專利名稱：糖蛋白激素四成員家族的單鏈形式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域以及一般以異源二聚體形式存在的蛋白質(zhì)激素。更具體地，本發(fā)明涉及絨毛膜促性腺激素(CG)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的單鏈形式。
背景技術(shù)：
在人中，四種重要的糖蛋白激素異源二聚體(LH、FSH、TSH和CG)具有相同的α亞基和不同的β亞基。這些激素中的三種幾乎存在于所有其它的脊椎動物中；目前僅在靈長類以及馬胎盤和尿中發(fā)現(xiàn)CG。
PCT申請WO90/09800(1990年9月7日出版，在此引用作為參考)描述了大量這些激素的修飾形式。一種重要的修飾是用人絨毛膜促性腺激素或其變異體的羧基端肽(carboxy terminal peptide，CTP)對β亞基進(jìn)行C端延伸。也描述了這些激素的其他突變蛋白。CTP的相關(guān)位置是從人絨毛膜促性腺激素β亞基的位置112-118中任一位置至位置145。該P(yáng)CT申請描述，通過保守氨基酸置換而獲得的CTP延伸變異體，沒有破壞CTP的改變清除特性的能力。此外，美國專利申請No.08/049,869(1993年4月20日申請，在此引用作為參考)描述，通過在除C末端之外的位置延伸或插入CTP而修飾這些激素，而且CTP片段比從位置112-118延伸至145的序列更短。
FSH的CTP-延伸型β亞基還在申請人的兩篇文章中有描述LaPolt，P.S.et al.；Endocrinoloy(1992)1312514-2520和Fares，F(xiàn).A.et al.；Proc Natl Acad Sci USA(1992)894304-4308。這兩篇文章在此引用作為參考。
人絨毛膜促性腺激素異源二聚體形式的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表于幾乎同時出版的兩篇文章中。一篇是Lapthorn，A.J.et al Nature(1994)369455-461，另一篇是Wu，H.et al.Structure(1994)2545-558。這些文章的結(jié)果總結(jié)于Patel，D.J.Nature(1994)369438-439中。
目前已經(jīng)知道至少有一個成功制備異源二聚體單鏈形式的例子。從夜樂甜蛋白莓中分離出處于異源二聚體形式的天然增甜劑蛋白-應(yīng)樂果甜蛋白(monellin)。對該異源二聚體的晶體結(jié)構(gòu)的研究與假設(shè)是一致的B鏈C末端可以與A鏈N末端通過接頭(linker)而連接，并保留異源二聚體形式的空間特性。這種連接是有利的，因?yàn)楫?dāng)作為增甜劑蛋白進(jìn)行使用時，它使分子在高溫下處于穩(wěn)定的形式。這是通過制備單鏈形式而成功地達(dá)到的，從而阻止了熱變性，參見美國專利5,264,558。
PCT申請WO91/16922(1991年11月14日出版)描述了異源二聚體糖蛋白激素的多種嵌合的及其他修飾形式。一般而言，該文獻(xiàn)針對涉及各種α或β鏈的α亞基或β亞基的嵌合物。簡單地列在該申請中而沒有給出其他說明的一個構(gòu)建物將幾乎所有人絨毛膜促性腺激素的β鏈與α亞基前體蛋白(即含有該亞基的分泌信號序列)融合在一起。該構(gòu)建物不在本發(fā)明范圍之內(nèi)，因?yàn)槲挥讦潞挺伶溨g的信號序列不能作為本申請所定義和描述的接頭成分(linkermoiety)。
目前已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處于單鏈形式時(其中包括含有各種上述CTP延伸和插入的單鏈形式)，一般的異源二聚體糖蛋白激素保留其特性。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了糖蛋白激素的單鏈形式，其中至少部分激素存在于絕大多數(shù)脊椎動物中。本發(fā)明的單鏈形式可以是糖基化、部分糖基化或非糖基化的，而且存在于天然糖蛋白激素或其變異體中的α和β鏈(或α和α，或β和β)可以任選地通過接頭成分而連接。特別優(yōu)選的接頭成分包括羧基端肽(CTP)單元，它或者是完整的單元或者是其一部分。產(chǎn)生的單鏈激素或者保留未修飾的異源二聚體形式活性，或者是該活性的拮抗劑。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種糖基化或非糖基化蛋白質(zhì)，它含有糖蛋白激素共有的α亞基氨基酸序列，該序列共價(jià)及任選地通過接頭成分連于一種這類激素的β亞基氨基酸序列，或該氨基酸序列的變異體(其中該變異體在本文中定義)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種糖基化或非糖基化蛋白質(zhì)，它含有糖蛋白激素四成員家族中某一成員的β亞基氨基酸序列，該序列共價(jià)及任選地通過接頭成分連于一種這類激素的β亞基氨基酸序列，或該氨基酸序列的變異體(其中該變異體在本文中定義)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種糖基化或非糖基化蛋白質(zhì)，它含有糖蛋白激素四成員家族的α亞基氨基酸序列，該序列共價(jià)及任選地通過接頭成分連于另一α亞基氨基酸序列，或該氨基酸序列的變異體(其中該變異體在本文中定義)。
另一方面，本發(fā)明涉及糖基化或非糖基化的生物學(xué)上重要的二聚體的單鏈形式，通過激素四成員家族的單鏈形式，可以預(yù)期它們是有效的。因此，本發(fā)明還涉及白細(xì)胞介素3和12(IL-3和IL-12)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和抑制素的單鏈形式。還包括雜合的白細(xì)胞介素，例如IL-3的一個亞基和IL-12的其他亞基的單鏈形式。
另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的單鏈蛋白的重組材料和方法，涉及含有單鏈蛋白的藥物組合物，涉及對單鏈蛋白特異的抗體，以及涉及其用途。
附圖簡述

圖1是在SalI位點(diǎn)結(jié)合的DNA片段從使CGβ的第三外顯子和編碼α亞基的第二外顯子融合的構(gòu)建圖。
圖2是人CGβ的氨基酸序列和位置112-145的編號。
圖3是用各種FSH類似物對FSH受體進(jìn)行競爭結(jié)合測定的結(jié)果。
圖4是FSH受體對各種FSH類似物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)測定的結(jié)果。
發(fā)明的實(shí)施方式在人體中有四種“糖蛋白”激素構(gòu)成一個包括人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成素(LH)和促甲狀腺激素(TSH)在內(nèi)的家族。如此處所用，“糖蛋白激素”指該家族的成員，無論是在人體還是在其他脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的。所有這些激素都是由α亞基和β亞基構(gòu)成的異源二聚體，其中對于某一物種而言在組別中的α亞基氨基酸序列是相同的，而β亞基因家族成員的不同而不同。因此，一般情況下這些糖蛋白激素是由相互結(jié)合但又不共價(jià)相連的α和β亞基構(gòu)成的異源二聚體。大多數(shù)脊椎動物產(chǎn)生FSH、TSH和LH；絨毛膜促性腺激素只在包括人在內(nèi)的靈長類和馬中發(fā)現(xiàn)。一種馬CG的具體形式已經(jīng)被命名為受孕母馬血清糖蛋白(PMSG)。
因此，該激素“四成員家族”是異源二聚體構(gòu)成，其中各自的α和β亞基由不同的基因編碼而且由宿主分別合成。然后宿主將分別合成的亞基裝配成非共價(jià)相連的異源二聚體復(fù)合物。按這種方式，該激素四成員家族的異源二聚體與那些由單一基因合成(在這種情況下有間插的“前”序列)、并且亞基通過二硫鍵而共價(jià)連接的異源二聚體如胰島素不同。該激素四成員家族也不同于免疫球蛋白，后者是從不同位點(diǎn)裝配而得但通過二硫鍵共價(jià)連接。另一方面，盡管應(yīng)樂果甜蛋白是植物蛋白質(zhì)，但是它通過A和B鏈之間的非共價(jià)作用結(jié)合在一起。目前還不知道這兩條鏈?zhǔn)欠裼刹煌蚓幋a。
因此，對于由相同或不同亞基構(gòu)成的二聚體的生物學(xué)活性化合物，眾多因素影響其行為的確定。亞基可以是共價(jià)或非共價(jià)連接；它可以由相同或不同基因合成；在其前體形式中，它們可以含有或不含有將二聚體的兩個單元連接在一起的“前”序列。根據(jù)對此處糖蛋白激素四成員家族的單鏈形式研究而獲得的結(jié)果，很明顯白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素3(IL-12和IL-3)、腫瘤壞死因子(TNF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)的生物學(xué)活性二聚體的單鏈形式也具有生物學(xué)活性。
異源二聚體或同源二聚體的單鏈形式與其二聚體形式相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，一般它們更穩(wěn)定。人們尤其注意到LH的不穩(wěn)定性和半衰期短。其次，減少了有關(guān)重組生產(chǎn)的問題，因?yàn)橹挥幸粋€單一基因需要轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工。這對于在細(xì)菌中的表達(dá)尤為重要。第三，當(dāng)然它們提供了另一種形式從而可以精細(xì)地調(diào)控活性水平和其在體內(nèi)的半衰期。最后，對于鑒定具有二聚體活性的截短形式，單鏈形式是優(yōu)異的材料。亞基之間的鍵允許蛋白質(zhì)被工程化而不破壞蛋白質(zhì)的總體折疊。四成員家族的成員特性hCG的β亞基基本上比其他的β亞基大，因?yàn)樗贑末端含有約34個額外氨基酸，此處被稱為羧基端部分(CTP)。當(dāng)在O-連接位點(diǎn)糖基化時，人們認(rèn)為是CTP使hCG比其他促性腺激素具有相對更長的血清半衰期(Matzuk，M.et al.，Endocrinol(1989)126376)。在天然激素中，該CTP延伸含有4個粘蛋白狀O-連接的寡糖。
在本發(fā)明的一個例子中，糖蛋白激素的α和β鏈被偶聯(lián)成單鏈的蛋白質(zhì)物質(zhì)，其中α和β鏈共價(jià)及任選地通過接頭成分相連。接頭成分可以含有其他氨基酸序列，尤其此處描述的CTP單元可以有利地包含于接頭成分中。此外，接頭成分可以含有針對激素受體的肽或非肽藥物。
除了簡單地通過肽鍵將兩個肽鏈偶聯(lián)而獲得頭對尾構(gòu)型之外，α和β鏈也可以頭對頭或尾對尾連接。頭對頭和尾對尾偶聯(lián)涉及使用將兩個羧基或兩個氨基通過接頭成分相連的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的合成化學(xué)方法。例如，用標(biāo)準(zhǔn)活化技術(shù)，兩個氨基可以通過酸酐或通過任何二羧酸衍生物而連接；兩個羧基可以通過二胺或二醇連接。但是，最優(yōu)選的形式是頭對尾構(gòu)型，其中形成標(biāo)準(zhǔn)的肽鍵，而且單鏈化合物可以通過重組方式或肽合成技術(shù)以融合蛋白形式制備，它或者是單鏈，或者較佳地連接全長序列的各部分。當(dāng)然，如果需要，也可以使用肽或非肽接頭成分，但這是不必要的，而且常規(guī)的單鏈蛋白質(zhì)重組生產(chǎn)方法暗示，使用這種生產(chǎn)方式的實(shí)施例顯然包括了最佳的方法。
采用頭對尾型構(gòu)型時，接頭成分基本上由額外肽序列構(gòu)成。對于異源二聚體的情況，兩個β鏈可以通過CTP單元連接，詳見下文。因此，本發(fā)明的可能例子包括α-FSHβ、βFSH-α、α-βLH、α-CTP-βLH、βLH-CTP-α、CTP-βLH-CTP-α等，其中N端在左邊。
異源二聚體促性腺激素或糖蛋白四成員家族的單鏈形式也包括其他重要的例子，其中與偶聯(lián)α和β亞基不同，將兩個β或兩個α亞基連接在一起形成單鏈化合物。對于異源二聚體，偶聯(lián)可以是頭對頭、頭對尾或尾對尾。
“雙β”單鏈串聯(lián)肽尤其可以用作拮抗劑，用于通常被異源二聚體糖蛋白激素所激活的受體。因?yàn)閾?jù)信α亞基主要負(fù)責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而β亞基提供受體特異性，而且因?yàn)棣梁挺聛喕哂邢嗨频臉?gòu)象，所以單鏈化合物應(yīng)能夠特異地結(jié)合至少存在一個β鏈的受體而不會激活受體。
“雙β”單鏈串聯(lián)肽的拮抗劑活性部分地基于異源二聚體的晶體結(jié)構(gòu)。應(yīng)注意，α和β鏈具有類似的半胱氨酸結(jié)(cystine-knot)構(gòu)型，而且兩種鏈的某些折疊方式類似。
本發(fā)明的“雙β”單鏈化合物含有串聯(lián)式排列的相同β亞基的拷貝，即FSHβ-FSHβ；HCGβ-HCGβ；TSHβ-TSHβ；或LHβ-LHβ；也可采用嵌合的單鏈化合物，例如HCGβ-FSHβ；FSHβ-LHβ；LHβ-TSHβ等。一共有12種可能的組合。此外，當(dāng)HCGβ亞基的羧基端肽(CTP)存在于兩個β鏈之間時會改善單鏈化合物的構(gòu)象。當(dāng)HCG是上游部分時，這是自動的；但是在其他情況下，常規(guī)方法是在上游部分的羧基端采用此處所述的CTP單元。兩個這種CTP單元也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，優(yōu)選的例子包括FSHβ-CTP-FSHβ；FSHβ-CTP-CTP-FSHβ；LHβ-CTP-FSHβ；LHβ-CTP-CTP-FSHβ等。
類似的描述適用于“雙α”單鏈化合物，當(dāng)然除了α變異體之外不包括嵌合型配對。也包括各種接頭成分尤其是基于CTP的接頭成分和CTP延伸。
下列定義幫助描述單鏈形式分子。
如此處所用，α亞基，和FSH、LH、TSH和CGβ亞基以及異源二聚體形式一般與其常規(guī)定義相同，指具有本領(lǐng)域中已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其等位變異體，而不論糖基化方式。
這些肽的“天然”形式是指具有從相關(guān)脊椎動物組織中分離出的氨基酸序列、而且具有本領(lǐng)域中已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其等位變異體。
這些蛋白質(zhì)的“變異體”形式指通過例如定點(diǎn)突變或其他重組操作而產(chǎn)生的或者人工合成的、在天然蛋白質(zhì)氨基酸序列中具有故意改變的蛋白質(zhì)。
這些改變由1-10、較佳地1-8、更佳地1-5個氨基酸變化構(gòu)成，包括缺失、插入和取代，其中最佳的保守氨基酸取代如下所述。得到的變異體必須保留活性以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)天然激素活性，即或者它們必須直接地保留天然激素的生物學(xué)活性，或者它們必須起拮抗劑的作用，一般是能夠與天然激素的受體結(jié)合但不能實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，已知如果α亞基52位上的糖基化位點(diǎn)通過氨基酸置換而去除，從而防止該位點(diǎn)上的所有糖基化的話，那么具有這種改變的α亞基的異源二聚體激素一般是促效劑，而且能夠在競爭中與受體結(jié)合以防止天然激素的結(jié)合。(另一方面，α亞基78位的糖基化位點(diǎn)似乎對激素活性的影響不大)。氨基酸序列的其他改變也可能使變異體是拮抗劑而不具有促效劑活性。
一組優(yōu)選變異體是α或β亞基或兩者的糖基化位點(diǎn)被改變的種類。α亞基含有兩個糖基化位點(diǎn)，一個在52位，另一個在78位，這些位點(diǎn)改變對活性的影響剛才已經(jīng)描述過。類似地，β亞基一般含有兩個N-連接的肽鍵位點(diǎn)(所處的位置隨β鏈性質(zhì)的不同而相異)，而且可以在這些位點(diǎn)進(jìn)行類似的改變。hCG的CTP延伸含有4個O-連接的糖基化位點(diǎn)，在絲氨酸殘基處的保守性突變(例如將絲氨酸變?yōu)楸彼?會破壞這些位點(diǎn)。O-連接的糖基化位點(diǎn)的破壞會導(dǎo)致從促效劑活性向拮抗劑活性的轉(zhuǎn)變。
最后，靠近N-連接或O-連接的糖基化位點(diǎn)處的氨基酸序列的改變會影響存在于產(chǎn)生的分子中糖基化的性質(zhì)，而且也會改變其活性。
氨基酸序列的改變也包括插入和缺失。因此，激素的截短形式被包括在變異體中，例如缺失C末端85-92位中部分或全部氨基酸的α亞基突變型。此外還包括缺失N末端的1-10個氨基酸的α亞基。此處所述的激素四成員家族的部分有用變異體在美國專利5,177,193中有描述(1993年1月5日出版，在此引用作為參考)。如其所述，可以通過破壞相關(guān)位點(diǎn)，或者通過選擇產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞而改變糖基化方式。
如上所述，單鏈形式是常規(guī)的、用于各種工程化突變蛋白的材料。這種突變蛋白包括非關(guān)鍵區(qū)域被改變或被去除的突變蛋白。這種缺失和改變可包括整個環(huán)，從而缺失或改變遠(yuǎn)大于10個氨基酸的序列。但是單鏈分子必須至少保留受體結(jié)合域和/或涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)域。
有相當(dāng)多的文獻(xiàn)涉及此處所述的激素四成員家族的變異體，而且從這些文獻(xiàn)中明顯地知道，可以制備大量可能具有促效劑和拮抗劑活性的變異體。參見Chen，F(xiàn).et al.Molec Endocrinol(1992)6914-919；Yoo，J.et al.J Biol Chem(1993)26813034-13042；Yoo，J et al.J Biol Chem(1991)26617741-17743；Puett，D.etal.Glycoprotein Hormones，Lusbader，J.W.et al.EDS，Springer Verlag New York(1994)122-134；Kuetmann，H.T.etal(ibid)P103-117；Erickson，L.D.et al.Endocrinology(1990)1262555-2560；和Bielinska，M.et al.J Cell Biol(1990)111330a(Abstract 1844)。
如上所述，一種構(gòu)建有效拮抗劑的方法是制備含有糖蛋白四成員家族中相同或不同成員的兩個β亞基單鏈分子。特別優(yōu)選的這些單鏈形式的變異體包括其中有一個或多個半胱氨酸連接被缺失的種類，典型地是通過用中性氨基酸置換一個或兩個參與連接的半胱氨酸實(shí)現(xiàn)缺失。特別優(yōu)選的可被缺失的半胱氨酸連接是位于26位和110位之間以及23位和72位之間的半胱氨酸。
此外，已表明，激素四成員家族的β亞基可以以嵌合形式構(gòu)建從而提供具有嵌合的兩種組份的生物學(xué)功能，或者一般提供生物學(xué)功能改變的激素。因此，可以按Moyle，Proc Natl Acad Sci(1991)88760-764；Moyle，Nature(1994)368251-255中的方法構(gòu)建具有FSH和LH/CG活性的嵌合分子。如這些文章中所述，用FSH-β101-109位氨基酸置換CG-β亞基中的相應(yīng)殘基可得到具有hCG和FSH活性的類似物。
β亞基的這些嵌合形式也可以用于偶聯(lián)兩個β亞基成為一個分子的單鏈化合物。
盡管意識到糖基化方式對活性會產(chǎn)生量和質(zhì)方面的影響，但是出于方便，與“α亞基”相同，術(shù)語FSH、LH、TSH和CGβ亞基指具有肽特性的氨基酸序列。當(dāng)僅指β鏈時，術(shù)語是例如FSHβ；當(dāng)指異源二聚體時，使用簡單術(shù)語“FSH”。從上下文中可以清楚地知道糖基化方式是如何受影響的，例如通過重組表達(dá)宿主或糖基化位點(diǎn)的改變。同樣也注意到具有特殊糖基化方式的糖蛋白形式。
如此處所用，“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，因?yàn)樗鼈冎g的長度區(qū)別不明確。
在本發(fā)明的單鏈形式中，α和/或β鏈可以在非關(guān)鍵區(qū)域插入CTP延伸。
α和β亞基的“非關(guān)鍵”區(qū)域是生物學(xué)活性(包括促效劑和拮抗劑活性)非必需的分子區(qū)域。一般地，這些區(qū)域可以從結(jié)合位點(diǎn)、前體剪切位點(diǎn)和催化區(qū)域中去除。應(yīng)避免對引導(dǎo)合適折疊、與受體結(jié)合和催化活性等至關(guān)重要的區(qū)域；類似地，也應(yīng)避免對確保蛋白質(zhì)三維構(gòu)象至關(guān)重要的區(qū)域。應(yīng)注意，在二聚體情況下是關(guān)鍵的某些區(qū)域在單鏈形式下會變成非關(guān)鍵的，因?yàn)橛蓡捂溗x予的構(gòu)象限制可能會改變這些區(qū)域的關(guān)鍵性。非關(guān)鍵區(qū)域的確定可以方便地通過缺失或修飾候選區(qū)域然后對所需活性進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y試即可實(shí)現(xiàn)。導(dǎo)致活性損失的修飾區(qū)域是關(guān)鍵的；導(dǎo)致相同或相似活性(包括拮抗劑活性)改變的區(qū)域被認(rèn)為是非關(guān)鍵的。
應(yīng)強(qiáng)調(diào)，“生物學(xué)活性”指對天然激素的活性起促效的或拮抗的活性。因此，某些區(qū)域?qū)ψ儺愺w作為拮抗劑起作用至關(guān)重要，盡管拮抗劑不能直接提供激素的生理效應(yīng)。
例如，對于α亞基，33-59位被認(rèn)為是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，而羧基端20個氨基酸的延伸段是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/受體結(jié)合所必需的。與β亞基進(jìn)行裝配中的關(guān)鍵殘基至少包括殘基33-58，尤其是37-40。
當(dāng)非關(guān)鍵區(qū)域“靠近”N末端或C末端時，插入可以位于10個末端氨基酸中的任何位置，更佳地在5個氨基酸中，最佳地為末端本身。
一般地，“靠近”用于表示在參照位置10個氨基酸之內(nèi)，較佳地5個氨基酸之內(nèi)，最佳地為參照位置本身。因此，某些變異體可含有“靠近”糖基化位點(diǎn)的氨基酸取代；其定義在此處是很明確的。此外，α和β亞基可以在“靠近”其N末端或C末端的位置相互連接。
如此處所用，“CTP單元”指在人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基端發(fā)現(xiàn)的、在C末端從氨基酸112-118延伸至殘基145的氨基酸序列，或指其片段。因此，每個“完整”CTP單元含有28-34個氨基酸，其長度取決于CTP的N末端。位置112-145的天然序列示于圖2。
“部分”CTP單元指這樣的氨基酸序列，它位于位置112-118至145(含145本身)，但是從最短的“完整”CTP單元(即從118-145位)中缺失至少一個氨基酸。如果需要的是促效劑活性，則包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的“部分”CTP單元最好含有至少一個糖基化位點(diǎn)。激素的某些非糖基化形式是拮抗劑，因此可以作為拮抗劑使用。CTP單元在絲氨酸殘基處含有4個這樣的位點(diǎn)，分別位于121(位點(diǎn)1)、127(位點(diǎn)2)、132(位點(diǎn)3)和138(位點(diǎn)4)位。用于本發(fā)明的促效劑的CTP部分形式可含有一個或多個按在天然CTP序列中的次序排列的這些位點(diǎn)。因此，用于本發(fā)明促效劑的“部分”CTP單元可以含有所有4個糖基化位點(diǎn)；位點(diǎn)1、2和3；位點(diǎn)1、2和4；位點(diǎn)1、3和4；位點(diǎn)2、3和4；或僅有位點(diǎn)1和2；位點(diǎn)1和3；位點(diǎn)1和4；位點(diǎn)2和3；位點(diǎn)2和4或位點(diǎn)3和4；或者僅含有一個位點(diǎn)1，2，3，或4。
“串聯(lián)式”插入或延伸表示插入子或延伸段含有至少兩個“CTP單元”。每個CTP單元可以是完整的或是片段，可以是天然的或變異的。在串聯(lián)式延伸或插入中的所有CTP單元可以是相同的，也可以互不相同。因此，例如，串聯(lián)式延伸或插入可以被分成若干種類部分-完整；部分-部分；部分-完整-部分；完整-完整-部分等，其中各個部分或完整CTP單元可以各自獨(dú)立地為變異的或天然序列。
“接頭成分”是將α和β序列連接在一起而又不干擾活性的組成部分，這些活性由作為異源二聚體成員的同一α和β所表現(xiàn)，或者它改變活性使其從促效劑轉(zhuǎn)變成拮抗劑活性?；钚运娇梢栽诤侠淼姆秶鷥?nèi)變動，但是接頭物的存在不能使單鏈形式基本上同時喪失其促效劑或拮抗劑活性。當(dāng)從生產(chǎn)介質(zhì)中回收時，必須仍維持單鏈形式，而且必須表現(xiàn)出與異源二聚體(異源二聚體的元件形成其組成)的激素活性有關(guān)的活性。變異體激素亞基和CTP單元可以完全對應(yīng)于天然的激素或CTP序列，也可以對應(yīng)于變異體。變異體的性質(zhì)已經(jīng)在上面描述過。在這些變異體中，天然序列中的1-10，較佳地1-8，更佳地1-5個氨基酸被與該位置上天然氨基酸不同的氨基酸所取代，或者1-10，較佳地1-8，更佳地1-5個氨基酸被簡單地缺失，或是上述變化的組合。如上所述，尤其當(dāng)通過檢測非關(guān)鍵“環(huán)”的存在而鑒別出單鏈形式的非關(guān)鍵區(qū)域時，缺失或取代而改變的氨基酸數(shù)目可以增加至20或30個氨基酸，或者某一任意數(shù)字，這取決于有關(guān)的非關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸序列長度。當(dāng)然，在一個以上非關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行的缺失或取代會導(dǎo)致單鏈形式中受影響的氨基酸數(shù)目更大，而且缺失和取代方案可以組合使用。累積性地進(jìn)行取代或缺失不會導(dǎo)致與激素相關(guān)的促效劑或拮抗劑活性的基本喪失。對天然氨基酸的保守類似物進(jìn)行取代是優(yōu)選的。
與常規(guī)含義相同，“保守類似物”指這樣的類似物，其中被取代的殘基與進(jìn)行取代的殘基屬于同一氨基酸種類。如本領(lǐng)域中熟知的那樣，氨基酸已經(jīng)被劃分成幾組，例如參見Dayhoff，M.et al.，Atlasof Protein Sequences and Structure(1972)589-99。一般地，酸性氨基酸被歸在一組；堿性氨基酸被歸在一組；中性親水氨基酸被歸在一組；等等。
更具體地，氨基酸殘基一般可以如下進(jìn)一步分成4個主要的亞組酸性的這種殘基在生理pH條件下由于失去H離子而帶負(fù)電荷，當(dāng)含有該殘基的肽處于生理pH條件下的水性介質(zhì)中時，該殘基受水溶液的牽引從而位于肽構(gòu)象的表面位置。
堿性的這種殘基在生理pH條件下由于攜帶H離子而帶正電荷，當(dāng)含有該殘基的肽處于生理pH條件下的水性介質(zhì)中時，該殘基受水溶液的牽引從而位于肽構(gòu)象的表面位置。
中性的/非極性的這種殘基在生理pH條件下不帶電荷，當(dāng)含有該殘基的肽在水性介質(zhì)中時，該殘基受水溶液的排斥從而位于肽構(gòu)象的內(nèi)部位置。這些殘基也被稱為是“疏水性的”。
中性的/極性的這種殘基在生理pH條件下不帶電荷，當(dāng)含有該殘基的肽處于水性介質(zhì)中時，該殘基受水溶液的牽引從而位于肽構(gòu)象的外部位置。
當(dāng)然，應(yīng)理解，對于統(tǒng)計(jì)意義上的一組殘基分子而言，一些分子帶電荷，另一些不帶電荷，水性介質(zhì)的吸引或排斥的程度會較大或較小。為了符合“帶電荷”的定義，在生理pH下應(yīng)有有意義的百分比(至少約25％)的分子是帶電荷的。對于劃分極性或非極性所需的吸引或排斥程度是任意確定的，因此本發(fā)明具體構(gòu)思中的氨基酸被歸為這一組或那一組。大多數(shù)沒有具體命名的氨基酸可以依據(jù)其已知的行為進(jìn)行劃分。
氨基酸殘基還可以進(jìn)一步細(xì)分成環(huán)狀的或非環(huán)狀的，芳香族的或非芳香族的，按殘基側(cè)鏈取代基以及大小進(jìn)行劃分。如果殘基總共含有4個或更少的碳原子(包括羧基碳原子)，那么該殘基被認(rèn)為是小的。當(dāng)然，小殘基總是非芳香族的。
對于天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸，用上述方法進(jìn)行劃分的結(jié)果如下酸性天冬氨酸和谷氨酸；堿性/非環(huán)狀精氨酸，賴氨酸；堿性/環(huán)狀組氨酸；中性/極性/小的甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸；中性/非極性/小的丙氨酸；中性/極性/大的/非芳香族的蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；中性/極性/大的/芳香族的酪氨酸；中性/非極性/大的/非芳香族的纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸；中性/非極性/大的/芳香族的苯丙氨酸和色氨酸。
基因編碼的二級氨基酸脯氨酸，盡管技術(shù)上被劃分在中性/非極性/大的/環(huán)狀和非芳香族的，但它是一個特殊例子，由于眾所周知它對肽鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，因此沒有被劃入這一組中。
如果本發(fā)明的單鏈蛋白質(zhì)是用重組方法構(gòu)建，那么它們僅含有基因編碼的氨基酸取代；但是，如果任一部分是用標(biāo)準(zhǔn)的方法如固相合成、肽合成方法合成的，并用例如酶法連入其余蛋白質(zhì)中，那么可以用非基因編碼的氨基酸，例如氨基異丁酸(Aib)、苯基甘氨酸(Phg)等取代其對應(yīng)的類似物。
這些非編碼的氨基酸還可以包括，例如β-丙氨酸(β-Ala)，或其他ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸、4-氨基丁酸等，肌氨酸(Sar)，鳥氨酸(Orn)，瓜氨酸(Cit)，叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)和環(huán)己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、磺基丙氨酸(Cya)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；巰基戊酸(Mvl)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)和甲硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide，MSO)，這些氨基酸可方便地歸入各組別。
根據(jù)上述定義，Sar和β-Ala和Aib是中性/非極性/小的；t-BuA、t-BuG、N-MeIle、Nle、Mvl和Cha是中性/非極性/大的/非芳香族的；Orn是堿性/非環(huán)狀的；Cya是酸性的；Cit、乙?；鵏ys和MSO是中性/極性/大的/非芳香族的；Phg、Nal、Thi和Tic是中性/非極性/大的/芳香族的；各種ω-氨基酸根據(jù)其大小被分成中性/非極性/小的(β-Ala，即3-氨基丙酸，4-氨基丁酸)或大的(所有其他的)。
因此，本發(fā)明范圍之內(nèi)的肽化合物還可以含有除基因編碼的取代之外的氨基酸取代，而且這些取代可以根據(jù)其結(jié)構(gòu)用上述一般方案進(jìn)行分類。單鏈激素的優(yōu)選例子本發(fā)明的單鏈激素可用重組技術(shù)進(jìn)行最有效和最經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)。因此，優(yōu)選那些僅含有基因編碼的氨基酸的α和β鏈、CTP單元和其他接頭成分形式。然而，如上所述，有可能用肽合成技術(shù)或其他有機(jī)合成技術(shù)可以合成至少部分單鏈激素，因此含有非基因編碼的氨基酸的變異體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的最佳單鏈激素例子中，β亞基的C-末端是任選地通過接頭而共價(jià)連于成熟α亞基的N-末端；至于α亞基的C末端連于β亞基的N末端的形式，也是有用的，但是其作為相關(guān)的受體拮抗劑或促效劑的活性稍低。連接可以是直接肽連接，其中一個亞基的C末端氨基酸與另一亞基的N末端直接通過肽鍵而相連；但是，在大多數(shù)情況下，最好在兩個末端之間含有接頭成分。在大多數(shù)情況下，接頭成分在兩個鏈之間至少提供一個β轉(zhuǎn)角。因此，在接頭中存在脯氨酸是有利的。
如上所述，在任何情況下，通過接頭單元也可將α鏈的N末端偶聯(lián)于β鏈的N末端，或者將α鏈的C末端偶聯(lián)于β鏈的C末端，類似的組合也可存在于含有兩個α或兩個β亞基的單鏈形式中。
應(yīng)理解，在所討論的構(gòu)成單鏈形式的亞基末端之間的連接中，一個或多個末端也可以通過如上所述的取代和/或缺失而改變。
含有兩個β亞基的單鏈化合物的優(yōu)選例子是那些一個亞基的C末端任選地通過接頭，尤其是肽接頭，而與另一亞基的N末端相連的種類。同樣，如上所述，在兩個β鏈的N末端之間的連接或在兩個β鏈的C末端之間的連接也是可行的；當(dāng)然，在這些例子中需要接頭。
盡管已對單鏈異源二聚體和單鏈雙β亞基形式的頭對頭、尾對尾和頭對尾構(gòu)型進(jìn)行了描述，但是在兩個亞基之間的連接可以不正好位于各亞基的N-或C-末端，是位于末端附近的位置。
在一組特別優(yōu)選的例子中，連接是頭對尾型，接頭成分含有一個或多個CTP單元和/或變異CTP單元或其片段。用于這種接頭成分的CTP單元的優(yōu)選形式在下面描述。
此外，接頭成分可含有共價(jià)地(最好可以釋放)連于接頭成分的藥物。將藥物偶聯(lián)于接頭成分的方法以及使其釋放的方法都屬常規(guī)。
CTP單元和變異CTP單元及其片段除了位于接頭成分之外，還可以位于構(gòu)成單鏈激素的各亞基的任何非關(guān)鍵區(qū)域。這種包含形式的性質(zhì)及位置在本專利應(yīng)用中有詳細(xì)描述。
盡管CTP單元是接頭成分中的優(yōu)選包含例子，應(yīng)理解接頭可以是能提供α和β亞基適當(dāng)空間關(guān)系的任何合適的共價(jià)結(jié)合材料。因此，對于頭對尾構(gòu)型，接頭一般是肽，它可含有任意數(shù)目的、但通常小于100個、更佳地小于50個的氨基酸，其中具有適當(dāng)?shù)挠H水性/疏水性比率以便在溶液中能提供適當(dāng)?shù)目臻g和構(gòu)象。一般地，接頭應(yīng)有均衡的親水性，從而位于周圍溶液中并且不干擾α和β亞基或者兩個β亞基之間的相互作用。較佳地，接頭含有通常由脯氨酸提供的β轉(zhuǎn)角?？梢允褂镁哂猩鲜稣_特性的任何合適的聚合物，其中包括肽接頭。
一種不在本發(fā)明范圍之內(nèi)的特殊接頭成分是含有正好位于亞基上游的信號肽的接頭成分。
特別優(yōu)選的本發(fā)明的單鏈激素例子包括βFSH-α；βFSH-βFSH；βFSH-βLH；βLH-α；βLH-βLH；βLH-βFSH；βTSH-α；βTSH-βTSH；βTSH-βFSH；βCG-α；β-CG-β-CG；βCGG-βFSH；βCG-βTSH；βFSH-CTP-α；βFSH-CTP-βFSH；βFSH-CTP-βLH；βLH-CTP-α；βLH-CTP-βLH；βLH-CTP-βFSH；βCG-CTP-α；βFSH-CTP-CTP-βLH；βFSH-CTP-CTP-α；βFSH-CTP-CTP-βTSH；βLH-CTP-CTP-α；βLH-CTP-CTP-βLH；
βCG-CTP-CTP-α；βD-CTP-CTP-βLH；α-α；α-CTP-α；和α-CTP-CTP-α等。人的亞基形式也是特別優(yōu)選的。在上述構(gòu)建物中，“CTP”指CTP或變異形式或它們的片段，這在下文中進(jìn)一步描述。CTP單元的優(yōu)選例子用于本發(fā)明的CTP單元的標(biāo)志法如下對于完整的CTP單元各部分，在該部分中包括的位置用數(shù)目進(jìn)行命名，如圖2所示。當(dāng)發(fā)生取代時，取代氨基酸帶有一個標(biāo)明其位置的上標(biāo)。因此，例如CTP(120-143)表示從位置120延伸至位置143的CTP部分；CTP(120-130；136-143)表示缺少天然序列位置118-119、131-135和144-145的融合氨基酸序列。CTP(Arg122)指122位賴氨酸被精氨酸取代的變異序列；CTP(Ile134)指134位亮氨酸被異亮氨酸取代的變異序列。CTP(Val128Val143)指發(fā)生兩個取代的變異形式，其中一個取代128位亮氨酸而另一個取代142位異亮氨酸。CTP(120-143；Ile128Ala130)表示發(fā)生兩個所標(biāo)出取代的CTP單元的相應(yīng)部分。
在CTP變異形式中，那些一個或多個O-連接的糖基化位點(diǎn)被改變或缺失的種類也是優(yōu)選的。一種改變位點(diǎn)以防止糖基化的特別優(yōu)選方法是用丙氨酸取代這些位置的絲氨酸。
特別優(yōu)選的是下式CTP單元#1 CTP(116-132)#2 CTP(118-128；130-135)#3 CTP(117-142)#4 CTP(116-130)#5 CTP(116-123；137-145)#6 CTP(115-133；141-145)#7 CTP(117-140，Ser123Gln140)
#8 CTP(125-143，Ala130)#9 CTP(135-145，Glu139)#10 CTP(131-143，Val142Val143)#11 CTP(118-132)#12 CTP(118-127)#13 CTP(118-145)#14 CTP(115-132)#15 CTP(115-127)#16 CTP(115-145)#17 CTP(112-145)#18 CTP(112-132)#19 CTP(112-127)α和β亞基的優(yōu)選例子當(dāng)然，天然的α和β亞基的單鏈形式屬于優(yōu)選例子。但是，某些變異體也是優(yōu)選的。
具體地，52位N-連接的糖基化位點(diǎn)通過對該位置或其附近處的氨基酸進(jìn)行取代而得以消除或改變的α亞基變異形式，優(yōu)選用于拮抗劑活性。對78位糖基化位點(diǎn)進(jìn)行類似修飾也是優(yōu)選的。缺失85-92位的一個或多個氨基酸也會影響含有α亞基的激素的活性性質(zhì)，對這些位置的氨基酸進(jìn)行取代或缺失也是優(yōu)選的。
類似地，β鏈中N-連接的糖基化位點(diǎn)可以方便地進(jìn)行修飾以消除糖基化，從而影響β鏈的促效劑或拮抗劑活性。如果存在CTP，無論是天然地存在于CG中還是以接頭形式存在，在這一成分中的O-連接的糖基化位點(diǎn)也可被改變。
含有修飾或缺失的糖基化位點(diǎn)的各種變異形式在下列文獻(xiàn)中有描述Yoo，J.et al.J.Biol Chem(1993)26813034-13042；Yoo，J.et al.J.Biol Chem(1991)26617741-17743和Bielinska，M.et al.J Cell biol(1990)111330a(都引用)和Matzuk，M.M.et al.J Biol Chem(1989)2642409-2414；Keene，J.L.et al.J BiolChem(1989)2644769-4775和Keene，J.L.et al.Mol En-docrinol(1989)32011-2017。
不僅糖基化位點(diǎn)本身可以被直接修飾，而且這些位點(diǎn)的鄰近位置也可以優(yōu)先被修飾從而影響突變型的糖基化狀態(tài)。對于α亞基，例如50-60位之間的氨基酸被取代(包括保守的和非保守的取代)的變異形式是優(yōu)選的，尤其是51、53和55位的取代，因?yàn)樗鼈兛拷腔稽c(diǎn)Asn52。
91位賴氨酸被轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸或谷氨酸的α亞基突變型也是優(yōu)選的。
盡管變異形式是按各亞基的變化進(jìn)行討論的，但是應(yīng)理解，二聚體中的單鏈形式可提供額外的修飾機(jī)會。具體地，對二聚體的折疊至關(guān)重要的區(qū)域可能對于單鏈分子的正確構(gòu)象并不是關(guān)鍵的，因而這些區(qū)域可以在單鏈形式中進(jìn)行改變，盡管上面并沒有對二聚體形式的各成員進(jìn)行描述。此外，單鏈形式還可以在非關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行劇烈的修飾，如上所述，這些非關(guān)鍵區(qū)域的改變和/或缺失不會影響生物學(xué)活性。合適的藥物可以包含在接頭成分中的合適藥物包括肽或蛋白質(zhì)，例如類似胰島素的生長因子；表皮生長因子；酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子；血小板衍生的生長因子；各種集落刺激因子(CFS)，例如粒細(xì)胞CFS、巨噬細(xì)胞CFS等；各種細(xì)胞素如IL-2、IL-3和多種其他白細(xì)胞介素蛋白質(zhì)；各種干擾素；腫瘤壞死因子等。肽類或蛋白質(zhì)類藥物的優(yōu)點(diǎn)是它們能被包含在單鏈中，而且整個構(gòu)建物可以方便地通過單個基因的重組表達(dá)而生產(chǎn)。另外，也可以使用小分子藥物如抗生素、消炎藥、毒素等。
一般地，包含在接頭成分中的藥物可以是需要在激素通常結(jié)合的受體附近發(fā)揮作用的藥物。還可提供合適的將藥物從接頭的包含形式中釋放出來的方法，例如通過在下面的“制備方法”一節(jié)中所述的引入酶催化裂解位點(diǎn)的方法。
其他修飾本發(fā)明的單鏈蛋白質(zhì)還可以用公知的方法進(jìn)行偶聯(lián)或衍化從而對氨基酸序列進(jìn)行衍生，例如磷酸化、糖基化、對通常的糖基化形式進(jìn)行去糖基化、對氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行修飾(如將脯氨酸轉(zhuǎn)變成羥基脯氨酸)以及與那些翻譯后修飾事件(已發(fā)現(xiàn)普遍存在)類似的修飾類似物。
本發(fā)明的激素的糖基化狀態(tài)尤為重要。激素可以以非糖基化形式制備，這可通過在原核宿主中生產(chǎn)，或通過改變亞基和/或任何CTP單元中一般存在的糖基化位點(diǎn)。非糖基化形式和部分糖基化的激素可以通過對糖基化位點(diǎn)的操作而制備。當(dāng)然，糖基化形式是在本發(fā)明范圍之內(nèi)的。
正如本領(lǐng)域中熟知的那樣，本發(fā)明的單鏈蛋白質(zhì)也可偶連于標(biāo)記物、載體、固相載體等，這取決于所需的用途?？梢允褂脴?biāo)記形式來跟蹤其代謝結(jié)果；用于該目的的合適標(biāo)記物包括(尤其是)放射性同位素標(biāo)記物如碘131、锝99、銦111等。這些標(biāo)記物也可用于介導(dǎo)在測試系統(tǒng)中對單鏈蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測；在該例子中，可以使用放射性同位素以及酶標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、生色標(biāo)記物等。使用這類標(biāo)記物對于這些蛋白質(zhì)特別有利，因?yàn)樗鼈兪菍?dǎo)向式(targeting)試劑受體配體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可偶聯(lián)于載體以便在制備與這些新的修飾形式發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體的過程中增加其免疫原性。用于該目的的合適載體包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、白喉類毒素等。可以采用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)技術(shù)將本發(fā)明的修飾肽與載體相連，包括使用雙功能接頭。
可以使用類似的連接技術(shù)及其他技術(shù)，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)偶聯(lián)于固相載體。偶聯(lián)后，可以將這些蛋白質(zhì)用作親和試劑，分離所需的、與其具有特異反應(yīng)的組份。
制備方法構(gòu)建本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。如上所述，如果僅含有基因編碼的氨基酸，而且單鏈?zhǔn)翘幱陬^對尾構(gòu)型，那么目前最實(shí)際的方法是通過表達(dá)編碼所需蛋白質(zhì)的DNA而重組合成這些材料。含有編碼單鏈形式(包括變異形式)的核酸序列的DNA可以用天然序列制備。定點(diǎn)誘變、連入額外序列、PCR和構(gòu)建合適表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)目前都是本領(lǐng)域中眾所周知的。編碼所需蛋白質(zhì)的部分或全部DNA可以用標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)合成，最好引入限制性酶切位點(diǎn)以方便連接?？蓪⒂糜谵D(zhuǎn)錄和翻譯包含的編碼序列的合適控制元件提供給DNA編碼序列。眾所周知，目前已有可以與大量不同宿主相容的表達(dá)系統(tǒng)，這些宿主包括原核宿主如細(xì)菌和真核宿主如酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞等。
宿主的選擇尤其應(yīng)涉及翻譯后事件，特別是包括糖基化。糖基化的位置主要由分子內(nèi)的糖基化位點(diǎn)的性質(zhì)所控制；但是，占據(jù)位點(diǎn)的糖的性質(zhì)主要由宿主的性質(zhì)所決定。因此，本發(fā)明激素性質(zhì)的微調(diào)可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇宿主而實(shí)現(xiàn)。
α亞基部分(其中α亞基是修飾的或非修飾的)的一種特別優(yōu)選的基因形式是“小基因”(minigene)構(gòu)建物。
如本文所用，α亞基“小基因”指在Matzuk，M.M.，et al，MolEndocrinol(1988)295-100中描述pM2/CGα或pM2/α構(gòu)建物中所公開的基因構(gòu)建物。該“小基因”的特征是僅保留外顯子3和外顯子4之間的內(nèi)含子序列，所有上游內(nèi)含子都已缺失。在描述的具體構(gòu)建物中，衍生自外顯子2和一部分外顯子3的N端編碼序列是從cDNA獲得的，并且直接通過XbaI限制性位點(diǎn)而連入外顯子3的編碼序列，從而缺少外顯子I和II之間以及外顯子II和III之間的內(nèi)含子。然而，外顯子III和IV之間的內(nèi)含子以及編碼序列3′的信號序列被保留下來。得到的小基因可以方便地作為BamHI/BglII片段而插入。當(dāng)然，其他構(gòu)建相容性小基因的方法也是可能的，因而并不需要將定義局限于編碼序列是通過XbaI位點(diǎn)而連入的特定構(gòu)建物。但是，這是構(gòu)建基因的方便方法，而且其他方法如通過合成或部分合成而制備基因的方法并沒有特別的優(yōu)點(diǎn)。此處的定義包括那些保留外顯子III和IV之間內(nèi)含子，或任何其他內(nèi)含子(但最好不含其他內(nèi)含子)的α亞基編碼序列。
對于重組生產(chǎn)，可使用已用表達(dá)系統(tǒng)修飾的宿主細(xì)胞，并培養(yǎng)至產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。此處使用的術(shù)語如下“修飾的”重組宿主細(xì)胞，即“經(jīng)修飾從而含有”本發(fā)明的重組表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，指這樣的宿主細(xì)胞，它已經(jīng)用任何方便的引入方法(包括轉(zhuǎn)染、病毒感染等)處理從而含有表達(dá)系統(tǒng)。“修飾的”是指細(xì)胞含有該表達(dá)系統(tǒng)而不論該表達(dá)系統(tǒng)是整合入染色體還是位于染色體之外?！靶揎椀摹奔?xì)胞對于包含表達(dá)系統(tǒng)可以是穩(wěn)定的，也可以是不穩(wěn)定的。簡而言之，帶有本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的“修飾的”重組宿主細(xì)胞是指，當(dāng)天然不含有該表達(dá)系統(tǒng)時，通過引入操作而含有該表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，而不論用何種方式實(shí)現(xiàn)這種引入。
“表達(dá)系統(tǒng)”指含有待表達(dá)的編碼核苷酸序列及其相伴的、實(shí)現(xiàn)編碼序列表達(dá)所必需的控制序列的DNA分子。典型地，這些控制序列包括啟動子、終止調(diào)控序列以及(在某些情況下)操縱子或其他調(diào)控表達(dá)的序列。控制序列是那些設(shè)計(jì)用于在特定靶宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的序列，因此必須選擇宿主細(xì)胞使之與構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)中的控制序列相容。
如果需要分泌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，那么還要包含編碼信號肽的其他核苷酸序列，從而產(chǎn)生可操作地連于(operably linked)所需單鏈激素的信號肽，進(jìn)而產(chǎn)生前體蛋白。一旦分泌，信號肽被切除，釋放出成熟的單鏈激素。
如本文所用，“細(xì)胞”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和“細(xì)胞系”可互換使用而不必在意其細(xì)微區(qū)別。在需要區(qū)分它們的地方，會在上下文中清楚地表明。對于都可以表示的場合，所有的都包括在內(nèi)。
產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞裂解液中獲得(如果產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi))，或者從培養(yǎng)基中獲得(如果是分泌的)。從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收重組蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，而且可以用已知技術(shù)如色譜法、凝膠電泳、選擇性沉淀等純化這些蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的全部或部分激素可以用本領(lǐng)域已知的肽合成技術(shù)直接合成。合成的部分可以連接起來，而在接頭成分中所含的任何藥物的釋放位點(diǎn)可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法引入。當(dāng)然，對于那些含有非基因編碼的氨基酸的例子以及采用頭對頭或尾對尾構(gòu)型的例子，合成工作至少部分是處于蛋白質(zhì)水平的。在天然N端或靠近天然N端的位置的頭對頭連接，可以通過含有與氨基起反應(yīng)的官能團(tuán)的接頭如二羧酸衍生物而實(shí)現(xiàn)。在天然C端或靠近天然C端的位置的尾對尾連接，可以通過二胺、二醇或其組合的接頭而實(shí)現(xiàn)。
抗體本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生與這些新化合物起特異性免疫反應(yīng)的抗體。這些抗體可以用于各種診斷和治療用途。例如，當(dāng)本發(fā)明的單鏈形式用于治療人或動物時，藥物的濃度可以通過常規(guī)的免疫分析技術(shù)，用這些抗體進(jìn)行監(jiān)測。此外，因?yàn)槟承┯脝捂溞问疆a(chǎn)生的抗體會與異源二聚體起交叉反應(yīng)，因此可用于診斷天然存在的異源二聚體的濃度。
抗體一般是用標(biāo)準(zhǔn)免疫方案在哺乳動物如兔、小鼠、羊或大鼠中制備，并且抗體作為多克隆抗血清進(jìn)行效價(jià)測定以保證有足夠的免疫。然后收獲多克隆抗血清以用于例如免疫測定。來自宿主的分泌抗體的細(xì)胞，如脾細(xì)胞或外周血白細(xì)胞，可以用已知的技術(shù)進(jìn)行永生化處理并篩選以產(chǎn)生與本發(fā)明的蛋白質(zhì)呈免疫特異性的單克隆抗體。
“對蛋白質(zhì)免疫特異的”指在確定親和性或非親和性的普通常數(shù)下，抗體能與單鏈蛋白質(zhì)起免疫反應(yīng)，但是不與異源二聚體本身起免疫反應(yīng)。應(yīng)理解，特異性是一個相對概念，可以選擇任意的限度，例如免疫反應(yīng)性可相差100倍或更多。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)的免疫特異性抗體與單鏈蛋白質(zhì)的反應(yīng)比與相應(yīng)異源二聚體的反應(yīng)至少大100倍。
配方可用與人們已知的、用于與單鏈形式相應(yīng)的異源二聚體的方法相類似的方法，來配制和施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，配制和施用方法會隨所用的特定激素而有所不同。然而，與異源二聚體相比，劑量水平和施用頻率也可以改變，尤其考慮到如果存在CTP單元，那么生物學(xué)半衰期會因其存在而延長。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的配方是典型的用于蛋白質(zhì)或肽藥物的配方，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack Pub-lishing Company，Easton，PA中所述的配方。蛋白質(zhì)的給藥一般是通過注射，例如靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、或腹膜內(nèi)注射，或者使用透粘膜或透皮給藥的配方。這些配方一般含有表面活性劑或滲透劑如膽鹽、梭鏈孢酸等。這些配方還可以以氣霧劑或栓劑形式，或者在透皮給藥中以皮膚膏藥(patch)形式給藥。
口服給藥也是可行的，只要配方能防止本發(fā)明的肽在消化道中被降解。
劑量規(guī)定和配方的優(yōu)化可以作為常規(guī)方法并如本領(lǐng)域中通常進(jìn)行的那樣進(jìn)行。
使用方法本發(fā)明的單鏈肽可以用于許多方面，最明顯地是作為激素異源二聚體形式的替代物。因此，與異源二聚體相同，本發(fā)明的促效劑形式的單鏈激素可用于在人或動物中治療不育癥(作為體外受精技術(shù)的輔助劑)以及其他與天然激素相關(guān)的治療方法。
單鏈激素還可以以類似于異源二聚體的方法用作試劑。
此外，本發(fā)明單鏈激素可用作診斷工具，檢測在生物樣品中針對天然蛋白質(zhì)的抗體的存在與否。它們還可以作為評估各種樣品中激素水平的試劑盒的對照試劑。用于評估激素本身的水平或針對它們的抗體的水平的方法是本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法。可以使用各種涉及放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等的標(biāo)記技術(shù)的競爭性和直接分析方法。
本發(fā)明的單鏈激素還可用于檢測和純化與天然激素結(jié)合的受體。因此，本發(fā)明的單鏈激素可以偶聯(lián)于固相載體，用于受體或抗激素抗體的親和色譜制備。得到的受體本身可用于在篩選治療和候選試劑的試驗(yàn)中評估激素作為候選藥物的活性。
最后，唯一地與本發(fā)明的單鏈激素反應(yīng)的抗體可用作純化工具，用于分離隨后的這些材料的制備物。它們還可用于監(jiān)測單鏈激素作為藥物施用時的水平。
下列實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1制備編碼CGβ-α的DNA圖1為表達(dá)載體中插入子的構(gòu)建圖，其中人CG的β鏈C末端與成熟的人α亞基N末端相連。
如圖1所示，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將CGβ外顯子3和α亞基外顯子2之間的兩個亞基融合在一起，使在閱讀框中CGβ羧基端氨基酸的密碼子直接與α亞基N末端氨基酸的密碼子融合。這是通過使用雜合引物擴(kuò)增含有CGβ外顯子3的片段而實(shí)現(xiàn)，其中雜合引物含有編碼α亞基N末端序列的“尾部”。得到的擴(kuò)增片段因此含有編碼人CGα外顯子2的一部分。
與之相獨(dú)立地，將編碼與CGβ的C末端密碼子融合的α亞基N末端序列的雜合引物作為擴(kuò)增α小基因的引物之一。將兩個擴(kuò)增片段，每個都含有編碼其他亞基的重疊部分，合并起來用另外兩個覆蓋全部區(qū)域的引物擴(kuò)增，從而得到SalI插入子。
更具體地，反應(yīng)1顯示了含有CGβ外顯子3和成熟α亞基的前4個氨基酸以及在編碼序列5′側(cè)的SalI位點(diǎn)的片段的產(chǎn)生過程。它通過擴(kuò)增CGβ基因組序列的一部分而獲得，該基因組序列見Matzuk，M.M.et al.，Proc Natl Acad Sic USA(1987)846354-6358；Policastro，P.et el.，J Biol Chem(1983)25811492-11499。
引物1提供SalI位點(diǎn)，其序列如下5′-GGA GGA AGG GTG GTC GAC CTC TCT GGT-3′Sal I另一引物即引物2，與α的N末端序列的4個密碼子和CGβ的C末端序列的5個密碼子互補(bǔ)，其序列如下 因此，作為反應(yīng)I的產(chǎn)物，得到的擴(kuò)增片段在融合的編碼區(qū)域的5′端具有SalI位點(diǎn)。
在反應(yīng)II中，從上述的α小基因獲得一個類似的融合編碼區(qū)域。引物3是含有β亞基的4個密碼子和α的5個密碼子的雜合引物，其序列如下 引物4含有一個SalI位點(diǎn)并且與α外顯子4的延伸部分互補(bǔ)。引物4的序列如下5′-TGA GTC GAC ATG ATA ATT CAG TGA TTG AAT-3′SalI因此，反應(yīng)I和反應(yīng)II的產(chǎn)物有重疊，當(dāng)它們在引物1和4存在下進(jìn)行PCR時，便產(chǎn)生所需的SalI產(chǎn)物，如反應(yīng)III所示。
含有CGβ外顯子3和α小基因的擴(kuò)增片段被插入pM2HA-CGβ外顯子1、2中的SalI位點(diǎn)。pM2HA-CGβ外顯子1、2是從含有CGβ外顯子1和2的pM2衍生而得的表達(dá)載體，詳見Sachais，B.，Snider，R.M.，Lowe，J.，Krause，J.J Biol Chem(1993)2682319。含有CGβ外顯子1和2的pM2在Matzuk，M.M.et al.，Proc Natl Acad Sic USA(1987)846354-6358和Matzuk，M.M.et al.，J Cell Biol(1988)1061049-1059中有描述。
該表達(dá)載體接著用于產(chǎn)生單鏈形式的人CG，其中β亞基的C末端直接連于α亞基的N末端。
實(shí)施例2單鏈人CG的產(chǎn)生和活性將實(shí)施例1中構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，通過放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)在SDS凝膠上的免疫沉淀而評估蛋白質(zhì)的產(chǎn)生情況。收集培養(yǎng)基，在對人LH受體的競爭性結(jié)合分析中，將單鏈蛋白質(zhì)的生物活性與異源二聚體進(jìn)行比較。在該分析中，編碼完整的人LH受體的cDNA被插入表達(dá)載體pCMX(Oikawa，J.X-C et al.Mol Endocrinol(1991)5759-768)。將處于冪指數(shù)生長期的293細(xì)胞用該載體并用Chen，C.et al.Mol Cell Biol(1987)72745-2752中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
在該分析中，表達(dá)人LH受體的細(xì)胞(2×105/管)與1ng標(biāo)記的hCG及與樣品競爭性地一起保溫以便在22℃測試18小時。然后樣品用補(bǔ)充有0.1％BSA的冷Dulbecco′s PBS(2ml)稀釋5倍，在800×g離心15分鐘。沉淀物用D′s PBS洗滌2次，用伽馬計(jì)數(shù)器測量放射性。在缺乏樣品時，特異性結(jié)合為加入的總標(biāo)記(碘標(biāo)記化)hCG的10-12％。在樣品存在時，標(biāo)記的下降便為樣品的結(jié)合能力。在該分析中，對于293細(xì)胞中的人LH受體，野生型hCG的ED50為0.47ng，而單鏈蛋白質(zhì)的ED50為1.1ng。
在另一測定促效劑活性的分析中，評估刺激cAMP產(chǎn)生的情況。在該試驗(yàn)中，將表達(dá)人LH受體的293細(xì)胞(2×105/管)與各種濃度的異源二聚體hCG或單鏈hCG一起保溫，培養(yǎng)18小時。按Da-voren，J.B.et al.Biol Reprod(1985)3337-52中所述的特異放射性免疫分析方法測定胞外cAMP的水平。在該分析中，野生型的ED50為0.6ng/ml，而單鏈形式的ED50為1.7ng/ml(ED50為50％有效劑量)。
因此，在所有情況下，野生型和單鏈形式的行為是類似的。
實(shí)施例3其他活性的測定收集已用βFSH-CTP-α單鏈構(gòu)建物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基，如實(shí)施例2所述進(jìn)行測定。對于與FSH受體結(jié)合的競爭性分析的結(jié)果列于圖3。結(jié)果表示，單鏈形式比野生型FSH或在β鏈含有CTP延伸的FSH能更有效地抑制FSH本身與受體的結(jié)合。單鏈形式的ED50約為50mIU(毫免疫單位)/ml，而延伸型異源二聚體的ED50超過100mIU/ml。野生型FSH的ED50約為120mIU/ml。
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)測定的結(jié)果示于圖4。所有三種FSH的效率都差不多。
實(shí)施例4構(gòu)建其他的表達(dá)載體按與實(shí)施例1類似的方式，制備產(chǎn)生單鏈FSH、TSH和LH(βFSH-α、βFSH-CTP-α、βTSH-α、βTSH-CTP-α、βLH-α、βLH-CTP-α)的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。當(dāng)按實(shí)施例2類似方法進(jìn)行分析時，得到的激素的活性與野生型激素的活性類似。
類似地，按與實(shí)施例1相似的方法構(gòu)建“雙β”單鏈形式的表達(dá)載體，并且如實(shí)施例2那樣進(jìn)行表達(dá)和分析。
權(quán)利要求
1.一種糖基化或非糖基化的蛋白質(zhì)，其特征在于，它含有糖蛋白激素共有的α亞基氨基酸序列，該序列共價(jià)及任選地通過接頭成分連接于一種這類激素的β亞基氨基酸序列，其中，所述的α和β亞基包括天然氨基酸序列或氨基酸序列的變異形式。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)含有該接頭成分，而且該接頭成分任選地含有可導(dǎo)向糖蛋白激素受體的藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，靠近β亞基C末端的某個位置，共價(jià)及任選地通過接頭成分，連接于靠近α亞基N末端的某個位置，或者靠近α亞基C末端的某個位置，共價(jià)及任選地通過接頭成分，連接于靠近β亞基N末端的某個位置。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，β亞基是人絨毛膜促性腺激素或其變異蛋白的β亞基；或β亞基是FSH或其變異蛋白的β亞基；或β亞基是在靠近其C末端的某個位置延伸有完整或部分CTP單元或其變異形式的FSHβ亞基；或β亞基是LH或其變異蛋白的β亞基；或β亞基是在靠近其C末端的某個位置延伸有完整或部分CTP單元或其變異形式的LHβ亞基；或β亞基是TSH或其變異蛋白的β亞基；或β亞基是在靠近其C末端的某個位置延伸有完整或部分CTP單元或其變異形式的TSHβ亞基；和/或α亞基在其N末端延伸有完整或部分CTP單元或其變異形式。
5.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，α亞基或β亞基或兩者通過在非關(guān)鍵區(qū)域插入完整或部分CTP單元或其變異形式而被修飾，和/或該接頭成分含有完整或部分CTP單元或其變異形式。
6.如權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該部分CTP單元含有位置112-132；115-132；116-132；或118-132；或者112-127；115-127；11 6-127；或118-127；和/或該CTP含有一個或多個修飾的或缺失的O-連接的糖基化位點(diǎn)；和/或該非關(guān)鍵區(qū)域靠近C末端；或該非關(guān)鍵區(qū)域靠近N末端。
7.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，β亞基含有一個或多個N-連接的糖基化位點(diǎn)的修飾；和/或其中α亞基的一個或兩個N-連接的糖基化位點(diǎn)已被修飾；和或它是非糖基化的；和/或α亞基85-92位置中的一個或多個氨基酸已缺失。
8.一種糖基化或非糖基化的蛋白質(zhì)，其特征在于，它含有一種糖蛋白激素的β亞基氨基酸序列，該序列共價(jià)及任選地通過接頭成分，連接于相同或不同的糖蛋白激素的β亞基氨基酸序列，其中，所述的β亞基包括該激素的天然氨基酸序列或氨基酸序列的變異形式；或一種糖蛋白激素的α亞基氨基酸序列，該序列共價(jià)及任選地通過接頭成分，連接于相同或不同的糖蛋白激素的α亞基氨基酸序列，其中，所述的α亞基包括該激素的天然氨基酸序列或氨基酸序列的變異形式。
9.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，靠近一個α或β亞基C末端的某個位置，共價(jià)及任選地通過接頭成分，連接于靠近另一個α或β亞基N末端的某個位置。
10.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)含有接頭成分。
11.一種藥物或獸藥組合物，其特征在于，它含有與適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑相混合的如權(quán)利要求1或8所述的蛋白質(zhì)。
12.一種對權(quán)利要求1或8所述的蛋白質(zhì)免疫特異的抗體。
13.一種DNA或RNA分子，其特征在于，含有編碼權(quán)利要求1或8所述的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
14.一種表達(dá)系統(tǒng)，它用于產(chǎn)生單鏈形式的糖蛋白激素，其特征在于，該表達(dá)系統(tǒng)含有含有編碼權(quán)利要求1或8所述的蛋白質(zhì)的主要核苷酸序列，該序列可操作地連于能夠?qū)崿F(xiàn)該主要核苷酸序列表達(dá)的控制序列。
15.如權(quán)利要求14所述的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，還含有編碼信號肽的次要核苷酸序列，該信號肽可操作地連于主要核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
16.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它經(jīng)修飾以含有權(quán)利要求15的表達(dá)系統(tǒng)。
17.一種產(chǎn)生單鏈形式糖蛋白激素的方法，其特征在于，該方法包括在適合該糖蛋白激素產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞；和從培養(yǎng)物中回收糖蛋白激素。
全文摘要
本發(fā)明公開了單鏈形式的糖蛋白激素四成員家族，其中至少部分成員已在絕大多數(shù)脊椎動物中發(fā)現(xiàn)。一個單鏈形式例子是將野生型異源二聚體的α和β亞基或其變異形式共價(jià)相連，其中可任選地通過接頭成分。在接頭成分中還可含有導(dǎo)向激素受體的藥物。某些單鏈形式是糖蛋白激素活性的促效劑，某些是拮抗劑。另一種本發(fā)明單鏈形式化合物例子含有糖蛋白激素的兩個β亞基，其中β亞基可相同或不同?！半pβ”形式是糖蛋白激素活性的拮抗劑。
文檔編號A61K38/00GK1131952SQ95190749
公開日1996年9月25日 申請日期1995年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月12日
發(fā)明者I·布伊米 申請人:華盛頓大學(xué)