收集后進行脫糖，沉淀用TNE重懸即為純化的病毒樣顆粒。
[0068]2、病毒 樣顆粒的定量
[0069]采用Bradford法測定總蛋白的濃度，具體方法見說明書。然后用SDS-PAGE和Western blot法計算出HA和Ml蛋白含量。方法如下:將純化的病毒樣顆粒稀釋至濃度分別為1500、500和167 μ g/mL，按照糖苷酶PNGase F說明書處理，18 μ L樣品中加入10 X Glycoprotein Denaturing Buffer2 μ L,混勻，10CTC水浴 IOmin進行還原處理，冷卻至室溫后，加入 10XG7Reaction Buffer2.5 μ L，10%ΝΡ_402.5 μ L，分別按 1:50、1:100 和 I:500的體積比加入糖苷酶PNGase F各1、0.5和0.1 μ L，37°C處理18h。樣品經(jīng)處理后加入8.5yL4X蛋白電泳上樣緩沖液。配制12% SDS-PAGE膠，取20 μ L樣品加入每孔中，進行電泳，電泳結(jié)束后，一塊膠以考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后，通過薄層掃描儀根據(jù)圖片中各條帶灰度值計算每條蛋白帶所占比例；另一塊膠進行Western blot檢測,鑒定出HA和Ml蛋白所在的位置。再根據(jù)對應(yīng)考馬斯亮藍(lán)染色膠的薄層掃描結(jié)果確定HA和Ml蛋白條帶所占總蛋白的比例，計算出HA和Ml蛋白的總含量，即為病毒樣顆粒的蛋白濃度。
[0070]3、病毒樣顆粒疫苗的制備及對小鼠的免疫學(xué)研究
[0071]將病毒樣顆粒用弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按照抗原比佐劑體積比為1:2的比例分別進行乳化，然后免疫6w雌性Balb/c小鼠。將40只6w雌性Balb/c小鼠隨機分成4組，每組10只。第一、第二和第三組分別經(jīng)腹腔免疫含20 μ g、50 μ g和100 μ g弗氏完全佐劑乳化的病毒樣顆粒的疫苗。第四組作為陰性對照腹腔接種200 μ L弗氏完全佐劑乳化的PBS。一免3w (周)后以相同方式和劑量加強免疫弗氏不完全佐劑乳化的病毒樣顆粒疫苗，并于二免2w后用XJ3親本毒株以IO7EID5tl的劑量通過呼吸道進行攻毒,攻毒后每天觀察臨床癥狀，并定時測量體重，連續(xù)監(jiān)測14d。并于攻毒后第2d每組各剖殺2只小鼠檢測臟器中病毒復(fù)制情況。免疫前Id、一免Iw和3w后、二免2w和4w后以及攻毒2w后分別采血，分離血清，測定HI抗體和中和抗體效價。[0072]病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)的HI抗體反應(yīng):一免Iw后20 μ @和50口 g免疫組產(chǎn)生41og2左右的HI抗體，而100 μ g免疫組沒有產(chǎn)生可檢測的HI抗體；一免后3w20y g和50 μ g免疫組抗體升高至5.21og2和6.21og2,100 μ g免疫組HI抗體迅速升高至8.21og2 ；二免2w后三組抗體水平均持續(xù)升高，100 μ g組抗體升至91og2 ;攻毒2w后三組抗體水平均升高至101og2左右，對照組攻毒前未產(chǎn)生可檢測的HI抗體，攻毒2w后HI抗體達到
5.21og2，結(jié)果如圖4所示。
[0073]病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng):一免Iw后20 μ g和50 μ g免疫組產(chǎn)生的中和抗體效價分別為1:25和1:22.25，100 μ g免疫組未檢測到中和抗體；一免3w后20 μ g和50 μ g免疫組產(chǎn)生的中和抗體效價分別達到為1:78,1:89.2，100 μ g免疫組中和抗體升高至1:178 ;二免2w后20 μ g組、50 μ g組和100 μ g組的中和抗體效價分別為1:355、1:178和1:237 ;攻毒2w后三組中和抗體分別達到1:443.75、1:532.5和1:591.68，結(jié)果如圖5所示。
[0074]病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后對強毒株攻擊的保護:病毒樣顆粒疫苗二免4w后用IO7EID5tl的XJ3親本毒株進行攻毒,攻毒后僅第ld50y g和100 μ g免疫組小鼠體重下降，隨后50 μ g組小鼠開始上升，而100 μ g組小鼠體重持續(xù)保持在低水平未見顯著增長，對照組小鼠體重在攻毒后第2d開始持續(xù)下降，第6d降到與100 μ g組相似的水平，結(jié)果如圖6所示。攻毒后第2d免疫組小鼠臟器中均未檢測到病毒復(fù)制，而對照組2只小鼠肺中均能檢測到病毒。
[0075]實驗結(jié)論:本發(fā)明制備得到的H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒疫苗不含有病毒的核酸，不存在感染動物的風(fēng)險，具有良好的安全性；其中，所含有的H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒具有與天然病毒粒子類似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，能夠模擬天然病毒粒子誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；而且其制備疫苗免疫動物 后能夠區(qū)分自然感染者和免疫者，不干擾流行病學(xué)調(diào)查。小鼠免疫試驗結(jié)果表明20μ g病毒樣顆粒疫苗對小鼠具有良好的免疫保護效果。因此，本發(fā)明制備的EI重組病毒樣顆粒疫苗可以作為預(yù)防和治療馬流感的候選疫苗。
【權(quán)利要求】
1.一種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒，其特征在于通過以下方法制備得到:將SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列或與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡并性的核苷酸序列克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，所得的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組桿粒，重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，并使其表達H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白，純化，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒，其特征在于所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為pFastBac Dual。
3.如權(quán)利要求2所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒，其特征在于通過以下方法制備得到: (1)將SEQID N0.1所示的核苷酸序列克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual的BamH I和Hind III酶切位點之間，得到重組載體pFBD-XJ3_HA ； (2)將SEQID N0.2所示的核苷酸序列克隆入步驟(1)得到的重組載體pFBD-XJ3_HA的Xhol I和Nhe I酶切位點之間，得到重組載體PFBD-XJ3-HA+M1 ； (3 )將重組載體pFBD-XJ3-HA+Ml按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)說明書轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，與Bacmid進行重組，得到重組桿粒rBac-XJ3_HA+Ml ； (4)將重組桿粒rBac-XJ3-HA+Ml轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞病變達到80%后收集上清，連續(xù)傳代1-5次后得到重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml ； (5)將得到的重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml接種Sf9細(xì)胞，使其分泌表達H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白，純化，即得。
4.如權(quán)利要求3所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒，其特征在于步驟(5)中將得到的重組桿狀病毒rBV-XJ3-HA+Ml接種Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心10min去除細(xì)胞碎片，將上清進行超速離心,38000r/min離心2h,然后用20%、30%和60%蔗糖墊進行密度梯度離心，將30%和60%蔗糖墊之間的蛋白收集后進行脫糖，沉淀用TNE重懸，即為純化的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒蛋白。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒在制備預(yù)防或治療H3N8亞型馬流感藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗。
7.—種H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求1-4任一項所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒以及藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑。
8.權(quán)利要求7所述的H3N8亞型馬流感重組病毒樣顆粒疫苗在制備預(yù)防或治療H3N8亞型馬流感藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/145GK103898070SQ201410076834
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】劉明, 劉春國, 相文華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所