29 細胞，每個化合物的濃度梯度都為 250 U M，125 U M，62. 5 U M，31. 25 U M，15. 625 U M，7. 813 U M, 3. 9063 y M, I. 953 y M, 0. 977 y M, 0. 488 y M, 0. 244 y M, 0. 122 y M, 0. 0610 y M,結果如圖 3 所示，丹酪酸A、丹參酸C和紫草酸的劑量響應曲線是單相"S"型，并且都達到飽和響應，對 應的 ECso 值分別為 37. 69 + 3. 77 U M、19. 36 + 1. 80 U M、37. 63 + 13. 83 U M。丹酪酸 A、丹參 酸C與紫草酸的作用效能（e巧cacy)的強弱順序是丹酪酸C〉丹酪酸A〉紫草酸；作用潛能 (potency)強弱順序是丹酪酸C〉丹酪酸A W紫草酸。丹酪酸B和丹參素在最高濃度500 U M 仍沒有達到飽和響應。
[0024] 然后使用脫敏分析的方法驗證丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹參素作 用于GPR35受體的特異性。HT-29細胞經(jīng)丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹參素 預處理Ih之后，每個化合物的濃度梯度都為250 U M，125 U M，62. 5 U M，31. 25 U M，15. 625 U M, 7. 813 U M, 3. 9063 U M, 1. 953 U M, 0. 977 U M, 0. 488 U M, 0. 244 U M, 0. 122 U M, 0. 0610 U M，再加入IiiM的敏喘寧繼續(xù)監(jiān)測比，結果如圖4所示，丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草 酸和丹參素對受體的脫敏都呈現(xiàn)劑量依賴性。而且丹酪酸A、丹酪酸C、紫草酸和丹參素能 在高濃度時將敏喘寧的DMR響應信號脫敏至最小，對應的ICw值分別為3. 48 + 0. 38 U M、 2. 70 + 0. 31 U M、109 + 23 U M、30. 42 + 2. 25 U M。
[0025] 最后使用枯抗分析方法驗證丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹參素作用于 GPR35受體的特異性。HT-29細胞經(jīng)GPR35受體的枯抗劑ML145預處理IOmin之后，ML145 的濃度梯度為 64 U M, 32 U M, 16 U M, 8 U M, 4 U M, 2 U M, 1 U M, 0. 5 U M, 0. 25 U M, 0. 125 U M, 0. 0 625 U M，0. 0313 U M，0. 0156 U M，0. 00781 U M，再加入濃度為ECso的紫草酸、丹參素、丹酪酸 B (分別是125 y M、100 y M和100 y M)與濃度為ECw、EC5e、EC2。的丹酪酸A (分別是125 y M、 35 U M和15 U M)和丹酪酸C(分別是IOOy M、20 UM和4uM)，結果如圖5所示。高濃度的 ML145能夠完全抑制紫草酸、丹參素和丹酪酸B的響應，其ICw值分別為0.47 + 0. 07 U M、 0. 25 ± 0. 02 U M和1. 48 ± 0. 22 U M ;ML145對ECs。濃度的丹酪酸A和丹酪酸C的DMR響應信 號幾乎沒有影響；對ECs。濃度的丹酪酸A和丹酪酸C的DMR響應信號有部分的抑制作用， 對ECw濃度的丹酪酸A和丹酪酸C的DMR響應信號呈現(xiàn)劑量依賴性抑制，對應的ICw分別 是0. 15 ± 0. 08 U M和0. 25 ± 0. 03 U M，但仍沒有完全抑制丹酪酸A和丹酪酸C的DMR響應信 號，由此可見丹酪酸A和丹酪酸C在低濃度時激活GPR35的同時，也激活其他受體；在高濃 度時更表現(xiàn)出激活了另一個受體。
[0026] 通過激動分析、脫敏分析和枯抗分析H個實驗表明GPR35受體是丹酪酸A、丹酪酸 B、丹酪酸C、紫草酸和丹參素的作用祀點，同時發(fā)現(xiàn)丹酪酸A和丹酪酸C在HT-29細胞上至 少有兩個作用祀點。
[0027] 目前的研究表明GPR35受體與必力衰竭、高血壓、冠狀動脈性必臟病、代謝綜合 癥、哮喘、疼痛、炎癥和癌癥等疾病相關，根據(jù)祀點與疾病的關聯(lián)關系，可拓寬丹酪酸A、丹酪 酸B、丹酪酸C、紫草酸及丹參素化合物的臨床應用范圍。
[002引實施例3 ;丹酪酸A和丹酪酸C的雙祀點作用機制
[0029] 結合丹酪酸A與丹參酸C在HT-29細胞和A431細胞上的初步表征，經(jīng)丹酪酸A 與丹酪酸C預處理細胞之后，己醜膽堿、緩激膚和組胺的DMR信號都存在一定的變化，由于 己醜膽堿受體、緩激膚受體和組胺受體都是G a q偶聯(lián)受體，說明丹酪酸A和丹酪酸C的激 活通路可能與G a q相關。因為G a q通路激活時會產(chǎn)生巧流，當巧泉被激活時也會產(chǎn)生巧 流，送樣G a q通路與巧泉存在異源脫敏的現(xiàn)象，所W推斷丹酪酸A與丹參酸C可能作用于 Ca2+-ATPase。為了驗證丹酪酸A和丹酪酸C作用于Ca2^-ATPase,使用丹酪酸A、丹酪酸C、 Ca2^-ATPase抑制劑毒胡蘿h素和環(huán)匹阿尼酸作用于A431細胞，丹酪酸A和丹酪酸C的濃 度梯度為 250 U M, 125 U M, 62. 5 U M, 31. 25 U M, 15. 625 U M, 7. 813 U M, 3. 9063 U M, 1. 953 U M，0. 977 U M, 0.488 U M, 0.244 U M，0. 122 U M, 0.0610 U M,毒胡蘿 h 素的濃度梯度為 32 U M ,16 U M, 8 U M, 4 U M, 2 U M, 1 U M, 0. 5 U M, 0. 25 U M, 0. 125 u M, 0. 0625 u M, 0. 03125 u M, 0.0 l 56 U M, 0. 007812 U M, 0. 00391 U M，環(huán)匹阿尼酸的濃度梯度為 64 U M, 32 U M, 16 U M, 8 U M, 4 U M, 2 U M, 1 U M, 0. 5 U M, 0. 25 U M, 0. 125 u M, 0. 0625 u M, 0. 03125 u M, 0. 0156 u M, 0. 00781 U M，結果如圖6所示，響應曲線呈現(xiàn)劑量依賴性且為單相"S"型，其對應的ECw值分別是 122. 46 + 11. 75 U M、60. 75 + 3. Oly M、0. 29 + 0. 02 U M 和 2. 04 + 0. 09 U M。A431 細胞經(jīng)丹酪 酸A和丹酪酸C濃度梯度預處理比后，濃度為16 U M的環(huán)匹阿尼酸在A431細胞上的DMR 響應受到抑制（圖7)，且與丹酪酸A和丹酪酸C的濃度呈劑量依賴關系，其對應的ICw值 分別是71. 43 + 9. 53 U M和26. 06 + 1. 70 U M，由此說明丹酪酸A和丹酪酸C的另一個作用革己 點與巧泉相關。丹酪酸A和丹酪酸C的雙祀點作用為臨床應用提供作用機制的解釋和為拓 寬此類化合物的臨床應用提供一定的導向。
【主權項】
1. 丹參中GPR35受體激動劑，其特征在于：其以丹參素、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹 酚酸C、及丹參素衍生物、紫草酸衍生物、丹酚酸A衍生物、丹酚酸B衍生物、丹酚酸C衍生 物、和上述化合物藥學上可接受的鹽中的一種或二種以上為活性成份。2. 按照權利要求1所述的激動劑，其特征在于：其中還包括有藥物學上可接受的載體 或賦形劑。3. 丹參中酚酸類化合物在制備預防和/或治療代謝綜合癥、哮喘、疼痛、炎癥和癌癥 中的一種或二種以上疾病的藥物中的應用，其特征在于：所述酚酸類化合物為丹參素、紫草 酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C及其衍生物、和它們藥學上可接受的鹽中的一種或二種以 上。4. 丹參中P型ATPase酶中Ca2+_ATPase的抑制劑，其特征在于：其以丹酚酸A、丹酚酸 C、及丹酚酸A衍生物、丹酚酸C衍生物、和上述化合物藥學上可接受的鹽中的一種或二種以 上為活性成份。5. 按照權利要求4所述的抑制劑，其特征在于：其中還包括有藥物學上可接受的載體 或賦形劑。6. 丹參中酚酸類化合物在制備肢端動脈痙攣癥、偏頭痛、梅尼埃爾氏病、閉塞性脈管炎 中的一種或二種以上疾病的藥物中的應用，其特征在于：所述酚酸類化合物為丹酚酸A、丹 酚酸C及其衍生物、和它們藥學上可接受的鹽中的一種或二種以上。7. 丹參中酚酸類化合物在制備心力衰竭和高血壓中的一種或二種疾病的藥物中的應 用，其特征在于：所述酚酸類化合物為丹酚酸C及其衍生物、和藥學上可接受的鹽中的一種 或二種以上。
【專利摘要】本發(fā)明涉及中藥丹參作用靶點的發(fā)現(xiàn)與臨床應用范圍的拓寬，具體地說是丹參中酚酸類化合物的新作用靶點的發(fā)現(xiàn)及此類化合物在臨床上的新應用，所述酚酸類化合物包括原兒茶醛、丹參素、咖啡酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D等類結構化合物及其衍生物、和它們藥學上可接受的成鹽化合物。體外細胞實驗表明，本發(fā)明中的化合物作用于孤兒受體GPR35，目前研究表明孤兒受體GPR35與心力衰竭、高血壓、冠狀動脈性心臟病、代謝綜合癥、哮喘、疼痛、炎癥和癌癥等疾病相關，據(jù)此可拓寬此類化合物的臨床應用范圍，此外還發(fā)現(xiàn)此類化合物具有雙靶點的作用特點，為臨床新應用提供一定導向作用。
【IPC分類】A61P9/14, A61P35/00, A61K36/537, A61P3/00, A61P9/04, A61P11/06, A61P9/12, A61P25/06, A61P9/00, A61P29/00
【公開號】CN105521016
【申請?zhí)枴緾N201410521294
【發(fā)明人】梁鑫淼, 王紀霞, 張秀莉, 魏來, 史麗穎, 侯滔
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2014年9月30日