一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，包括：(1)氧化石墨烯復(fù)合材料GOX-PEI-HA的合成；(2)將氧化石墨烯復(fù)合材料溶解于水中，加入鹽酸阿霉素水溶液，并調(diào)pH值為中堿性。避光震蕩反應(yīng)后，離心除去未連接上的DOX，冷凍干燥合成GOX/DOX載藥復(fù)合物。本發(fā)明的載藥材料具有pH敏感型釋放的特點(diǎn)，可以用于抗腫瘤研究，有著很好的實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米材料的制備領(lǐng)域，特別涉及一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合 材料的制備方法。 一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，氧化石墨烯薄片是石墨粉末經(jīng)化學(xué)氧化及剝離后 的產(chǎn)物，它一方面保持了石墨烯單一原子層的層狀結(jié)構(gòu)，可以隨時(shí)在橫向尺寸上擴(kuò)展到數(shù) 十微米，這種結(jié)構(gòu)跨越了一般化學(xué)和材料科學(xué)的典型尺度，成為人們研究的熱點(diǎn)。而其在生 物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究也在這幾年興起。另一方面，經(jīng)過氧化處理后，在每一層的石墨烯單片上 引入了許多氧基功能團(tuán)，如羥基、羧基、羰基、環(huán)氧基等親水性基團(tuán)，因而具有良好的水溶液 穩(wěn)定性和生物相容性。同時(shí)，由于氧化石墨烯具有單原子層結(jié)構(gòu)，其比表面積很大，且兩個(gè) 基面都可以吸附藥物，因此非常適合用作藥物載體。
[0003] 然而盡管氧化石墨烯易溶于水，但是它在生理鹽水中由于電荷屏蔽效應(yīng)的存在易 團(tuán)聚，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值的發(fā)揮受到阻礙。納米材料的表面化學(xué)是改善 納米材料的生物相容性以及控制其在生物系統(tǒng)中行為的關(guān)鍵因素，因此不同的應(yīng)用目的， 就產(chǎn)生了不同的表面修飾方法，其中包括共價(jià)和非共價(jià)鍵修飾，最終官能化的石墨烯基材 料有望用于可控釋放及靶向控制的藥物載體，在生物醫(yī)藥和診斷等領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前 景。
[0004] 鹽酸阿霉素（Doxorubicin，D0X)屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是一種抑制DNA和RNA 合成的抗腫瘤藥物。其作用機(jī)制主要是嵌入DNA的相鄰堿基對(duì)使DNA發(fā)生錯(cuò)配，從而使DNA 鏈裂解，阻礙DNA和RNA合成。阿霉素對(duì)實(shí)體瘤的有效率約達(dá)70%，主要用于治療惡性淋巴 瘤、急性白血病、肺癌、乳腺癌、骨及軟組織肉瘤、頭頸部腫瘤、肝癌、食道癌、胃癌等?？沽鲎V 廣，應(yīng)用廣泛，鹽酸阿霉素也有著傳統(tǒng)抗癌藥物的不良反應(yīng)，主要是消化道毒性、骨髓抑制、 心臟毒性、脫發(fā)等問題，少數(shù)患者有發(fā)熱、肝功能損傷與肌紅蛋白尿、紅斑以及色素沉著。 [000 5]最近的研究表明，氧化石墨稀與阿霉素之間的結(jié)合是屬于JI-II堆積的作用力的 非共價(jià)鍵結(jié)合。這種結(jié)合是pH依賴性的，在酸性環(huán)境下，由于去質(zhì)子作用藥物從氧化石墨 烯表面離去，達(dá)到pH敏感釋放。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的 制備方法，該載藥方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和。氧化石墨烯復(fù)合載藥材料藥物裝載率高， 且具有pH敏感型釋放特性。
[0007] 本發(fā)明的一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，包括：
[0008] 將氧化石墨烯-聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸G0X-PEI-HA溶解在水中，加入阿霉素 D〇x 的水溶液，混合均勻，用氫氧化鈉調(diào)pH值至中堿性，避光搖床反應(yīng)1〇小時(shí)，離心除去未連接 上的D0X，冷凍干燥合成G0X/D0X載藥復(fù)合物。
[0009] 所述的GOX-PEI-HA與D0X的質(zhì)量比為1 : 0.5?1 : 1。
[0010] 采用〇· 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為8-10。
[0011] 所述反應(yīng)條件為避光，搖床37°C，時(shí)間4?10小時(shí)。
[0012] 所述的離心轉(zhuǎn)速為13000rpm，離心時(shí)間為8?12分鐘。
[0013] 本發(fā)明配制不同濃度的D0X磷酸緩沖溶液液及醋酸緩沖溶液，于紫外分光光度計(jì) 中檢測(cè)最大吸收值，并繪制兩種pH環(huán)境下的D0X標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014] 所述的不同pH值環(huán)境分別為5?6及7?7. 5。
[0015] 所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線D0X濃度為0. 001?0. 08mg/ml。
[0016] 本發(fā)明將G0X/D0X載藥復(fù)合物溶于PBS緩沖液中，置于透析袋。再將透析袋放入 兩種pH值環(huán)境中的溶出儀。于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，并補(bǔ)充緩沖液，得出藥物釋放曲線。
[0017] 所述透析工藝為采用透析袋，內(nèi)液為pH二7.5的PBS緩沖液，外液為步驟（2)中 的緩沖液。
[0018] 所述藥物釋放所需的G0X/D0X為0. 5?2mg,緩沖液體積為5?20ml。
[0019] 所述透析袋MW為8, 000?14, 000。
[0020] 有益效里
[0021] (1)本發(fā)明利用氧化石墨烯與阿霉素之間的π-ατ堆積作用，合成含阿霉素的氧 化石墨烯載藥復(fù)合材料，制備方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件溫和；
[0022] (2)本發(fā)明的含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料藥物裝載量高，能夠長(zhǎng)效緩釋。 且具有pH敏感型輸送，在較低pH值環(huán)境下釋放率高，適合腫瘤組織的微環(huán)境，具有應(yīng)用其 做后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析的潛力；
[0023] (3)含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料可以研究其體內(nèi)循行及特定組織的定向 輸送。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為實(shí)施例1所得的含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料在不同pH環(huán)境下的 釋放曲線。
[0025] 圖2為實(shí)施例2所得的阿霉素在不同pH環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中2a為pH = 7. 5 的PBS緩沖溶液、此為pH二5. 8的醋酸緩沖液。
[0026] 圖3為實(shí)施例3所得的不同pH條件下的D0X的上樣率和包封率。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] (1)稱取5mg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在5ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入 5mL含D0X (4. 5mg)的水溶液，用〇· 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9. 03,鋁箔紙避光，在37-C搖 床條件下反應(yīng)5h。最后將含阿霉素的氧化石墨烯溶液離心，i3〇〇〇rpm離心8min，用以將未 連接上的阿霉素除去。最后將沉淀冷凍干燥后獲得GOX/DOX。
[0030]⑵稱取 2mg 阿霉素，分別配制 〇· 〇〇2Μ、0· 004Μ、0· 008Μ、0· 01碰、0· 032M 的 PBS 溶 液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = 5· 8)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm， 收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031] (3)稱取2. 4mg載藥復(fù)合物于2. 4ml磷酸緩沖液（pH = 7. 5)中，充分溶解，各取 1ml分別放入兩個(gè)透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加15ml的 PBS溶液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = 5. 8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分 別于 2h、4h、6h、8h、1 Oh、24h、48h、72h、96h、120h 取出 lml 透析液，并回補(bǔ) lml 相應(yīng)的 PBS 緩 沖溶液和醋酸緩沖溶液。對(duì)收集的透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并 并計(jì)算藥物釋放情況。
[0032] (4)D0X在兩種pH環(huán)境下的釋放曲線如圖1所示。在120h后，D0X在pH = 5. 8的 緩釋液中約釋放25%。而在PBS環(huán)境中釋放不足5%，兩者釋放存在顯著差異，腫瘤組織較 正常組織細(xì)胞相比其pH要低，該載藥符合材料的釋放正好符合這一特性。表明該載藥復(fù)合 材料是一種可以用于腫瘤治療的pH敏感型材料。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] (1)稱取7. 8mg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在8ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入 8mL含D0X (6. 2mg)的水溶液，用0. 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 8. 86,鋁箔紙避光，在37°C搖 床條件下反應(yīng)4h。最后將含阿霉素的氧化石墨烯溶液離心，13000rpm離心8min，用以將未 連接上的阿霉素除去。最后將沉淀冷凍干燥后獲得G0X/D0X。
[0035] (2)稱取 2mg 阿霉素，分別配制 0· 0025Μ、0· 005Μ、0· 01Μ、0· 02Μ、0· 04M 的 PBS 溶液 (pH = 7· 5)及醋酸溶液（pH = 5. 8)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收 集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] (3)稱取4. 5mg載藥復(fù)合物于4. 5ml磷酸緩沖液（pH = 7. 5)中，充分溶解，各取 2ml分別放入兩個(gè)透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加20ml的 PBS溶液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = 5. 8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，分 別于 2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、96h、120h 取出 1. 5ml 透析液，并回補(bǔ) 1. 5ml 相應(yīng)的 PBS溶液和醋酸溶液。對(duì)收集的透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481mn，收集數(shù)據(jù)并并 計(jì)算藥物釋放情況。
[0037] (4)D0X在兩種pH值環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，選擇481nm處的吸光度為縱坐 標(biāo)與橫坐標(biāo)（D0X濃度）制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)D0X在PBS(pH = 7. 5)(圖2-a)中的濃度范圍在 0· 0025-0. 04mg/mL時(shí)，D0X的濃度-吸光度線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0. 99937說明其有著很好 的線性關(guān)系。當(dāng)D0X在醋酸鹽緩沖液（pH = 5. 8)(圖2-b)中的濃度范圍在0. 0025-0. 04mg/ mL時(shí)，線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0. 99993,說明該pH值下D0X的濃度-吸光度依然有著很好的 線性關(guān)系。
[0038] 實(shí)施例3
[0039] (1)稱取10. 3mg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在12ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加 入10mL含D0X(9. 8mg)的水溶液，用〇· 1M的氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH = 5. 5、6· 5、7· 5、8. 5 和9. 5,鋁箔紙避光，在37°C搖床條件下反應(yīng)5h。最后將含阿霉素的氧化石墨烯溶液離心， 13000rpm離心8min，用以將未連接上的阿霉素除去。最后將沉淀冷凍千燥后獲得G0X/D0X。
[0040]⑵稱取 2mg 阿霉素，分別配制 〇· 001Μ、0· 002Μ、0· 004Μ、0· 012M、0. 036M 的 PBS 溶 液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = δ. 8)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為48inm， 收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0041] ⑶各稱取〇· 5mg載藥復(fù)合物于1ml磷酸緩沖液（PH = 7. 5)中，充分溶解，放入兩 個(gè)透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加 KM的PBS溶液（pH = 7.5)及醋酸溶液（PH = 5. S)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、 8h、10h、24h、48h、72h、96h、120h取出lml透析液，并回補(bǔ)lml相應(yīng)的PBS溶液和醋酸溶液。 對(duì)收集的透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并計(jì)算藥物釋放情況。
[0042] ⑷不同pH條件下，DOX的上樣率和包封率如圖3所示。上樣率與包封率之比為 5 : 3。pH值環(huán)境越高越有利與藥物的上載，這是由于，堿性環(huán)境中，由于去質(zhì)子作用，阿霉 素更容易和碳納米管產(chǎn)生ji-ji堆積效應(yīng)。
[0043] 實(shí)施例4
[0044] (1)將6. lmg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在8ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入 5mL含DOX (4. 5mg)的水溶液，用0. 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9· 52,鋁箔紙避光，在37?搖 床條件下反應(yīng)5h。最后將含阿霉素的氧化石墨烯溶液離心，13000rpm離心8min，用以將未 連接上的阿霉素除去。最后將沉淀冷凍干燥后獲得GOX/DOX。
[0045]⑵稱取 2mg 阿霉素，分別配制 0· 〇〇3Μ、0· 〇〇6Μ、0· 012Μ、0· 24Μ、0· 48M 的 PBS 溶液 (pH = 7· 5)及醋酸溶液（ΡΗ = 5· S)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收 集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0046] ⑶稱取lmg載藥復(fù)合物于2ml磷酸緩沖液（ΡΗ = 7· 5)中，充分溶解，放入兩個(gè)透 析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加5ml的PBS溶液（pH = 7. 5)及 醋酸溶液（ρΗ= 5·8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、8h、10h、 24h、48h、96h、120h取出0. 8ml透析液,并回補(bǔ)0. 8ml相應(yīng)的PBS溶液和醋酸溶液。對(duì)收集 的透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481mn，收集數(shù)據(jù)并并計(jì)算藥物釋放情況。
【權(quán)利要求】
1. 一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，包括： 將氧化石墨烯-聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸GOX-ΡΕΙ-ΗΑ溶解在水中，加入阿霉素D0X的水 溶液，混合均勻，用氫氧化鈉調(diào)PH值至中堿性，搖床反應(yīng),離心除去未連接上的D〇x，所得沉 淀冷凍千燥得GOX/DOX載藥復(fù)合物。 ^
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，其 特征在于：所述的GOX-PEI-HA溶液濃度為3mg/ml-5mg/ml，GOX-PEI-HA與d〇X的質(zhì)量比為 1 : 0_ 5 ?1 : 1。
3·根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于：采用〇· 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7?10。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于：所述反應(yīng)條件為避光，搖床37°C，時(shí)間4?10小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于：所述離心轉(zhuǎn)速為l3〇〇〇rpm,離心時(shí)間為8?12分鐘。
【文檔編號(hào)】A61K31/704GK104189917SQ201410395971
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】朱利民, 楊卉卉, 陶磊, 公曉, 李赫宇, 胡娟 申請(qǐng)人:東華大學(xué)