一種Erk信號(hào)通路抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Erk信號(hào)通路抑制劑，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明首次確定了可以抑制Erk1/2信號(hào)通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E，并且發(fā)現(xiàn)Mce3E是通過(guò)空間調(diào)控Erk1/2蛋白而實(shí)現(xiàn)對(duì)Erk1/2信號(hào)通路的抑制。本發(fā)明成果可為臨床多種疾病的治療提供新的工具和思路，尤其在抗腫瘤等多種藥物的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用等方面將有著廣闊的前景，也可以直接應(yīng)用于科研領(lǐng)域或指導(dǎo)開(kāi)發(fā)Erk1/2的抑制劑。此外，該成果還對(duì)尋找新的藥物靶點(diǎn)和篩選新藥具有重要的理論意義。
【專利說(shuō)明】一種Erk信號(hào)通路抑制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Erk信號(hào)通路抑制劑，是一種能抑制Erk信號(hào)通路的結(jié)核分枝桿 菌分泌蛋白，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核?。═uberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis， Mtb)引起的一種古老疾病，它致今仍是嚴(yán)重威脅全球人類健康的傳染病之一。
[0003] 通過(guò)比較基因組學(xué)的研究，研究人員發(fā)現(xiàn)用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗卡介苗（Bacilli CalmetteGuerin,簡(jiǎn)稱BCG)的基因組相比人結(jié)核分枝桿菌Mtb有16段缺失，這些相應(yīng)的 區(qū)域在Mtb基因組中被命名為RD1-RD16,并且研究表明這些RD區(qū)所編碼的蛋白對(duì)于Mtb 的致病性有至關(guān)重要的作用。在這些RD區(qū)中，RD15包含Mce3A-F六個(gè)基因。Mtb基因組 中共有四個(gè)mce操縱子（mcel-4)，每個(gè)操縱子編碼MceA-F六個(gè)蛋白。之前有研究發(fā)現(xiàn)在 大腸桿菌中過(guò)表達(dá)McelA蛋白使得該非致病性細(xì)菌能夠入侵巨噬細(xì)胞，并且能夠在巨噬細(xì) 胞中存活。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)包被有McelA蛋白的珠子能夠進(jìn)入非吞噬性的HeLa細(xì)胞。此 外還有研究表明Mcel操縱子能夠調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，mce3操縱子缺失的 Mtb感染的小鼠有更長(zhǎng)的存活期，其肺組織研磨后涂板有更少的菌落數(shù)，肺組織切片顯示肺 組織病變不明顯。以上這些研究結(jié)果提示：mce3操縱子對(duì)Mtb的存活、毒力以及致病性起 重要作用。但到目前為止，有關(guān)Mce3E蛋白對(duì)炎癥和免疫相關(guān)信號(hào)通路的研究還是一個(gè)空 白。而研究Mce3E蛋白是否調(diào)控Erkl/2信號(hào)通路以及Mtb的胞內(nèi)存活并從分子水平上闡 明其起作用的具體分子機(jī)制，將促進(jìn)人們對(duì)Mtb致病性的理解，為診斷以及治療結(jié)核病提 供新的線索和分子靶標(biāo)。
[0004]Erkl/2是由Boulton等在20世紀(jì)90年代初期先后分離鑒定出的一種蛋白激酶， 分子質(zhì)量分別為44kD和42kD，它們有90%的同源性。目前對(duì)Erkl/2信號(hào)通路的激活過(guò)程 及生物學(xué)意義已有了較深入的認(rèn)識(shí)，Erkl/2信號(hào)通路的活化是將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn) 導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵，參與這一轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的有6了? &%、1^8、1^卜1、絲/蘇氨酸激酶和1^1(1/2雙 特異性激酶等；Erkl/2信號(hào)通路是由一個(gè)小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋 白組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其活化的中心是使Ras進(jìn)行鳥(niǎo)苷酸交換變成其活化形式Ras-GTP，并需 要Ras、Raf-l蛋白參與。PD98059和U0126是Erkl/2信號(hào)通路的特異性抑制劑，它們可以 通過(guò)抑制MEK1/2的活性阻止Erkl/2的磷酸化，從而起到阻斷Erkl/2信號(hào)通路的作用。平 時(shí)Erkl/2位于胞楽內(nèi)，一旦被激活,Erkl/2迅速穿過(guò)核膜并通過(guò)磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄 因子的活性如NF-AT、AP-I、NF-κB等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄， 引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能并影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué) 效應(yīng)。研究還表明，Erkl/2信號(hào)通路的激活能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖并抑制其凋亡， 轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-I和NF-κB可能是Erkl/2信號(hào)通路影響T淋巴細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān) 鍵環(huán)節(jié)。已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)Erkl/2信號(hào)通路的活性與多種病理過(guò)程及重要疾病密切相關(guān)， 包括：炎癥反應(yīng)、肝臟疾病、肥胖癥和糖尿病等代謝性疾病以及腫瘤等。因此，Erkl/2可作 為潛在的分子治療靶點(diǎn)，應(yīng)用Erkl/2抑制劑進(jìn)行多種疾病的治療將可能取得很好的臨床 效果。
[0005] 本發(fā)明提供了一種能抑制Erk信號(hào)通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E。我們還 發(fā)現(xiàn)Mce3E蛋白是通過(guò)與Erkl/2信號(hào)通路中的Erkl/2蛋白直接互作而實(shí)現(xiàn)對(duì)該通路的抑 制。進(jìn)一步的研究結(jié)果還表明Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)空間調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)Erkl/2信號(hào)通路 的抑制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種Erkl/2信號(hào)通路抑制劑，尤其是一種 Erkl/2蛋白磷酸化和/或p-Erkl/2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的抑制劑。所述抑制劑定位在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)，通過(guò)空間調(diào)控抑制Erkl/2信號(hào)通路；所述抑制劑與Erkl/2蛋白直接互作，使Erkl/2蛋 白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中而無(wú)法被磷酸化；所述抑制劑與p-Erkl/2蛋白直接互作，使 p-Erkl/2蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中而無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核。
[0007] 所述抑制劑是結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E，其氨基酸序列如（a)或（b)或（C): [0008](a)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)氨基酸或幾個(gè)氨基酸且具 有結(jié)合Erkl/2活性的由（a)衍生的多肽或其類似物；
[0010] (c)與（a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類 似物。
[0011] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供所述抑制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)構(gòu)建含有編碼Mce3E蛋白的基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-Mce3E，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；
[0013] (2)超聲破菌，高速離心后收取上清液，將上清液流過(guò)填充好的 Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆緩沖液充分洗漆柱子，最后加入含有谷 胱甘肽的洗脫液洗脫蛋白，將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管中，離心濃縮；
[0014] (3)在蛋白濃縮管中加入PBS混勻后離心、分裝蛋白，-80°c保存待用。
[0015] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌分泌性效應(yīng)蛋白Mce3E可以抑制Erkl/2信號(hào)通路并抑 制Erkl/2的磷酸化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并通過(guò)與Erkl/2和p-Erkl/2 直接互作將其隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而一方面阻止Erkl/2的磷酸化，一方面阻止已活化的 p-Erkl/2入核。本發(fā)明不但找到了可以抑制Erkl/2信號(hào)通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白 Mce3E，更重要的是我們發(fā)現(xiàn)其活性調(diào)控機(jī)制。由于臨床上多種疾病的發(fā)生都與高水平的 p-Erkl/2相關(guān)，因此抑制這種蛋白的磷酸化水平對(duì)于很多疾病都有控制作用。本發(fā)明成果 將來(lái)可為臨床多種疾病的治療提供新的工具和思路，尤其在抗腫瘤等多種藥物的開(kāi)發(fā)和臨 床應(yīng)用等方面將有著廣闊的前景，也可以直接應(yīng)用于科研領(lǐng)域或指導(dǎo)開(kāi)發(fā)Erkl/2通路的 抑制劑。此外，該成果還對(duì)尋找新的藥物靶點(diǎn)和篩選新藥具有重要的理論意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖I: (A)Mce3E能抑制Erkl/2信號(hào)通路；（B)Mce3E抑制Erkl/2磷酸化。
[0017]圖2 :Mce3E與Erkl/2相互作用。
[0018] 圖3 :Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
[0019] 圖4:(A)Mce3E將Erkl/2隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，阻止MEKl激活Erkl/2;(B)同時(shí)將 p-Erkl/2隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而阻止p-Erkl/2入核；（C)Mce3E蛋白在體外不能阻止Erk2蛋 白的磷酸化。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下實(shí)施例用作對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步解釋，不作為限制。如無(wú)特殊說(shuō)明，采用的出發(fā) 質(zhì)粒、細(xì)胞、抗體、探針等為商業(yè)化廣品。
[0021] 實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E
[0022] 可以阻止宿主Erkl/2蛋白磷酸化的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E，其氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1所示。Mce3E及其結(jié)構(gòu)類似物可用于Erkl/2活性抑制劑的開(kāi)發(fā)。Erk2基 因序列如GeneID:5594所示，MEKl基因的序列如GeneID:5604所示。
[0023] 實(shí)施例2Mce3E能夠抑制Erkl/2通路的活化，并且可以阻止Erkl/2蛋白的磷酸化
[0024]㈧采用雙熒光報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)Mce3E對(duì)Erkl/2通路活化的影響
[0025] 1)構(gòu)建含有編碼Mce3E基因的重組質(zhì)粒p3XFlag-CMV14_Mce3E;
[0026] 2)構(gòu)建含有編碼MEKl-ED基因（SEQIDNO. 2)的重組質(zhì)粒pCS2HA-MEKl-ED，采用 重疊延伸PCR法將MEKl蛋白中的218位絲氨酸以及222位絲氨酸分別突變?yōu)楣劝彼岷吞?冬氨酸后獲得MEKl-ED基因片段；
[0027] 3)采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒p3XFlag-CMV14-Mce3E和檢測(cè)Erkl/2通路活化 情況的質(zhì)粒pGal4-Elk、pGal4-luc、pRL_TK(購(gòu)買自Promega公司）以及表達(dá)Erkl/2通路 組成型激活劑HA-MEKl-ED的質(zhì)粒pCS2HA-MEKl-ED轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞；
[0028]4)轉(zhuǎn)染6h后換新鮮培養(yǎng)基，24h后用promega公司的試劑盒以及熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè) Mce3E對(duì)Erkl/2通路活化的影響。
[0029](B)檢測(cè)Mce3E對(duì)Erkl/2蛋白磷酸化的影響
[0030] 將上述檢測(cè)熒光后的細(xì)胞裂解液用BCA法定量后用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)，用 p-Erkl/2抗體和Erkl/2抗體分別檢測(cè)Erkl/2的磷酸化水平和總Erkl/2蛋白量。
[0031](C)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
[0032] 雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明Mce3E可以顯著抑制由MEKl-ED激活的Erkl/2通 路（見(jiàn)圖1中A);而對(duì)應(yīng)的western實(shí)驗(yàn)證明Mce3E可以下調(diào)p-Erkl/2水平（見(jiàn)圖1中 B);因此Mce3E是通過(guò)抑制Erkl/2的磷酸化而阻礙Erkl/2通路的活化。
[0033] 實(shí)施例3Mce3E蛋白能夠與Erk蛋白直接互作
[0034] (A)Mce3E蛋白的制備
[0035] 1)構(gòu)建含有編碼Mce3E基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-l_Mce3E，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸 桿囷BL21中；
[0036] 2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在30°C條件下加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間 為4h ;
[0037] 3)超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0038] 4)將上清液緩緩流過(guò)填充好Glutathione-Sepharose beads (GE公司，GST柱材 料）中，然后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0039] 5)將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管（millipore)中，3500rpm離心濃縮 20min；
[0040] 6)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液（PBS)混勻后同步驟5)重復(fù)離心；
[0041] 7)分裝蛋白，-80°c保存待用。
[0042] (B)Erk蛋白的制備
[0043] 1)構(gòu)建含有編碼Erk2基因（GeneID: 5594)的重組質(zhì)粒pMAL-c2x-Erk2,并將該質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0044] 2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在16°C條件下加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間 為 12h;
[0045] 3)超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0046] 4)將上清液緩緩流過(guò)填充好Amyloseresin(NewEnglandBioLabs公司）中，然 后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0047] 5)將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管（millipore)中，3500rpm離心濃縮 20min；
[0048] 6)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液（PBS)混勻后同步驟5)重復(fù)離心；
[0049] 7)分裝蛋白，_80°C保存待用。
[0050] (C)體外pull-down實(shí)驗(yàn)
[0051] 1)將攜帶MBP_Erk2 蛋白的Amyloseresin(NewEnglandBioLabs公司）與 GST-Mce3E于4攝氏度共同孵育2h。
[0052] 2)WesternBlot檢測(cè)GST-Mce3E與MBP-Erk2 的結(jié)合情況。
[0053](D)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
[0054] 從圖2中可以看出，MBP標(biāo)簽蛋白本身不能結(jié)合GST_Mce3E，而MBP_Erk2融合蛋白 可以有效地結(jié)合GST-Mce3E，這就說(shuō)明Mce3E能夠與Erk直接互作。
[0055] 實(shí)施例4Mce3E蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且通過(guò)空間調(diào)控Erkl/2蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)Erkl/2 信號(hào)通路的抑制
[0056] (A)Mce3E蛋白定位
[0057] 1)構(gòu)建含有Mce3E基因的重組質(zhì)粒pEGFP-Cl_Mce3E;
[0058] 2)通過(guò)Lipofectamine2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA)轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 到鋪在蓋玻片上的HeLa細(xì)胞中；
[0059] 3)轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0060] 4) 24h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞兩遍，然后依次用4%多聚甲醛固定細(xì)胞 10min、PBS洗滌細(xì)胞三遍、0. 5%TritonX-IOO穿透細(xì)胞10min、PBS洗滌細(xì)胞三遍、1 %BSA 封閉細(xì)胞30min;
[0061] 5)封閉完以后的細(xì)胞用Calnexin(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針）或Golgi-58K(高爾基探針）室 溫孵育Ih;
[0062] 6)PBS洗滌細(xì)胞三遍后用Alexa594紅色熒光二抗室溫孵育lh，之后PBS洗滌細(xì)胞 三遍并用含有DAPI(即4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片劑封片并用于激光共聚焦顯微 鏡鏡檢；
[0063]7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：如圖3所示，在HeLa細(xì)胞中Mce3E能夠很好的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針 Calnexin共定位，而不與高爾基體探針Golgi-58K共定位，這表明Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
[0064] (B)Mce3E蛋白與Erkl/2、p-Erkl/2 蛋白共定位
[0065] 1)構(gòu)建含有Erk2基因的重組質(zhì)粒p3XFlag-CMV14-Erk2和含有 MEKl(GeneID:5604)基因的重組質(zhì)粒pcDNA3-MEKl ;
[0066] 2)通過(guò)Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒 p3XFlag-CMV14-Erk2和pEGFP-Cl-Mce3E或pcDNA3-MEKl共轉(zhuǎn)染到鋪在蓋玻片的HeLa細(xì)胞 中；
[0067] 3)轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮去血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0068] 4) 24h后用于Erkl/2染色的細(xì)胞不用EGF(上皮生長(zhǎng)因子）刺激，直接固定、透化 和封閉（如A中所述）；用于p-Erkl/2染色的細(xì)胞用EGF刺激15min后再固定、透化和封 閉；
[0069] 5)封閉完以后的細(xì)胞用Erkl/2抗體（Cell Signaling Technology)或 p-Erkl/2 (Cell Signaling Technology)抗體室溫孵育Ih ;
[0070] 6)PBS洗滌細(xì)胞三遍后用Alexa594紅色熒光二抗室溫孵育lh，之后PBS洗滌細(xì)胞 三遍并用含有DAPI的封片劑封片并用于激光共聚焦顯微鏡鏡檢；
[0071] 7)對(duì)于MEKl的染色分別用小鼠抗Myc -抗（Santa Cruz Biotecnology)和FITC 綠色熒光二抗；
[0072] 8)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：如圖4,在非活化的HeLa細(xì)胞中，Erk蛋白與MEKl蛋白均勻 地共定位在細(xì)胞質(zhì)中，而共轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-Mce3E質(zhì)粒后，Erk蛋白由細(xì)胞質(zhì)定位改為同 GFP-Mce3E蛋白共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖4中A)，從而阻止了Erk蛋白與MEKl蛋白的結(jié)合；同 時(shí)EGF刺激后p-Erkl/2主要定位在細(xì)胞核中，而GFP-Mce3E可以與p-Erkl/2共定位在內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)從而阻止p-Erkl/2的入核（圖4中B)。
[0073](C)體外去磷酸化實(shí)驗(yàn)
[0074]DHis-MEKl-ED蛋白純化
[0075] ①構(gòu)建含有MEKl-ED基因（SEQIDNO. 2)的重組質(zhì)粒pET28a-MEKl-ED，并將該質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0076] ②將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在30°C條件下加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間 為6h;
[0077] ③超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0078] ④將上清液緩緩流過(guò)填充好Ni2+-NTA柱子中，然后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱 子，最后加入2_3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0079] ⑤將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管（millipore)中，3500rpm離心濃縮 20min；
[0080] ⑥在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液（PBS)混勻后同步驟⑤重復(fù)離心；
[0081] ⑦分裝蛋白，_80°C保存待用。
[0082] 2)GST-Erk2蛋白純化：構(gòu)建含有Erk2基因（GeneID:5594)的重組質(zhì)粒 pGEX-6P-l-Erk2,蛋白純化方法同GST-Mce3E蛋白的純化。
[0083] 3)將50ng His-MEKl-ED、200ng GST-Erk2以及1 μ g GST-Mce3E加入30 μ 1反應(yīng) 緩沖液中，在30°C孵育30min，孵育緩沖液含IOmM HEPES，IOmM MgCl2, ImM MnCl2，pH7. 4;之 后用WesternBlot檢測(cè)p-Erk。
[0084] 4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：盡管Mce3E蛋白在體外能夠結(jié)合Erk2蛋白（見(jiàn)圖2)，但純化的 Mce3E蛋白本身在體外不能阻止Erk2蛋白的磷酸化（如圖4中C)，這就說(shuō)明Mce3E蛋白阻 止Erk蛋白磷酸化依賴于其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，進(jìn)而通過(guò)空間調(diào)控阻止Erk蛋白與其上游激 酶MEKl蛋白的互作，最終阻止Erk蛋白的磷酸化。
[0085]Mce3E抑制Erk的磷酸化依賴于Mce3E與Erk的互作，而它們之間的互作是通過(guò) Mce3E蛋白中的一個(gè)Motif實(shí)現(xiàn)的，而這個(gè)Motif既可以用來(lái)結(jié)合Erk2,也可以用來(lái)結(jié)合 Erkl,因此本結(jié)論也適用于Erkl。
[0086] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種Erkl/2蛋白磷酸化抑制齊[|，其特征在于，與Erkl/2蛋白直接互作，使Erkl/2蛋 白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無(wú)法被磷酸化。
2. -種p-Erkl/2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的抑制劑，其特征在于，與p-Erkl/2蛋白直接互作， 使p-Erkl/2蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核。
3. -種Erkl/2信號(hào)通路抑制劑，其特征在于，通過(guò)與Erkl/2蛋白直接互作，使Erkl/2 蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無(wú)法被磷酸化；和/或與P-Erkl/2蛋白直接互作，使 p-Erkl/2蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制Erkl/2信號(hào)通路。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑是結(jié)核分枝桿菌分 泌蛋白Mce3E，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
5. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在抑制Erkl/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在制備治療與Erkl/2信號(hào)通路相關(guān)的疾病的藥物 中的應(yīng)用。
7. -種制備要求4所述的抑制劑的方法，其特征在于， (1)構(gòu)建含有編碼Mce3E蛋白的基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-Mce3E，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌BL21中，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)； ⑵超聲破菌，高速離心后收取上清液，將上清液流過(guò)填充好的 Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆緩沖液充分洗漆柱子，最后加入含有谷 胱甘肽的洗脫液洗脫蛋白，將收集的洗脫液加入到10kD的蛋白濃縮管中，離心濃縮； (3)在蛋白濃縮管中加入PBS混勻后離心、分裝蛋白，-80°C保存待用。
8. -種抑制Erkl/2蛋白磷酸化的方法，其特征在于，是通過(guò)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1的蛋白Mce3E與Erkl/2蛋白進(jìn)行結(jié)合，并共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以阻止Erkl/2與其上游激酶 MEK1的互作，從而阻止Erkl/2的磷酸化。
9. 一種阻止p-Erkl/2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的方法，其特征在于，是通過(guò)氨基酸序列如SEQ ID NO :1的蛋白Mce3E與p-Erkl/2蛋白進(jìn)行結(jié)合，并共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而阻止p-Erkl/2蛋 白進(jìn)入細(xì)胞核。
10. -種抑制Erkl/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的方法，其特征在于，通過(guò)Mce3E與Erkl/2蛋白進(jìn) 行結(jié)合，并共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以阻止Erkl/2與其上游激酶MEK1的互作，從而阻止Erkl/2的 磷酸化和Erkl/2信號(hào)通路的激活；和/或通過(guò)Mce3E與p-Erkl/2蛋白進(jìn)行結(jié)合，并共定位 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而阻止P-Erkl/2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，抑制Erkl/2信號(hào)通路的激活。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK104327172SQ201410523217
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】劉翠華, 李 杰, 汪靜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所