專(zhuān)利名稱(chēng)：一種在腸道降低人體膽固醇的菌株及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于降低高膽固醇血癥的屎鏈球菌和含有該菌株活菌的微生態(tài)制劑。
近年來(lái)，隨著生活水平的提高，社會(huì)上出現(xiàn)了一些令人擔(dān)擾的問(wèn)題，少兒肥胖，中老年人血脂高等癥，嚴(yán)重影響人們的身心健康，尤其是青少年的正常生長(zhǎng)發(fā)育。為了解決這一問(wèn)題，就要降低膽固醇的含量，減少脂肪的合成與沉積。人體的膽固醇都要經(jīng)過(guò)腸道，腸道中存在大量的細(xì)菌，某些菌群成員可以直接參與宿主的膽固醇代謝，并對(duì)異常的代謝進(jìn)行調(diào)整，使之恢復(fù)正常。日本河谷康雄(1984)，曾從健康人腸道中分離出一株具有降低膽固醇作用的菌株(AD1001)，沒(méi)有公開(kāi)是什么菌。Gililand(1985)報(bào)導(dǎo)，自豬糞便中分離出一株乳桿菌，能明顯抑制豬高膽固醇飲食而致的血膽固醇升高的作用。還未見(jiàn)到其它菌株及其制劑用于人體，并參與宿主的膽固醇代謝，而起到降低膽固醇及血膽固醇含量及血脂的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是提供一種生長(zhǎng)旺盛，遺傳穩(wěn)定，無(wú)毒的可降低人體高膽固醇水平的新菌株，進(jìn)而提供降低高血脂的該活菌制劑。
本發(fā)明用于在人體腸道降低人體膽固醇的DM891129菌株，是從健康人體內(nèi)分離出的新菌株。經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所檢定，確定為屎鏈球菌(S.faecium)，是經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的，保藏號(hào)為CGMCCNO.0278的屎鏈球菌(S.faecium)。S.faecium是streptococcus faecium的簡(jiǎn)寫(xiě)。
人體腸道寄生著大約1014個(gè)正常的微生物，這些微生物參與了人體的生理、生長(zhǎng)，生物物理和藥理及病理的全部生命活動(dòng)進(jìn)程，保藏號(hào)為CGMCC NO.0278的屎鏈球菌(S.faecium)DM891129菌株就是由這些生理性的正常微生物中優(yōu)選出來(lái)的。DM891129菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能分泌出一種由多糖、蛋白質(zhì)和核糖核酸構(gòu)成的物質(zhì)，這些物質(zhì)可促進(jìn)膽固醇分解代謝，使其轉(zhuǎn)變成膽汁酸，從而降低膽固醇水平。經(jīng)穩(wěn)定性及各種毒性試驗(yàn)證明，該菌無(wú)毒副作用，且具有遺傳的穩(wěn)定性。
DM891129菌株的生物學(xué)特征為1、形態(tài)和染色光鏡下G+球形，成對(duì)或單個(gè)呈鏈狀排列，菌體大小為0.5—1.μm，無(wú)鞭毛，莢膜及芽胞。
電鏡下該菌呈分裂相，電子密度均勻，胞壁清晰。
菌落形態(tài)在Nb固體培養(yǎng)基上呈灰白色，園形、光滑，周邊整齊，表面隆起，直徑0.5—15mm，在EC選擇性培基上，為紫紅色表面光滑菌落。
2、培養(yǎng)特性DM891129菌株在EC基礎(chǔ)固體培基及Nb培養(yǎng)基上，37℃需氧培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，15—45℃生長(zhǎng)，10℃不生長(zhǎng)，最佳溫度為37℃、PH5.0—9.6，液體培基呈混濁生長(zhǎng)，最佳PH7.4，0.5—9％ Nacl液體培基中均呈混濁生長(zhǎng)。
在EC基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中呈沉淀生長(zhǎng)，無(wú)菌膜形成，在EC基礎(chǔ)半固體培基穿刺培養(yǎng)無(wú)動(dòng)力，沿穿刺線生長(zhǎng)。
3、生化反應(yīng)特性見(jiàn)表1表1DM891129菌株生化反應(yīng)特點(diǎn)(72小時(shí)培養(yǎng)結(jié)果)項(xiàng)目反應(yīng)尿素 -杏仁素+果糖+纖維二糖 +衛(wèi)茅醇 -葡萄糖+乳糖+麥芽糖+甘露醇 +甘露糖+半乳糖 +蔗糖 +菊糖 -肌醇 -水楊素 +棉子糖+罩糖 +密二糖+鼠李糖 -阿伯糖+山梨醇 +木糖 ±4、抗生素敏感試驗(yàn)見(jiàn)表2表2DM891129抗生素敏感試驗(yàn)(49hr觀察結(jié)果)抗生素名稱(chēng)抑菌圈(mm)抗生素名稱(chēng)抑菌圈(mm)頭孢霉素26四環(huán)素 8白 霉 素24復(fù)方新諾明 -新 霉 素16卡那霉素 13氯 霉 素22慶大霉素 15先鋒霉素24鏈霉素 -紅 霉 素30慶大霉素 8青 霉 素--土霉素 8
DM891129對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明和鏈霉素耐藥，對(duì)頭孢霉素、白霉素、新霉素、氯霉素、先鋒霉素、紅霉素敏感(＞15mm)，對(duì)四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素中度敏感(≤15mm)。
5、紫外線照射實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表3表3DM891129紫外線照射實(shí)驗(yàn)時(shí) 間距離(m)5′20′30′60′0.5+ +- -+ --1.0++ + +- -+將DM891129劃線于非選擇性EC基礎(chǔ)培基，不同高度，經(jīng)紫外線照射不同時(shí)間，然后將平皿置37℃，培養(yǎng)24-48hr，觀察結(jié)果++為全平皿均有菌生長(zhǎng)+ 平皿邊緣有生長(zhǎng)，中央部位很少有菌生長(zhǎng)+-較+平皿菌落還少-+僅于平板邊緣有零散的菌落。
以上結(jié)果可見(jiàn)，紫外線照射60′基本上達(dá)到滅菌，照射30′，效果欠佳。
DM891129菌株進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)菌株DM891129，固體培養(yǎng)物以生理鹽水稀釋制成濃的菌液，將菌液以生理鹽水稀釋成5個(gè)濃度，3×1010個(gè)菌/ml，3×109個(gè)菌/ml，3×108個(gè)菌/ml，3×107個(gè)菌/ml，3×106個(gè)菌/ml，以0.1ml/10g體重，對(duì)昆明種小鼠25只腹腔注射，觀察2周，無(wú)一只動(dòng)物死亡，因此DM891129，LD50＞3×1010個(gè)菌/10g體重，相當(dāng)于成人口服量(1.0×108個(gè)菌/50kg·日)的5×105倍，因而DM891129菌株屬無(wú)毒類(lèi)。
DM891129菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)DM891129菌株在40℃的條件下，5天后大部分死亡，在60℃下，存活30分鐘，80℃下，存活5秒鐘，100℃5分鐘內(nèi)全部殺死。在常溫25℃下及在2-8℃條件下留樣觀察，發(fā)現(xiàn)在2-8℃條件下保存效果最好，在室溫25℃條件下保存一年其菌體存活率仍在10％以上。
DM891129菌株發(fā)酵工藝
將DM891129菌株接種于胰胨、酵母浸膏、葡萄糖，NaHPO4，KH2PO4的混合培養(yǎng)液中，分別置35℃，37℃和39℃培養(yǎng)，35℃對(duì)DM891129菌株生長(zhǎng)最佳，見(jiàn)表4。pH為7.5對(duì)DMM891129菌株生長(zhǎng)有利，見(jiàn)表5。0.5％糖含量適合DM891129菌株生長(zhǎng)，見(jiàn)表6，DM891129菌株對(duì)耐氧實(shí)驗(yàn)不敏感，在16小時(shí)，對(duì)厭氧好些，在24小時(shí)，無(wú)顯著差異，見(jiàn)表7。
表4 溫度對(duì)DM891129生長(zhǎng)的影響×108CFU/ML時(shí)間(h) 816 24溫度℃35 1411.5 9.037 1010 7.039 6.5 9.06.5表5 pH對(duì)DM891129菌株生長(zhǎng)影響×108CFU/ML時(shí)間(h)8 16 24溫度℃6.5 4.56.55.07.0 5.07.55.07.5 7.59.06.5由表5知，pH為7.5對(duì)DM891129菌株生長(zhǎng)有利表6 糖含量DM891129菌株生長(zhǎng)的菌數(shù)影響×108CFU/ml時(shí)間(h) 816 24糖量％0.2 0.83 7.54.170.5 1.10 12.5 9.51.0 0.95 8.17 5.831.5 1.05 4.17 3.672.0 -- 5.04.67由表6知，0.5％糖含量適合DM891129菌株生長(zhǎng)表7 DM891129菌株的耐氧性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)號(hào) 16 小 時(shí) 24 小 時(shí)裝量 PH 活菌數(shù)×108CFU/ml PH 活菌數(shù)×108CFU/ml100ml5.8 12.83 5.8 17.83200ml5.8 15.33 5.8 18.17300ml5.7 125.8 13.5400ml5.6 145.7 16.00500ml5.6 21.67 5.7 17.00由表7可知DM891129菌株對(duì)氧實(shí)驗(yàn)不敏感，在16小時(shí)對(duì)厭氧好些，在24小時(shí)，100ml和500ml無(wú)顯著差異。
菌種保藏DM891129可斜面，半固體深層保存或凍干保存，半固體深層保存，需將0.3—0.5％瓊脂半固體穿制培養(yǎng)保存，以液體石蠟封閉，凍干保存時(shí)；海藻糖、脫脂奶粉、谷氨酸鈉是較好的保護(hù)劑。
為適應(yīng)作為藥物，經(jīng)培養(yǎng)的DM891129菌株已由最初的厭氧型轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑿柩蹙?。本發(fā)明降低膽固醇的屎鏈球菌制劑是含有該屎鏈球菌DM891129活性成分的活菌制劑。以該菌為有效成分制成的口服藥物，可在人體腸道內(nèi)定植過(guò)程中降解膽固醇，使其轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)固醇，從而降低血膽固醇含量及高血脂水平，但對(duì)正常水平的血脂無(wú)降低作用，可保持正常的血脂水平。該制品安全，無(wú)毒副作用。
本發(fā)明的屎鏈球菌制劑是將屎鏈球菌接種于EC液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)、收集菌體與保護(hù)劑混合，冷凍干燥制成菌粉，與一定比例的賦形劑混合，制成藥粉。劑型可為粉劑，片劑或囊劑。其微生物指標(biāo)如表9，理化指標(biāo)如表8。
表8 DM891129制劑理化指標(biāo)項(xiàng)目 指 標(biāo)規(guī)格與偏差(mg/粒) 340+25水份％ ≤7.0顆粒度 目 ≥40砷(以AS計(jì))mg/kg≤0.5鉛(以Pb計(jì)) mg/kg≤1.0銅(以Cu計(jì)) mg/kg≤10.0表9 DMM891129制劑微生物指標(biāo)項(xiàng) 目 指 標(biāo)DM891129菌種檢定 陽(yáng)性DM891129活菌數(shù) 個(gè)/g ≥107大腸菌群 個(gè)/100g≤30霉菌 個(gè)/g ≤100致病菌(沙門(mén)氏菌、志賀氏菌，葡萄球菌) 不得檢出對(duì)冷凍干燥制成菌粉，與一定比例的賦形劑混合制成藥粉的制劑，進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗(yàn)，在2—8℃保存效果最好，在室溫條件下保存一年其菌體存活率仍在10％以上，還屬有效范圍之內(nèi)。室溫下貯存時(shí)間與DM891129屎鏈球菌活菌含量測(cè)試具體結(jié)果見(jiàn)下列數(shù)據(jù)貯存時(shí)間(月)批號(hào) 含量(×108CFU/g) 水份(％) 霉菌數(shù)0921002 1.20 3.8-921015 1.35 4.0-921025 1.31 4.3-3921002 0.81 3.8-921015 0.72 4.1-921025 0.85 4.4-6921002 0.51 3.8-921015 0.43 4.1-921025 0.61 4.4-12 921002 0.15 3.9-921015 0.26 4.2-921025 0.13 4.4-18 921002 0.07 4.0-921015 0.05 4.2-921025 0.04 4.4-采用本發(fā)明的屎鏈球菌制劑進(jìn)行了動(dòng)物性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用，證明，此制劑對(duì)正常血清膽固醇水平無(wú)影響，對(duì)高膽固醇血癥者血膽固醇水平有降低作用，對(duì)單純性肥胖小兒血脂較高者；經(jīng)服用本制劑后，血脂可降至正常，體重明顯減輕。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1將DM891129在Ec、EMB中培養(yǎng)，形成菌懸液，濃度為109個(gè)細(xì)菌/ml，將42只沙土鼠雌雄各半，隨機(jī)分為3組，第1組13只為正常組；第2組13只，在正常飲食中加5％膽固醇飲喂一周；第3組16只，在第2組飲食的基礎(chǔ)上，每天以DM891129菌懸液(109個(gè)細(xì)菌/ml)0.5ml/次，灌胃一周。3組沙土鼠以眼球采血，分別檢測(cè)血清膽固醇，甘油三酯和膽酸水平及糞便中腸球菌和腸桿菌水平，結(jié)果見(jiàn)表10及表11。
表10各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便菌群檢測(cè)結(jié)果(1g/g濕便)正常沙土鼠 0.5％膽固醇 0.5％膽固醇飲食飲食一周后 +DM891129菌液灌 ③① ③② ①②① ②胃一周后③腸球菌 6.36±0.69(8) 6.49±1.02(7) 7.75±1.19(12) **** **腸桿菌 5.44±0.45(10) 6.75±1.37(9) 6.79±1.07(11) ** ***注表中擴(kuò)號(hào)內(nèi)數(shù)字為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)****P＜0.01**P＜0.05***P＜0.02表11各組沙土鼠血清膽固醇、膽酸和甘油三酯水平0.5％膽固醇 0.5％膽固醇飲食+正常沙土鼠 飲食一周后 DM891129菌液灌胃②① ②③① ② 一周 ③膽固醇 105.72±32.5(13) 220±73.9(13) 145.11±28.85(16) **** ****(ml/dl)膽酸215.46±261.5(11) 520.57±400.2(13) 336.23±187.4(9)(ug/dl)甘油三酯57.57±27.66(13) 67.19+33.26(13) 72.00±23.58(16)(mg/dl)注****P＜0.001結(jié)果表明，第3組球菌水平明顯高于第1、2組(P＜0.01，P＜0.05)，2、3組腸桿菌水平明顯高于第1組(P＜0.02，P＜0.05)，第2組膽固醇水平較第1組明顯升高(P＜0.001)，第3組膽固醇水平較第2組明顯降低(P＜0.001)。膽酸、甘油三酯水平3組之間無(wú)顯著性差異。可見(jiàn)DM891129菌株對(duì)沙土鼠高膽固醇飲食所致的高膽固醇血癥具有明顯的降低作用而對(duì)血甘油三酯、膽酸水平無(wú)顯著性影響。
實(shí)施例2選取高膽固醇血癥者17人，男性11人；女性6人，年齡32-67歲；血清膽固醇水平正常者5人，均有男性，年齡52-71歲。以上病人隨機(jī)分為兩組。DM891129制劑膠囊，每粒含藥粉0.25g(含DM891129屎鏈球菌0.25×108個(gè))，第1組用法為3粒，Bid.po；第2組為3粒，Tid.po正常對(duì)照組服法同第1組。正常對(duì)照組及第1組服藥4周，停藥4周，再繼續(xù)服藥4周，共觀察12周，每階段服藥前后各查一次各項(xiàng)指標(biāo)；第2組服藥4周，檢查臨床一般性況及副作用，包括一般感覺(jué)、食欲、每天大小便次數(shù)、睡眠、發(fā)熱情況、血常規(guī)、尿檢、腎功、血膽固醇、血甘油三酯及血糖水平。
一般情況所有志愿者在服藥期間及服藥后2周內(nèi)均未見(jiàn)任何不良反應(yīng)，血GPT，尿檢，血糖水平，血常規(guī)，腎功均未見(jiàn)異常，無(wú)發(fā)熱現(xiàn)象，一般臨床狀況均正常。正常對(duì)照組的血膽固醇及甘油三酯水平見(jiàn)表12。
表12正常對(duì)照組血膽固醇、甘油三酯水平(mmol/L)檢查時(shí)間 ChTg0周 4.2±0.9l(5) 2.17±1.85(5)4周 4.12±0.81(5)1.41±0.49(5)5.4±0.822.09±1.52(5)12周 4.5±1.32(5) 2.02±2.11(5)注Ch代表血清膽固醇水平，Tg代表血清甘油三酯水平，0周為第一階段服藥前；4周為第一階段服藥結(jié)束；8周為第二階段服藥前；12周為第二階段服藥結(jié)束；表中括號(hào)為觀察人數(shù)由表12可見(jiàn)，第8周時(shí)血Ch水平略有上升，此為第一階段結(jié)束，第二階段服藥前的結(jié)果，但其數(shù)值仍在正常范圍之內(nèi)，第二階段服藥后又略下降，與服藥前水平相近?？梢?jiàn)此制劑對(duì)正常血Ch水平及Tg水平無(wú)明顯影響，各階段相應(yīng)指標(biāo)比較無(wú)顯著意義(P＞0.05)。
第1組各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表13
表13第1組血膽固醇、甘油三酯水平(mmol/L)檢查時(shí)間 ChTg0周 6.65±0.54(11)1.61±0.19(11)4周 5.56±0.72(10)1.50±0.33(10)8周 5.61±0.84(11)1.52±0.21(11)12周 5.0±.062(11) 1.44±0.21(11)由表13可見(jiàn)，血清Ch水平于第1次服藥后即呈明顯下降(P＜0.01)，在間斷服藥期間無(wú)明顯變化(P＜0.05)，第2次服藥后又旦顯著下降(P＜0.05)。
第一階段服藥后，血Ch水平下降超過(guò)30％者為1人(9.1％)；第二階段服藥后，血Ch水平下降率超過(guò)30％者為3人(27.3)。在整個(gè)服藥期間(3個(gè)月內(nèi))，血甘油三酯水平無(wú)明顯變化(P＜0.05)。
第2組各項(xiàng)指示檢測(cè)結(jié)果如表14表14第2組血膽固醇、甘油三酯水平(mmol/L)檢查時(shí)間 ChTg0周 7.70±1.0(6) 1.46±0.65(6)4周 4.54±0.89(6)1.35±0.37(6)注第2組志愿者因時(shí)間限制僅觀察一個(gè)月由表14可見(jiàn)，服藥4周后，血Ch水平明顯下降(P＜0.01)，Tg水平無(wú)顯著變化。在6位志愿者中，有5位(83.3％)血Ch水平下降率超過(guò)40％，另1例下降率為21.5％。與第1組志愿者同期相比，血Ch下降率差別顯著(P，0.005)。提示可能與兩組用藥劑量差異有關(guān)。
綜合以上的實(shí)驗(yàn)，具有體外動(dòng)物模型能降血清膽固醇水平的菌株DM891129在動(dòng)物性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，由少數(shù)志愿服用，未見(jiàn)任何不良反應(yīng)，對(duì)正常人血清膽固醇水平無(wú)影響，有降低高膽固醇血癥者血膽固醇水平的作用。對(duì)血清甘油三酯水平作用不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該制劑對(duì)高膽固醇血癥者血膽固醇的作用呈劑量依賴(lài)性和用藥依賴(lài)性，提示該制劑作用程度與所給藥量有一定關(guān)系。
實(shí)施例3以超過(guò)同年齡，同性別小兒平均體重20％以上者為肥胖。
本實(shí)施例選取體重超30-39％4例，超40-59％14例，超60％8例。同時(shí)選出性別年齡與治療組完全相同，體重超重20--59％的21名肥胖而作體重觀察對(duì)照組。
每人服制劑每次0.75--1g(體重＞50公斤者1g)每日二次，飯后15分鐘口服。每二周隨診一次，測(cè)體重身長(zhǎng)，全身情況查體，三個(gè)月一療程。本組與對(duì)照組在服藥開(kāi)始前及療程結(jié)束后，同時(shí)測(cè)體重一次。
治療組小兒在開(kāi)始服藥前及療程結(jié)束后各抽血一次，以酶測(cè)定法測(cè)血清甘油三酯及血清總膽固醇定量，并以放射免疫法測(cè)血清超氧化物化酶(SOD)之含量。兩組體重增減情況，治療組21例中，11例體重減輕，8例增加1-10％，僅2例增加21-30％。
血脂測(cè)定結(jié)果血清甘油三酯測(cè)定21例中，高于正常值者6例，治療后，5例將為正常，1例仍高于正常值。血清總膽固醇的測(cè)定，21例中高于正常值者5例(4例處于正常值高限)。治療后2例降至正常值，1例仍高。
血清超氧化物歧化酶測(cè)定結(jié)果21例中9例低于正常值(235mg/ml)治療后仍有5例低于正常值。
權(quán)利要求
1.一種在腸道降低人體膽固醇的菌株，是從健康人體內(nèi)分離出的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO.0278的屎鏈球菌(S.faecium)屎鏈球菌DM891129菌株。
2.一種降低膽固醇的活菌制劑，含有在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO.0278的屎鏈球菌(S.faecium)DM891129活性成分的活菌制劑。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)的活菌制劑，是將屎鏈球菌接種于EC液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)、收集菌體與保護(hù)劑混合，冷凍干燥制成菌粉，與一定比例的賦形劑混合，制成的藥粉。
4.如權(quán)利要求1所說(shuō)的活菌制劑，劑型為粉劑或片劑或囊劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于降低高膽固醇血癥的屎鏈球菌和含有該菌株活菌的微生態(tài)制劑。屎鏈球菌(S.faecium)DM891129菌株就是由人體內(nèi)正常微生物中優(yōu)選出來(lái)的,在生長(zhǎng)過(guò)程中能分泌出一種由多糖、蛋白質(zhì)和核糖核酸構(gòu)成的物質(zhì),這些物質(zhì)可促進(jìn)膽固醇分解代謝,使其轉(zhuǎn)變成膽汁酸,從而降低膽固醇水平。經(jīng)穩(wěn)定性及各種毒性試驗(yàn)證明,該菌無(wú)毒副作用,且具有遺傳的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1186855SQ9710130
公開(kāi)日1998年7月8日 申請(qǐng)日期1997年1月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月2日
發(fā)明者康白 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)科達(dá)藥業(yè)有限公司