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      核糖體失活蛋白質(zhì)及其衍生物的制作方法

      文檔序號(hào):829910閱讀:648來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):核糖體失活蛋白質(zhì)及其衍生物的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及可用于制備免疫毒素的核糖體失活蛋白質(zhì)以及它們的疏基衍生物。
      由植物得到的核糖體失活蛋白質(zhì)(RIPs)(CancerSurveys1,489,1982;J.NaturalProducts.48,446,1985,F(xiàn)EBSLetters.195,1,1986)使得真核生物核糖體的60s核糖體亞單位催化失活。它們可以是單鏈蛋白質(zhì)(RIPS1型)或雙鏈蛋白質(zhì)(RIPS2型)、其中的一條鏈具有酶活性而另一條具有半乳糖特異性植物血凝素的性質(zhì)。RIPs1型較為常見(jiàn),它存在于許多并且有可能是幾乎所有植物的若干部分中,包括種子、根、葉和植物乳汁中,有時(shí)以多于一種的形式,可能為異構(gòu)體形式存在。RIPs具有一個(gè)獨(dú)特的N-糖苷酶活性,并且斷裂28srRNA中腺嘌呤4324的N-糖苷鍵,造成一種損傷,使得RNA可以在由α-sarcin誘導(dǎo)產(chǎn)生的斷裂的鄰近位點(diǎn)被苯胺裂解。這就使得核糖體不能與延伸因子1或2結(jié)合,因而阻礙了蛋白質(zhì)的合成。盡管它們有許多結(jié)構(gòu)上的相似之處,以及相同的酶活性,但是對(duì)于源于不同生物體的核糖體(源于植物、原生動(dòng)物、昆蟲(chóng)及后生動(dòng)物),RIPs具有不同的作用。
      由于RIPs已用作為“免疫毒素”的成分,所以對(duì)它的興趣愈來(lái)愈增加,“免疫毒素”是由連到抗體上去的毒性分子部分組成的雜化分子。免疫毒素將有希望用于消除有害細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、免疫活性細(xì)胞及寄生細(xì)胞。這些細(xì)胞被認(rèn)為是可能的靶細(xì)胞(CancerImmunol.Immunother27,95,1988)。
      對(duì)RIPs另外的興趣是來(lái)自于它們的抗病毒活性,所有被試驗(yàn)的RIPs都能抑制植物和動(dòng)物病毒的感染。實(shí)際上,首先發(fā)現(xiàn)的RIP1型即商陸植物抗病毒蛋白質(zhì)(PAP)最初純化為一種抗病毒蛋白質(zhì)。RIPs的這種性質(zhì)歸因于它更容易穿透到病毒感染的細(xì)胞中,因而使這些細(xì)胞的核糖體失活,并且阻礙了病毒的繁殖??墒亲罱l(fā)現(xiàn),一種1型RIP,Trichosanthin,它通過(guò)一個(gè)顯然與對(duì)核糖體作用無(wú)關(guān)的機(jī)制,來(lái)抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒的復(fù)制。
      有用的是,得到一些用于制備免疫毒素的RIP、得到對(duì)一些RIPs具有抗性的細(xì)胞起活性作用的共軛物,并且防止因用藥后的免疫反應(yīng)造成的中和作用以及在共軛作用過(guò)程中一些RIPs失活所引起的問(wèn)題。
      現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以從植物木鱉(MomordicaCochinchinensis)BryoniaDioicaeAsparagusOfficinalis中得到的新的核糖體失活蛋白質(zhì)。所述植物在先前已被研究過(guò),沒(méi)有認(rèn)識(shí)到它們里面存在有本發(fā)明的蛋白質(zhì),這種蛋白質(zhì)的特征是比從同一植物種中提取的已知的類(lèi)似蛋白質(zhì)具有顯著更高的活性。例如從木鱉(一種產(chǎn)于印度的葫蘆科植物)中提取的蛋白質(zhì)與已知從一些苦瓜屬(MomordicaGenus)(苦瓜(MomordiaCharantia))中提取的已知Momordine相比顯示出人意料的不同特性。類(lèi)似的是,從AsparagusofficinalisL.(Biochem.J.216,617,1983)得到的三種糖蛋白是已知的,而從該同種植物中提取的本發(fā)明物質(zhì)是具有不同生物和物理化學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì),本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性在于主要是在無(wú)細(xì)胞體系中有效地抑制蛋白質(zhì)的合成盡管對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞毒性很小,但是它們可以通過(guò)(用合適的化學(xué)試劑)-共軛到合適的載體(“Haptomers”)例如單克隆抗體上,而轉(zhuǎn)化成為高度細(xì)胞毒性劑。如果所述載體對(duì)腫瘤細(xì)胞是抗原特異的,則可以使用所述新的RIPS進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的選擇性破壞。
      還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)能夠在用各種病毒包括人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV1)忽性傳染的培養(yǎng)細(xì)胞中抑制病毒的復(fù)制。
      本發(fā)明還涉及所述RIPs的引入了疏基的衍生物,這種衍生物由式Ⅰ表示。所述衍生物與起始RIPs相比具有相同的或略低的抑制活性,因此,由于它們都是起始RIPs釋放到細(xì)胞中的免疫毒素與抑制劑的合成中間體,所以對(duì)于制備抗體毒素結(jié)合物是有用的。
      (其中Tox表示有關(guān)的RIP;Y、R和X的含義見(jiàn)下文)按照常規(guī)方法使用雙功能試劑得到式Ⅰ的衍生物,這些雙功能試劑有例如3,3′-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯或下面所述的試劑N-琥珀酰亞胺基(succinimidy1)-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)Y
      X0.5-3(優(yōu)選0.7-2,最好0.7-1.5)2)-亞胺基硫烷(Iminothiolane)(Traut′s試劑)Y
      X0.5-2(優(yōu)選0.5-1,最好0.7)3)S-乙?;?疏基-琥珀酐(SAMSA)
      Y
      X0.2-3(優(yōu)選0.4-1;最好0.7-1)本發(fā)明的RIPS將以下列名稱(chēng)表示木鳘因momorcochin(從木鱉種子中得到);bryodine-L瀉根因(從Brioniadioica葉中得到);天門(mén)冬因1(asparin1)和天門(mén)冬因2(asparin2)(從天門(mén)冬屬ArparagusOfficinalis種子中得到)。木鱉因和瀉根因-L是糖蛋白,而天門(mén)冬因1和2是蛋白質(zhì)。
      通過(guò)常規(guī)的從植物中提取蛋白質(zhì)的方法可以得到本發(fā)明的蛋白質(zhì),其特征在下文中被描述。本發(fā)明蛋白質(zhì)因此可以通過(guò)包括以下各步的方法獲得a)研磨和萃取種子或葉;
      b)將提取物離心或過(guò)濾;
      c)將步驟b的下清液在交聯(lián)葡糖上進(jìn)行色譜或進(jìn)行透析;
      d)按照合適的順序進(jìn)行離子交換色譜和/或凝膠過(guò)濾;
      e)通過(guò)透析、凍干、色譜、沉淀或其它常規(guī)方法進(jìn)行最終的純化。
      按照已知方法,借助于前面列舉的試劑可以將所獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。所得衍生物可以用于制備免疫毒素。用于治療,例如用于治療腫瘤,這時(shí)可以通過(guò)非腸道途經(jīng)采用合適的藥物劑型,以1至100mg劑量范圍給藥。
      下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
      實(shí)施例1
      制備粗提取物將種子在適當(dāng)?shù)难心テ髦袧衲ゲ⑤腿?將葉和根切成小片,并在萃取前過(guò)濾離心,回收汁液并萃取殘余物。用0.14M氯化鈉/5mM磷酸鈉緩沖液PH7.4-7.5,在4-10℃下攪拌12小時(shí)進(jìn)行提取。通過(guò)離心使提取物澄清;將按上述方法獲得的葉和根的汁加至澄清的混合物中,然后再通過(guò)高g離心使其澄清。最終的澄清溶液(“粗提取物”)進(jìn)行下一階段的處理。用乙酸將提取物的PH值調(diào)至4.2-4.8,例如4.5;放置后形成沉淀,將其離心除去。將澄清的上清液(“酸提取物”)裝在S-SepharoseR柱上柱用10mM的乙酸鈉緩沖液PH4.5平衡,用同樣的緩沖液洗滌并隨后用5mM、PH7.5的磷酸鈉洗至洗脫液為中性后,用1M氯化鈉/磷酸鈉緩沖液洗脫該柱。
      用硫酸銨使澄清的洗脫液飽和;放置后,離心收集沉淀物。
      將固體溶于5mM、PH7.0的磷酸鹽緩沖液中;通過(guò)離心使溶液澄清,并將其分離成單一的RIPS(“S-Sepharose滲濾”)或者,所說(shuō)的最后的提取物的制備也可以通過(guò)在4℃、在50-500體積的5mMPH6.5的磷酸鹽緩沖液(至少全部更換兩次)中透析至少24小時(shí),離心除去每次透析過(guò)程中形成的沉淀,并將澄清的提取物進(jìn)行分離。在“粗提取物”、“酸提取物”、“S-Sephazose滲濾液”這些步驟中,都要對(duì)每個(gè)RIP進(jìn)行下文中所述的總蛋白質(zhì)含量、比活度及總活度的測(cè)定。
      實(shí)施例2木鱉因(momorcochin)的分離與性質(zhì)A)提取與分離按照實(shí)施例1中所描述的方法對(duì)1.2kg木鱉,一種產(chǎn)于印度的葫蘆科種植物的種子進(jìn)行提取。將最終溶液“S-Sepharose滲濾液”在Sephadex G-50R上進(jìn)行色譜層析(“Sephadex G-50洗脫液”),然后裝在用5mM、PH7.0的磷酸鈉緩沖液平衡過(guò)的并配備有流動(dòng)盒和280nm吸收探測(cè)器的CM-Sepharose Fast FlowR柱上。用平衡緩沖液洗柱直至該滲濾液在280nm不再有任何吸收為止。在20℃,用在相同緩沖液中的0至300mM線(xiàn)性梯度的Nacc洗脫滲濾速度為1.2升/小時(shí),總體積為20升,收集450ml的組分,測(cè)定每一組分在260nm處的吸收及電導(dǎo)(mscm)并測(cè)定每一組分的抑制特異蛋白及全蛋白合成的活性,這些活性在下面的生物學(xué)特性中將描述。對(duì)洗脫液特性與已知木鱉丁(Momordin)(由Momordica Charantia獲得J、Chromatogr、408,235,1987)之間的比較證實(shí)了這兩種物質(zhì)的不一致性(木鱉丁約從12至17升的洗脫組分,木鱉因從6至7.5升的組分)。將含有木鱉因的組分合并并在水中透析至完全沒(méi)有鹽。將最終的溶液凍干,對(duì)比殘余物(“木鱉因”)進(jìn)行物理化學(xué)及其生物學(xué)特性分析。
      B)物理化學(xué)性質(zhì)a)提取液的蛋白質(zhì)含量結(jié)果是根據(jù)以下方法得出的-Lowry的方法(J.BiolChem193,265,1956),(標(biāo)準(zhǔn)-牛血清白蛋白)-Kalb與Bernlhor的方法(AnalBiochem82,362,1977)-利用該提純蛋白質(zhì)在280nm的吸收進(jìn)行分光光度測(cè)定(摩爾消光系數(shù)為0.8)。
      b)相對(duì)分子量(rm)根據(jù)下述方法測(cè)定-采用下述標(biāo)記(括號(hào)中是相對(duì)的rm)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(Nature227,680,1970)細(xì)胞色素C(12300)、肌紅蛋白(17200)、碳酸酐酶(30000)卵白蛋白(45000)、牛血清白蛋白(66250)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(76000-78000);
      -通過(guò)用含有0.3m Nacl的20mM、PH7.5的磷酸鈉緩沖液平衡過(guò)的Sephacry S-200R(95×1.6cm柱)進(jìn)行凝膠過(guò)濾,在20℃洗脫速度為8ml/小時(shí);標(biāo)定(括號(hào)中為相對(duì)的rm)葡聚糖藍(lán)(2×106)、牛血清白蛋白(66250)、卵白蛋白(45000)、胰凝乳蛋白酶原A(25000)、核糖核酸酶A(13700)。
      C)按照Biochem、J.240,659,1986測(cè)定等電點(diǎn)、氨基酸的組成、氨基糖和中性糖的組成。
      通過(guò)對(duì)中間提取物(實(shí)施例1中描述的)、對(duì)本實(shí)施例的中間提取物以及最終的凍干產(chǎn)品“木鱉因”使用上述方法,得出如下結(jié)果不同純化階段的蛋白質(zhì)(每千克起始種子的克/升)-“粗提取物”-52.26-“酸提取物”-36.00-“S-Sepharose滲濾液”-19.48-“SephadexG-50洗脫液”-2.55-“木鱉因”-0.74
      即以木鱉因相對(duì)于首次提取的總蛋白質(zhì)的產(chǎn)率約1%(重量),而相對(duì)于所提取的種子只有0.07%(重量)的產(chǎn)率。
      最終產(chǎn)品的分子量凝膠過(guò)濾31000電泳30700電泳分析還顯示存在著一個(gè)單一的化學(xué)物質(zhì)。等電點(diǎn)>9(木鱉丁8.60-Biochem.J.207,505,1982)在280mm(A280)的消光值0.7氨基酸組成(mols/mole蛋白質(zhì))(水解24,48和72小時(shí)的平均值;假定rm=30700下計(jì)算出的比率;誤差<1%;IUPAC符號(hào),括號(hào)內(nèi)是木鱉丁的相應(yīng)值-Biochem.J.207,505,1982;aa氨基酸)
      與木鱉丁組份的比較表明從相同苦瓜屬的兩個(gè)種中提取的這兩種RIPS的組份不同。
      中性糖的總含量2.82%(木鱉丁-上面所引用的Biochem、J、207-含量為1.74%的)。
      糖組成(Mols/MolRIP)(假定rM=30700下所計(jì)算的比率,IUPAC符號(hào);括號(hào)內(nèi)是木鱉丁的相應(yīng)值-上面所引用的BiochemJ.207)糖Mols/MolRIPFuc1.42(0.90)Glc0.98(0.80)Man2.16(1.30)Xyl0.98(0.50)Glc-NH2 abs.(2.00)在此例中,木鱉因與木鱉丁之間的意外區(qū)別是很明顯的,C)生物學(xué)性質(zhì)C.1.-對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制活性通過(guò)下述方法測(cè)定C.1.1-兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物(Biochem.J.240,659,1986)。通過(guò)這種方法測(cè)定在有網(wǎng)狀細(xì)胞成分(陽(yáng)性線(xiàn)粒體部分)存在的情況下,RIPS抑制蛋白質(zhì)合成的能力。
      該方法是基于在有合適的輔助因子及天然氨基酸,其中的一個(gè)氨基酸用3H或14C標(biāo)記混合物存在下,用所述亞細(xì)胞制劑進(jìn)行體外誘導(dǎo)合成,在所獲得的蛋白質(zhì)中結(jié)合的放射活性的量隨時(shí)間的關(guān)系可以估價(jià)該系統(tǒng)中蛋白質(zhì)合成的速度以及諸如RIPS這類(lèi)不同試劑對(duì)它的影響。
      向含有100mM乙酸銨、2mM乙酸鎂、1mMAT、0.2mMGTP、15mM磷肌酸、0.5mM中性氨基酸(除亮氨酸以外)的10mM、PH7.4的Tris/Hcl緩沖溶液中加入3μg肌酸激酶、89nCi的L-(14C)-亮氨酸和25μl兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物(按照J(rèn).Biol.Chem.237,760,1982的方法制備),最終體積為62.5μl。在28℃保溫5分鐘后加入1ml 0.1MKOH中止反應(yīng)。可以按照Biochem.J 174,491,1978中描述的方法測(cè)定所結(jié)合的放射活性。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,在保溫之前加入梯量的RIP。這些結(jié)果以IC50(50%合成被抑制的濃度)或以單位和比活度(單位/毫克)表示。一個(gè)抑制單位(或活度單位)-能抑制50%蛋白質(zhì)合成所需的RIP的量(以毫克表示),調(diào)正反應(yīng)體積為1ml。
      C.1.2-聚尿苷酸酯(Poly-u)-用兔或布氏錐蟲(chóng)網(wǎng)狀細(xì)胞的核糖體進(jìn)行苯丙氨酸的控制聚合(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.47.1588,1961)。此方法可以估價(jià)RIPs對(duì)聚苯丙氨酸合成的抑制活性,聚苯丙氨酸的合成是由從t-RNA酯化的苯丙氨酸起始,合成由僅僅由尿嘧啶核苷酸組成的合成多核苷酸Poly-U控制的。
      此方法與前一種是相似的,只是用一種簡(jiǎn)化的多核苷酸代替兔網(wǎng)狀細(xì)胞mRNAs控制復(fù)合蛋白質(zhì)的合成,這種簡(jiǎn)化的蛋白質(zhì)可以在有純核糖體存在的情況下轉(zhuǎn)譯一個(gè)均聚物-聚苯丙氨酸的合成。
      在最終體積為250μl、含120mM乙酸鎂、2m MGTP的80mM、PH7.4的Tris/Hcl緩沖液中加入200μg Poly-U25Pmol14C-苯丙氨酰-t-RNA、20Pmol兔網(wǎng)狀細(xì)胞核糖體或布氏錐蟲(chóng)核糖體(J.Protozool.35,384,1988)以及250μg(作為蛋白質(zhì))的按Biochem.J.176,265,1978中的“PH5的上清液”。在30℃保溫30分鐘后,測(cè)定(已引用的Biochem J.240)三氯乙酸不溶物的放射活性(即被聚合了的,被標(biāo)記的苯丙氨酸的量)。然后在梯量RIPs存在下再進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。通過(guò)線(xiàn)性回歸分析計(jì)算IC50。
      C.1、3-人細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充非必需氨基酸抗菌素及10%牛胎血清的RPMI1640培養(yǎng)基中以單層培養(yǎng)物形式保持Hela、TG細(xì)胞(人輸卵管癌)、JAR細(xì)胞(人絨膜癌)、人纖維細(xì)胞以及NB100細(xì)胞(人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系)此方法可以通過(guò)比較毒素存在與不存在條件下的蛋白質(zhì)合成來(lái)估價(jià)在不同的完整細(xì)胞系統(tǒng)中RIPs的細(xì)胞毒素的作用。
      此方法包括在無(wú)牛胎血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中、在存在不同量的RIPs條件下培養(yǎng)不同的細(xì)胞。18小時(shí)后,通過(guò)在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞1-5小時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)合成活性,在培養(yǎng)基中不含血清和亮氨酸,而在每毫升培養(yǎng)基中加入0.1-1μCi的L-(14C)-亮氨酸。根據(jù)J.Biol、Chem 257,7495,1982的方法測(cè)定結(jié)合于細(xì)胞中的放射性。通過(guò)線(xiàn)性回歸分析計(jì)算ID50(抑制50%蛋白質(zhì)合成的劑量)。
      C.2-對(duì)動(dòng)物的毒性對(duì)體重為27-32g的瑞士雌小鼠(FedadLibitum)以劑量范圍是5.6-23.7mg/kg體重的6種不同的劑量給藥,每種劑量6只動(dòng)物,通過(guò)腹膜途徑對(duì)純RIPs的毒性進(jìn)行評(píng)估在48小時(shí)后通過(guò)線(xiàn)性回歸分析計(jì)算LD50、對(duì)主要器官進(jìn)行尸體剖驗(yàn)。
      通過(guò)對(duì)實(shí)施例1、本實(shí)施例中的中間提取物以及對(duì)最終冷凍干燥產(chǎn)品(“木鱉因”)應(yīng)用所述方法,得到下面結(jié)果組分網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物時(shí)蛋白質(zhì)合成的抑制活性(C.1.1)組分比活度提取總活度※產(chǎn)率※※(單位/mg×10-3)(單位×10-6-“粗提取物”16.8877.2(100)-“酸提取物”29.11049.6119.6-“S-Sepharose27.5536.661.2滲濾液”-“Sephadex149.2379.143.2G-50洗脫液”-“木鱉因”285.7211.924.0※指1.2kg起始種子※※指“粗提取物”假設(shè)為100。
      必須指出木鱉因的比活度(211.9單位/mg×10-3)比木鱉丁的比活度(在J.Chromatogr.408,235,1987中報(bào)導(dǎo)為1.0526×10-3單位/mg)高約201倍。
      在無(wú)細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)合成的IC50方法酶體系 IC50(nM)C.1.1網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物0.12C.1.2網(wǎng)狀細(xì)胞的純化核糖體1.0C.1.2布氏錐蟲(chóng)的純化核糖體3,330
      將用網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物得到的木鱉丁(FEBS-Letters 195,1,1986)的IC50(0.06nM)與木鱉因的IC50相比較證明了這兩種RIPs進(jìn)一步的不同。
      在Integer細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的IC50(C.1.3)(表中的值是兩個(gè)不同測(cè)定的平均值;括號(hào)中是木鱉丁的ID50值;其中的符號(hào)同C.1.3中)細(xì)胞 ID50(nM)Hela2,870(32,000)TG2,040Jar3,330NB320人纖維細(xì)胞109動(dòng)物毒性(C.2)LD5024.5mg/kg體重。木鱉丁的LD50值為4.30mg/kg體重(上面引用的FEBS Letter)。
      D)化學(xué)修飾D.1-用SPDP使用Biochem.J.240,659,1986中描述的方法。根據(jù)Biochem.J.173,727,1978中描述的方法測(cè)定引入的2-吡啶基疏基基團(tuán)。將待疏基化的木鱉因溶解于PH9.0硼酸鹽緩沖液中,濃度為10mg/ml。SPDP與木鱉因的摩爾比率、引入基團(tuán)的數(shù)目以及IC50值列于表D.4中。
      D.2-用2-亞胺基硫烷(Iminothiolane)使用Biochemistry24,1517,1985中描述的方法。根據(jù)Arch、Biochem、Biophys 82,70,1959的方法測(cè)定引出疏基基團(tuán)的數(shù)目。木鱉因是溶于50mM、PH9.0硼酸鹽緩沖液中的1.5mM溶液。通過(guò)Sephadex G25進(jìn)行凝膠過(guò)濾,純化最終產(chǎn)品。2-亞胺基疏烷與木鱉因的摩爾比率和ID50值列于表D.4中。
      D.3-用SAMSA根據(jù)J.Am.Chem.Soc.81,3802,1959。根據(jù)Enzymology25,457n1972的方法測(cè)定加入羥胺后引入疏基基團(tuán)的數(shù)目。木鱉因是溶于125mM、PH7磷酸鹽緩沖液的溶液。
      D.4-測(cè)定改性RIPs的IC50計(jì)算用網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物(方法C.1.1)時(shí)這種改性產(chǎn)物的IC50值(以nM表示)。每個(gè)值是三個(gè)測(cè)定的平均值。
      試劑摩爾比引入基團(tuán)的 IC50試劑/RIP(※)數(shù)目(nM)無(wú)0.12SPDP1.5∶11.130.12SPDP2.0∶11.440.202-亞胺基1.25mM0.730.10硫烷SAMSA28∶10.700.10(※)在上面所述實(shí)驗(yàn)條件下。
      實(shí)施例3瀉根因-L(bryodine-L)的分離與性質(zhì)A)提取與分離根據(jù)實(shí)施例1的方法提取12.5kg新鮮的Bryoniadioica-一種葫蘆科種植物的葉,直到獲得“S-Sepharose滲濾液”;按照實(shí)施例2的方法處理所述溶液,用Sephacryl-SrooR(“Sephacryl-SzooR洗脫液”)代替Sephadex G-50R;在如對(duì)木鱉因所述的條件下,在CM-Sepharose Fast FlowR上進(jìn)行色譜后,混合活性組分(“CM-Sepharose洗脫液”),在水中徹底地透析,裝入用10mM、PH8.0的Tris/HCl緩沖液平衡過(guò)的Blue SepharoseR柱上用0-200mM在相同緩沖液中的Nacl對(duì)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫,監(jiān)測(cè)組分在280nm的吸收及傳導(dǎo)率(ms/cm)。
      混合從6.8-7.6升的組分并在水中徹底地透析,然后冷凍干燥(Bryodine-L)。
      B)物理化學(xué)性質(zhì)所使用的方法是在實(shí)施例2的B中a、b、c段所公開(kāi)的方法。
      不同純化步驟的蛋白質(zhì)(g/12.kg葉)。
      -“粗提取物”293.75-“S-Sepharose滲濾液”1.74-“Sephacryl-Sroo洗脫液”0.41-“CM-Sepharose洗脫液”0.035-“瀉根因-L”0.021最終產(chǎn)品的分子量通過(guò)凝膠過(guò)濾27300通過(guò)電泳28800電泳進(jìn)一步表明冷凍干燥物是一個(gè)單一物質(zhì)。
      等電點(diǎn)>9.5在280nm的消光系數(shù)(A280)0.8氨基酸組成(Mol/Mol(蛋白質(zhì))(在24、48、72小時(shí)水解的平均值;假設(shè)rM=28800時(shí)所計(jì)算的比率,誤差<1%;IUPAC符號(hào);括號(hào)內(nèi)容是Bryodine的相應(yīng)值-Biochem.J.240,659,1986;aa氨基酸)。
      數(shù)據(jù)之間的比較表明這兩種RIPs不同的組成。下面的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明了這種顯著的區(qū)別。對(duì)于瀉根因(被引用過(guò)的Biochem.J.240)總含量為6.33%。
      糖組成(mols/molRIP)(假設(shè)rM=28800時(shí)計(jì)算得的比率;IUPAC符號(hào);括號(hào)內(nèi)是瀉根因的相應(yīng)值-引用了的Biochem.J.240)糖mols/molRIPFuc1.52(3.47)Glc0.43(1.55)Man2.52(6.27)Xyl0.63(0.93)C)生物性質(zhì)根據(jù)實(shí)施例1中C.1.1、C.1.2、C.1.3項(xiàng)所描述的方法測(cè)定生物性質(zhì),根據(jù)C.2的方法估價(jià)毒性。用兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物時(shí)蛋白質(zhì)合成的抑制活性(C.1.1)
      比活度提取總活度*(單位/(單位×組分 mg×10-3) 10-6) 產(chǎn)率**-“粗提取物”0.6170.0(100)-“S-Sepharose滲濾液”81.4141.083.2-“Sephacryl-S200洗脫液”123.050.029.7-“CM-Sepharose洗脫液”251.98.75.1-“瀉根因-L”362.36.73.9*指12.5kg鮮葉,**指“粗提取物”假設(shè)為100。
      應(yīng)當(dāng)指出,葉中的瀉根因-L的比活度(362.3單位/mg×10-3)分別比CM0.097M和CM0.112M組分的比活度高2.8倍和1.6倍,比在所引用的Biochem.J.240中所描述的瀉根因(根中的CM0.100M組分)高2.56倍。無(wú)細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)合成的IC50方法酶體系IC50(nM)C.1.1兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物0.09C.1.2網(wǎng)狀細(xì)胞的純化核糖體1.3C.1.2布氏錐蟲(chóng)的純化核糖體3,330在此例中無(wú)法與Biochem.J.240中所描述的數(shù)據(jù)比較,因?yàn)闊o(wú)論是在被結(jié)合的d.p.m或者ID50數(shù)據(jù)(與IC50的含義相同)都是用不同的核糖體制劑(源于小麥胚或源于Bryoniadioica)估價(jià)的在完整的細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)合成的IC50(C.1.3)(這些值是兩個(gè)不同測(cè)定的平均值)細(xì)胞TD50(nM)HeLa3,330TG770Jar3,330NB50人體纖維細(xì)胞800動(dòng)物毒性(C.2)LD5010mg/kg體重瀉根因(被引用的Biochem.J.240)14.5mg/kg。
      D)化學(xué)修飾采用實(shí)施例2中D.1、D.2、D.3的方法進(jìn)行化學(xué)修飾。測(cè)定修飾瀉根因-L的IC50根據(jù)實(shí)施例2的方法C.1.1測(cè)定IC50、IC50以nM表示。每個(gè)值是三次測(cè)定的平均值。
      摩爾比IC50試劑試劑/RIP(*) 引入基團(tuán)的數(shù)目 (nM)無(wú)0.10SPDP1.5∶11.030.11SPDP2.0∶11.320.122-亞胺基硫烷1.25mM0.700.09SAMSA28∶10.750.11
      實(shí)施例4天門(mén)冬因(asparin)1和2的分離與性質(zhì)A)提取與分離按照實(shí)施例3的方法提取1kgAsparagusOfficinalis種子,將CM-Sepharose提取液分成兩種組分(“CM-峰1∶1.8至2.4升之間的組分;“CM-峰2∶3.3至3.8升之間的組分)。然后將這兩種組分分別在兩個(gè)Red-Sepharose柱上純化,柱子用pH8.0的Tris/HCl緩沖液平衡,用0-300mM溶于相同緩沖液中的Nacl梯度洗脫。
      將“CM-峰1”的純化組分(“天門(mén)冬1”)冷凍干燥,而“CM-峰2”的純化組分(“天門(mén)冬2”)首先通過(guò)Sepharyl S-200R柱上洗脫。
      B)物理化學(xué)性質(zhì)使用實(shí)施例2中B項(xiàng)的a,b,c段所描述的方法。
      不同純化步驟的蛋白質(zhì)(g/1kg種子)-“粗提取物”-23.23-“酸提取物”-13.58-“S-Sepharose滲濾液”-7.55-“SephacrylS-200洗脫液”-2.04-“CM-峰1”-0.159-“CM-峰2”-0.229-“asparin1”(天門(mén)冬因1)-0.054-“asparin2”(天門(mén)冬因2)-0.049最終產(chǎn)品的分子量
      天門(mén)冬因1通過(guò)凝膠過(guò)濾29700通過(guò)電泳30500天門(mén)冬因2通過(guò)凝膠過(guò)濾28100通過(guò)電泳29800電泳結(jié)果還表明這兩種組分都是單一物質(zhì)。
      等電點(diǎn)-天門(mén)冬因1∶8.7-天門(mén)冬因2∶9.2在280nm的消光系數(shù)(A280)∶1.0(兩種都是)氨基酸組成(mol/mol蛋白質(zhì))天門(mén)冬因1(在24、48、72小時(shí)水解的平均值假設(shè)rM∶30500時(shí)計(jì)算得的比率;誤差<1%;IUPAC符號(hào);aa氨基酸)氨基酸mol/mol氨基酸mol/mol氨基酸mll/mol/pr./pr./pr.
      Lys15.3Glx24.3Met4.1His3.4Pro14.9Ile11.4Arq14.4Gly15.0Leu26.3Asx26.5Ala19.5Tyr9.8Thr13.9半胱氨酸3.3Phe6.3Ser11.0Val16.7Trpabs.
      天門(mén)冬因2
      (在24、48、72小時(shí)水解的平均值;假設(shè)rM=29800時(shí)計(jì)算比率;誤差<1%;IUPAC符號(hào);aa氨基酸)氨基酸mol/mol氨基酸mol/mol氨基酸mol/mol/pr./pr./pr.
      Lys14.9Glx23.2Met1.1His2.9Pro15.4Ile11.5Arg14.8Gly15.2Leu26.6Asx27.2Ala18.8Tyr9.8Thr14.2半胱氨酸1.3Phe6.3Ser11.3Val16.9Trpabs.
      中性糖的總含量0%對(duì)于三種糖蛋白(被引用的Biochem.J.216)其中含量為1.42%、1.20%、1.32%,其組成為糖糖蛋白峰1峰2峰3(mol/mol蛋白質(zhì))巖藻糖痕跡量00半乳糖0.3痕跡量0.3葡萄糖2.12.12.1甘露糖0.40.30.3c)生物性質(zhì)根據(jù)實(shí)施例2中C.1.1、C.1.2和C.1.3項(xiàng)的方法測(cè)定生物活性,根據(jù)C.2的方法測(cè)定毒性。用兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物時(shí)蛋白質(zhì)合成的抑制活性(C.1.1)比活度提取脂的總組分(單位/毫克活性(單位×10-3) ×10-6)*產(chǎn)率**-“粗提取物”7.9183.5(100)-“酸提取物”16.3221.0120-“S-Sepharose滲透物”35.3266.5145-“Sephacryl-S200提洗液”69.4141.877-“CM-峰1”89.915.78.5-“CM-峰2”218,049.927.2-“天門(mén)冬1”112.46.13.3-“天門(mén)冬2”224.210.95.9*指1kg種子**指“粗提取物”,假定為100。
      無(wú)細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)合成的IC50天門(mén)冬因1方法酶體系IC50(nM)C.1.1兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物0.27C.1.2網(wǎng)狀細(xì)胞的純化核糖體8.8C.1.2布氏錐蟲(chóng)的純化核糖體>3,330
      天門(mén)冬因2方法酶體系IC50(nM)C.1.1兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物0.15C.1.2網(wǎng)狀細(xì)胞的純化核糖體6.9C.1.2布氏錐蟲(chóng)的純化核糖體>3,330在完整的細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的IC50(C.1.3)(這些值是兩次不同測(cè)定的平均值)天門(mén)冬因1細(xì)胞ID50(nM)HeLa3,330TG610Jar3,330NB180人體纖維細(xì)胞3,330天門(mén)冬因2細(xì)胞 ID50(nM)HeLa3,330TG210Jar3,330NB180人體纖維細(xì)胞2,020
      動(dòng)物毒性(C.2)LD50∶20mg/kg體重(兩者相同)D)化學(xué)修飾根據(jù)實(shí)施例2中D.1、D.2、D.3項(xiàng)的方法進(jìn)行化學(xué)改性。測(cè)定修飾的天門(mén)冬因1和2的IC50值。
      修飾的天門(mén)冬1和2的TC50的測(cè)定根據(jù)實(shí)施例2中C.1.1的方法測(cè)定IC50,IC50以nM表示。每個(gè)值是三次測(cè)定的平均值。
      天門(mén)冬因1試劑/RIP引入基團(tuán)IC50試劑摩爾比的數(shù)目(nM)NOne0.27SPDP1.5∶11.030.41SPDP2.0∶11.320.672-亞胺基硫烷1.25mM0.700.28SAMSA28∶10.750.26天門(mén)冬因2試劑試劑/RIP引入基團(tuán)IC50摩爾比的數(shù)目(nM)NOne0.15SPDP1.5∶11.030.19SPDP2.0∶11.320.402-亞胺基硫烷1.25mM0.700.26SAMSA28∶10.750.21
      實(shí)施例5抗HIV活性抑制HIV1在lymphoblastoid培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制的活性。
      將在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的VB細(xì)胞與已知濃度的HIV1病毒在37℃保溫約60分鐘。通過(guò)洗滌除去未結(jié)合到細(xì)胞中的多余病毒,然后在各個(gè)逐漸增加濃度(10-8和10-6M之間)的Bryodine或天門(mén)冬因1或天門(mén)冬因2或木鱉因下培養(yǎng)此細(xì)胞(大約1×105細(xì)胞/毫升)。
      利用常規(guī)免疫測(cè)定法,通過(guò)分析病毒抗原P24的表達(dá),測(cè)定培養(yǎng)物中HIV1的存在。
      如通常一樣,在最大病毒產(chǎn)生的周期里評(píng)估抗HIV1活性。
      根據(jù)P24相對(duì)于對(duì)照的百分含量估價(jià)對(duì)復(fù)制的抑制。
      所得結(jié)果表明瀉根因、天門(mén)冬因1、天門(mén)冬因2和木鱉因在不削弱細(xì)胞的大分子合成的濃度下,能夠抑制病毒的復(fù)制,抑制值為70-80%。
      在被傳染的單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞中對(duì)HIV1的抑制根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Ficoll梯度方法,從健康志愿者的外周血液中分離單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。
      如上所述將此細(xì)胞在HIV1感染后進(jìn)行培養(yǎng)。
      一旦根據(jù)Growe S.,Mills J.e Mc Grath M.1987 AIDS Res.Hum.Retrov.3 135-145的方法測(cè)出感染量,用濃度為10-8至10-6M的本發(fā)明RIPs處理該細(xì)胞,并且培養(yǎng)4天。通過(guò)熒光分析法測(cè)定P24抗原的表達(dá),以及用相對(duì)于對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示的抑制值。結(jié)果表明,本發(fā)明的RIPs在這些實(shí)驗(yàn)濃度下能抑制病毒的復(fù)制,其抑制值為70-80%。
      權(quán)利要求
      1.一種由木鱉植物種子制備名為木鱉因的核糖體夫活蛋白質(zhì)的方法,該蛋白質(zhì)具有下述特征--通過(guò)凝膠過(guò)濾的分子量31,000--通過(guò)電泳的分子量30,700--等電點(diǎn)>9--在280nM的消光系數(shù)0.7--rM=30,700的氨基酸組成mol/molmol/molmol/mol氨基酸/Pr·氨基酸/Pr·氨基酸/Pr·Lys15.1Glx21.7Met3.3His2.7Pro8.8Ile12.3Arg8.1Gly11.3Leu26.6Asx27.7Ala23.6Tyr11.4Thr18.4半胱氨酸abs.Phe10.8Ser19.2Val18.7Trpabs.--中性糖的總含量2.82%--rM=30,700的糖組成(mols/molRIP)糖mols/molRIPFuc1.42Glc0.98Man2.16Xyl0.98Glc-NH2 abs.該方法包括a)磨碎并提取種子;b)將提取物離心;c)在交聯(lián)葡聚糖上進(jìn)行色譜;d)離子交換色譜;e)透析并冷凍干燥。
      2.一種由Bryoriadioica葉制備名為瀉根因-L的核糖體失活蛋白質(zhì)的方法,該蛋白質(zhì)具有下述特征-通過(guò)凝膠過(guò)濾的分子量27,300-通過(guò)電泳的分子量28,800-等電點(diǎn)>9.5-在280nm的消光系數(shù)0.8-rM=28,800的氨基酸組成mol/molmol/molmol/mol氨基酸/pr.氨基酸/pr.氨基酸/pr.Lys10.8Glx18.9Met2.2His1.0Pro7.2Ile15.4Arg11.0Gly11.4Leu24.5Asx25.5Ala24.1Tyr11.7Thr17.4半胱氨酸abs.Phe7.4Ser24.4Val14.4Trpabs.-中性糖的總含量2.72%-rM=28.800的糖組成(mol/molRIP)Sugarmols/molRIPFuc1.52Glc0.43Man2.52Xyl0.63該方法包括a)磨碎并提取葉;b)將提取物離心;c)在交聯(lián)葡聚糖上進(jìn)行色譜;d)離子交換色譜;e)透析并冷凍干燥。
      3.一種由Asparagusofficinalis種子制備名為天門(mén)冬因1的核糖體失活蛋白質(zhì)的方法,該蛋白質(zhì)具有下述特征-通過(guò)凝膠過(guò)濾的分子量29,700-通過(guò)電泳的分子量30,500-等電點(diǎn)>8.7-在280nm處的消光系數(shù)1.0-rM=30,500的氨基酸組成mol/molmol/molmol/mol氨基酸/pr.氨基酸/pr.氨基酸/pr.Lys15.3Glx24.3Met4.1His3.4Pro14.9Ile11.4Arg14.4Gly15.0Leu26.3Asx26.5Ala19.5Tyr9.8Thr13.9半胱氨酸3.3Phe6.3Ser11.0Val16.7Trpabs.該方法包括a)磨碎并提取種子;b)將提取物離心;c)在交聯(lián)葡聚糖上進(jìn)行色譜;d)離子交換色譜;e)在Sephacryl S-200R上進(jìn)行色譜。
      4.一種由Asparagusofficinalis種子制備名為天門(mén)冬因2的核糖體失活蛋白質(zhì)的方法,該蛋白質(zhì)具有下述特征-通過(guò)凝膠過(guò)濾的分子量28,100-通過(guò)電泳的分子量29,800-等電點(diǎn)>9.2-在280nm處的消光系數(shù)1.0-rM=29,800的氨基酸組成。mol/molmol/molmol/mol氨基酸/pr.氨基酸/pr.氨基酸/pr.Lys14.9Glx23.2Met1.1His2.9Pro15.4Ile11.5Arg14.8Gly15.2Leu26.6Asx27.2Ala18.8Tyr9.8Thr14.2半胱氨酸1.3Phe6.3Ser11.3Val16.9Trpabs.該方法包括a)磨碎并提取種子;b)將提取物離心;c)在交聯(lián)葡聚糖上進(jìn)行色譜;d)離心交換色譜;e)在Sephaczyl S-200R上進(jìn)行色譜。
      5.一種制備式Ⅰ的蛋白質(zhì)衍生物的方式,式Ⅰ中Tox表示木鱉因、瀉根因-L、天門(mén)冬因1或天門(mén)冬因2,Y選自
      R選自氫、乙酰基、2-吡啶基,X的范圍是0.2-3,該方法的特征在于將木鱉因、瀉根因-L、天門(mén)冬因1或天門(mén)冬因2與3,3′-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、S-乙酰基-疏基-琥珀酐或2-亞胺基硫烷反應(yīng)。
      全文摘要
      本發(fā)明公開(kāi)了從苦瓜屬(Momordica),Bryonia.和Asparagus種植物提取的可用于制備免疫毒素的新的核糖體失活蛋白質(zhì)。
      文檔編號(hào)A61P31/12GK1046335SQ90102670
      公開(kāi)日1990年10月24日 申請(qǐng)日期1990年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1989年3月31日
      發(fā)明者費(fèi)奧林佐·思第皮, 路易季, 巴比里, 佳妮, 歌蘿莫 申請(qǐng)人:伊塔爾法馬科聯(lián)合股份公司
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