一種慢性腎臟病血管鈣化實驗模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬腎臟病學領(lǐng)域，涉及一種慢性腎臟病血管鈣化實驗模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前醫(yī)學界公認，CKD-MBD(chronic kidney disease-mineral and bonedisorder,腎性骨骼病變)是指由慢性腎臟病引起的礦物質(zhì)和骨代謝系統(tǒng)性紊亂，其中，血管鈣化是CKD的常見并發(fā)癥，各期CKD患者均存在程度不等的鈣磷代謝紊亂，由此所引起的血管鈣化是CKD患者晚期心血管事件死亡的獨立危險因素。
[0003]通常，現(xiàn)有技術(shù)常采用5/6th切除大鼠腎模型和腺嘌呤大鼠腎毒性模型進行腎衰竭引起血管鈣化的研究。在上述兩個模型中，受到急性腎損傷后的實驗動物回出現(xiàn)嚴重的高磷酸鹽血癥和甲狀旁腺機能亢進，隨后發(fā)展成CKD。所述5/6th切除大鼠腎模模型較經(jīng)典，所發(fā)生的腎小球損傷與人的局灶節(jié)段性腎小球硬化相似，一般8周到12周后手術(shù)組出現(xiàn)血肌酐、尿素氮明顯增高，低血鈣，高血磷，呈現(xiàn)典型的慢性腎衰竭癥狀，并出現(xiàn)血管鈣化、骨密度下降等心血管及腎性骨病等慢性腎衰竭并發(fā)癥表現(xiàn)；但該模型存在以下缺點:
(1)需通過一步法或兩步法外科手術(shù)建立模型，增加了麻醉意外和手術(shù)感染的幾率；(2)建模周期較長，通常需要18周以上；相比之下，所述腺嘌呤大鼠腎毒性模型因其簡便易行，成活率高近年來引起較多關(guān)注，其比5/6th切除大鼠腎模型有更快速和嚴重的腎病進展以及甲狀旁腺機能亢進和動脈鈣化，通常給予含0.75%腺嘌呤的飲食4周后出現(xiàn)CKD癥狀，表現(xiàn)為繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥，甲狀旁腺增生，血中甲狀旁腺激素急劇升高，鈣磷代謝嚴重紊亂，骨的再吸收作用增強，主動脈、冠狀動脈以及其他軟組織的鈣化形成；所述主動脈鈣化主要出現(xiàn)在中膜，與臨床上典型的慢性透析病人動脈鈣化極為相似，但該模型亦存在兩大缺點:(1)由于大鼠自由進食，攝取腺嘌呤的量有較大差異，模型個體差異較大；(2)是該模型會引起大鼠嚴重的體重下降，甚者在建模后體重幾乎下降了 50%。上述缺陷明顯不利于藥物研究和篩選，基于此，Terai等改良了腺嘌呤大鼠腎毒性模型，給予大鼠灌胃600mg/kg/d腺嘌呤，10天后即造成急性腎損傷，且未見明顯體重下降；但所建模型的最大缺點是血管鈣化發(fā)生率較低，在第8周時只有12.5%左右，盡管其表現(xiàn)有腎毒性和骨改變。
[0004]綜上所述，目前的慢性腎臟病血管鈣化動物模型均采用大鼠造模，且成模率普遍不高；且由于大鼠實驗要求藥物用量大，實驗空間大，勞動量大，業(yè)內(nèi)對采用該類動物模型進行篩選、評價抗血管鈣化的藥物不樂觀。
[0005]同時，基于實驗小鼠僅限于基因敲除模型，如:載脂蛋白E缺陷小鼠、骨橋蛋白(0ΡΝ)缺陷小鼠、基質(zhì)Gla蛋白(MGP)缺陷小鼠、骨保護素(osteoprotegerin, 0PG)缺陷小鼠等；基因敲除的方法雖然可排除飲食和藥物誘導血管鈣化時所伴隨的副作用和復合因素，但其制備過程復雜，需時長，且成本較高，無法得到廣泛應(yīng)用。
[0006]當前，國內(nèi)外尚未見有關(guān)腺嘌呤或5/6Nx切除誘導小鼠血管鈣化模型的報道，其可能與小鼠進行腎切除手術(shù)難度較大或給藥后死亡率較高有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種慢性腎臟病血管鈣化實驗模型的建立方法。
[0008]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0009]采用腺嘌呤聯(lián)合維生素D，配合高磷低蛋白飲食，建立慢性腎臟病血管鈣化實驗模型。本發(fā)明的實施例中，采用腺嘌呤聯(lián)合維生素D，配合高磷低蛋白飲食，建立慢性腎臟病血管鈣化實驗C57BL/6小鼠模型。
[0010]本發(fā)明的慢性腎臟病血管鈣化實驗模型通過下述方法建立，其包括步驟:
[0011](1)采用腺嘌呤(劑量100mg/kg)對實驗C57BL/6小鼠，每隔2天灌胃1次，持續(xù)1周；
[0012](2)第2周至第6周，每周給藥同樣劑量的腺嘌呤1次；
[0013](3)第2周至第6周，每隔2天給藥活性維生素D3 Calcitr1l lyg/kg;本發(fā)明的實施例中采用腹腔注射給藥方式；
[0014](4)第2周至第6周，模型鼠全部采用高磷低蛋白飲食(含磷量為1.2% )，建立慢性腎臟病血管鈣化動物模型。
[0015]對制得的慢性腎臟病血管鈣化實驗模型進行性能鑒定:其包括步驟:
[0016](1)建立模型6周后，常規(guī)處理實驗動物，取鑒定樣品(血或腎臟、血管組織)；
[0017](2)測定血液生化指標；
[0018](3)腎臟組織進行HE染色，血管組織進行von kossa染色；
[0019](4)數(shù)據(jù)分析；
[0020]鑒定結(jié)果顯示:
[0021](1)所述實驗模型血清中的尿素氮(BUN)，血肌酐(Cre)，尿酸(UA)，血磷⑵，血(Ca)均顯著增加；
[0022](2)部分實驗模型發(fā)生明顯血管鈣化；或發(fā)生血管壁明顯增厚，中層纖維變形的血管病變；
[0023]結(jié)果表明，本發(fā)明采用腺嘌呤聯(lián)合1，25(0H)2D3和高磷飲食可致實驗小鼠腎毒性，并引起血管鈣化制得慢性腎臟病血管鈣化實驗模型，本方法成模時間短，穩(wěn)定性好；所述慢性腎臟病血管鈣化模型可進一步用于篩選治療慢性腎臟病血管鈣化的藥物及其機制研究。
【附圖說明】
[0024]圖1為建立模型的操作步驟。
[0025]圖2顯示了建模后小鼠血清生化指標的變化情況，其中:
[0026]A為血清尿素氮變化；B為血肌酐變化；C為尿酸變化；D為血磷變化；E為血鈣變化。
[0027]圖3顯示了建模后小鼠腎臟病理學的變化，其中:
[0028]A為對照組(未造模)小鼠的腎臟形態(tài)學情況；B為模型小鼠的腎臟病形態(tài)學情況。
[0029]圖4顯示了建模后小鼠血管病理學的變化，其中:
[0030]A為對照組(未造模)小鼠的血管形態(tài)學情況；B為模型組發(fā)生鈣化小鼠的血管形態(tài)學情況；C為模型組未發(fā)生鈣化小鼠的血管形態(tài)學情況。
【具體實施方式】
[0031]實施例1建立慢性腎臟病血管鈣化實驗模型
[0032](1)采用劑量100mg/kg腺嘌呤，每隔2天灌胃1次實驗C57BL/6小鼠，持續(xù)1周；
[0033](2)第2周至第6周，每周給藥同樣劑量的腺嘌呤1次；
[0034](3)第2周至第6周，每隔2天給藥活性維生素D3 Calcitr1l lyg/kg;本發(fā)明的實施例中采用腹腔注射給藥方式；
[0035](4)第2周至第6周，模型鼠全部采用含磷量為1.2%的高磷低蛋白飲食，建立慢性腎臟病血管鈣化實驗模型。
[0036]組織取材和血液指標測定:
[0037]各動物稱體重，取血分離血清，分離胸主動脈，取雙腎臟稱平均質(zhì)量；所有組織分成兩部分，一部分置于4%的多聚甲醛中，做常規(guī)石蠟包埋、切片，供病理和免疫組化檢查，另一部分腎置于-80°C冰箱中備用；血清用自動生化分析儀測定血鈣、血磷、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、尿酸(UA)含量；
[0038]測定結(jié)果顯示:與對照組相比，模型血清BUN，Cre, UA, P，Ca均顯著增加，表明所建的實驗模型致腎衰效果明顯；
[0039]制備石蠟切片:
[0040](1)取材的組織樣品4 %多聚甲醛中固定48小時以上；
[0041](2)乙醇梯度脫水:70%乙醇24小時，80%乙醇12小時，95%乙醇12小時，100%乙醇1小時，100%乙醇1小時，為石蠟滲透至組織內(nèi)部、包埋組織做必要的準備；
[0042](3) 二甲苯透明:二甲苯:乙醇(1:1) 10分鐘，二甲苯I 20分鐘，二甲苯II 20分鐘；
[0043](4)浸蠟:石蠟I 40分鐘，石蠟II 90分鐘；
[0044](5)石蠟包埋:將融化的石蠟倒入包埋框，而后用加溫的鑷子將浸蠟的組織塊放入，控制溫度在56 °C ；
[0045](6)切片:每個標本取10長切片，每張切片厚3 μ m。用經(jīng)0.1%多聚賴氨酸處理的玻片貼片，烤片過夜后，存于4°C冰箱待用。
[0046]HE 染色:
[0047](1)石醋切片置二甲苯中脫醋5-10min ；
[0048](2)移入二甲苯和純酒精(1: 1)混合液中5min左右；
[0049](3)移入100%、95%、85%、70%酒精，各級為2?5min。最后經(jīng)蒸餾水，水洗5min后轉(zhuǎn)入染液；
[0050](4)Harris 蘇木素染 5-lOmin ;
[0051](5)水洗 5min ；
[0052](6)0.5%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻，鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)30s ；
[0053](7)水洗 15min，藍化；
[0054](8) 75% 乙醇，洗 lmin ;
[0055](9) 0.5 %水溶性伊紅Y乙醇液染色lmin ；
[0056](10)依次經(jīng)70%、85%、95%、100%酒精脫水，各級為2?3分鐘；
[0057](11) 二甲苯透明(二次)，共約10分鐘；
[0058](12)擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固；
[0059]腎臟病理學檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，所述模型組腎小球萎縮，系膜細胞增多，間質(zhì)區(qū)增寬，表明實驗小鼠發(fā)生了腎衰竭。
[0060]Von kossa 染色:
[0061](1)石蠟切片脫蠟至水；
[0062](2)在日光下或紫外線燈下用2%硝酸銀浸染20_60min ；
[0063](3)蒸餾水洗 5min ；
[0064](4) 5 %硫代硫酸鈉水溶液處理2min ；
[0065](5)自來水洗 5min;
[0066](6)0.1%核固紅染液復染l_2min ;
[0067](7)蒸餾水洗5-10秒鐘；
[0068](8)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固；
[0069]血管病理學檢測結(jié)果如圖4所示:與對照組相比，所述模型組實驗小鼠血管壁均明顯增厚，部分小鼠可見到明顯鈣化的發(fā)生(圖中黑色部分)，未發(fā)生鈣化的小鼠血管其中層可見清晰的的彈力纖維并發(fā)生變性；
[0070]檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的制備方法可有效導致血管向鈣化病變發(fā)展，成功建立慢性腎臟病血管鈣化實驗模型。
【主權(quán)項】
1.一種慢性腎臟病血管鈣化實驗模型的建立方法，其特征在于，選用實驗動物，按下述步驟: (1)腺嘌呤每隔2天灌胃1次，持續(xù)1周； (2)第2周至第6周，每周給同樣劑量的腺嘌呤1次； (3)第2周至第6周，每隔2天給活性維生素D3Calcitr1l ； (4)第2周至第6周，采用高磷低蛋白飲食，建立慢性腎臟病血管鈣化實驗模型。2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，實驗動物為C57BL/6小鼠。3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，腺嘌呤的劑量為lOOmg/kg。4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，活性維生素D3Calcitr1l的劑量為1 μ g/kg。5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，高磷低蛋白飲食的含磷量為 1.2%。6.按權(quán)利要求1?5任一所述的方法制備得到的慢性腎臟病血管鈣化實驗模型。7.按權(quán)利要求6所述慢性腎臟病血管鈣化動物模型，其特征在于，該模型通過下述步驟進行鑒定: (1)建立模型6周后，常規(guī)處理實驗動物，取鑒定樣品； (2)測定血液生化指標； (3)腎臟組織進行HE染色，血管組織進行vonkossa染色； (4)數(shù)據(jù)分析。
【專利摘要】本發(fā)明屬腎臟病學領(lǐng)域，涉及一種慢性腎臟病血管鈣化實驗模型及其制備方法。本發(fā)明利用C57BL/6小鼠造模，采用腺嘌呤聯(lián)合維生素D，配合高磷低蛋白飲食的干預方式，建立慢性腎臟病血管鈣化實驗模型。本發(fā)明的制備方法成模時間短，穩(wěn)定性好；建立的慢性腎臟病血管鈣化實驗模型可進一步用于篩選治療慢性腎臟病血管鈣化的藥物及其機制研究。
【IPC分類】A01K67/02, A61K31/593, A61K31/52
【公開號】CN105434447
【申請?zhí)枴緾N201410432207
【發(fā)明人】張雪梅, 彭文, 陳啟菁, 王浩
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年8月28日