預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的制備，其特征在于具體步驟如下：從病貂體內(nèi)分離獲得血清G型綠膿桿菌SD302、血清C型綠膿桿菌SD312、血清I型綠膿桿菌SD403，上述菌種采用凍干保存；將三種血清型綠膿桿菌分別置于含2%胎牛血清的PYG培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)后，擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)菌液進(jìn)行滅活處理；按照菌體含量將滅活菌液運(yùn)用生理鹽水稀釋至濃度為8.0×109CFU/mL；將三種稀釋后的滅活菌液與40%鋁膠溶液按照1:1:1:1體積比混合，加入終濃度為0.004%硫柳汞，混合得到三價(jià)滅活疫苗；其具有安全、多效價(jià)性、免疫原性好和特異性好等特點(diǎn)；并且價(jià)格適中，適用于基層或臨床預(yù)防水貂出血性肺炎。
【專利說明】預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的制備方法，本疫苗屬于一種新的動(dòng)物疫苗，主要用來預(yù)防綠膿桿菌引起水貂出血性肺炎的；應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]水紹出血性肺炎是由綠膿單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,又稱綠膿桿菌)，引起水貂的一種急性接觸性傳染病，以出血性肺炎和敗血癥為主要特征。1983年首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)該病以來，陸續(xù)在各地相繼有報(bào)道，尤其在新世紀(jì)以來，水貂出血性肺炎在我國(guó)很多地方呈現(xiàn)地方性爆發(fā)。其與水貂細(xì)小病毒病、犬瘟熱并稱危害水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的三個(gè)重大傳染病。
[0003]綠膿單胞菌為重要的條件致病菌，在環(huán)境中廣泛存在，如土壤、海水、淡水以及純凈水中；綠膿桿菌為植物、大多數(shù)非哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物以及人的重要病原；而水貂是唯一的可以由綠膿桿菌引起急性、傳染性、致死性出血性肺炎的動(dòng)物。本菌具有O抗原、H抗原、黏液抗原、R抗原、菌毛抗原等成分。O抗原分為內(nèi)毒素和原內(nèi)毒素蛋白質(zhì)(originalendotoxin protein, ΟΡΕ)兩種成分。根據(jù)LPS的O抗原可以將其分為20個(gè)不同的血清型。水貂出血性肺炎呈現(xiàn)地方流行性，因此對(duì)山東地區(qū)流行血清型、菌株耐藥性以及分子型等流行病學(xué)資料的調(diào)查對(duì)該地區(qū)水貂出血性肺炎的防治起到了重要作用。
[0004]水貂出血性肺炎病原一綠膿桿菌為條件致病菌，其抵抗力強(qiáng)，容易產(chǎn)生耐藥性，故疫苗接種是預(yù)防該病的重要途徑；我國(guó)我國(guó)尚無國(guó)家認(rèn)證的水貂出血性肺炎疫苗，因此亟需研制一種針對(duì)我國(guó)流行血清型的水貂出血性肺炎疫苗。
[0005]滅活疫苗制備工藝在世界各國(guó)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，并且免疫效果良好，作為動(dòng)物疫病預(yù)防的首選策略。滅活疫苗制備主要是將病原通過甲醛等滅活后，加入佐劑，通過皮下或肌肉注射，使動(dòng)物產(chǎn)生免疫力的生物制品。其價(jià)格低廉、易于操作，同時(shí)免疫效果好，在獸醫(yī)臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明的目的在于提供一種預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的其制備方法，它是從病貂體內(nèi)分離出血清G型、血清C型、血清I型三株綠膿桿菌,并在一定條件下進(jìn)行分別培養(yǎng)，再以生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行充分滅活制備滅活菌液；將三種滅活菌液與40%鋁膠溶液等體積混合，加入終濃度為0.004%的硫柳汞，從而得到相應(yīng)的三價(jià)滅活疫苗；形成外觀呈均勻棕黃色懸液構(gòu)象，置于2-8°C保存，靜置后，上層為淡黃澄清液體，下層為灰黃色沉淀。注射時(shí)，通過肌肉注射或者皮下注射方式對(duì)水貂進(jìn)行注射，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)水貂出血性肺炎綠膿桿菌血清G型、C型、I型的中和抗體，使機(jī)體獲得對(duì)血清G型、C型、I型綠膿桿菌的免疫力；具有安全、多效價(jià)性、免疫原性好和特異性好等特點(diǎn)；并且價(jià)格適中，適用于基層或臨床預(yù)防水貂出血性肺炎。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的制備，其特征在于具體步驟如下:(I)從病貂體內(nèi)分離獲得血清G型綠膿桿菌SD302、血清C型綠膿桿菌SD312、血清I型綠膿桿菌SD403，上述菌種采用凍干保存；(2)將三種血清型綠膿桿菌分別置于含2%胎牛血清的PYG培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)后，再以生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，利用終濃度為0.2%的甲醛溶液對(duì)菌液進(jìn)行滅活處理；(3)按照菌體含量將滅活菌液運(yùn)用生理鹽水稀釋至濃度為8.0 X 109CFU/mL ； (4)將三種稀釋后的滅活菌液與40%鋁膠溶液按照1:1:1:1體積比混合，加入終濃度為0.004%硫柳汞，混合得到三價(jià)滅活疫苗；(5)對(duì)滅活疫苗進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、甲醛與硫柳汞殘留量檢測(cè)以及超劑量免疫安全性檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行滅活疫苗保護(hù)率實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)疫苗的安全性以及保護(hù)效力；疫苗要經(jīng)過物理性狀檢測(cè)、無菌檢驗(yàn)、超劑量免疫安全性檢查、效力檢查，最終2-8°C保存。使用時(shí)，充分均勻，成年水貂Iml/只肌肉注射活皮下注射，幼齡水貂0.8ml/只皮下注射。
[0008] 本發(fā)明的積極效果是其具有生物安全性，選用的疫苗株菌通過甲醛充分滅活；具有同時(shí)預(yù)防血清G型、C型、I型綠膿桿菌引起水貂出血性肺炎的功能，本疫苗所用的疫苗株均分離自我國(guó)山東地區(qū)，且通過分子分型方法確立其為流行優(yōu)勢(shì)菌株；具有免疫源性強(qiáng)，本發(fā)明是全病原滅活制備而成，因此可以產(chǎn)生強(qiáng)的免疫力；具有特異性好的特點(diǎn)，本疫苗選用的疫苗株均分離自水貂體內(nèi)，對(duì)綠膿桿菌引起的水貂出血性肺炎具有特異性好的特點(diǎn)；具有成本低的特點(diǎn)，本疫苗使用的滅活疫苗制備簡(jiǎn)易，成本低等特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明的性狀形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0011]實(shí)例1、滅活疫苗制備
1.菌種復(fù)壯
將SD403、SD302、SD312菌種分別以IOLD5tl接種小鼠，待小鼠死亡后，無菌條件下，打開胸腔，在肺臟剪一小口，用接種環(huán)蘸去，在LB固體培養(yǎng)基上劃線；37°C培養(yǎng)16h，挑取單菌落于5ml PYG培養(yǎng)基中，37°C 220 rpm培養(yǎng)12h，PCR鑒定，保存菌種。將Iml菌液加入1000mlPYG培養(yǎng)基中，37°C 220 rpm培養(yǎng)12h，活菌計(jì)數(shù)，制備種子。
[0012]2.滅活疫苗制備
(I)菌液制備和檢驗(yàn)
取檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)合格的SD403、SD302、SD312 二級(jí)種子液分別以3%比例接種于裝有PYG液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，通氣、37°C培養(yǎng)14h ；PCR鑒定、計(jì)數(shù)。
[0013](2)菌液滅活和濃縮
向前述菌液中加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，邊加邊攪拌，370C 120rpm作用48h ；將滅活后菌液沉降30d，去除上清，用生理鹽水調(diào)整菌液濃度為8.0X109CFU/mL，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。
[0014](3)三價(jià)疫苗的制備
將調(diào)整好濃度的三種單價(jià)滅活菌液與40%的Al (OH) 3溶液按照1:1:1:1混合，加入終濃度為0.004%硫柳汞，充分混勻，即為水貂出血性肺炎三價(jià)疫苗。分別制作了 3批次疫苗，分別為 201301,201302,201303ο
[0015](4)疫苗分裝
無菌檢驗(yàn)合格后的菌液按照每瓶100mL進(jìn)行分裝，密封瓶口，2-8°C保存。
[0016]實(shí)例2.滅活疫苗成品檢驗(yàn) I安全檢查
檢驗(yàn)項(xiàng)目(有無菌檢驗(yàn)，安全性檢驗(yàn)、甲醛殘留量與硫柳汞殘留量檢驗(yàn)、物理性狀)均按《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》(以下稱為《規(guī)程》)方法進(jìn)行。
[0017]1.1無菌檢驗(yàn)
參照《規(guī)則》進(jìn)行操作；經(jīng)無菌檢測(cè)，201301、201302、201303三批次疫苗無菌檢驗(yàn)均合格。
[0018]1.2物理形狀檢驗(yàn)
分別在靜置與搖勻狀態(tài)下觀察顏色、形態(tài)等；搖勻后為均勻棕黃色懸液；靜置后，上層為淡黃澄清液體，下層 為灰黃色沉淀；
1.3甲醛殘留量與硫柳汞殘留量檢驗(yàn)
參照《規(guī)則》進(jìn)行操作；經(jīng)檢測(cè)甲醛殘留量為0.10-0.13%，硫柳汞殘留量為
0.002-0.003%。均在《規(guī)則》規(guī)定范圍內(nèi)。
[0019]1.4超劑量安全性檢驗(yàn)
取3ml滅活疫苗免疫家兔5只，設(shè)立生理鹽水對(duì)照組，30日內(nèi)觀察接種疫苗試驗(yàn)動(dòng)物的采食、精神狀態(tài)以及局部吸收狀況。在注射疫苗30天內(nèi)，家兔采食、精神狀態(tài)與對(duì)照組無明顯差異，局部吸收良好。結(jié)果表明:本疫苗為安全生物制品。
[0020]2效力檢驗(yàn)
2.1水貂出血性肺炎三價(jià)滅活疫苗對(duì)小鼠免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)
將120只昆明小鼠，隨機(jī)分為12組，每組10只。第1、4、7組分別免疫0.2ml 201301批次水貂出血性肺炎三價(jià)滅活疫苗；第2、5、8組分別免疫0.2ml 201302批次水貂出血性肺炎三價(jià)滅活疫苗；第3、6、9組分別免疫0.2ml 201303批次水貂出血性肺炎三價(jià)滅活疫苗；第10、11、12組分別注射0.2ml生理鹽水。
[0021]免疫21d 后，第 1、2、3、10 組分別皮下注射 IOLD5tl SD302 (G)菌株；第 5、4、5、6、11組分別皮下注射IOLD50 SD312(C)菌株；第7、8、9、12組分別皮下注射IOLD50 SD403(I)菌株；觀察記錄小鼠死亡情況。結(jié)果顯示:免疫組小鼠全部存活，對(duì)照組全部死亡，說明本疫苗對(duì)小鼠具有良好免疫保護(hù)。
【權(quán)利要求】
1.一種預(yù)防水貂出血性肺炎的三價(jià)滅活疫苗的制備，其特征在于具體步驟如下:(1)從病貂體內(nèi)分離獲得血清G型綠膿桿菌SD302、血清C型綠膿桿菌SD312、血清I型綠膿桿菌SD403,上述菌種采用凍干保存；(2)將三種血清型綠膿桿菌分別置于含2%胎牛血清的PYG培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)后，再以生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，利用終濃度為0.2%的甲醛溶液對(duì)菌液進(jìn)行滅活處理；(3)按照菌體含量將滅活菌液運(yùn)用生理鹽水稀釋至濃度為8.0X 109CFU/mL ； (4)將三種稀釋后的滅活菌液與40%鋁膠溶液按照1:1:1:1體積比混合，加入終濃度為0.004%硫柳汞，混合得到三價(jià)滅活疫苗；(5)對(duì)滅活疫苗進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、甲醛與硫柳汞殘留量檢測(cè)以及超劑量免疫安全性檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行滅活疫苗保護(hù)率實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)疫苗的安全性以及保護(hù)效力；疫苗要經(jīng)過物理性狀檢測(cè)、無菌檢驗(yàn)、超劑量免疫安全性檢查、效力檢查，最終2-8°C保存；使用時(shí)，充分均勻，成年水貂Iml/只肌肉注射活皮下注射，幼齡水貂 .0.8ml/只皮下注射。
【文檔編號(hào)】A61K39/104GK103948918SQ201410197287
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】母連志, 韓明明, 劉慧 , 劉曉飛, 劉旭平 申請(qǐng)人:母連志