本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種spak抑制劑zt-1a，具體來(lái)說(shuō)是spak抑制劑zt-1a在制備治療癲癇的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癲癇是一種由大腦神經(jīng)元大規(guī)模同步化異常放電引起的、以反復(fù)發(fā)作的腦功能失調(diào)為特征的綜合癥，影響著全世界約5000萬(wàn)人。在中國(guó)，癲癇也是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，總體患病率為7.0‰，年發(fā)病率為28.8/10萬(wàn)，目前約有900萬(wàn)的癲癇病人，癲癇不僅嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，給社會(huì)及家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)也給國(guó)家健康醫(yī)療事業(yè)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。目前可用于臨床治療的抗癲癇藥物多為鈉離子通道阻斷劑或gaba能系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑如苯巴比妥、卡馬西平等，長(zhǎng)期服用副作用大，易產(chǎn)生耐藥性。因此急需找到有效的干預(yù)機(jī)制，研發(fā)新型抗癲癇藥物用于癲癇病人的長(zhǎng)期治療。

2、鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體kcc2對(duì)維持成熟神經(jīng)元cl-內(nèi)穩(wěn)態(tài)和gaba正常抑制功能是必要的。在小鼠、果蠅、線蟲基因中部分敲除kcc2，均會(huì)提高神經(jīng)元胞內(nèi)cl-離子濃度([cl-]i)，去極化gaba(egaba)的平衡電位，破壞抑制作用，引起神經(jīng)元過(guò)度興奮，完全敲除則會(huì)呼吸衰竭而死。癲癇的發(fā)生發(fā)展中均證實(shí)了kcc2表達(dá)水平和功能有下調(diào)，而研究人員用電生理學(xué)和分子生物學(xué)的方法證實(shí)了kcc2下調(diào)先于在體外和體內(nèi)驚厥誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作活動(dòng)，kcc2表達(dá)和功能降低促進(jìn)了癲癇大發(fā)作的發(fā)展。因此，kcc2有望作為癲癇治療新靶點(diǎn)，旨在提高kcc2功能促進(jìn)神經(jīng)元cl-擠壓來(lái)恢復(fù)gabaar開放后的gaba的抑制作用。

3、wnk是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠感知細(xì)胞內(nèi)cl-濃度、細(xì)胞外滲透壓和細(xì)胞體積的變化，通過(guò)磷酸化下游spak調(diào)控陽(yáng)離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(cccs)的活性，以維持細(xì)胞和有機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，影響細(xì)胞形態(tài)和行為。wnk-spak-cccs信號(hào)通路的活性在胚胎和新生兒出生后第一周升高，隨著大腦成熟到成年顯著降低。但在病理狀態(tài)下，此通路被重新激活。目前對(duì)于wnk-spak通路對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多重調(diào)控機(jī)制研究主要集中在缺血性腦卒中領(lǐng)域，且僅關(guān)注對(duì)鉀-鈉-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體nkcc1活性的調(diào)節(jié)上。泛蛋白激酶抑制劑(staurosoprine&nem)和spak特異性抑制劑closantel、stock1a-14279/50699被證實(shí)可通過(guò)抑制wnk-spak通路調(diào)節(jié)nkcc1活性，但這些藥物在臨床試驗(yàn)中產(chǎn)生了虛弱、視力障礙，甚至失明的不良反應(yīng)。針對(duì)上述副作用，張金偉課題組改進(jìn)合成新型spak特異性抑制劑zt-1a，并用zt-1a成功抑制了mcao缺血后spak激酶對(duì)nkcc1的激活來(lái)改善小鼠腦損傷和腦水腫面積。

4、越來(lái)越多的研究表明在癲癇病理狀態(tài)下，激活的wnk-spak通路同時(shí)增強(qiáng)對(duì)應(yīng)kcc2(thr1007)、nkcc1(thr212)殘基磷酸化水平，可升高神經(jīng)元[cl-]i，使神經(jīng)元gabaar開放后的gaba的抑制作用減弱，加重癲癇癥狀。在此過(guò)程中，新型spak抑制劑zt-1a能否通過(guò)抑制wnk-spak-kcc2/nkcc1通路激活治療癲癇就非常值得關(guān)注。本發(fā)明的相關(guān)研究從體內(nèi)及體外多種癲癇模型出發(fā)，研究zt-1a通過(guò)抑制上游spak激酶激活多重調(diào)控下游kcc2和nkcc1蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元以及大鼠癲癇模型癇樣放電的抑制作用。該抑制劑對(duì)癲癇調(diào)控作用的確定，將為未來(lái)以wnk-spak-kcc2/nkcc1通路為抗癲癇藥物靶點(diǎn)的研發(fā)提供一個(gè)新的研發(fā)方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了spak抑制劑zt-1a在制備治療癲癇的藥物中的應(yīng)用，所述的這種應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中的藥物對(duì)于治療癲癇的效果不佳的技術(shù)問(wèn)題。

2、本發(fā)明提供了spak抑制劑zt-1a在制備治療癲癇的藥物中的應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)式如下所示，

3、

4、本發(fā)明還提供了鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(kcc2)和鉀-鈉-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(nkcc1)聯(lián)合作為靶點(diǎn)在篩選治療癲癇的藥物中的用途。

5、本發(fā)明闡明了一種介導(dǎo)癲癇病理發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，確立了中樞海馬神經(jīng)元表達(dá)的wnk-spak-kcc2/nkcc1信號(hào)通路與癲癇的關(guān)聯(lián)性以及spak的異常上調(diào)是癲癇誘導(dǎo)發(fā)生的重要機(jī)制之一，確立zt-1a作為spak抑制劑對(duì)癲癇的調(diào)控作用。

6、本發(fā)明先在整體ptz誘導(dǎo)癲癇小鼠模型上進(jìn)行研究，探究經(jīng)側(cè)腦室注射zt-1a是否會(huì)影響ptz誘導(dǎo)的癲癇行為發(fā)作；研究結(jié)果明確了zt-1a能有效降低小鼠癲癇發(fā)作易感性。對(duì)造模小鼠海馬膜/全蛋白進(jìn)行western?blot實(shí)驗(yàn)后進(jìn)一步證明了zt-1a的抗癲癇作用是由于抑制了驚厥刺激后spak激活實(shí)現(xiàn)的，從而揭示了zt-1a和wnk-spak-kcc2/nkcc1參與癲癇的調(diào)控機(jī)制。隨后在原代海馬培養(yǎng)神經(jīng)元培養(yǎng)到div14時(shí)進(jìn)行細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)。對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行20um致癇劑ctz孵育3h的基礎(chǔ)上，分別給予30min?3um?zt-1a和30min?10um?nkcc1抑制劑bumetanide(bum)后使用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)了各神經(jīng)元的自發(fā)癲癇樣放電情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，zt-1a表現(xiàn)出與陽(yáng)性對(duì)照組bum類似的抑制ctz癲癇造模后海馬培養(yǎng)神經(jīng)元癲癇樣burst放電的作用。加入zt-1a后原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中癲癇樣神經(jīng)元所占比例降低，其中癇樣神經(jīng)元發(fā)作的時(shí)長(zhǎng)、頻率和強(qiáng)度均減弱，從而進(jìn)一步表明zt-1a的抗癲癇作用。

7、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是積極明顯的。本發(fā)明與單純提高gaba抑制功能的傳統(tǒng)治療策略不同，本發(fā)明將kcc2作為癲癇治療新靶點(diǎn)，找到其上游調(diào)控信號(hào)通路wnk-spak-kcc2/nkcc1，提供了spak抑制劑zt-1a在制備抗癲癇藥物上的應(yīng)用。zt-1a通過(guò)抑制上游spak激酶激活能實(shí)現(xiàn)對(duì)下游kcc2和nkcc1蛋白的多重調(diào)控，減小甚至逆轉(zhuǎn)病癥對(duì)gaba抑制功能的損傷，能有效地阻止癲癇的發(fā)生發(fā)展。相較于傳統(tǒng)的泛蛋白激酶抑制劑，zt-1a對(duì)spak蛋白抑制作用更強(qiáng)且副作用更小，因此極具藥物研發(fā)價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.spak抑制劑zt-1a在制備治療癲癇的藥物中的應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)式如下所示，

2.鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀-鈉-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體聯(lián)合作為靶點(diǎn)在篩選治療癲癇的藥物中的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了SPAK抑制劑ZT?1a在制備治療癲癇的藥物中的應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)式如下所示，WNK?SPAK?KCC2/NKCC1信號(hào)通路的活性在胚胎和新生兒出生后第一周升高，隨著大腦成熟到成年顯著降低，但在癲癇病理狀態(tài)下，此通路被重新激活。KCC2的Thr1007殘基磷酸化水平升高，降低其功能，從而加重癲癇癥狀。本發(fā)明中新型SPAK抑制劑ZT?1a通過(guò)抑制該通路激活多重調(diào)控KCC2和NKCC1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，有效抑制致癇劑誘導(dǎo)的癲癇行為及培養(yǎng)神經(jīng)元癲癇樣放電的發(fā)生。本發(fā)明提供了一種全新的基于神經(jīng)元陽(yáng)離子?氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控機(jī)制治療癲癇的治療手段，改變了目前集中于鈉離子通道和GABA抑制型功能的抗癲癇藥物靶點(diǎn)篩選，因此極具藥物研發(fā)價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：王云,劉旭,蔡靜宜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17