專利名稱：：衣原體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗衣原體感染的疫苗配方，尤其涉及一種含有重組MOMP且以QS21和3D-MPL為佐劑的配方。專性的胞內(nèi)細(xì)菌沙眼衣原體感染結(jié)膜和泌尿生殖道的粘膜上皮細(xì)胞，造成多種人類疾患如沙眼和生殖器的各種感染，而后者能夠?qū)е麻L期的后遺癥。沙眼流行于若干個發(fā)展中國家，是引起可預(yù)防性失明的首要原因；生殖器感染的病例在美國每年約有三百萬起，其能使每年有200,000個婦女因衣原體感染的輸卵管炎而喪失生育能力(1)。因此，這種病原體是影響公眾健康的重大問題，致力于建立一種抗人類衣原體感染的疫苗的努力就顯得十分必要。在人類和非人類靈長類動物身上的疫苗實(shí)驗(yàn)表明，以完整的生物體作為免疫原能產(chǎn)生血清種-特異的保護(hù)，但是有些這樣的疫苗在再次感染時往往產(chǎn)生嚴(yán)重的反應(yīng)(2)。一些研究證明，衣原體感染從病理學(xué)角度上講是受免疫介導(dǎo)的(3)。此外，純化的衣原體57KDa(Hsp60)會引起和事先感染的動物的再次感染相似的病理特征(4，5)?；谝陨系陌l(fā)現(xiàn)可以得出這樣的結(jié)論僅使用一種亞單位疫苗就可以達(dá)到預(yù)防沙眼衣原體感染的目的。沙眼衣原體的種類可分成15個血清型，它們又分屬于3個血清群B復(fù)合體(包括血清型B、Ba、D、E、L1和L2)，中間復(fù)合體(血清型F、G、K和L3)和C復(fù)合體(血清型A、C、H、I和J)(6)。性病(STD)是由橫跨3個血清群的血清型D到K引起。因此，抗衣原體性病(STD)的亞單位疫苗應(yīng)當(dāng)能夠抵抗多種血清型(它們或多或少有一定抗原相關(guān)性)。在設(shè)計(jì)亞單位疫苗的時候，更多的興趣是集中在存在于一種40KDa的主要外膜蛋白(MOMP)中的血清型抗原上。這種外膜蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中有孔素(porin)功能(7)，存在于細(xì)菌的整個生命周期中(8)；該主要的表面蛋白在人和動物體內(nèi)具有極高的免疫原性。該MOMP有4個可變區(qū)(VD)，外圍由五個在各種血清型中高度保守的恒定區(qū)包圍(9，10)。在體內(nèi)和體外，中和B細(xì)胞的抗原決定簇已被定位在可變區(qū)(VD)(11，12，13，14，15)上，而T細(xì)胞的抗原決定簇既可位于可變區(qū)也可位于恒定區(qū)(16，17)。已有不同的科學(xué)家將重組的外膜蛋白(MOMP)在大腸桿菌中表達(dá)(19，20)。但是manning等人指出他們獲得的重組蛋白不能和識別一種構(gòu)象MOMP抗原決定簇的單抗反應(yīng)(18)。在多種動物模型中，用重組的或純化的MOMP免疫動物，接著用同型或異型衣原體攻擊動物，結(jié)果對感染參數(shù)有不同的影響(21，22，23)。在小鼠上建立了一個非常好的輸卵管炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在此模型里，在小鼠子宮內(nèi)接種人類沙眼衣原體導(dǎo)致了長期不孕(24，25)。在異型攻擊實(shí)驗(yàn)中，Tuffrey等人發(fā)現(xiàn)用鋁膠吸附的rMOMP非腸道和粘膜免疫分別降低了輸卵管炎的嚴(yán)重性和下生殖道移地發(fā)育的持續(xù)時間。但是，該制劑對感染引起不育沒有保護(hù)作用(23)。細(xì)胞免疫和體液免疫似乎對沙眼衣原體造成的生殖器病變均有保護(hù)意義。但是，Rank研究小組指出在小鼠體內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫是控制衣原體生殖器疾病的主要免疫機(jī)制(26，27，28)，而且也發(fā)現(xiàn)CD4和CD8陽性的T細(xì)胞在體內(nèi)對抗衣原體的免疫反應(yīng)有作用(29，30)。3脫-O-?；鶈瘟柞ｎ愔珹見于GB2220221(Ribi)。從化學(xué)組成上講，它是由3-脫?；鶈瘟柞ｎ愔珹和4，5或6?；湹幕旌衔锴沂怯蒖ibi免疫化學(xué)蒙大拿公司制造。QS21是由HPLC純化的皂苷的非毒性組分。這種皂苷來源于南美Quillajasaponariamolina樹的皮，它的提取純化方法見于美國專利No.5,057,540。包含QS21和3D-MPL的疫苗公開于國際專利申請No.WO94/PP153。本發(fā)明首次提供了一種能有效地預(yù)防衣原體感染所致的不孕的疫苗組合物。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了包括3D-MPL，QS21和來源于衣原體的MOMP的疫苗配方。特別地，該疫苗含有來源于B復(fù)合體血清群的衣原體的MOMP。優(yōu)選地，該疫苗至少含有一種來源于L2血清型的MOMP，但還可以含有來源于其他血清型如D和E的抗原。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，QS21和甾醇一起提供。研究表明這樣的組合物不僅降低了反應(yīng)原性而且提高了QS21對堿介導(dǎo)的水解的穩(wěn)定性。在本發(fā)明優(yōu)選的組合物中，QS21和包括膽固醇在內(nèi)的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)相結(jié)合(此后稱為DQ)。這種佐劑組合物在同時待審的英國專利申請9508326.7和9513107.4中有詳盡描述，這些申請的公開內(nèi)容以參考文獻(xiàn)的形式并入本發(fā)明。在一個優(yōu)選的配方中，抗原和MPL在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)之外。疫苗制備一般見于Voller等人編著的《疫苗的新趨勢和新進(jìn)展》中(Park大學(xué)出版社，巴爾的摩，Maryland，美國，1978年)。脂質(zhì)體中微囊化見于諸如Fullerton的美國專利4,235,877。蛋白質(zhì)和大分子結(jié)合公開于諸如Likhite的美國專利4,472,945和Armor等人的美國專利4,474,757。每一疫苗劑量中蛋白質(zhì)的量選擇為在典型疫苗中可誘發(fā)起免疫保護(hù)反應(yīng)但卻不引起明顯的副作用的量。這個量因所用的特定免疫原及其存在形式而變。通常每劑疫苗中有1～1000μg的蛋白，優(yōu)選地為2～100μg，最優(yōu)選地是4～40μg。每種具體疫苗的最佳用量可由標(biāo)準(zhǔn)的研究方法(包括觀察實(shí)驗(yàn)對象的合適免疫反應(yīng))而得以確定。初次接種以后，實(shí)驗(yàn)對象可能還需要在有足夠時間間隔的情況下接受一到多次加強(qiáng)免疫。本發(fā)明所提供的配方既可用于預(yù)防疾病也可用于治療目的。從而另一方面，本發(fā)明提供了一個治療方法，其包括對患者給于有效劑量的本發(fā)明的疫苗。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，MOMP抗原從L2血清型(Serovart2)中來并用DNA重組技術(shù)在E.Coli中生產(chǎn)。這種情況下，生產(chǎn)出的蛋白質(zhì)不帶有它的信號序列。在這個發(fā)明中，抗原是否以MPL+QS21為佐劑強(qiáng)烈地影響了免疫實(shí)驗(yàn)組中IgG1∶IgG2a的比例；抗原接種時加入MPL+QS21產(chǎn)生低的IgG1∶IgG2a比例，而不加MPL和QS21的抗原免疫導(dǎo)致高的IgG1∶IgG2a比例；前者有部分保護(hù)活性而后者沒有任何保護(hù)活性。有趣的是B細(xì)胞轉(zhuǎn)向生產(chǎn)IgG2a抗體是受γ-干擾素的介導(dǎo)，γ干擾素由輔助T淋巴細(xì)胞的Th1亞群產(chǎn)生；而IgG1的生產(chǎn)受Th2細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素4調(diào)節(jié)(40)。因?yàn)镮gG2a的產(chǎn)生由Th1細(xì)胞產(chǎn)物控制，所以該保護(hù)實(shí)驗(yàn)組是以MPL+QS21激活了Th1細(xì)胞。在人和小鼠的模型中，Th1細(xì)胞因子，白介素2(IL-2)和γ-干擾素通常與抵抗胞內(nèi)病原體感染相關(guān)，而Th2細(xì)胞因子，IL-4和IL-10，則是同漸進(jìn)性疾病相關(guān)。這種情況可由小鼠對Leishmaniamajor的近交株的耐受或敏感狀況和特異性的Th1或Th2反應(yīng)的誘發(fā)密切相關(guān)而得到證實(shí)(41)。此外，γ干擾素在體外有抗衣原體活性，并且在體內(nèi)也參與了感染的消除(42，43)。因此，免疫刺激因子激活了Th1細(xì)胞可以說明為什么在上述的疫苗實(shí)驗(yàn)中觀察到保護(hù)活性。還有其它兩個觀察結(jié)果支持該在rMOMP+MPL+QS21免疫接種的實(shí)驗(yàn)組中帶有保護(hù)性的細(xì)胞免疫的假說第一，陰道分泌物中沒有特異的分泌型IgA和強(qiáng)烈seric抗體反應(yīng)的非中種特性排除了體液免疫保護(hù)的可能性；第二，應(yīng)用兩種不同的在MOMPVSs序列水平上差異極大的血清型獲得了保護(hù)作用的異型特征，這提示來源于MOMP上加工過的保守區(qū)的T細(xì)胞抗原決定簇可能是預(yù)防不育癥的因子。以下舉例說明本發(fā)明。I.材料和方法1.1衣原體品系和實(shí)驗(yàn)動物沙眼衣原體F血清型NIl品系由Tuffrey等人分離，蒙J.Orfila博士饋贈，本研究應(yīng)用的是其和沙眼衣原體L2血清型434品系(ATCC，RockvilleMd)。衣原體以大約106IFU/ml(包涵體形成單位/毫升)的濃度接種到MEM中的McCoy細(xì)胞上(ATCC，RockvilleMd)，再補(bǔ)充10％胎牛血清(FCS)(GibcoBRL公司)。離心1小時(1500g)并在37℃(5％CO2)下培養(yǎng)2小時后，移去接種物，細(xì)胞在補(bǔ)充了0.5μg/ml放線菌素酮(Sigma公司產(chǎn)品)的新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)。37℃下培養(yǎng)48小時之后，細(xì)胞用玻璃珠裂解，收集裂解物到250mM蔗糖，10mM磷酸鈉，5mML-谷氨酸PH7.2(SPG)中，并使得濃度達(dá)到107～108IFU/ml，然后-70℃貯存。6～8周齡的雌性C3H/HeOuJ(H-2K)小鼠從IffaGredo(法國)公司購得。用8～10周齡的相同品系(B&amp;K，U.K.)的雄鼠來雜交。1.2PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒購建擴(kuò)增MOMPL2血清型DNA是通過在240μl裂解緩沖液中裂解10μl衣原體接種物而獲得的，而PCR擴(kuò)增如Denamnr等人(33)以前的報(bào)道進(jìn)行。人工合成的寡核苷酸引物5’-GAGACTCCCATGGATCCACTGCCCTGTGGGGGAATCCTGC-3’和5＇-TTAGAAGCGGAATTGTGCATTTAC-3＇(SBBioloyical公司，比利時)選自已經(jīng)發(fā)表的序列(34)。該5＇端寡核苷酸引物包含有編碼成熟的MOMP分子氨基端蛋白的序列(下劃線)，在它之前是內(nèi)切酶BamHI的識別位點(diǎn)(黑體)。PCR反應(yīng)用Statagene公司的pfuDNA聚合酶和KockLightNBS熱循環(huán)儀(NewBrunswick公司)進(jìn)行。正確大小的PCR產(chǎn)物是用GenecleanII試劑盒(Biolol)從1％瓊脂糖凝膠上純化的。1.3克隆化將擴(kuò)增的L2血清型MOMPDNA用NDA聚合酶I的Klenow片段進(jìn)行平端化，然后連接到已由SmaI消化的載體PGEM4Z(promega公司)中并使用常規(guī)的CaCl2法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中。限制性酶切分析所得的克隆，正確的DNA構(gòu)建結(jié)構(gòu)被增殖并且用核鍵(nucleobond)PC-100試劑盒(Macherey-Nagel公司)進(jìn)行純化。然后，用BamHI從PGEM4Z-MOMP上消化切出MOMPDNA，接著插入經(jīng)BamHI消化的PET15(Novagen公司)的T7lac啟動子和His標(biāo)志序列的下游。正確的克隆是在轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B株(Stratagene公司)后用限制性酶切分析進(jìn)行篩選的?？寺』腄NA的全部序列是通過雙脫氧鏈終止法鑒定的(35)。PET15-MOMP質(zhì)粒的制備是為了最終用于轉(zhuǎn)化BL21(DE3)(Novagen公司)，其在含有IPTG誘導(dǎo)的T7聚合酶時能夠促進(jìn)該重組產(chǎn)物的表達(dá)。1.4免疫原生產(chǎn)、鑒定、純化和配方1.4.1生產(chǎn)和鑒定。將PET15-MOMP轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)菌在含有200μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液的OD600約為0.6～0.8時，加入1mMIPTG以誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)3小時后收集細(xì)胞，用PBS洗3遍并用含2％SDS和5％巰基乙醇的樣品緩沖液裂解。在95℃下加熱樣品3分鐘并在12％SDS-PAGE上(用在同樣凝膠(GibcoBRL)上分離的分子量標(biāo)記)分離總蛋白。進(jìn)行免疫印跡時，將該12％SDS-PAGE分離的蛋白由膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用H.Caldwell博士惠贈的單抗L2I-45和L2I-10以及羊抗MOMP抗血清(Chemicon公司)檢測。該rMOMP在細(xì)胞中的定位用Maniatis等人報(bào)道的細(xì)胞分級分離方法測定(36)。將該沉淀和上清液在樣品緩沖液中重懸或調(diào)整并象總細(xì)胞裂解物一樣進(jìn)行分析。1.4.2純化。將100ml，IPTG誘導(dǎo)3小時的培養(yǎng)液用溶菌酶和脫氧膽酸鹽裂解(Marston等)(37)。12,000g離心15分鐘，沉淀在2mlSDS-PAGE樣品緩沖液(含2％SDS，無巰基乙醇)中重懸，煮沸3分鐘。再離心(1,2000g)15分鐘。棄沉淀，上清補(bǔ)充調(diào)節(jié)到最終含Tris-HCl(PH7.9)20mM，SDS0.5％，NaCl500mM，咪唑5mM。然后上樣到含2ml組氨酸結(jié)合樹脂(Novagen)的色譜柱上。然后，按照制造商建議的方法進(jìn)行金屬離子親和層析。洗脫下的產(chǎn)品的鑒定和純度是用還原條件下的SDS-PAGE結(jié)合考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡(見上述)而進(jìn)行測評的。蛋白質(zhì)濃度用Lowry分析法確定。含有rMOMP的部分收集在一起，用pierce公司SlideAlyserCassettes對PBS透析過夜。抗原配方。試用了3種配方1)MOMP+QS21+3DMPL2)MOMP+SB62水包油乳濁液3)MOMP，SB62，QS21，3DMPL實(shí)驗(yàn)依WO95/17210和/或WO94/00153中的步驟進(jìn)行?；炯兓屯肝龊蟮膔MOMP用PBS稀釋到25μg/ml(200μl)，再和5μgMPL加10μgQS21一起注射動物。或rMOMP用PBS稀釋到50μg/ml(100μl)，再同100μl水包油的乳濁液(指SB62)混合，再加或不加5μgMOL/10μgQS21注射動物。對于任一種配方，疫苗制備方法均如下述1)MPL/QS21是通過將10nm顆粒狀MPL加到MOMP抗原中，再加緩沖溶液，最后加QS21而配制。2)MPL/QS21/SB62是通過先將抗原加到緩沖溶液，接著加SB62，再加100nm顆粒狀的MPL，最后加QS21而配制。在此配方中，可以確?？乖谌榛旱沃?，MPL和大多數(shù)QS21也在其外。3)SB62是通過將SB62加到抗原溶液中而制備?？乖谌榛旱瓮狻?.5小鼠輸卵管炎模型的接種，生育力及血清學(xué)隨訪。每組10只雌性C3H/HeOuJ小鼠在尾基部皮下注射免疫。在0周和第二周分別用200μl的含2×5μgrMOMP的上述不同配方注射，對照組則按相同時間注射含有5μgMPL和10μgQS21的乳濁液。在第六周以Tuffrey等人報(bào)到的方法接種(24)。簡單地說，小鼠在攻擊前7天皮下注射2.5mg黃體酮(Depo-Provera，Upjohn)，而攻擊是通過在雙側(cè)子宮內(nèi)接種100μlSPG或McCoy細(xì)胞提取物(內(nèi)含沙眼衣原體5×105IFU)而進(jìn)行的。在第10周，處理過的雌小鼠和雄小鼠一起籠養(yǎng)3個月進(jìn)行生育評估(1只雄鼠配兩只雌鼠，雄鼠每周在各組中輪轉(zhuǎn)養(yǎng))。交配期之后要計(jì)算的參數(shù)是每組平均產(chǎn)仔數(shù)(M)和平均同窩仔大小(N)。第六周時取血，血清用以分析rMOMP特異的抗體、在體外感染中F血清型NI1品系衣原體包涵體的異源認(rèn)別和中和。在第六周收集陰道洗液，方法是取50μlPBS吸出和沖入陰道幾次。而后分析rMOMP特異的分泌型IgA抗體。1.6血清學(xué)分析1.61抗rMOMP抗體的測定。rMOMP特異的IgG或IgA滴度通過以rMOMP為抗原的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)測定。微孔板(Maxisorp，Nane)用溶于10mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(PH9.6)的5μg/ml抗原溶液4℃包被過夜，而后用洗滌液(0.1％Tween20，PBS)洗滌，3％BSA(PBS)(Sigma產(chǎn)品)37℃封閉1小時。待檢血清在37℃用含0.5％BSA的洗滌緩沖液(卵育液)系列稀釋1小時。洗板，再加過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG或IgA(Sigma)，37℃培育1小時。洗滌后，加反應(yīng)底物鄰苯二按，室溫20分鐘，滴加2M硫酸終止反應(yīng)并在492nm波長下用LabsystemsMultiskan分光光度儀測光吸收值?？箁MOMP的IgG或IgA的滴度用顯示中點(diǎn)光吸收值的血清樣品的稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。對每一個血清樣，該rMOMP特異的IgG反應(yīng)可以用以上描述的直接ELISA稍加修改來測定rMOMP特異的IgG中IgG2b、IgG2a和IgG1的比例而仔細(xì)研究。待檢血清一式三份進(jìn)行培育，洗滌并分別加入用培育緩沖液稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG2a，IgG2b，IgG1(Amersham公司)到一式三份的每一孔中。37℃培育1小時后，洗滌，再用鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化氫酶復(fù)合物(Amersham)培育1小時。顯色和效價(jià)測定按上述進(jìn)行。3種IgG亞型中的每一個的普遍率是以其在3個亞型的IgG的總量中所占百分比例來計(jì)算的。1.6.2衣原體包涵體的異型檢出MacCoy細(xì)胞在無菌的平底96孔板(Nunc公司)中培養(yǎng)，鋪滿的單層細(xì)胞用大約5×104IFU衣原體(血清種F品系NI1)感染。24小時之后，用PBS洗細(xì)胞并用甲醇固定10分鐘。重復(fù)洗滌，與100μl經(jīng)PBS100倍稀釋的血清樣品在37℃下共培養(yǎng)1小時。洗滌96孔板并用過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma公司產(chǎn)品)37℃處理1小時。PBS洗滌，加DAB(二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物)(Sigma公司)顯色。用倒置光學(xué)顯微鏡觀察經(jīng)抗rMOMPIgG顯示出的NI1包涵體的存在。1.6.3體外的異型中和活性補(bǔ)體非依賴性的體外中和實(shí)驗(yàn)按Su等人的方法(38)稍作改進(jìn)進(jìn)行。將50μl的用SPG兩倍稀釋的去補(bǔ)體的單個小鼠血清加到含有105IFU的F血清型NI1品系的50μlSPG溶液中。將該混合液在37℃(5％CO2)下培養(yǎng)30分鐘，然后取100μl接種到HBSS(GibcoBRL公司)洗過的SyrianHamster腎細(xì)胞(Hak，ATCC，Rockville，Md)上，37℃(5％CO2)培養(yǎng)2小時。然后，除去培養(yǎng)液，用HBSS液洗細(xì)胞，再加入含有10％FCS，50μg/ml慶大霉素和0.5μg/ml環(huán)己酮的MEM。37℃下培養(yǎng)24小時之后，固定細(xì)胞并用商品化的羊抗rMOMP抗血清(Chemicon公司)和堿性磷酸酶標(biāo)記的免抗羊抗體(Sigma公司)按上述免疫化學(xué)方法檢測包涵體。以BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑)為反應(yīng)的酶的底物。IFU是通過用倒置顯微鏡的5個放大200倍的視野來定量。樣品血清每個視野的平均IFU數(shù)表示為其相對于以未免疫的小鼠血清為陰性對照而獲得的平均IFU數(shù)的降低的百分率。中和反應(yīng)效價(jià)(NT50)是以造成傳染性降低50％的血清樣品的稀釋倍數(shù)之倒數(shù)來計(jì)算。1.7結(jié)果1.7.1重組抗原的表達(dá)和鑒定含有編碼成熟的MOMPL2血清型分子的核苷酸序列的DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，然后插入到正確閱讀框并定位于PET15表達(dá)載體中。衣原體蛋白核苷酸序列以及和編碼5＇端His標(biāo)記肽的多核苷酸序列融合連接如同克隆策略所設(shè)計(jì)。細(xì)胞分級分離之后，表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌的不可溶部分，可見表達(dá)產(chǎn)物以不溶性的包含體的形式被表達(dá)。將含有沉淀的重組rMOMP用2％SDS緩沖液溶解，而后過金屬離子親和層析柱。鎳離子被固定在該柱上，它可以螯合重組rMOMP融合的His標(biāo)記肽所帶有組氨酸殘基。SDS-PAGE和Westemblot檢測分別證明經(jīng)過洗滌并在無SDS的緩沖液中洗脫的純化蛋白的分子量和預(yù)期相符，同時能和抗MOMP的單抗和多抗進(jìn)行免疫反應(yīng)。透析之后，rMOMP的濃度介于500μg/ml和1mg/ml間而純度估計(jì)達(dá)90％。1.7.2與佐劑一起免疫時rMOMP對小鼠的血清學(xué)反應(yīng)以及異型攻擊后生殖力的影響。用以測評各種帶有佐劑的MOMP的預(yù)防能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。組4和組5是用5μgMPL和10μgQS21作為佐劑同rMOMP一起皮下免疫。在組4中，帶有佐劑的重組蛋白在SB62乳化液中制備，其中含有油相鯊烯和α-生育酚，還有吐溫80作為表面活性劑。組6也將rMOMP與相同于組4的SB62乳化液一起皮下免疫，但其中不含免疫刺激物。同時設(shè)有三個對照組組1未經(jīng)任何處理；組2是模擬免疫組，只用免疫刺激物和SB62乳化液一起免疫；組3象組4一樣免疫，但這是為了模擬感染。組2，4，5和6用異型的沙眼衣原體品系NI1行免疫攻擊。1.7.3免疫對血清學(xué)反應(yīng)的影響為了測評各種配方的免疫原性，在第二次接種后4周(攻擊日)，取血清用ELISA法測IgG效價(jià)并計(jì)算出每組的平均幾何滴度(AMT)。兩次5μg的rMOMP注射免疫引起了高水平的rMOMPIgG。如表1，幾何平均滴度(AMT)在組4和組6中其實(shí)相等，但和免疫刺激因子及乳化液結(jié)合后則導(dǎo)致了rMOMP特異的IgG平均效價(jià)增加了兩倍。僅用佐劑的動物模擬免疫(組2)沒有明顯的抗衣原體重組抗原的抗體效價(jià)。各組中，在免疫攻擊前收集的陰道洗液中均檢測不到特異的rMOMP分泌型IgA。如表1所示，在含有免疫刺激物的組(組4和組5)與用SB62乳化rMOMP的組(組6)之間，IgG亞類的分布有顯著差異。使用MPL+Q21明顯提高了IgG2a的相對水平，卻降低了IgG1的相對水平；在非乳化的配方中這種現(xiàn)象表現(xiàn)到極至。為了證實(shí)rMOMP特異的IgG對異型的感染品系是否有交叉反應(yīng)，將樣品血清稀釋100倍并分別在甲醇固定的感染細(xì)胞上進(jìn)行酶免實(shí)驗(yàn)以檢測其識別衣原體包涵體的能力。所有來自免疫組的血清均表現(xiàn)出一定的與用于攻擊的衣原體品系NI1反應(yīng)的IgG。因此，在體外的補(bǔ)體非依賴性試驗(yàn)中分別測定這些血清抵抗該品系的中和活性(用模擬免疫組的血清作為陰性對照)。因?yàn)闆]有任何一組血清能明顯降低衣原體的傳染性，所以與ELISA和酶免實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比，這些結(jié)果是不一致的。1.7.4異型免疫對攻擊后生育力的影響在用rMOMP最后一次免疫(或模擬免疫)8周后并且宮內(nèi)感染(或模擬感染)4周之后，雌鼠用雄鼠交配兩個月。異源的NI1品系對C3H/HeOuJ小鼠生育力的攻擊結(jié)果用以下參數(shù)計(jì)算每組平均產(chǎn)仔數(shù)(N)和平均同窩仔大小(M)。同未處理的小鼠比，衣原體接種的組2(模擬免疫)小鼠生育力明顯改變。這個結(jié)果證明了此實(shí)驗(yàn)動物模型的有效性。經(jīng)免疫和模擬感染過的小鼠(組3)同未處理組相比表現(xiàn)出降低的生育力參數(shù)。這個組是用來作為一個對照評估rMOMP配方的預(yù)防能力且考慮到了生育力的非病理性改變。如表1所示，免疫刺激因子共接種組(組4和5)同用SB62乳化rMOMP免疫的組(組6)之間生育力有明顯差異。組5表現(xiàn)出最佳結(jié)果(10只小鼠有7只產(chǎn)仔)和最大的生育力參數(shù)；N值達(dá)到對照組3的50％，M值與對照組相當(dāng)。相反，沒加免疫刺激物的組6的生育力參數(shù)同感染的對照組2的相當(dāng)。聯(lián)合了免疫刺激因子和SB62乳濁液的rMOMP免疫也產(chǎn)生了抗不育的保護(hù)作用，但SB62浮濁液的應(yīng)用好象部分地降低了保護(hù)率。如此，應(yīng)用MPL加上QS21能夠部分預(yù)防上生殖道衣原體感染，并且該現(xiàn)象的最大效應(yīng)在非乳化的配方中獲得。1.8結(jié)論我們的結(jié)果表明以MPL+QS21為佐劑的rMOMP非腸道免疫能夠部分地預(yù)防由異源衣原體感染小鼠生殖道所造成的不孕；相反，不加兩種免疫刺激因子而僅注射SB62乳化的rMOMP不能產(chǎn)生任何預(yù)防作用。另一方面，每一抗原配方在所免疫動物的血清中均引起強(qiáng)烈的而相對同型的MOMP特異的總IgG反應(yīng)；這些抗體能夠和用甲醇固定的異型感染品系的衣原體包涵體進(jìn)行交叉反應(yīng)，但不能在體外降低衣原體的傳染性。剛好在攻擊之前，在陰道分泌物中檢測不到rMOMP特異的IgA，這同非腸道抗原給藥方法所得結(jié)果一致。因此，將總的特異性IgG效價(jià)或中和效價(jià)同各免疫組的病理學(xué)結(jié)果對比得不出任何顯著的有關(guān)這些對比之間的關(guān)系。以上研究結(jié)果證實(shí)重組MOMP聯(lián)合免疫刺激物MPL+QS21能夠誘發(fā)預(yù)防沙眼衣原體造成不育的免疫保護(hù)作用。2.各種MOMP佐劑配方的第二組實(shí)驗(yàn)。2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法衣原體和小鼠品系同實(shí)施例1中所述的實(shí)驗(yàn)使用的一樣。2.2MOMP制備和配制生產(chǎn)和利用構(gòu)建的PET15-MOMP質(zhì)粒DNA來生產(chǎn)抗原如實(shí)施例1所述。為了獲得大量不含內(nèi)毒素的抗原，抗原純化方法做了一些修改。簡要地說是這樣在依據(jù)制造商建議的方法進(jìn)行純化步驟之前，將10mlHis結(jié)合樹脂(Novagen公司)用25倍體積的2％SDS/6M尿素的水溶液洗滌。將250ml誘導(dǎo)的裂解物離心，收集沉淀；沉淀分別用4M尿素，2MNaCl和2％Zwittergen(Calbiochem公司產(chǎn)品)洗滌，接著溶于Tris-HCl(PH7.9)，0.5％SDS，500mMNaCl，5mM咪唑中?？乖蒚ris-HCl(PH7.9)，100mM咪唑洗脫下來，對5mMTris-HClPH7.4徹底透析，用0.22μm無菌濾膜過濾。然后，用鱟裂解物實(shí)驗(yàn)(Coatest，Chromogenix)來分析LPS內(nèi)容物。2.3配制除每劑中的MPL量改為10μg外，抗原按實(shí)施例1所述進(jìn)行配制。有一組使用了同時待審的英國專利申請950832.7，9513107.4(稱為DQ)報(bào)道的改進(jìn)的QS21來實(shí)驗(yàn)，加入的劑量是10μg/劑。更詳細(xì)地說，疫苗的配制方案是加抗原到緩沖液，然后加入100nm大小的MPL顆粒；在一分離管中，QS21同由二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)和膽固醇組成的小單層脂質(zhì)體混合(DOPC∶膽固醇＝4∶1W/W)，因此QS21和膽固醇之比為1∶5(在此條件下，所有的QS21都摻入脂質(zhì)體膜中)；接著將QS21/SUV混合液(稱為DQ)加到抗原/MPL混合液中。在這種配方中，抗原和MPL在脂質(zhì)體外，而QS21在脂質(zhì)體內(nèi)。2.4小鼠輸卵管炎模型的接種，生育力，免疫學(xué)和組織學(xué)隨訪。免疫、實(shí)驗(yàn)性感染和取樣的方案同前述一致，但陰性對照是由含10μgMPL和10μgQS1的乳濁液模擬免疫；另外增加一組抗原和MPL+DQ聯(lián)合免疫的小鼠。每組有15只小鼠其中10只同雄鼠交配8周，而另外5只在免疫攻擊兩周后處死用于組織病理學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。用以評估各組生育力的參數(shù)如下F(生產(chǎn)過一次或多次的小鼠數(shù)除以總小鼠數(shù))，M(新生小鼠數(shù)(死亡或者活的)除以總的新生仔數(shù))和N(新生鼠數(shù)(死的和活的)除以總的鼠數(shù))。血清和陰道洗液用ELISA檢測rMOMP特異的抗體。血清也用來在體外感染中檢測F血清型NI1品系衣原體包涵體識別和異源(NI1)感染中和。所用技術(shù)均如前述。上部生殖道(卵巢、輸卵管和子宮角頂)在OCT化合物中包埋(組織-TEK，Miles)，速凍，10μm大的冷凍切片裝于載波片(Superforst，Menzel-glarter)上。風(fēng)干切片，丙酮固定5分鐘，-70℃貯存。進(jìn)行組織病理分析時，重新水化切片，然后用蘇木精(H)和伊紅(E)染色。在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析染色時，切片用PBS重新水化，用100μl含2μg生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4或CD8單抗(Serotec公司)的PBS培育60分鐘，PBS洗兩遍，再在2000倍稀釋的HRP-鏈霉抗生物素蛋白(Zymed公司)中重新培育30分鐘。洗滌之后，用液體DAB試劑盒(Zymed公司)顯色，用蘇木精復(fù)標(biāo)記，在丙烯醇中進(jìn)行永久封固。2.5γ干擾素檢測在第0周和第2周用200μl配方在小鼠尾基部皮下注射，對照組用10μgMPL和10μgQS21聯(lián)合乳化液模擬免疫。小鼠第4周取血進(jìn)行血清學(xué)分析，然后處死，無菌操作取脾臟，收集細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液，以用1μg/mlrMOMP重新刺激或者用4/mlConA(Boer-hingerMannheim)刺激作為對照。在平底24孔板中以每毫升RPMI1640106響應(yīng)細(xì)胞加上10％胎牛血清(Gibco-BRL公司產(chǎn)品)進(jìn)行培養(yǎng)。重刺激96小時后收集上清，用商品化的ELISA試劑盒(Cytoscreen，Biosource)檢測γ干擾素(IFN)。2.6結(jié)果2.6.1抗原透析之后，rMOMP濃度估計(jì)約為2mg/ml，污染的內(nèi)毒素水平低于0.05EU/μgrMOMP。2.6.2帶佐劑的rMOMP免疫對小鼠體液免疫反應(yīng)，異型攻擊后對生育力，以及感染導(dǎo)致的發(fā)炎感染的影響。用于評估不同佐劑輔助下rMOMP的預(yù)防能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。2.6.3免疫對體液反應(yīng)的影響。攻擊的當(dāng)天收集血清和陰道洗液來檢測接種后的體液反應(yīng)。所有的抗原配方產(chǎn)生相近的幾何平均滴度(GMT)大約為30,000的抗rMOMPIgG。只用佐劑的模擬免疫動物沒有產(chǎn)生明顯的抗衣原體重組抗原的抗體效價(jià)。任何一組實(shí)驗(yàn)動物中，在剛好在攻擊前收集的陰道洗液中均檢測不到rMOMP特異的分泌型IgA。同型的rMOMP特異的IgG反應(yīng)揭示出同只用乳濁液中rMOMP激起的反應(yīng)相比，MPL+QS21或DQ的存在提高了IgG2a的相對水平。所有的免疫后血清都含有可同甲醇固定的血清種FC沙眼衣原體品系NI1(即用以免疫攻擊)的包涵體反應(yīng)的IgG。2.6.4攻擊后的異型免疫對生育力的影響。用異源的NI1品系對小鼠生育的攻擊結(jié)果用實(shí)驗(yàn)步驟中定義的參數(shù)F、N和M來定量。計(jì)算出的各組在交配期的這些參數(shù)值見表1。和模擬感染組相反，對模擬免疫組的感染幾乎導(dǎo)致完全不育。這就說明觀察到的不育是由于沙眼衣原體所致，而不是由于對動物的操作。兩種佐劑都加的rMOMP免疫組，即MPL+DQ配方的抗原產(chǎn)生了部分的保護(hù)作用F和N多數(shù)的值大約達(dá)到了模擬感染組(陽性對照)最高值的80％。相反，在攻擊前用乳濁液中配置的rMOMP免疫所得的生育力參數(shù)F和N值較低。2.6.5攻擊后的組織病理學(xué)變化在生育力實(shí)驗(yàn)的組織病理學(xué)副實(shí)驗(yàn)中，組織切片經(jīng)傳統(tǒng)HE著色發(fā)現(xiàn)在模擬免疫組和接種組間，輸卵管和卵巢的炎癥傷痕處無明顯的差異?？墒怯妹庖呒?xì)胞化學(xué)染色觀察T細(xì)胞亞群頻率時，CD4陽性T細(xì)胞只在MPL+DQ接種組中發(fā)現(xiàn)(4/4小鼠)，而CD8陽性T細(xì)胞在免疫和模擬免疫組均有(表3)。因此在這實(shí)驗(yàn)中，只在MPL+DQ接種組中發(fā)現(xiàn)了CD4陽性的浸潤T細(xì)胞并且在生育力研究的副實(shí)驗(yàn)中，這也是唯一有保護(hù)性的組。2.6.6該配方在體外再刺激時，對γ干擾素分泌的影響。抗原配方誘導(dǎo)的細(xì)胞活性用單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)檢測(見表4)。一方面，將rMOMP聯(lián)合MPL+QS21或MPL+DQ接種的動物的脾細(xì)胞分離出來并用抗原在體外重刺激后，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)上清中就有濃度和在同期用4μg/ml的刀豆球蛋白A刺激后的相當(dāng)?shù)摩?干擾素。另一方面，從模擬免疫或接種了無免疫刺激因子的rMOMP的動物中分離的細(xì)胞卻不能產(chǎn)生可測到的γ-干擾素，而其用ConA共培養(yǎng)的副實(shí)驗(yàn)總表現(xiàn)出此細(xì)胞因子陽性。對從各組中收集的血清樣進(jìn)行血清學(xué)分析揭示出γ干擾素的分泌同抗原特異的IgG2a比率增高相關(guān)。結(jié)論總之，攻擊試驗(yàn)和γ干擾素檢測的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明重組MOMP同兩種佐劑MPL和QS21或IDQ的結(jié)合物在小鼠體內(nèi)聯(lián)合免疫能導(dǎo)致抗原特異的Th1樣免疫反應(yīng)(這由γ干擾素分泌和IgG2a比例的升高的來檢測)，并因此能預(yù)防沙眼衣原體引起的不育癥。文獻(xiàn)1.WashingtorAE，JohnsonRE和SanderiLL.。美國的沙眼衣原體感染花了我們多少錢。美國醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志1987，257，2070-2072。2.GraystonJT和WangSP.關(guān)于衣原體和其致病的新知識。傳染性疾病雜志(TheJournalofInfectionsDiseases)1975，13287-105。3.GraystonJT.WangSP.YehLJ和KuoCC。再感染在沙眼發(fā)病機(jī)理中的重要性。傳染性疾病綜述(ReviewsofInfectionsDiseases)1985，7，717-725。4.MorrisonRP，RJBelland，Klyng和HDCaldwell.衣原體疾病發(fā)病機(jī)理，57KD的衣原體高敏感抗原是一個應(yīng)激反應(yīng)蛋白。實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1989，170，127-12835.BlanderJT和AmorteguiAJ，用衣原體提取液免疫的小鼠在小鼠肺炎的沙眼衣原體因子感染生殖器后除增強(qiáng)發(fā)炎外沒有增強(qiáng)早期保護(hù)性免疫，感染免疫學(xué)(Infec.Immun.)1994，62，3617-3624，μg6.WangSP.KuoCC，BovrnesRC，StephensRS和GraystonJT.用單克隆抗體對沙眼衣原體的免疫分型，傳染病雜志，1985，152，791-8007.BavoilP.OhlinA和SchachterJ.二硫鍵在沙眼衣原體外膜結(jié)構(gòu)和滲透性中的作用感染免疫學(xué)，感染免疫學(xué)(Infect.Immun.)1984，44，479-4858.HatchTP.MiceliM.SublettJE.在鸚鵡熱衣原體和沙眼衣原體發(fā)育周期中二硫鍵合的外膜蛋白合成，細(xì)菌學(xué)雜志，1986，165，379-3859.StephersRS，RSanchez-Pezcador，EAWangar.CInowye和MSUredea沙眼衣原體主要外膜蛋白基因的多樣性，細(xì)菌學(xué)雜志，1987，169，3879-388510.YuanY，zhamgXY，WatkinsNG.和CaldwellHD.15個沙眼衣原體血清種的主要外膜蛋白的4個可變化的核苷酸序列和簡并氨基酸序列，感染免疫學(xué)，1989，57，1040-104911.BaehrW，ZhangYX，JosephT，SuH，SvanoFE，EverttEK和CalwellHD圖譜分析沙眼衣原體主要外膜蛋白基因表達(dá)的抗原區(qū)，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，1988，85，4000-400412.LuceroME，和KuoCC，用血清種特異的單克隆抗體中和沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)物感染，感染免疫學(xué)1985，50，595-59713.ZhangYX，StewartS.JosephT，TaforHR和HDCaldwell.保護(hù)性的單抗識別沙眼衣原體主要外膜蛋白上的抗原決定簇，免疫學(xué)雜志，1987，138，575-58114.PetersonE.ZhongG，CarlsonE和delaMazaLM.Mg離子在沙眼衣原體的單抗中和作用中的保護(hù)作用，感染免疫學(xué)1988，56，885-89115.ZhangYX，StewartSJandCalolwellHD.沙眼衣原體血清種和血清型特異的主外膜蛋白因子的保護(hù)性單克隆抗體，感染免疫學(xué)，1989，57，636-63816.AllenJE.RMLolosley和RSStephens.來源于沙眼衣原體之外膜蛋白的單個肽誘發(fā)用于保護(hù)性因子的抗體的生產(chǎn)的輔助T細(xì)胞，免疫學(xué)雜志，1991，147，647-67917.SuH，RPMorrison，NGWatkins和HDCaldwell.沙眼衣原體主要外膜蛋白上的輔助T細(xì)胞抗原決定簇的鑒定和定性，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，1990，172，203-21218.ManningDS梆SJStewart.在大腸桿菌中表達(dá)沙眼衣原體主外膜蛋白，感染免疫學(xué)，1993，61，4093-409819.KoehlerJE.BirkelundS和StephensRS.沙眼衣原體主要外膜蛋白在大腸桿菌中的超表達(dá)和表面定位，分子微生物學(xué)，1992，6，1087-109420.PickettMA，MEWard和INClarke沙眼衣原體血清種L1的主外膜蛋白的高水平表達(dá)和抗原決定簇定位，分子微生物學(xué)，1988，2，681-68521.TaylorHR.JWhittum-Hudson，Jschachter，HDCaldwell和RAPrendergast.用沙眼衣原體主要外膜蛋白(MOMP)進(jìn)行口服免疫，眼科學(xué)和視覺科學(xué)研究(InvestigativeOphthalmologyandvisualScience)，1988，29，1847-185322.BatteigerBE，RGRank，PMBaroid和LSFSoderberg.用從豚鼠包涵體結(jié)膜炎的衣原體因子中分離的主要外膜蛋白免疫豚鼠對生殖道再感染的部分預(yù)防作用，普通微生物學(xué)雜志1993，139，2965-297223.TuffreyM，F(xiàn)Alexander，Wconlan，CWoods和MWard.先用重組L1主要外膜蛋白免疫之后，人血清種F沙眼衣原體分離物對小鼠衣原體性輸卵管炎和下生殖道移地發(fā)育的異型保護(hù)作用，普通微生物學(xué)雜志，1992，138，1707-171524.TuffreyM.PFalder，JGale和DTaylor-Robinson.人類沙眼衣原體誘引的小鼠輸卵管炎，英國實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志(Br.J.exp.Path.)，1986，67，605-61625.TuffreyM.PFalder，JGale.RQuinn和DTaylor-Robinson.人類沙眼衣原體感染小鼠生殖器造成的不孕，英國實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1986，78，251-26026.RanseyKH.LSFSoderberg和RGRank.衣原體對B細(xì)胞缺陷小鼠的生殖器感染的消退和再感染的免疫，感染免疫學(xué)，1988，56，1320-132527.RankRG.LSFSoderberg和ALBarron.先天性無胸腺裸鼠的衣原體慢性生殖器感染，感染免疫學(xué)，1985，48，847-84928.IgietsemeJU和RGRank.初次衣原體感染后對二次感染的敏感性與生殖道中抗原特異的T細(xì)胞減少有關(guān)，感染免疫學(xué)，1991，59，1346-135129.IgietsemeJU.KHRansey.DMMagee.MDWilliamsTJKincy和RGRank.通過生物種特異的TH1淋巴細(xì)胞克隆的過繼轉(zhuǎn)移的鼠衣原體性生殖器感染的消除。局部免疫學(xué)(RegioualImmunology)，1993，5，317-32430.IgietsemeJU，DMMagee，DMWillanas和RGRank.CD8陽性T細(xì)胞在衣原體特異的T細(xì)胞克隆確定的抗衣原體的免疫中的作用，感染免疫學(xué)，1994，62，5195-519731.MyersKR和JTUlrich.單磷脂A作為佐劑的有效應(yīng)用在新疫苗中策略中。粘膜，佐劑和遺傳途徑。國際商業(yè)通訊(InternationalBusinessCommunication)，Ma.USA.32.NewmanMJ.JYWu，BHGardner，KJMunroc.Dleombruno.JRecohia，CDKensil和RTCoughlin.皂甙佐劑誘發(fā)卵清蛋白特異性的CD8陽性細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)，免疫學(xué)雜志，1992，148，2357-236233.DenammrE，CSonyaola，ASourian.Jorfila.ARodolakis和JElion.外膜蛋白基因的限制性酶切圖譜提供了在反芻動物中鸚鵡熱衣原體分離物的同源侵染類型的證據(jù)。普通微生物學(xué)雜志，1991，137，2525-253034.ZhangYX，SGMorrison和HDCaldwell.沙眼衣原體血清種F的主要外膜蛋白基因的核苷酸序列，核酸研究，1990，18，160135.Tabor和CCRichardson，美國國家科學(xué)院院刊，1989，86，4076-408036.SambrookJ，EFFritsch和TManiatis，分子克隆，第二版，冷泉港出版社，198937.MarstonFAO.大腸桿菌表達(dá)的真核多肽的純化。見于DNA克隆化一個實(shí)用方法(ed.DMGlover)，第3冊，59頁，IRL出版社，牛津38.SuH和HDCaldwell，一個同能中和沙眼衣原體主要外膜蛋白的抗原決定簇的抗原普通的T輔助細(xì)胞和B細(xì)胞相對應(yīng)的人工合成寡肽的免疫原性，疫苗(Vaccine)，1993，11，1159-116639.TuffreyM.FAlexander，CInman和MEWard.人沙眼衣原體的生殖道分離物導(dǎo)致小鼠輸卵道炎而改變的輸卵管形狀和功能與不育的相關(guān)性，繁殖與生育雜志(J.Reprod.Fert.)，1990，88，295-30540.SnapperCM和WEPaul.γ干擾素和B細(xì)胞刺激因子1互相地調(diào)節(jié)同型IgG產(chǎn)量，科學(xué)，1987，236，944-94741.HeinzelFP，MDSadick.SSMutha和RMLOKsky.在治愈和進(jìn)行性的鼠利什曼病的體內(nèi)過程中，CD4陽性淋巴細(xì)胞生產(chǎn)的γ干擾素、白介素2、白介素4和白介素10，美國國家科學(xué)院院刊，1991，88，701142.BymeGi，LKLehmann和GJLandry，在T24細(xì)胞中用于γ干擾素介導(dǎo)的鸚鵡熱衣原體胞內(nèi)復(fù)制的抑制的色氨酸降解的誘發(fā)，感染免疫學(xué)，1986，5334743.RankRG.KH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