Linc-RAM在治療肌肉疾病中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及Linc-RAM在治療肌肉疾病中的用途。具體地，本發(fā)明涉及Linc-RAM在制備治療肌肉疾病，特別是肌肉損傷和橫紋肌肉瘤的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及Linc-RAM制備促進(jìn)肌肉干細(xì)胞分化的藥物中的用途，制備促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞試劑及藥物中的用途。
【專利說明】L i nc-RAM在治療肌肉疾病中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] Linc-RAM是本發(fā)明人首次鑒定并對其功能和分子機(jī)制進(jìn)行研究，本發(fā)明涉及 Linc-RAM在治療肌肉疾病，特別是肌肉損傷和橫紋肌肉瘤的作用。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨骼肌是人體最大的組織器官，約占體重的40%，在生物體的生命活動(dòng)中起著非 常重要的作用。它不僅發(fā)揮運(yùn)動(dòng)和支持的功能，同時(shí)它也是一個(gè)重要的代謝器官。身體所 攝取的糖和脂類物質(zhì)大多在骨骼肌中代謝產(chǎn)生能量，這對維持整個(gè)身體的平衡狀態(tài)起著非 常重要的作用。骨骼肌的發(fā)生是一個(gè)有序和嚴(yán)格調(diào)控的過程，不僅受各種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄 因子的調(diào)控，同時(shí)受到ncRNAs以及染色質(zhì)修飾和重塑等表觀遺傳的精細(xì)調(diào)控。
[0003] 在眾多的肌肉疾病中，如周期性癱瘓、肌營養(yǎng)不良、肌炎等都存在不同程度的肌肉 損傷，目前的治療藥物較少、副作用較大，效果較差。如杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD)，是一種性 聯(lián)隱性遺傳病，又名為假性肥大型肌肉萎縮癥，為癥狀最嚴(yán)重的肌肉萎縮癥。由于基因突 變?nèi)毕輰?dǎo)致肌肉細(xì)胞不能正常產(chǎn)生一種稱為抗肌萎縮蛋白（Dystrophin)的蛋白質(zhì)，會(huì)使 鈣離子滲入細(xì)胞，引發(fā)瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致患者全身肌肉無力，又因肌肉細(xì)胞內(nèi)缺少抗肌萎縮蛋 白，導(dǎo)致細(xì)胞組織肌肉纖維變得無力且脆弱，其肌細(xì)胞不斷地處于損傷修復(fù)過程中,經(jīng)長期 的伸展后該缺失肌肉細(xì)胞組織將產(chǎn)生機(jī)械性傷害等因素而破壞，最終導(dǎo)致肌肉細(xì)胞死亡。 全球平均每3500個(gè)新生男嬰中就有一人罹患此病，患者在學(xué)齡前就會(huì)因骨骼肌不斷退化 出現(xiàn)肌肉無力或萎縮，導(dǎo)致不便行走。大概在7歲到12歲時(shí)，會(huì)徹底喪失行走能力，通常到 20多歲就會(huì)因?yàn)樾募?、肺肌無力而死亡。目前針對該病，醫(yī)學(xué)界尚無有效療法。
[0004] 近年來，將成體干細(xì)胞植入DMD肌肉疾病的小鼠體內(nèi)，取得顯著治療效果， 參見 Benchaouir R，Meregalli M，F(xiàn)arini A，D'Antona G，Belicchi M，Goyenvalle A, Bat t i ste 11 i M,Bresolin N,Bottinelli R,Garcia L, Torrente Y.Cell Stem Cell. Restoration of human dystrophin following transplantation of exon-skipping-engineered DMD patient stem cellsinto dystrophic mice. 2007, 1 (6) :646-57。但是成肌細(xì)胞移植治療存在著排異反應(yīng)以及差的細(xì)胞生存率等 局限性，Partridge TA. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 2002, 9(11) :752-3。利用基因治療將肌萎縮蛋白（Dystrophin)導(dǎo)入患者體內(nèi)， 使之表達(dá)肌萎縮蛋白，具體實(shí)施非常困難，主要是因?yàn)閿y帶DNA片段較大且要將它們置于 大基因組的正確的位置，且外源DNA需先轉(zhuǎn)錄mRNA后再翻譯為目的蛋白，此過程會(huì)受到體 內(nèi)各種機(jī)制的調(diào)節(jié)和影響。因而尋找到直接用于基因治療的核酸類藥物更容易治療或緩解 疾病的效果。
[0005] 此外，橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma)是發(fā)生自胚胎間葉組織的一種惡性腫 瘤，其細(xì)胞類似于成肌細(xì)胞（myoblast)，大多數(shù)的橫紋肌肉瘤細(xì)胞表達(dá)生肌決定因子 (myogenic differentiation l，MyoD)，然而橫紋肌肉瘤細(xì)胞卻不具備從增殖至終末分化 的能力，因而無限增殖，形成惡性腫瘤。橫紋肌肉瘤占兒童實(shí)體腫瘤的15%，軟組織肉瘤的 50%。臨床表現(xiàn)的多樣性、病理改變的多重性以及發(fā)病部位的不同，使橫紋肌肉瘤成為小兒 腫瘤中最復(fù)雜的一種。橫紋肌肉瘤分成以下4種亞型：胚胎型、腺泡型、葡萄簇型和多形型。 早期的根治性手術(shù)方法包括截肢、骨盆及眼眶腫瘤剜除術(shù)。在過去的幾十年里，針對腫瘤的 不同發(fā)生部位及其擴(kuò)展的范圍采用化療、放療與手術(shù)相結(jié)合的措施，患者的生存率有了顯 著地提高，由于橫紋肌肉瘤的治療具有特征性，即外科及放射的局部治療往往達(dá)不到長期 生存的目的，只有應(yīng)用全身性化療才能明顯提高生存率，這種全身性的化療對人體產(chǎn)生極 大的危害。
[0006] 因此，尋找抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞增殖，且降低對病人身體傷害的藥物成為當(dāng)今癌 癥治療的研究熱點(diǎn)，目前，已有報(bào)道表明anti-miR-122在美國已經(jīng)獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床治療肝 癌，提示越來越多的核酸類藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用的可能性，且核酸類藥物因其自身的使用方 便，容易大量生產(chǎn)，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，為臨床用藥的選擇提供了潛能。
[0007] 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, IncRNA)廣泛存在于各種生物體中， 參見 Stefani G, Slack FJ_ Small non-coding RNAs in animal development· Nat Rev Mol Cell Biol. 2008,9(3):219-30。絕大多數(shù)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄并經(jīng)可變剪接而來。 IncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形 式在多種層面上，如表觀遺傳調(diào)控、參見Mazo A, Hodgson JW，Petruk S，Sedkov Y, Brock HW. Transcriptional interference:an unexpected layer of complexity in gene regulation. J Cell Sci. 2007, 120(Pt 16):2755-61 ；Katayama S, Tomaru Y, Kasukawa T, ffaki K, Nakanishi M, Nakamura M, et al.Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science, 2005, 309 (5740) : 1564-6。轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等調(diào)控基因 的表達(dá)水平。
[0008] 最近的研究表明，一些IncRNAs參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子 和信號分子的表達(dá)，從而調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化。如，Myostain處理小鼠后， Malatl在腓腸肌中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞和原代骨骼肌 細(xì)胞分化時(shí)Malat 1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，敲除Malat 1后，細(xì)胞增殖受到抑制，參見Watts R, Johnsen VL, Shearer J, Hittel DS Myostatin-induced inhibition of the long noncoding RNA Malatl is associated with decreased myogenesis. Am J Physiol Cell Physiol.2013,304(10):C995-1001。類固醇受體 RNA 激活子（SRA)可轉(zhuǎn)錄為非編 碼（SRA ncRNA)和編碼的SRAP亞型，SRAncRNA能夠增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞分化，同時(shí)SRA ncRNA 與MyoD結(jié)合后，能夠增強(qiáng)MyoD介導(dǎo)的非骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為骨骼肌細(xì)胞，但是這種作 用可被SRAP抑制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SRAP的抑制作用需要通過與SRA ncRNA的相互作 用得以實(shí)現(xiàn)，參見 Caretti G，Schiltz RL，Dilworth FJ，Di Padova M，Zhao P, Ogryzko V, Fuller-Pace FV, Hoffman EP, Tapscott SJ, Sartorelli V. The RNA helicases p68/ p72and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 2006, 11(4) :547-60 ；HubeF,Velasco G,Rollin J, Furling D, Francastel C. Steroid receptor RNA activator protein binds to and counteracts SRA RNA-mediated activation of MyoD and muscle differentiation. Nucleic Acids Res. 2011，39(2) :513-25。
[0009] 目前，對于IncRNAs調(diào)控骨骼肌發(fā)育的機(jī)制研究中，有研究者發(fā)現(xiàn)IncRNAs能夠 調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)或與miRNAs相互作用，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。如，YY1 正調(diào)控骨骼肌相關(guān)的lincRNA-Yam-1的表達(dá)，Yam-1通過調(diào)節(jié)miR-715的表達(dá)抑制骨骼 肌生成，參見 Lu L，Sun K, Chen X，Zhao Y, Wang L, Zhou L, Sun H, Wang H. Genome-wide survey by ChIP-seq reveals YY1 regulation of lincRNAs in skeletal myogenesis. EMBO J. 2013, 32(19) : 2575-88。H19敲除的骨骼肌細(xì)胞和小鼠骨骼肌干細(xì)胞分化受到抑制， 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H19基因第一個(gè)外顯子編碼miR-675-3p和miR-675-5p兩個(gè)miRNA,兩者 隨著分化逐漸被誘導(dǎo)表達(dá)，二者能夠彌補(bǔ)由于H19敲除所造成的骨骼肌細(xì)胞分化和損傷修 復(fù)抑制，參見 Dey BK, Pfeifer K，Dutta A. The H19 long noncoding RNA gives rise to microRNAs miR-675-3p and miR-675-5p to promote skeletal muscle differentiation and regeneration. Genes Dev. 2014 Mar 1;28 (5) :491-501。Cesana 等通過分析 miR-206 和miR_133b的基因組結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)一個(gè)骨骼肌細(xì)胞特異性表達(dá)且隨著骨骼肌細(xì)胞分化表達(dá)上 調(diào)的長鏈非編碼RNA--linc-MDl，linc-MDl基因與miR-206和miR-133b的基因組序列重 疊，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，line-MD1通過結(jié)合miR-133和miR-135,競爭性調(diào)節(jié)miR-133和miR-135 與其靶基因 MAML1和MEF2C結(jié)合，從而調(diào)控骨骼肌細(xì)胞分化，參見Cesana M，Cacchiarelli D, Legnini I, Santini T, Sthandier 0, Chinappi M，Tramontane) A, Bozzoni I. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 20110ct 14 ;147(2) :358_69。提示，miRNAs 作為 IncRNAs 與耙基因 之間的橋梁，可能對探討IncRNAs的作用機(jī)制更顯捷徑。
[0010] 同樣，在肌肉疾病中可以檢測到一些IncRNAs分子的異常表達(dá)，提示IncRNAs參 與肌肉疾病的生理病理進(jìn)程。DMD基因座位鑒定出一系列IncRNAs，提示這些IncRNAs可 能參與肌營養(yǎng)不良，參見 Bovolenta M，Erriquez D，Valli E，Brioschi S, Scotton C, Neri M, Falzarano MS, Gherardi S, Fabris M, Rimessi P, Gualandi F, Perini G, Ferlini A. The DMD locus harbours multiple long non-coding RNAs which orchestrate and control transcription of muscle dystrophin mRNA isoforms· PLoS One. 2012,7(9):e45328。 Linc-MDl 在杜氏肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，參見 Cesana M, Cacchiarelli D, Legnini I，Santini T, Sthandier 0, Chinappi M, Tramontane) A, Bozzoni I. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 2011 Oct 14 ; 147 (2) :358-69。面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（FSHD)是常染色體顯性遺傳肌肉病，大部 分患者存在4q35的D4Z4重復(fù)序列的缺失，健康的受試者D4Z4募集PcG蛋白抑制4q35基 因，F(xiàn)SHD患者由于D4Z4的缺失，PcG復(fù)合體的沉默作用降低，導(dǎo)致產(chǎn)生染色質(zhì)相關(guān)的非編碼 RNA-DBE-T，DBE-T募集AshlL蛋白到FSHD位點(diǎn)，使H3K36去甲基化，染色質(zhì)重塑，導(dǎo)致4q35 區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄激活，參見 Cabianca DS, Casa V，Bodega B，Xynos A, Ginelli E, Tanaka Y, Gabel1 ini D. A long ncRNA links copy number variation to a polycomb/trithorax epigenetic switch in FSHD muscular dystrophy. Cell. 2012, 149(4) :819-31,提示DBE-T 參與面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)生發(fā)展。
[0011] 這些研究結(jié)果提示IncRNAs參與骨骼肌細(xì)胞增殖、分化及骨骼肌發(fā)育的調(diào)控，并 且在肌肉疾病的病理發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。MyoD是肌生成中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào) 節(jié)Myogenin等一系列肌生成相關(guān)基因的表達(dá)，MyoD敲除的小鼠肌肉損傷修復(fù)存在缺陷， 參見 Yablonka-Reuveni Z，Rudnicki MA, Rivera AJ，Primig M, Anderson JE，Natanson P. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Dev Biol. 1999, 210(2) :440-55 ;且異位表達(dá)MyoD可將成 纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞，參見 Tapscott SJ, Davis RL, Thayer MJ, Cheng PF，Weintraub H, Lassar AB. MyoDl:a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 1988,242(4877) :405-11。因而尋找受 MyoD 調(diào)控且在骨骼肌細(xì)胞中特異表達(dá)的IncRNAs可能在肌生成以及肌肉疾病的病理發(fā)生過程 中發(fā)揮重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明人通過一系列實(shí)驗(yàn)首次鑒定一個(gè)受MyoD調(diào)控的長鏈非編碼 RNA-2310015B20Rik，根據(jù)RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其5'端增加四個(gè)堿基序列（CAGT)，遂全長變?yōu)?447bp，因其在骨骼肌細(xì)胞中特異表達(dá)，其表達(dá)量在小鼠骨骼肌發(fā)育、C2C12細(xì)胞以及分離的 原代成肌細(xì)胞的分化過程中逐漸上調(diào)，且在基因組中介于兩個(gè)編碼蛋白的基因之間，命名 為 Linc-RAM(linc-RNA Activator of Myogenesis)。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，Linc-RAM 受:轉(zhuǎn) 錄因子MyoD調(diào)控，顯著促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化，在CTX誘導(dǎo)的急性肌肉損傷修復(fù)模型中顯著 促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)進(jìn)程，Linc-RAM單獨(dú)或者協(xié)助MyoD將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成肌細(xì)胞。 將小鼠的Linc-RAM在胚胎型橫紋肌肉瘤細(xì)胞系RD細(xì)胞中異位表達(dá)，Linc-RAM顯著抑制RD 細(xì)胞增殖，并促進(jìn)分化。并且，人-Linc-RAM在人類肌肉營養(yǎng)不良疾病中表達(dá)下調(diào)，提示可 能在肌肉疾病中發(fā)揮作用。
[0013] 分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Linc-RAM作為MyoD的共激活子調(diào)節(jié)肌源性基因的表達(dá)，進(jìn)一 步研究發(fā)現(xiàn)Linc-RAM通過與MyoD結(jié)合，介導(dǎo)MyoD-Baf60c-Brgl復(fù)合體的形成，從而使染 色質(zhì)重塑，調(diào)節(jié)下游肌源性基因的表達(dá)，并且這種作用是p38a依賴的。分子信號傳導(dǎo)研究 發(fā)現(xiàn)bFGF通過RAS/Raf/Mek/Erkl/2/MyoD信號通路調(diào)節(jié)Linc-RAM的表達(dá)。
[0014] 我們的研究提示Linc-RAM促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化，單獨(dú)或者協(xié)助MyoD將成纖維細(xì) 胞轉(zhuǎn)分化為成肌細(xì)胞，促進(jìn)RD細(xì)胞分化，在人類肌肉疾病治療中具有潛在作用。
[0015] 因此，本發(fā)明提供一種長鏈非編碼RNA分子在制備治療肌肉疾病的藥物中的用 途，所述長鏈非編碼RNA分子選自Linc-RAM。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肌肉疾病選自肌肉損傷或橫紋肌肉瘤。
[0017] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肌肉損傷為急性肌肉損傷。
[0018] 本發(fā)明另一方面提供一種長鏈非編碼RNA分子在制備促進(jìn)肌肉干細(xì)胞分化、成纖 維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、促進(jìn)橫紋肌肉瘤細(xì)胞分化的藥物中的用途，所述長鏈非編碼RNA分子選自 Linc-RAM〇
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種含有編碼Linc-RAM的核苷酸的載體用于治療肌肉疾病， 特別是肌肉損傷和橫紋肌肉瘤用途。優(yōu)選地，所述肌肉損傷為急性肌肉損傷。
[0020] 術(shù)語"肌肉損傷"是指在直接外力或間接外力的作用下引起的肌肉的挫傷、拉傷 等，急性肌肉損傷是指肌肉的急性損傷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1A顯示Line-RAM在小鼠不同組織中的表達(dá)情況；圖1B顯示Linc-RAM在小鼠 胚胎11. 5天的表達(dá)情況；圖1C顯示Line-RAM在小鼠骨骼肌不同發(fā)育階段中的表達(dá)情況； 圖1D顯示Linc-RAM在C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況；圖1E顯示Linc-RAM在小鼠原 代成肌細(xì)胞的表達(dá)情況；圖1F顯示ChIP-PCR檢測MyoD在Linc-RAM的啟動(dòng)子區(qū)具有結(jié)合 位點(diǎn)；圖1G顯示熒光素酶報(bào)告基因檢測MyoD通過結(jié)合Line-RAM啟動(dòng)子區(qū)域的E-Box調(diào)節(jié) Linc-RAM的表達(dá)；1H顯示異位表達(dá)MyoD的成纖維細(xì)胞中，Linc-RAM被誘導(dǎo)表達(dá)；圖II顯 示Linc-RAM在MyoD敲除的小鼠骨骼肌中的表達(dá)情況；圖1J顯示Linc-RAM在細(xì)胞質(zhì)和細(xì) 胞核中的分布；圖1K顯示FISH檢測Line-RAM在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布。
[0022]圖2A顯示利用慢病毒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞構(gòu)建Linc-RAM敲低的細(xì)胞系，real-time PCR檢測Line-RAM的敲低倍數(shù)；圖2B顯示C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM敲低細(xì)胞分化60 小時(shí)后MHC(綠色）免疫熒光染色結(jié)果，DAPI染色（紅色）定位細(xì)胞核；圖2C顯示MHC陽性 細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖2D顯示C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM敲低的細(xì)胞分化60小時(shí)后MHC 蛋白水平的檢測結(jié)果；圖2E顯示利用慢病毒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞構(gòu)建Line-RAM高表達(dá)的細(xì)胞 系，real-time PCR 檢測 Line-RAM 的高表達(dá)倍數(shù)；圖 2F 顯示 C2C12-NC 和 C2C12-Linc-RAM 高表達(dá)的細(xì)胞分化6〇小時(shí)后MHC (綠色）免疫熒光染色結(jié)果，DAPI染色（紅色）定位細(xì)胞 核；圖2G顯不MHC陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖2H顯不C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM高表達(dá) 的細(xì)胞分化60小時(shí)后MHC蛋白水平的檢測結(jié)果；圖21顯示利用慢病毒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞構(gòu) 建MyoD敲低的細(xì)胞系，real-time PCR檢測MyoD mRNA敲低倍數(shù)；圖2J顯示Line-RAM高 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MyoD敲低的C2C12細(xì)胞分化24h后，Myogenin (綠色）免疫熒光染色結(jié)果， DAPI染色（紅色）定位細(xì)胞核；圖2K顯示Myogenin陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖2L顯示 Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MyoD敲低的C2C12細(xì)胞分化24h后，檢測Myogenin mRNA的表 達(dá)。
[0023] 圖3A-1和圖3A-2分別顯示利用慢病毒轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞構(gòu)建Linc-RAM高表達(dá) 和MyoD高表達(dá)的細(xì)胞系，real-time PCR檢測Linc-RAM和MyoD的高表達(dá)倍數(shù)；圖3B顯示 Linc-RAM高表達(dá)和MyoD高表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞分化3天后MHC (綠色）免疫熒光染色結(jié) 果，DAPI染色（藍(lán)色）定位細(xì)胞核；圖3C-1至圖3C-3顯示real-time PCR檢測MyoD高表 達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞分化3天后Linc-RAM，MyoG和MHC mRNA的表達(dá)；圖3D-1至圖3D-3顯 示 real-time PCR 檢測 Linc-RAM 高表達(dá)的 C3H10T1/2 細(xì)胞分化 3 天后 Linc-RAM，MyoG 和 MHC mRNA的表達(dá)；圖3E顯示MyoD高表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞分別高表達(dá)和敲低Linc-RAM后 分化48小時(shí)，MHC mRNA的表達(dá)情況；圖3F顯示MyoD高表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞分別高表達(dá) 和敲低Linc-RAM后分化48小時(shí)，MHC免疫熒光染色結(jié)果；圖3G顯示敲低Linc-RAM分化48 小時(shí)后，MHC陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖3H顯示敲低Linc-RAM分化48小時(shí)后MHC陽性多核 (>2個(gè)）細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖 31顯示收取處于增殖期和分化48小時(shí)Line-RAM和MyoD高 表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞，RNA-seq檢測差異表達(dá)的基因 ，Heat map顯示差異表達(dá)（fold>2) 的基因；圖3J顯示RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞譜系和成肌細(xì)胞譜系相關(guān)基因在Line-RAM高表 達(dá)和MyoD高表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化。
[0024] 圖4A-1和圖4A-2顯示CTX損傷24小時(shí)的脛骨前肌電轉(zhuǎn)Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒后， RT-PCR檢測Linc-RAM的表達(dá)；圖4B顯示CTX損傷的脛骨前肌電轉(zhuǎn)Line-RAM髙表達(dá)質(zhì)粒 5. 5和7. 5天后，脛骨前肌橫切面HE染色結(jié)果；圖4C顯示CTX損傷7. 5天脛骨前肌肌纖維 橫切面面積統(tǒng)計(jì)；圖4D-1至圖4D-3顯不CTX損傷3. 5天，real-time PCR檢測MyoD，MyoG 和MHC mRNA的表達(dá)。
[0025] 圖5A顯示利用慢病毒轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞構(gòu)建小鼠-Linc-RAM高表達(dá)的細(xì)胞系，RT-PCR 檢測Linc-RAM的高表達(dá)倍數(shù)；圖5B顯示Linc-RAM高表達(dá)的RD細(xì)胞分化72小時(shí)后MHC (綠 色）免疫熒光染色結(jié)果，DAPI染色（紅色）定位細(xì)胞核；圖5C顯示MHC陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng) 計(jì)結(jié)果；圖5D-1和圖5D-2顯示real-timePCR檢測Linc-RAM高表達(dá)的RD細(xì)胞分化3天 后MyoD和MyoG mRNA的表達(dá)；圖5E顯示根據(jù)小鼠 Linc-RAM在基因組中的位置，通過同源 線性區(qū)域分析人類基因組中human-Linc-RAM，包括兩種變體；圖5F-1至圖5F-4顯示人類 肌營養(yǎng)不良的樣品中檢測human-Linc-RAM的表達(dá)，以及MyoD和MyoG mRNA的表達(dá)，其中 1111111&11-1^1^-1^1包括兩個(gè)變體，4代表正常的骨骼肌組織，8代表肌營養(yǎng)不良組織，3,5,6， 7,8代表5個(gè)肌營養(yǎng)不良的病人。
[0026] 圖6A顯示Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞分化12小時(shí)，RNA-seq檢測差異 表達(dá)的基因 ，Heat map顯示差異表達(dá)（f〇ld>2)的基因；圖6B顯示G0基因注釋的結(jié)果；圖 6C顯示MyoD和Linc-RAM共同調(diào)節(jié)的基因；圖6D顯示MyoD和Linc-RAM共同調(diào)節(jié)與肌細(xì)胞 增殖，分化和結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因；圖6E顯示RT-PCR進(jìn)一步確定MyoD和Linc-RAM共同調(diào)節(jié)的 基因在Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞分化12小時(shí)后的表達(dá)變化；圖6F顯示不同劑 量（0,0· 6ug, 1. Oug)的Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒與0. 4ug MyoD高表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染C3H10T1/2 細(xì)胞，突光素酶報(bào)告基因檢測MyoG啟動(dòng)子（MyoG基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-470bp?+103bp) 活性；圖6G顯示C3H10T1/2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染MyoD和Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒分化48小時(shí)后， real-time PCR檢測MyoG的表達(dá)；圖6H-1至圖6H-3顯示甲醛固定Linc-RAM高表達(dá)和敲 低的C2C12細(xì)胞，超聲破碎后分別加入MyoD, H3K4Me3和Pol II抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉 淀實(shí)驗(yàn)，real-time分別檢測這三種蛋白在MyoG啟動(dòng)子區(qū)域的富集程度；圖61-1至圖61-3 顯示甲醛固定Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞，超聲破碎后分別用MyoD, H3K4Me3和 Pol II抗體染色質(zhì)免疫共沉淀，real-time分別檢測這三種蛋白在miR-206(遠(yuǎn)端）啟動(dòng)子 區(qū)域的富集程度。
[0027] 圖7A顯示提取RNase-free的C2C12細(xì)胞裂解液，利用MyoD抗體免疫共沉淀， Western Blot檢測MyoD蛋白水平，RT-PCR檢測Line-RAM水平；圖7B顯示提取RNase-free 的C2C12細(xì)胞裂解液，分別利用MyoD，Baf60c和Brgl抗體免疫共沉淀，RT-PCR檢測 Linc-RAM水平；圖7C-1和圖7C-2顯示real-time PCR檢測Linc-RAM高表達(dá)和敲低的 C2C12細(xì)胞中Baf60c和Brgl mRNA的表達(dá)量；圖7D顯示分別提取Linc-RAM高表達(dá)和敲低 的C2C12細(xì)胞RNase-free裂解液，利用MyoD抗體免疫共沉淀，Western Blot檢測MyoD, Baf60c和Brgl蛋白水平；圖7E-1至圖7E-4顯示甲醛固定Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12 細(xì)胞，超聲破碎后分別用MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac抗體染色質(zhì)免疫共沉淀，real-time PCR分別檢測MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac蛋白在MyoG啟動(dòng)子區(qū)域的富集程度；圖7F顯示 10uM SB203580處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞分化36小時(shí)，MHC (綠色）免疫熒光染 色結(jié)果，DAPI染色（藍(lán)色）定位細(xì)胞核；圖7G顯示MHC陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖7H顯示 10uM SB203580處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞分化36小時(shí)，MHC mRNA水平的檢測結(jié) 果；圖71顯示10uM SB203580處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞分化18小時(shí)，Line-_ 的表達(dá)結(jié)果；圖7J顯示10uM SB203580處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞分化18小時(shí)， 甲醛固定Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞，超生聲破碎后用Brgl抗體染色質(zhì)免疫共沉淀， real-time分別檢測Brgl在MyoG啟動(dòng)子區(qū)域的富集程度。
[0028]圖8A1至圖8A3顯示10ng/mL bFGF處理C2C12細(xì)胞分化6、12、24小時(shí)后檢測 Linc-RAM的表達(dá)情況；圖8B顯示C2C12細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Linc-RAM野生型和突變型啟動(dòng)子， 即 Linc-RAM-WT(-390bp ?+80bp)和 Linc-RAM-Mutant(-87 和-88 位堿基突變），l〇ng/ mL bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因檢測Linc-RAM啟動(dòng)子的活性， MyoD(-lkb)和MyoG(GBBS)啟動(dòng)子作為陽性對照；圖8C顯示10uM PD98059預(yù)處理C2C12 細(xì)胞1小時(shí)后再用bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)檢測p-Erk, t-Erk，p-MEK, t-MEK蛋 白的表達(dá)情況；圖8D-1至圖8D-3顯示PD98059預(yù)處理C2C12細(xì)胞1小時(shí)后再用bFGF處理 C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)檢測MyoD，Linc-RAM和MyoG的表達(dá)情況；圖8E顯示10uM PD98059 預(yù)處理C2C12細(xì)胞1小時(shí)后再用bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因檢 測Linc-RAM-WT和Linc-RAM-Mutant啟動(dòng)子的活性；圖8F-1至圖8F-3顯示5uM FTA預(yù)處 理C2C12細(xì)胞30分鐘后再用bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)，檢測MyoD，Linc-RAM和 MyoG的表達(dá)情況；圖8G-1至圖8G-3顯示2. 5uM GW預(yù)處理C2C12細(xì)胞30分鐘后再用bFGF 處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)后，檢測MyoD，Linc-RAM和MyoG的表達(dá)情況；圖8H顯示bFGF 處理 C2C12-NC 和 C2C12-Linc-RAM-0E 細(xì)胞分化 24,36 小時(shí)后 Myogenin 和 MHC (綠色）免 疫突光染色結(jié)果，DAPI染色（紅色）定位細(xì)胞核；圖81顯示Myogenin陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì) 結(jié)果；圖8J顯示MHC陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是用于闡明本發(fā)明而不以任 何方式限制本發(fā)明。
[0030] 本發(fā)明所使用的Linc-RAM由生物信息學(xué)分析得到，RT-PCR檢測Linc-RAM的表達(dá) 量。
[0031] 實(shí)施例1發(fā)現(xiàn)一個(gè)受MyoD調(diào)控并在骨骼肌細(xì)胞中特異表達(dá)的長鏈非編碼RNA，命 名為 Linc-RAM
[0032] 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表文章中的兩套數(shù)據(jù)庫，參見Cao Y, Yao Z, Sarkar D, Lawrence M, Sanchez GJ, Parker MH, MacQuarrie KL, Davison J, Morgan MT, Ruzzo WL, Gentleman RC,Tapscott SJ. Genome-wide MyoD binding in skeletal muscle cells:a potential for broad cellular reprogramming. Dev Cell. 2010, 18 (4):662-74 ；Trapnell C, Williams BA,Pertea G,Mortazavi A,Kwan G,van Baren MJ,Salzberg SL,Wold BJ, Pachter L.Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.2 010, 28(5) :511-5,利用生物信息學(xué)分析得到一系列受MyoD調(diào)控的IncRNAs，RT-PCR檢 測這些IncRNAs在肌生成過程中的表達(dá)圖譜，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)在骨骼肌中特異表達(dá)的 lncRNA-2310015B20Rik,同時(shí)早期胚胎（E11. 5)體節(jié)中也檢測到其表達(dá),23l〇〇l5B2〇Rik 位于小鼠 10號染色體，介于ccdc6和slcl6a9兩個(gè)編碼蛋白基因之間，2310015B20Rik在核 質(zhì)中均有表達(dá)，且保守性較低，2310015B20Rik的表達(dá)量隨著肌生成過程逐漸上調(diào)，命名為 Linc-RAM〇
[0033] 通過Northern Blot檢測Linc-RAM在小鼠各組織中的分布；通過原位雜交檢 測Linc-RAM在胚胎期的表達(dá)情況。按照常規(guī)操作進(jìn)行骨骼肌原代成肌細(xì)胞（primary myoblasts)的分離與培養(yǎng)；提取C2C12細(xì)胞和骨骼肌組織中總RNA，RT-PCR檢測Linc-RAM 的表達(dá)量。
[0034] 結(jié)果：如圖1A至1E所示，Linc-RAM在骨骼肌細(xì)胞中特異表達(dá)，小鼠胚胎11. 5天 檢測Linc-RAM表達(dá)。其表達(dá)量在骨骼肌發(fā)育，C2Q2細(xì)胞分化以及原代成肌細(xì)胞中，隨著 肌生成過程逐漸上調(diào)。結(jié)果提示Linc-RAM在肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用。
[0035] MyoD在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Linc-RAM表達(dá)
[0036] ChIP-PCR檢測MyoD在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Linc-RAM表達(dá)
[0037] 根據(jù)預(yù)測的MyoD在Linc-RAM啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)（E-Box)設(shè)計(jì)多組引物， RT-PCR檢測MyoD是否結(jié)合在Linc-RAM的啟動(dòng)子區(qū)域。
[0038] 結(jié)果：如圖1F所不，MyoD在Linc-RAM的啟動(dòng)子區(qū)域有結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果提示MyoD 調(diào)節(jié)Linc-RAM的表達(dá)。
[0039] 另外，本發(fā)明人將Linc-RAM的啟動(dòng)子區(qū)域（-390bp?+80bp)插入到pGL3-Basic 載體，并將Linc-_啟動(dòng)子區(qū)域的MyoD結(jié)合位點(diǎn)（E-Box)進(jìn)行點(diǎn)突變（-87和-88位堿基 突變）后插入到pGL3-Basic載體，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（如圖1G)表明MyoD通過結(jié) 合在Linc-RAM啟動(dòng)子區(qū)域的E-Box調(diào)節(jié)Linc-RAM轉(zhuǎn)錄。異位轉(zhuǎn)染MyoD高表達(dá)質(zhì)粒的成 纖維細(xì)胞中，MyoD誘導(dǎo)Linc-RAM的表達(dá)（如圖1H)。MyoD敲除的小鼠骨骼肌中Linc-RAM 的表達(dá)顯著下調(diào)（如圖II)。以上所有結(jié)果顯示MyoD調(diào)節(jié)Linc-RAM的表達(dá)。
[0040] 檢測Linc-RAM在細(xì)胞中的分布
[0041] 根據(jù)核質(zhì)分離試劑盒（Ambion公司）的步驟，分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA， RT-PCR檢測Linc-RAM在細(xì)胞中的分布。FISH技術(shù)進(jìn)一步檢測Linc-RAM在細(xì)胞中的分布。 [0042] 結(jié)果：如圖1J和1K所示，Line-RAM在核質(zhì)中均有表達(dá)，且細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量多于細(xì) 胞核。結(jié)果提示Linc-RAM可能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮不同的作用。
[0043] 實(shí)施例2 Linc-RAM對骨骼肌干細(xì)胞系分化的作用
[0044] 構(gòu)建Linc-RAM高表達(dá)及敲低細(xì)胞系
[0045] 利用 BL0CK-It Lentiviral RNAi Expression System(Invitrogen)構(gòu)建 sh-Linc-RAM敲低質(zhì)粒，與病毒包裝質(zhì)粒pVSVG，Λ 〇8· 91共感染29：3T細(xì)胞，分別收集24 小時(shí)和48小時(shí)上清，1100g離心3. 5分鐘去除細(xì)胞碎片，〇· 45um濾器過濾，24000rpm/min 離心2.4h，100ul PBS溶解病毒顆粒，感染C2C12 (購自ATCC)細(xì)胞48小時(shí)后，殺稻癌菌素 (Invitrogen)篩選得到Linc-RAM(sh-Linc-RAM)敲抵細(xì)胞系。同樣的方法得到(^ 〇111：1>〇1質(zhì) 粒對照組細(xì)胞系。 ~
[0046] 將 BLOCK-It Lentiviral RNAi Expression System 中的 pENTRTM/U6 Entry Construct pU6啟動(dòng)子表達(dá)區(qū)域置換為pEGFP-Nl的pCMV啟動(dòng)子表達(dá)區(qū)域，得到質(zhì)粒命名為 pvirus (從香港科技大學(xué)部振國老師處得到），將Line-RAM片段插入該質(zhì)粒，與pLenti6/ BL0CK-iT-DEST質(zhì)粒重組后，包裝病毒，感染C2C12細(xì)胞得到Line-RAM高表達(dá)（Linc-RAM 0E)的C2C12細(xì)胞系。
[0047] Real-time RT-PCR 檢測 Line-RAM 表達(dá)
[0048] 結(jié)果：如圖2A和2E所不，Line-RAM在1?表達(dá)和敲除的細(xì)胞系中分別被高表達(dá)和 敲低，結(jié)果提示細(xì)胞系構(gòu)建成功。
[0049] 免疫熒光檢測Linc-RAM對C2C12細(xì)胞分化的影響
[0050] 分別將1. 2 X 104個(gè)Line-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中（DMEM 培養(yǎng)基，包含10%胎牛血清，1 %青霉素，1 %鏈霉素，1 %谷氨酰胺），培養(yǎng)24h換分化培養(yǎng)基 (DMEM培養(yǎng)基，包含2%馬血清，1 %青霉素，1 %鏈霉素，1 %谷氨酰胺），60小時(shí)后收取細(xì)胞。
[0051] 結(jié)果：如圖28、2(：、2「、26所示，分化6011時(shí)1^11(：-腿1高表達(dá)組的麗(：陽性的細(xì)胞 數(shù)比對照組顯著增加，而Linc-RAM敲低組的MHC陽性的細(xì)胞數(shù)比對照組顯著減少，結(jié)果提 示Linc-RAM顯著促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。（MHC是C2C12細(xì)胞分化標(biāo)記基因）。
[0052] Western Blot檢測蛋白表達(dá)
[0053] 結(jié)果：Western Blot結(jié)果顯示（如圖2D、2H)，分化60小時(shí)后，Linc-RAM高表達(dá)組 的MHC蛋白表達(dá)量比對照組顯著增加，Linc-RAM敲低組的MHC蛋白表達(dá)量比對照組顯著減 少。結(jié)果提示Linc-RAM顯著促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。
[0054] Line-RAM能夠部分彌補(bǔ)由于MyoD敲低造成的C2C12細(xì)胞分化缺陷
[0055] 如實(shí)施例 1 所示 BLOCK-It Lentiviral RNAi Expression System,構(gòu)建MyoD 敲低 的C2C12細(xì)胞系。MyoD敲低的C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒，檢測細(xì)胞分化情況。
[0056] 結(jié)果：real-time PCR結(jié)果顯示MyoD mRNA表達(dá)量顯著降低（如圖21)，分化24小 時(shí)后，轉(zhuǎn)染了 Line-RAM高表達(dá)質(zhì)粒的MyoD敲低C2C12細(xì)胞，MyoG陽性細(xì)胞數(shù)目顯著多于 MyoD敲低組（如圖2J，2K)，MyoG mRNA的表達(dá)量也顯著多于MyoD敲除組（如圖2L)，結(jié)果 提示Linc-RAM能夠部分彌補(bǔ)由MyoD敲低造成的C2C12細(xì)胞分化缺陷。
[0057] 實(shí)施例3 Linc-RAM將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞的作用
[0058] 如實(shí)施例 1 所不 BL0CK-It Lentiviral RNAi Expression System，構(gòu)建 MyoD 高表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞系，標(biāo)記為MyoD 0E C3H10T1/2細(xì)胞。利用Lenti-XTM Tet-on 3G Inducible Expression System(Clontech Laboratories)構(gòu)建 Linc-RAM 高表達(dá)的 C3H10T1/2細(xì)胞系，標(biāo)記為pLVX-Linc-RAM 0E C3H10T1/2細(xì)胞，同時(shí)構(gòu)建其對照質(zhì)粒標(biāo)記為 pLVX-TRE C3H10T1/2細(xì)胞。其中ΟΗΙΟ--/2細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。
[0059] Linc-RAM將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞
[0060]如同實(shí)施例 2,分別將 1. 5X 104 個(gè) pLVX-Line-RAM 0E，pLVX-TRE 和 MyoD 0E C3H10Tl/2細(xì)胞培養(yǎng)于l2孔板中，培養(yǎng)1?換分化培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，包含lOug/mL胰島 素， 5ug/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，1%青霉素，1%鏈霉素，1 %谷氨酰胺），分化72h后分別收取細(xì)胞，免 疫熒光，real-time RT-PCR等具體實(shí)驗(yàn)操作如同實(shí)施例2。將pLVX-Linc-RAM 0E，pLVX-TRE 和MyoD 0E C3H10T1/2細(xì)胞培養(yǎng)于10厘米培養(yǎng)盤中，分化48小時(shí)后，收取總RNA，送于貝瑞 和康公司，進(jìn)行RNA-seq測序后，生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的基因，RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞 和成肌細(xì)胞譜系相關(guān)基因的表達(dá)。
[0061] 結(jié)果：如圖3A-1和3A_2所示，Linc-RAM和MyoD高表達(dá)的C3H10T1/2系均構(gòu)建成 功。分化三天后，pLVX-Linc-RAM 0E和MyoD 0E C3H10T1/2細(xì)胞中存在MHC陽性的細(xì)胞，且 MyoD 0E C3Hl〇n/2細(xì)胞中MHC陽性的細(xì)胞多于Line-RAM高表達(dá)的C3H10T1/2細(xì)胞（如圖 3B) ;real-time RT-PCR 結(jié)果顯示 Linc-RAM 高表達(dá)的 Ο3Η10Τ1/2 細(xì)胞中 MyoG，MHC mRNA 表 達(dá)量低于 MyoD 0E C3H10T1/2 細(xì)胞（如圖 3C-1 至 3C-3,3D-1 至 3D-3)，結(jié)果提示 Linc-RAM 具有將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞的能力，但這種能力低于MyoD。如圖31所示，heap map 圖示RNA-seq結(jié)果，顯示相對于對照組，pLVX-Linc-RAM 0E的成纖維細(xì)胞在增殖期1247個(gè) 基因表達(dá)上調(diào)，613個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；分化48小時(shí)后，1265個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，968個(gè)基因表 達(dá)下調(diào)；圖3J所不，RT-PCR進(jìn)一步檢測成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞譜系相關(guān)基因的表達(dá)。
[0062] 實(shí)施例4 Linc-RAM協(xié)助MyoD將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞 [0063] Linc-RAM協(xié)助MyoD將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞
[0064] 將1. 2X 104個(gè)MyoD 0E C3H10T1/2細(xì)胞培養(yǎng)于I2孔板中，12h后分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Line-RAM高表達(dá)和shRNA的質(zhì)粒，24h后更換分化培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，包含l〇ug/mL胰島 素， 5ug/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，1 %青霉素，1 %鏈霉素，1 %谷氨酰胺），分化4池后分別收取細(xì)胞，免 疫熒光，Western Blot以及real-time RT-PCR等具體實(shí)驗(yàn)操作如同實(shí)施例2。其中胰島素 購自若和諾德公司，轉(zhuǎn)鐵蛋白購自Sigma公司。
[0065] 結(jié)果：如圖3E，3F，Χ，3Η所示，轉(zhuǎn)染Linc-RAM高表達(dá)的質(zhì)粒的MyoD 0E C3H10T1/2 細(xì)胞中，MHC mRNA以及蛋白表達(dá)量顯著多于對照組，并且MHC陽性的多核細(xì)胞顯著多于對 照組；而轉(zhuǎn)染Linc-RAM shRNA質(zhì)粒的MyoD 0E C3H10T1/2細(xì)胞中，MHC mRNA以及蛋白表達(dá) 量顯著少于對照組，并且MHC陽性的細(xì)胞顯著少于對照組，結(jié)果提示Line-RAM協(xié)助MyoD將 成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞。
[0066] 實(shí)施例5 Linc-RAM對肌肉損傷再生的作用 [0067] 1、動(dòng)物處理
[0068]從維通利華公司購買8周齡左右的雄性CS7BL/6小鼠，向其后肢左腿和右腿脛 骨前肌注射2〇微升蛇毒細(xì)胞毒素（CTX，cardiotoxin，溶于PBS (稀釋至終濃度為?ο μ Μ ; Sigma)造成肌肉急性損傷-再生修復(fù)模型,22小時(shí)后注射20ul 5U透明質(zhì)酸，兩個(gè)小時(shí)后 再向右腿脛骨前肌注射20ul 25ug Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒（pvirus-Linc-_)，左腿注射 control質(zhì)粒作為對照組，剔除小鼠腿部的毛，用電極（BTX，10mm) 15v/mm電壓，8個(gè)脈沖，每 個(gè)脈沖20毫秒電擊脛骨前肌處肌肉。
[0069] 2、肌肉組織收集
[0070] 肌肉損傷3· 5,5_ 5和7· 5天后斷頸處死小鼠，用剪刀將后肢左右兩腿皮毛剪開，找 到小腿脛骨，用鈍鑷子撕開脛骨外側(cè)脛骨前肌表面的肌膜，從肌腱處剪斷取下整塊脛骨前 肌。
[0071] 3、石蠟包埋及蘇木素和伊紅（HE)染色
[0072] 1)將取下的脛骨前肌固定在10°%福爾馬林（甲醛溶液1:10溶于PBS(如上所述 配制））中24-48小時(shí)；
[0073] 2)固定后經(jīng)70 %、S0 %、％ %、100 %乙醇各浸泡1小時(shí)至完全脫水；
[0074] 3)脫水后轉(zhuǎn)移至二甲苯透明兩次各半小時(shí)；
[0075] 4)在50_6〇度透蠟和包埋（Leica EG1150全自動(dòng)包埋機(jī)）；
[0076] 5)修整蠟塊樣品，切片3-4微米（Leica RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)）；
[0077] 6)將切片分割開，投入到40度的溫水浴中展片（Leica HI1220攤片機(jī)）后貼片至 載玻片上，在燙板（Leica HI 1210烤片機(jī)）上60°C烤干；
[0078] 7)將組織切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡1〇分鐘。無水乙 醇中浸泡5分鐘；95%乙醇中浸泡5分鐘；70%乙醇中浸泡5分鐘；最后入蒸餾水浸泡2分 鐘；
[0079] 8)將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5分鐘。酸水及氨水中分色， 各5-10秒鐘。流水沖洗5分鐘后入蒸餾水片刻。入70%和90%酒精中脫水各5分鐘。入 酒精伊紅染色液染色2?3分鐘。
[0080] 9)染色后經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，用中性樹膠封片。
[0081] 4、照相及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0082] 正置顯微鏡（Olypums BX 53) X 20倍鏡下照片，手動(dòng)利用Image-pro Plus 5. 1軟 件計(jì)數(shù)損傷區(qū)域上新形成的核在中央的肌纖維面積。
[0083] 結(jié)果：如圖4A-1和4A-2所示，RT-PCR檢測Linc-RAM在脛骨前肌中高表達(dá)；CTX損 傷7. 5天HE染色結(jié)果顯示注射Linc-RAM組的脛骨前肌中新形成的核在中央的肌纖維面積 顯著大于對照組（如圖48,40;0^損傷3.5天1^ &1-^1^1?1'-?〇?檢測損傷修復(fù)相關(guān)基因 的表達(dá)，如圖4D-1至4D-3所示注射Line-RAM組的脛骨前肌中MyoD，MyoG, eMHC mRNA的表 達(dá)多于對照組，結(jié)果提示Linc-RAM促進(jìn)骨骼肌再生。
[0084] 實(shí)施例6 Linc-RAM促進(jìn)RD細(xì)胞（一種橫紋肌肉瘤細(xì)胞系）分化的作用
[0085] 如實(shí)施例 1 所不 BL0CK-It Lentiviral RNAi Expression System，構(gòu)建 Line-RAM 高表達(dá)的RD細(xì)胞系，其RD細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。
[0086] Linc-RAM促進(jìn)RD細(xì)胞分化
[0087] 如同實(shí)施例2,分別將2X 104個(gè)Linc-RAM高表達(dá)的RD細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中，培 養(yǎng)12h換分化培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，包含10ug/mL胰島素，10ug/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，1%青霉素， 1 %鏈霉素，1 %谷氨酰胺），分化48h后收取細(xì)胞，免疫熒光，RT-PCR等具體實(shí)驗(yàn)操作如同實(shí) 施例1，2。
[0088] 結(jié)果：如圖5A顯示細(xì)胞系構(gòu)建成功。5B，5C顯示Linc-RAM高表達(dá)的RD細(xì)胞中 MHC陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著多于對照組。1至5D-2所示Linc-RAM高表達(dá)的RD細(xì)胞中MyoD， MyoG mRNA的表達(dá)多于對照組，結(jié)果提示Linc-RAM促進(jìn)RD細(xì)胞分化。
[0089] 實(shí)施例7 Linc-RAM可能參與人類肌營養(yǎng)不良疾病的發(fā)生發(fā)展 [0090] 取自肌營養(yǎng)不良病人的組織樣品，提取總RNA，real-time RT-PCR檢測 human-Linc-RAM-variant l，human-Linc-RAM_variant2 的表達(dá)，以及 MyoD, MyoG mRNA 表 達(dá)量。
[0091] 結(jié)果：5E顯示根據(jù)小鼠 Linc-RAM在基因組中的位置，通過同源線性區(qū)域分析人類 基因組中human-Linc-RAM的位置，包括兩種變體；如圖5F-1至5F-4所示，相對于正常肌肉 組織，human-Linc-RAM-variant 1 和 human-Linc-RAM-variant 2 在病人組織中表達(dá)量下 調(diào)，且MyoD，MyoG mRNA表達(dá)量下調(diào)，結(jié)果提示human-Linc-RAM可能參與肌營養(yǎng)不良的發(fā)生 發(fā)展（A表示正常肌肉組織；B表示肌營養(yǎng)不良組織）。
[0092] 實(shí)施例8 Linc-RAM作為MyoD的共激活子，調(diào)節(jié)肌源性基因的表達(dá) [0093] 分別將1. 2X 104個(gè)Linc-RAM高表達(dá)和敲除的C2C12細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，更換 分化培養(yǎng)基12小時(shí)后收取細(xì)胞總RNA，RNA-seq檢測差異表達(dá)基因；根據(jù)已知的受MyoD調(diào) 控的基因，利用生物信息學(xué)分析受MyoD和Linc-RAM共同調(diào)節(jié)的基因；MyoD和Linc-RAM高 表達(dá)的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，48小時(shí)后收取RNA，檢測MyoG基因的表達(dá)；不同劑量 (〇,〇· 6ug，1. 〇ug)的Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒與0. 4ug MyoD高表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì) 胞，滅光素酶報(bào)告基因檢測MyoG啟動(dòng)子（MyoG基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-470bp?+130bp) 活性；如同實(shí)施例1，甲醛固定Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞，超聲破碎后分別用 MyoD，H3K4Me3和Pol II抗體染色質(zhì)免疫共沉淀，real-time分別檢測這三種蛋白在MyoG 和miR-206(遠(yuǎn)端）啟動(dòng)子區(qū)域的富集程度。
[0094] 結(jié)果：如圖6A顯示Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞分化12小時(shí)，RNA-seq 檢測差異表達(dá)的基因，Heat map顯示差異表達(dá)（fold>2)的基因；6B顯示GO基因注釋的 結(jié)果，差異表達(dá)的基因主要富集于核小體組裝及肌源性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；6C顯示MyoD和 Linc-RAM共同調(diào)節(jié)的基因；6D顯示MyoD和Linc-RAM共同調(diào)節(jié)與肌細(xì)胞增殖，分化和結(jié)構(gòu) 相關(guān)的基因；6E顯示RT-PCR進(jìn)一步確定MyoD和Linc-RAM共同調(diào)節(jié)的基因在Linc-RAM高 表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞分化12小時(shí)后的表達(dá)變化；6F顯示不同劑量（〇,〇.6ug，l.Oug)的 Linc-RAM高表達(dá)質(zhì)粒與0. 4ug MyoD高表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基 因結(jié)果顯示Linc-RAM呈劑量依賴性促進(jìn)MyoD調(diào)節(jié)MyoG啟動(dòng)子的活性；6G顯示C3H10T1/2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染MyoD高表達(dá)質(zhì)粒分化48小時(shí)后，real-timePCR結(jié)果顯示MyoD誘導(dǎo)MyoG的表 達(dá)；6H-1至6H-3結(jié)果顯示相對于正常組，Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞中，更多的MyoD, H 3K4Me3和Pol II富集于MyoG和miR_2〇6 (遠(yuǎn)端）啟動(dòng)子區(qū)域，而Linc-RAM敲低的C2C12 細(xì)胞中，這些蛋白的富集減少，結(jié)果提示Linc-RAM作為MyoD的共激活子，調(diào)節(jié)肌源性基因 的表達(dá)。
[0095] 實(shí)施例9 Linc-RAM以p38a依賴的方式通過與MyoD相互作用，介導(dǎo) MyoD-Baf60c_Brgl復(fù)合物的形成
[0096] 提取RNase-free的C2C12細(xì)胞裂解液，利用MyoD抗體免疫共沉淀，Western Blot檢測MyoD蛋白，RT-PCR檢測Linc-RAM ;提取RNase-free的C2C12細(xì)胞裂解液，分別 利用 MyoD, Baf60c 和 Brgl 抗體免疫共沉淀，RT-PCR 檢測 Linc-RAM ;real-time PCR 檢測 Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞中Baf60c和Brgl mRNA的表達(dá)量；分別提取Linc-RAM 高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞RNase-free裂解液，利用MyoD抗體免疫共沉淀，Western Blot 檢測MyoD，Baf60c和Brgl蛋白；甲醛固定Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞，超聲破碎 后分別用MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac抗體染色質(zhì)免疫共沉淀， real-time PCR分別檢測 這四種蛋白在MyoG啟動(dòng)子區(qū)域的富集程度；10uM SB203580處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12 細(xì)胞分化36小時(shí)后，免疫熒光，real-time PCR及ChIP-PCR檢測如同實(shí)施例2。
[0097] 結(jié)論：圖7A顯示在MyoD抗體的免疫共沉淀產(chǎn)物中檢測到Linc-RAM，提示 Linc-RAM和MyoD結(jié)合在一起；7B結(jié)果顯示Linc-RAM與MyoD結(jié)合，而沒有與Baf60c和Brgl 結(jié)合；7C顯示Linc-RAM高表達(dá)和敲低的C2C12細(xì)胞中Baf60c和Brgl mRNA的表達(dá)量沒有 差異；7D顯示相對于對照組，Linc-RAM高表達(dá)的細(xì)胞中，Baf60c和Brgl蛋白在MyoD抗體 的免疫共沉淀產(chǎn)物中富集增多，而Linc-RAM敲低的細(xì)胞中，Baf60c和Brgl蛋白在MyoD抗 體的免疫共沉淀產(chǎn)物中富集減少；7E-1至7E-4顯示相對于對照組，Linc-RAM高表達(dá)的細(xì)胞 中，更多的MyoD，Baf60c，fcg 1和H3K9ac蛋白富集于MyoG啟動(dòng)子區(qū)域，Linc-RAM高敲低的 細(xì)胞中，MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac蛋白在MyoG啟動(dòng)子區(qū)域的富集減少；7F，7G，7H顯示 10uM SB203580處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞分36小時(shí)，MHC陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)顯著低 于沒有處理的Line-RAM高表達(dá)細(xì)胞組，且MHC mRNA的表達(dá)量降低；71顯示10uM SB203580 處理Linc-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞分化18小時(shí)后，Linc-RAM的表達(dá)量沒有改變；7J顯示 SB203580處理Line-RAM高表達(dá)的C2C12細(xì)胞18小時(shí)后，Brgl在MyoG啟動(dòng)子區(qū)域的富集減 少，結(jié)果提示Linc-RAM以p38a依賴的方式通過與MyoD相互作用，介導(dǎo)MyoD-Baf60c-Brgl 復(fù)合物的形成。
[0098] 實(shí)施例10 bFGF通過Ras/Raf/Mek/Erkl/2/MyoD信號通路在肌細(xì)胞分化過程中調(diào) 節(jié)Linc-RAM的表達(dá)和功能
[0099] l〇ng/mL bFGF (Sigma)處理 C2C12 細(xì)胞分化 6,12, 24 小時(shí)后，收取 RNA，real-time RT-PCR檢測Linc-RAM的表達(dá)水平（如圖5-A所示）；10ng/mL bFGF處理C2C12細(xì)胞分化 24小時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因檢測Linc-RAM啟動(dòng)子的活性；i〇uM PD98059預(yù)處理C2C12細(xì)胞 1小時(shí)后再用bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)檢測p-Erk，t-Erk，p-MEK，t-MEK蛋白的表 達(dá)情況；PD98059預(yù)處理C2C12細(xì)胞1小時(shí)后再用bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)檢測 MyoD，Linc-RAM和MyoG的表達(dá)情況；10uM PD98059預(yù)處理C2C12細(xì)胞1小時(shí)后再用bFGF 處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)，天光素酶報(bào)告基因檢測Linc-RAM-WT和Line-RAMHVIutant啟 動(dòng)子的活性；5uM FTA預(yù)處理C2C12細(xì)胞30分鐘后再用bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小 時(shí)，檢測MyoD, Linc-RAM和MyoG的表達(dá)情況；2. 5uM GW預(yù)處理C2C12細(xì)胞30分鐘后再用 bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)后，檢測MyoD，Line-RAM和MyoG的表達(dá)情況；bFGF處理 C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM-0E細(xì)胞分化24,36小時(shí)后Myogenin和MHC免疫熒光染色， real-time PCR檢測如同實(shí)施例2。
[0100] 結(jié)論：8A顯示bFGF處理C2C12細(xì)胞分化6,12,24小時(shí)后，Linc-RAM的表達(dá)下調(diào)； 8B顯示bFGF處理C2C12細(xì)胞分化24小時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示Linc-RAM啟動(dòng)子 的活性降低；8C顯示PD98059預(yù)處理后，能夠部分彌補(bǔ)由于bFGF引起的p-Erk和p-MEK蛋 白表達(dá)量的增加；8D-1至8D-3,8E顯示PD98059預(yù)處理后，能夠部分彌補(bǔ)由于bFGF引起的 Linc-RAM表達(dá)量的降低；8F，8G顯示FTA和GW分別部分彌補(bǔ)由bFGF引起的Line-RAM表達(dá) 量的降低；8H, 81，8J顯示bFGF降低了 Linc-RAM對C2C12細(xì)胞的促分化作用，提示bFGF通 過Ras/Raf/Mek/Erkl/2/MyoD信號通路在肌細(xì)胞分化過程中調(diào)節(jié)Line-RAM的表達(dá)和功能。 [0101] 隨著ENCODE計(jì)劃的公布，目前在人類基因組上發(fā)現(xiàn)至少存在9640個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄成 lncRNAs,這些IneRNAs勢必參與了生物學(xué)的各個(gè)過程，然而目前僅對不到0. 1 %的IneRNAs 進(jìn)行了功能性研究，因而研究IneRNAs生物學(xué)過程中功能成為新的研究熱點(diǎn)。本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)一個(gè)受MyoD調(diào)控的IneRNA，命名為Linc-RAM，Linc-RAM在肌生成過程中表達(dá)上調(diào)，顯 著促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化，促進(jìn)肌肉損傷修復(fù)，能夠單獨(dú)或者協(xié)助MyoD將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換 為成肌細(xì)胞，并且促進(jìn)橫紋肌肉瘤細(xì)胞分化，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明bFGF通過Ras/Raf/ Mek/Erk信號通路在肌細(xì)胞分化過程中調(diào)節(jié)Linc-RAM的表達(dá)。其發(fā)揮功能的分子機(jī)制是 Line-RAM以p38a依賴的方式通過與MyoD相互作用，介導(dǎo)MyoD-BafOOc-Brgl復(fù)合物的形 成，從而調(diào)節(jié)肌源性基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果提示Linc-RAM在骨骼肌發(fā)育進(jìn)程中具有重 要的調(diào)節(jié)作用，可以為人類疾病提供臨床治療作用。
【權(quán)利要求】
1· 一種長鏈非編碼RNA分子在制備治療肌肉疾病的藥物中的用途，所述長鏈非編碼 RNA分子選自Linc-RAM。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述肌肉疾病選自肌肉損傷或橫紋肌肉瘤。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述肌肉損傷為急性肌肉損傷。
4. 一種長鏈非編碼RNA分子在制備促進(jìn)肌肉干細(xì)胞分化或促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化或 促進(jìn)橫紋肌肉瘤細(xì)胞分化的藥物中的用途，所述長鏈非編碼RNA分子選自Linc-RAM。
5. -種含有編碼Line-RAM的核苷酸的載體用于治療肌肉疾病的藥物中的用途。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述肌肉疾病選自肌肉損傷或橫紋肌肉瘤。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其中所述肌肉損傷為急性肌肉損傷。
【文檔編號】A61P21/00GK104189921SQ201410446245
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】朱大海, 于瀟華, 張勇, 李婷婷 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所