持續(xù)型人生長激素制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及持續(xù)型人生長激素綴合物制劑，其包括：持續(xù)型人生長激素(hGH)綴合物——其由免疫球蛋白Fc區(qū)域和構(gòu)成生物活性肽的人生長激素(hGH)之間的綴合產(chǎn)生、緩沖液溶液、非離子表面活性劑和糖醇。更具體而言，本發(fā)明涉及持續(xù)型人生長激素綴合物凍干制劑和液體制劑，涉及凍干制劑的生產(chǎn)方法，涉及重構(gòu)凍干制劑的方法，和涉及包括凍干制劑和重構(gòu)溶液的試劑盒。
【專利說明】
持續(xù)型人生長激素制劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及長效人生長激素綴合物的制劑，其包括長效人生長激素（hGH)綴合 物--其中作為生理活性肽的人生長激素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域、緩沖液、非離子表面 活性劑和糖醇，具體地涉及長效人生長激素綴合物的凍干制劑和液體制劑，用于制備凍干 制劑的方法，用于重構(gòu)凍干制劑的方法和包括凍干制劑和重構(gòu)溶液的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人生長激素（下文稱為"hGH"）是由垂體前葉腺分泌的由具有約22,000的分子量的 191個氨基酸組成的多肽激素。人生長激素已經(jīng)主要用于兒科垂體性侏儒癥的治療。傳統(tǒng) 地，已經(jīng)使用從人垂體腺提取的hGH，但是由于其有限的供應(yīng)，僅治療了非常有限數(shù)量的人。 而且，自從報導(dǎo)了在用從垂體腺提取的hGH治療的一些患者中發(fā)現(xiàn)的克-雅二氏病一一退行 性神經(jīng)障礙，禁止了從垂體腺提取的hGH的使用。目前，基因工程技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)能夠生產(chǎn) 大腸桿菌和酵母菌中的hGH，和自1985年以來由此生產(chǎn)的生物合成的hGH藥物已經(jīng)在數(shù)個國 家被批準(zhǔn)，并且在經(jīng)過毒理學(xué)和臨床試驗后成為商業(yè)上可獲得的。
[0003] -般而言，多肽比如hGH具有低穩(wěn)定性并且因此容易變性。而且，它們?nèi)菀妆谎?蛋白酶降解和通過腎或肝去除。因此，包含多肽作為藥物成分的蛋白質(zhì)類藥物必須被頻繁 地施用至患者以維持其血液濃度和效價(titer)。然而，因為蛋白質(zhì)類藥物通常以注射的形 式被施用，為維持活性多肽的最佳血液濃度的蛋白質(zhì)類藥物的頻繁注射引起患者的大量疼 痛。為了解決這些問題，已經(jīng)存在許多嘗試以增加血液中蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定性和維持其 血液濃度在長時間段內(nèi)為高水平以使藥物的療效最大化。
[0004] 最近，韓國專利號10-0567902(具有改進(jìn)的體內(nèi)耐久性的生理活性多肽綴合物)和 韓國專利號10-0725315(使用免疫球蛋白片段的蛋白質(zhì)復(fù)合物和制備其的方法)公開了通 過將生理活性多肽與免疫球蛋白Fc區(qū)域和非肽基聚合物連接制備的綴合物，作為蛋白質(zhì)類 藥物的長效制劑，能夠獲得蛋白質(zhì)活性的最小降低和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加二者。根據(jù)這些 方法，hGH可用作生理活性多肽以制備長效hGH綴合物。為了使包含長效hGH綴合物的藥物商 業(yè)化，防止由于在儲存和運(yùn)輸過程期間通過光、熱或添加劑中的雜質(zhì)誘導(dǎo)的降解的物理化 學(xué)改變，比如變性、聚集、吸附或水解，同時保留hGH的體內(nèi)活性是必要的。因為與hGH多肽相 比，長效hGH綴合物具有較大的尺寸和增加的分子量，因此難以使綴合物穩(wěn)定。
[0005] 凍干法(冷凍-干燥法)通常用于通過從感興趣的蛋白質(zhì)制劑中去除水以保存蛋白 質(zhì)。凍干法是通過其首先冷凍待干燥的材料并且然后通過升華去除冰或冷凍溶劑的過程。 賦形劑可包括在預(yù)凍干制劑中以維持或增強(qiáng)在凍干過程期間的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或改進(jìn)在儲 存期間凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性。然而，由于待保存的蛋白質(zhì)的性質(zhì)的不同，適用于一種蛋白質(zhì)的 凍干制劑的組合物通常不適用于其他蛋白質(zhì)。具體而言，由于其不同的化學(xué)性質(zhì)，不同蛋白 質(zhì)在儲存、凍干和重構(gòu)過程期間的不同條件下可能是滅活的。也就是說，由用于穩(wěn)定性的材 料提供的穩(wěn)定性的增強(qiáng)對于不同蛋白質(zhì)不相同，并且因此用于在儲存、凍干和重構(gòu)過程期 間提供穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑的合適的比率、濃度和種類不同，這取決于蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。 當(dāng)不同的穩(wěn)定劑組合使用時，由于其競爭或不良反應(yīng)可產(chǎn)生有害負(fù)面作用，并且由于在凍 干或儲存過程期間蛋白質(zhì)的性質(zhì)或濃度的改變，可能出現(xiàn)非期望的作用。因此，蛋白質(zhì)穩(wěn)定 性需要許多努力和防范。
[0006] 具體而言，因為具有改進(jìn)的體內(nèi)耐久性和穩(wěn)定性的長效hGH綴合物具有其中作為 生理活性肽的人生長激素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域的形式，其分子量和體積與人生長激素 的分子量和體積有很大不同。因此，需要特定組合物用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。而且，因為每種生理 活性肽hGH和免疫球蛋白Fc區(qū)域具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，所以它們應(yīng)被同時穩(wěn)定。然而， 如上所述，由于其物理化學(xué)性質(zhì)的不同，不同的肽或蛋白質(zhì)可在不同的比率和條件下逐漸 滅活。而且，當(dāng)同時使用適于每種肽或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑時，由于它們之間的競爭性相互作用 和副作用，它們可引起不良結(jié)果。此外，由于儲存的蛋白質(zhì)的性質(zhì)和濃度在其儲存期間可能 變化，穩(wěn)定劑可能展現(xiàn)非期望的副作用。因此，對于長效hGH綴合物，難以找到適于能夠同時 穩(wěn)定生理活性肽hGH和免疫球蛋白Fc區(qū)域二者的穩(wěn)定劑的組合物。另外，對于凍干制劑，應(yīng) 該以各種方式控制凍干和重構(gòu)的方法以維持在重構(gòu)時的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性。這些方法也 可根據(jù)制劑的組合物和其使用的蛋白質(zhì)變化。
[0007] 另外，當(dāng)凍干制劑包括高濃度的蛋白質(zhì)時，由于高濃度，蛋白質(zhì)可在凍干期間聚 集，并且其處理也變得困難。因此，高濃度的蛋白質(zhì)常規(guī)地已經(jīng)通過制備包括低濃度的蛋白 質(zhì)的凍干制劑并且然后重構(gòu)其具有小體積獲得，而不是在重構(gòu)高濃度蛋白質(zhì)之后進(jìn)行凍 干。然而，如果蛋白質(zhì)重構(gòu)為具有小體積，對于待直接適用于患者的制劑，不僅蛋白質(zhì)而且 包括在其中的其他成分變得過于濃縮和過于高滲。因此，存在開發(fā)使得高濃度蛋白質(zhì)保持 原樣凍干的制劑的需要。
[0008] 最近，研發(fā)了為患者方便可重復(fù)使用的蛋白質(zhì)和肽的制劑。然而，這些多用途制劑 應(yīng)包含防腐劑以防止在重復(fù)施用之后和處理之前微生物污染。包含防腐劑的多用途制劑相 對于單一用途制劑具有一些優(yōu)勢。例如，對于單一用途制劑，可能浪費大量的藥物，取決于 劑量，當(dāng)使用多用途制劑時其可降低。此外，多用途制劑可以被使用若干次而不用考慮在給 定時間段期間的微生物生長，并且因為其可以在單個容器中提供，所以包裝可以最小化，產(chǎn) 生經(jīng)濟(jì)益處。然而，防腐劑的使用可能影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。與防腐劑的使用相關(guān)的最熟知的 問題是沉淀物的形成。當(dāng)施用至身體時，蛋白質(zhì)的沉淀可降低藥物的療效并且誘導(dǎo)非期望 的免疫應(yīng)答。因此，選擇維持微生物污染而不影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力的適當(dāng)類型和濃度 的防腐劑是關(guān)鍵的。
[0009] -般而言，溶液狀態(tài)的制劑以注射器形式形成。最常用的類型是預(yù)裝注射器，并且 還頻繁使用更方便的自動注射器。另外，允許需要的劑量自動注射至患者的筆式注射器主 要用于生長激素、胰島素等。雖然這些注射設(shè)備對溶液狀態(tài)的制劑的施用是方便的，但是它 們不能用于因為低穩(wěn)定性必須被凍干的藥物。
[0010] -般而言，凍干制劑與用于溶解的溶劑分開地在強(qiáng)化玻璃小瓶中制備。在使用注 射器注射之前立即混合二者以溶解凍干制劑。最近的趨勢是從凍干小瓶(例如，強(qiáng)化玻璃小 瓶)朝向為方便患者的單一用途或多用途注射器。實例包括Vetter(德國）的雙腔式藥筒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 技術(shù)問題
[0012]在此背景下，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)努力開發(fā)了在凍干過程期間能夠保持長效人生 長激素綴合物的穩(wěn)定性并且能夠儲存其持續(xù)長時間段的凍干制劑，和能夠穩(wěn)定儲存長效人 生長激素綴合物的液體制劑。結(jié)果，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用包括緩沖液、糖醇和非離子表面活 性劑的穩(wěn)定劑時，在凍干和儲存期間長效hGH綴合物的穩(wěn)定性增加，并且因此可制備有成本 效益的和穩(wěn)定的液體制劑。而且，證實了當(dāng)長效hGH綴合物的濃度為10-58.5mg/mL時，可提 供具有優(yōu)異穩(wěn)定性的無氯化鈉的液體制劑。此外，證實了本發(fā)明的凍干制劑不僅在儲存和 運(yùn)輸期間穩(wěn)定而且當(dāng)重構(gòu)時對于皮下注射也具有適當(dāng)?shù)臐B透壓和穩(wěn)定性。另外，證實了凍 干制劑可用作多用途制劑，因為即使當(dāng)包括防腐劑時其也保持穩(wěn)定性。
[0013]技術(shù)方案
[0014] 本發(fā)明涉及提供長效人生長激素綴合物的制劑，其包括長效人生長激素(hGH)綴 合物--其中人生長激素(hGH)作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域、緩沖液、非離子 表面活性劑和糖醇。
[0015] 本發(fā)明還涉及提供長效hGH綴合物的凍干制劑，該凍干制劑包括水性溶液和無白 蛋白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括長效人生長激素綴合物一一其中hGH作為生理活 性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0016] 本發(fā)明還涉及提供長效hGH綴合物的液體制劑，該液體制劑包括藥學(xué)上有效量的 長效hGH綴合物一一其中hGH作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域一一和無白蛋白穩(wěn) 定劑，其中穩(wěn)定劑包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0017] 本發(fā)明還涉及提供用于制備該制劑的方法。
[0018] 本發(fā)明還涉及提供用于重構(gòu)凍干制劑的方法，包括添加重構(gòu)溶液至水性溶液和無 白蛋白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括長效人生長激素綴合物一一其中人生長激素作 為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括緩沖液、非離子表面活性劑 和糖醇。
[0019] 本發(fā)明還涉及提供包括長效hGH綴合物的凍干制劑的試劑盒。
[0020] 有益效果
[0021] 因為本發(fā)明的長效hGH綴合物的制劑不包括人血清白蛋白或任何潛在有害的因 素，所以不存在病毒污染的擔(dān)心。另外，該制劑允許通過連接hGH多肽至免疫球蛋白Fc區(qū)域 制備的長效hGH綴合物的高穩(wěn)定性，因此相比于野生型具有較大的分子量和增加的體內(nèi)耐 久性。具體而言，凍干制劑不僅在凍干期間而且在重構(gòu)之后提供優(yōu)異的穩(wěn)定性，并且即使當(dāng) 其包含防腐劑時也保持穩(wěn)定性，因此可用作用于多次施用的制劑。
【附圖說明】
[0022]圖1顯示用于本發(fā)明的凍干過程的溫度梯度。
[0023]圖2顯示用于本發(fā)明的凍干過程的溫度梯度，其中初級干燥被劃分為兩個階段。 [0024]圖3a顯示用于本發(fā)明的強(qiáng)化玻璃小瓶。
[0025] 圖3b顯示Vetter的雙腔式藥筒。
【具體實施方式】 [0026]最佳模式
[0027] 在一方面，本發(fā)明提供長效人生長激素綴合物的制劑，其包括長效人生長激素 (hGH)綴合物一一其中人生長激素(hGH)作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域、緩沖 液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0028] 在另一方面，本發(fā)明提供長效人生長激素綴合物的凍干制劑，其包括水性溶液和 無白蛋白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括長效hGH綴合物一一其中hGH作為生理活性肽 連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0029] 在示例性實施方式中，緩沖液是醋酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。
[0030] 在另一示例性實施方式中，緩沖液是醋酸鹽緩沖液。
[0031] 在另一示例性實施方式中，醋酸鹽是醋酸鈉，并且檸檬酸鹽是檸檬酸鈉。
[0032] 在另一示例性實施方式中，緩沖液的pH范圍是5.0至6.0。
[0033] 在另一示例性實施方式中，糖醇是甘露醇或山梨醇。
[0034] 在另一示例性實施方式中，包括的糖醇的濃度范圍是水性溶液的總體積的1 % (w/ v)至 10% (w/v) 〇
[0035] 在另一示例性實施方式中，包括的糖醇的濃度范圍是2.5% (w/v)至5% (w/v)。
[0036] 在另一示例性實施方式中，非離子表面活性劑是聚山梨醇酯80。
[0037] 在另一示例性實施方式中，非離子表面活性劑的濃度范圍是水性溶液的總體積的 0 · 001 % (w/v)至0 · 05% (w/v)。
[0038] 在另一示例性實施方式中，無白蛋白溶液進(jìn)一步包括選自糖、多元醇和氨基酸的 至少一種。
[0039] 在另一示例性實施方式中，氨基酸是組氨酸或甘氨酸。
[0040] 在另一示例性實施方式中，組氨酸的濃度范圍是1至10mM。
[00411在另一示例性實施方式中，長效hGH綴合物的濃度范圍是10至100mg/mL。
[0042] 在另一示例性實施方式中，無白蛋白溶液進(jìn)一步包括等滲劑。
[0043] 在另一示例性實施方式中，等滲劑是氯化鈉。
[0044] 在另一示例性實施方式中，氯化鈉的濃度范圍是0至200mM。
[0045] 在另一示例性實施方式中，凍干制劑的容器是小瓶、雙腔式藥筒或雙腔式注射器。
[0046] 在另一方面中，本發(fā)明提供長效hGH綴合物的液體制劑，其包括藥學(xué)上有效量的長 效hGH綴合物一一其中hGH作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和無白蛋白穩(wěn)定劑， 其中穩(wěn)定劑包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0047] 在示例性實施方式中，液體制劑不包括等滲劑。
[0048] 在另一示例性實施方式中，緩沖液是檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或組氨酸緩 沖液。
[0049] 在另一示例性實施方式中，糖醇是甘露醇或山梨醇。
[0050] 在另一示例性實施方式中，包括的糖醇的濃度范圍是2% (w/v)至4.5% (w/v)。
[0051 ]在另一示例性實施方式中，包括的糖醇的濃度是4% (w/v)。
[0052]在另一示例性實施方式中，緩沖液的pH范圍是5.0至6.0。
[0053]在另一示例性實施方式中，緩沖液的pH是5.2。
[0054]在另一示例性實施方式中，非離子表面活性劑是聚山梨醇酯80。
[0055]在另一示例性實施方式中，非離子表面活性劑的濃度范圍是制劑總體積的 Ο · 001 % (w/v)至Ο · 05% (w/v)。
[0056] 在另一示例性實施方式中，制劑中包括的長效hGH綴合物的濃度范圍是5. Omg/mL 至60.Omg/mL。
[0057] 在另一示例性實施方式中，hGH具有與野生型hGH相同的氨基酸序列。
[0058] 在另一示例性實施方式中，免疫球蛋白Fc區(qū)域是源自IgG、IgA、IgD、IgESlgi^Fc 區(qū)域。
[0059] 在另一示例性實施方式中，免疫球蛋白Fc區(qū)域的每個結(jié)構(gòu)域是具有不同來源的結(jié) 構(gòu)域的雜種(hybrid)，該不同來源源自選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
[0060] 在另一示例性實施方式中，免疫球蛋白Fc區(qū)域是由單鏈免疫球蛋白組成的二聚體 或多聚體，所述單鏈免疫球蛋白由具有相同來源的結(jié)構(gòu)域組成。
[0061 ]在另一示例性實施方式中，免疫球蛋白Fc區(qū)域是IgG4Fc區(qū)域。
[0062]在另一示例性實施方式中，免疫球蛋白Fc區(qū)域是無糖基化的（aglycosylated)人 IgG4Fc區(qū)域。
[0063]在另一示例性實施方式中，綴合物是這樣的形式一一hGH經(jīng)非肽基聚合物作為連 接體或經(jīng)遺傳重組連接至免疫球蛋白Fc。
[0064]在另一示例性實施方式中，非肽基聚合物選自生物可降解的聚合物，比如聚乙二 醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙 烯基乙醚、聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸和其組合。 [0065]在另一示例性實施方式中，非肽基聚合物是聚乙二醇。
[0066] 在另一示例性實施方式中，制劑用于垂體性侏儒癥、生長激素缺乏、普-韋二氏綜 合征或特發(fā)性身材矮小癥的治療。
[0067] 在另一方面中，本發(fā)明提供長效hGH綴合物的凍干制劑，其包括水性溶液和無白蛋 白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括長效hGH綴合物--其中hGH作為生理活性肽連接至 免疫球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括醋酸鹽緩沖液、聚山梨醇酯80和甘露醇。
[0068] 在另一方面中，本發(fā)明提供長效hGH綴合物的液體制劑，其包括藥學(xué)上有效量的長 效hGH綴合物一一其中hGH作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和包括檸檬酸鹽緩沖 液、聚山梨醇酯80和甘露醇的無白蛋白穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑不包括等滲劑。
[0069] 在另一方面中，本發(fā)明提供用于制備凍干制劑的方法，其包括凍干長效hGH綴合 物一一其中人生長激素作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和包括緩沖液、非離子 表面活性劑和糖醇的無白蛋白溶液。
[0070] 在另一方面中，本發(fā)明提供用于重構(gòu)凍干制劑的方法，其包括添加重構(gòu)溶液至水 性溶液和無白蛋白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括長效hGH綴合物--其中人生長激 素(hGH)作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括在凍干制劑中包 括的緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0071 ]在示例性實施方式中，重構(gòu)溶液是注射用水。
[0072] 在另一示例性實施方式中，重構(gòu)溶液進(jìn)一步包括防腐劑。
[0073] 在另一示例性實施方式中，防腐劑是苯甲醇、間甲酚或苯酚。
[0074] 在另一示例性實施方式中，通過該方法重構(gòu)的制劑包括的長效hGH綴合物的濃度 范圍是10至l〇〇mg/mL。
[0075] 在另一方面中，本發(fā)明提供包括長效hGH綴合物的凍干制劑的試劑盒。
[0076] 發(fā)明模式
[0077] 在一方面，本發(fā)明提供長效人生長激素綴合物的制劑，其包括長效人生長激素 (hGH)綴合物一一其中hGH作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域、緩沖液、非離子表面 活性劑和糖醇。
[0078]如本文所使用，術(shù)語"長效人生長激素(hGH)綴合物"指其中生理活性肽人生長激 素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，并且其生理學(xué)活性與野生型hGH相比具有增加的體內(nèi)耐久性 的綴合物。如本文使用的術(shù)語"長效"意思是生理學(xué)活性具有比野生型hGH更長的耐久性。如 本文所使用，術(shù)語"綴合物"指其中人生長激素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域的形式。
[0079] 具體而言，制劑可以是長效hGH綴合物的凍干制劑，其包括水性溶液和無白蛋白溶 液的凍干混合物，該水性溶液包括長效hGH綴合物--其中hGH作為生理活性肽連接至免疫 球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0080] 如本文所使用，術(shù)語"長效hGH綴合物的凍干制劑"指包括長效hGH綴合物的凍干制 劑。它包括包含通過凍干長效hGH綴合物和穩(wěn)定長效hGH綴合物的物質(zhì)比如賦形劑獲得的以 固體狀態(tài)存在的材料的制劑。在本發(fā)明中，凍干制劑包括凍干物質(zhì)本身。凍干物質(zhì)也可稱為 凍干餅（lyophilized cake)。
[0081 ] 凍干制劑通過從準(zhǔn)備制劑(preparatory formulation)升華水的凍干過程制備， 該準(zhǔn)備制劑包括長效hGH綴合物和用于穩(wěn)定長效hGH綴合物的賦形劑。在本發(fā)明中，長效hGH 綴合物的凍干制劑可包括治療有效量的長效hGH綴合物，并且治療有效量的hGH可以包含在 單一用途容器或多用途容器中，盡管不限于此。
[0082] 凍干制劑可以包含在小瓶(例如，強(qiáng)化玻璃小瓶）、雙腔式藥筒或雙腔式注射器中， 盡管不限于此。
[0083] 本發(fā)明的凍干制劑具有在凍干過程期間能夠穩(wěn)定長效hGH綴合物并且當(dāng)儲存后重 構(gòu)時能夠保持制劑的穩(wěn)定性的組合物。具體而言，即使當(dāng)包括范圍為10mg/mL至100mg/mL的 高濃度的長效hGH綴合物時，本發(fā)明的凍干制劑也能夠提供穩(wěn)定性。
[0084] 長效hGH綴合物的凍干制劑可以儲存在容器中并且當(dāng)需要施用至受試者時重構(gòu)。
[0085] 如本文所使用，術(shù)語"重構(gòu)"意思是固體狀態(tài)的凍干物質(zhì)液化以允許hGH綴合物的 施用。當(dāng)重構(gòu)時，包括在本發(fā)明的凍干制劑中的長效hGH綴合物的濃度范圍是1 mg/mL至 150mg/mL，特別地10mg/mL至120mg/mL，更特別地10mg/mL至100mg/mL，盡管不限于此。
[0086] 可通過溶解凍干物質(zhì)進(jìn)行重構(gòu)，通過添加溶劑至包含凍干物質(zhì)的小瓶或通過添加 溶劑至包含在單一用途注射器或多用途注射器中的凍干物質(zhì)溶解凍干物質(zhì)，但是不具體限 于此。
[0087] 本發(fā)明的長效hGH綴合物的凍干制劑相對于現(xiàn)存液體制劑的優(yōu)勢在于hGH綴合物 可以被穩(wěn)定儲存并且綴合物的有效濃度可以被控制。重構(gòu)之后的濃度可以與凍干過程期間 預(yù)凍干制劑的濃度相同或不同。
[0088] 本發(fā)明的凍干制劑包括水性溶液和無白蛋白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括 長效hGH綴合物，該無白蛋白溶液包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0089] 如本文所使用，術(shù)語"無白蛋白溶液"指能夠使長效hGH綴合物穩(wěn)定儲存并且在凍 干和重構(gòu)過程期間維持其穩(wěn)定性的物質(zhì)。具體而言，無白蛋白溶液指包括長效hGH綴合物和 穩(wěn)定長效hGH綴合物的賦形劑的水性溶液，并且因此提供在凍干過程期間長效hGH綴合物的 穩(wěn)定性并且使得凍干制劑的制備具有儲存穩(wěn)定性。具體而言，水性溶液包括緩沖液、糖醇和 非離子表面活性劑。此外，可包括等滲劑用于滲透壓的調(diào)整。對于蛋白質(zhì)比如長效hGH綴合 物，儲存穩(wěn)定性不僅對于確保精確施用劑量而且對于抑制針對長效hGH綴合物的抗原物質(zhì) 的潛在形成是重要的。在本發(fā)明中，術(shù)語無白蛋白溶液可與"預(yù)制劑(preformulation)"互 換使用。
[0090] 因為可通過調(diào)整添加至凍干制劑的重構(gòu)溶液的體積控制長效hGH綴合物的濃度， 所以無白蛋白溶液中的長效hGH綴合物的濃度不被具體限制。然而，本發(fā)明的制劑是有利 的，其在于包括甚至l〇-l〇〇mg/mL或更高的高濃度的長效hGH綴合物的無白蛋白溶液可被穩(wěn) 定凍干，制備的凍干制劑可以在3分鐘內(nèi)快速溶解并且在重構(gòu)的溶液中可維持長效hGH綴合 物的穩(wěn)定性。
[0091] 水性溶液不包含人血清白蛋白。因為可用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的人血清白蛋白由人血 清產(chǎn)生，所以存在被源自人的病原性病毒污染的風(fēng)險。另外，明膠或牛血清白蛋白在一些患 者中可引起疾病或可誘導(dǎo)過敏反應(yīng)。因為本發(fā)明蛋白質(zhì)的無白蛋白溶液不包含異源性蛋白 比如源自人或動物的血清白蛋白或純化明膠，所以不存在病毒感染的風(fēng)險。
[0092]如本文所使用，術(shù)語"緩沖液"指包括在本發(fā)明的無白蛋白溶液中并且用來維持凍 干或重構(gòu)過程之后制劑穩(wěn)定的pH水平從而防止制劑pH的急劇改變以使長效hGH綴合物的活 性保持穩(wěn)定的溶液。緩沖液可包括堿鹽(例如，磷酸鈉或磷酸鉀或其一元堿鹽或二元堿鹽）、 檸檬酸鹽(例如，檸檬酸鈉或檸檬酸）、醋酸鹽(例如，醋酸鈉或醋酸）、組氨酸、本領(lǐng)域已知的 任何其他藥學(xué)上可接受的pH緩沖劑、或其組合。緩沖液可以具體地是醋酸鹽緩沖液、組氨酸 緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，更具體地是醋酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，盡管不限于此。
[0093]構(gòu)成緩沖液的檸檬酸鹽或醋酸鹽的濃度具體地在5至lOOmM的范圍內(nèi)，更具體地在 10至50mM的范圍內(nèi)，盡管不限于此。緩沖液的pH具體地在4.0至7.0的范圍內(nèi)，更具體地在 5.0至6.0的范圍內(nèi)，進(jìn)一步更具體地在5.2至6.0的范圍內(nèi)，盡管不限于此。
[0094]如本文所使用，術(shù)語"糖醇"指包括在本發(fā)明的凍干制劑中并且在凍干過程期間用 來保護(hù)長效hGH綴合物的蛋白質(zhì)和在重構(gòu)之后改進(jìn)長效hGH綴合物的穩(wěn)定性的氫化的碳水 化合物。用于本發(fā)明的糖醇的濃度范圍可以是制劑總體積的1至10%(w/v)，盡管不限于此。 具體而言，糖醇的濃度可以在2.5至5% (w/v)的范圍內(nèi)。當(dāng)糖醇的濃度在該范圍內(nèi)時，使用 與預(yù)制劑相同體積的重構(gòu)溶液通過重構(gòu)獲得的重構(gòu)制劑可具有與等滲溶液相應(yīng)的滲透壓， 盡管不限于此。
[0095] 用于本發(fā)明的糖醇可以是選自甘露醇和山梨醇的至少一種，具體地甘露醇，但是 不具體限于此。包括在本發(fā)明的制劑中的糖醇比如甘露醇可用來調(diào)節(jié)滲透壓。具體而言，通 過重構(gòu)本發(fā)明的凍干制劑獲得的制劑可以是等滲的。然而，高滲或低滲制劑也適于本發(fā)明。
[0096] 如本文所使用，術(shù)語"非離子表面活性劑"指降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力以防止蛋 白質(zhì)被吸附在疏水表面上或在重構(gòu)之后蛋白質(zhì)聚集的物質(zhì)。可用于本發(fā)明的非離子表面活 性劑的具體實例包括聚山梨醇酯型非離子表面活性劑、泊洛沙姆型非離子表面活性劑和其 組合。更具體而言，可使用聚山梨醇酯型非離子表面活性劑。聚山梨醇酯型非離子表面活性 劑的實例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80,并且其中聚山 梨醇酯80是優(yōu)選的，盡管不限于此。添加高濃度的非離子表面活性劑至制劑可能是不合適 的，因為當(dāng)通過分析方法比如UV--光譜測定方法或等電聚焦（IEF)分析蛋白質(zhì)以確定蛋白 質(zhì)濃度或穩(wěn)定性時高濃度的非離子表面活性劑可能引起干擾效果，并且因此難以精確地確 定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的凍干制劑可包括具體地為0.1% (w/v)或更低，更具體地在 0.001至0.1 % (w/v)的范圍內(nèi)，和進(jìn)一步更具體地在0.001至0.05% (w/v)的范圍內(nèi)的低濃 度的非離子表面活性劑，盡管不限于此。
[0097] 具體而言，無白蛋白溶液可進(jìn)一步包括選自糖、多元醇和氨基酸的至少一種。本發(fā) 明的發(fā)明人證實的是，當(dāng)組氨酸作為氨基酸被進(jìn)一步添加時，可改進(jìn)溶解速率和實現(xiàn)重構(gòu) 而不起泡。
[0098] 可被進(jìn)一步包括以增加長效hGH綴合物的儲存穩(wěn)定性的糖的具體實例包括單糖比 如甘露糖、葡萄糖、巖藻糖和木糖，以及多糖比如乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖和葡聚糖。多元 醇的具體實例包括丙二醇、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇和其組合。氨基酸 的實例包括組氨酸或甘氨酸，盡管不限于此。組氨酸等可以以范圍從1至10mM的濃度存在于 水性溶液中，盡管不限于此。
[0099] 無白蛋白溶液可進(jìn)一步包括用于控制滲透壓的等滲劑。
[0100] 如本文所使用，術(shù)語"等滲劑"指當(dāng)重構(gòu)之后將長效hGH綴合物施用至身體時保持 適當(dāng)?shù)臐B透壓的試劑。等滲劑可具有進(jìn)一步穩(wěn)定溶液中的長效hGH綴合物的作用。例如，等 滲劑可以是水溶性無機(jī)鹽，具體地氯化鈉，盡管不限于此。用于本發(fā)明的氯化鈉的濃度具體 地在0至200mM的范圍內(nèi)，盡管不限于此。而且，取決于包括在制劑中的物質(zhì)的類型和量，可 調(diào)節(jié)包括的等滲劑的量使得包括所有成分的溶液制劑變得等滲。
[0101] 在稀釋1/2倍、1/4倍或更多之后無白蛋白溶液可被凍干。本發(fā)明的發(fā)明人證實的 是，當(dāng)稀釋1/2倍或1/4倍之后無白蛋白溶液被凍干時溶解時間可降低(測試實施例1-(5))。
[0102] 包括凍干混合物的本發(fā)明的凍干制劑展現(xiàn)優(yōu)異的溶解時間。溶解時間是凍干物質(zhì) 的重要性質(zhì)之一。如果溶解時間長，蛋白質(zhì)必須長時間暴露于濃縮的溶液中，在此期間它可 能變性。而且，因為不能施用不完全溶解產(chǎn)品，所以短的溶解時間可為患者和醫(yī)師二者均提 供方便。然而，隨著蛋白質(zhì)濃度增加，溶解時間不可避免地會增加。因此，具有短的溶解時間 的制劑的開發(fā)對高濃度凍干制劑可能是重要的問題。
[0103] 本發(fā)明的發(fā)明人證實的是，本發(fā)明的凍干制劑在短至10秒內(nèi)溶解，并且即使當(dāng)它 包括1 Omg/mL或更高的高濃度的長效hGH綴合物時長至3分鐘內(nèi)溶解。
[0104] 通過凍干具有期望濃度的目標(biāo)蛋白并且然后用一定體積的預(yù)制劑重構(gòu)目標(biāo)蛋白 可實現(xiàn)凍干產(chǎn)品期望的劑量，盡管不具體限于此。可選地，預(yù)制劑可以通過稀釋用增加的體 積被凍干并且然后使用較小體積的重構(gòu)溶液重構(gòu)。然而，如果過度稀釋預(yù)制劑，凍干周期 (具體而言，初級干燥時間）可能被延長并且因此生產(chǎn)成本可能增加。因此，本發(fā)明的制劑就 成本而言也是有利的，因為即使高濃度長效hGH綴合物可以被凍干而不用過分稀釋。
[0105]另外，本發(fā)明的凍干制劑可進(jìn)一步包括除了上述緩沖液、等滲劑、糖醇、非離子表 面活性劑和包括在重構(gòu)溶液中的防腐劑之外的本領(lǐng)域已知的其他成分或材料，只要它們不 減弱本發(fā)明的效果。
[0106]本發(fā)明的發(fā)明人制備了作為預(yù)制劑的凍干制劑，該凍干制劑包括長效hGH綴合物 和包括緩沖液、糖醇和表面活性劑的無白蛋白溶液并且評估其穩(wěn)定性和溶解速率。具體而 言，使用包括20mM pH 5.2或pH 5.6的檸檬酸鹽緩沖液、150mM氯化鈉、5%甘露醇和0.005% 聚山梨醇酯80的預(yù)凍干制劑將長效hGH綴合物凍干為具有19.5mg/mL或78. Omg/mL的濃度， 并且然后使用蒸餾水重構(gòu)。優(yōu)異的穩(wěn)定性在以上濃度下是優(yōu)異的。具體而言，在78.Omg/mL 的更高濃度下穩(wěn)定性更好。而且，在pH 5.2和5.6二者下均能實現(xiàn)良好的穩(wěn)定性(測試實施 例1-( 1))。另外，當(dāng)長效hGH綴合物溶解在包括pH 5.2或pH 5.6的20mM醋酸鹽緩沖液、150mM NaCl、5%甘露醇和0.005%聚山梨醇酯80的預(yù)凍干制劑中并且然后使用包括間甲酚、苯甲 醇或苯酚作為防腐劑的重構(gòu)溶液重構(gòu)時，穩(wěn)定性被維持。該結(jié)果證實了，通過用包括防腐劑 的重構(gòu)溶液重構(gòu)凍干物質(zhì)可制備具有保存活性的重構(gòu)的制劑。具體而言，當(dāng)使用水性醋酸 鹽溶液時，即使當(dāng)使用包括防腐劑的重構(gòu)溶液進(jìn)行重構(gòu)時，可以實現(xiàn)優(yōu)異的穩(wěn)定性而沒有 沉淀（測試實施例1_(2))。此外，證實了隨著綴合物的濃度從19.511^/1]11^增加至39.〇11^/1]11^、 至5 8.5mg /mL和至7 0.0 mg /mL，制備的凍干制劑的溶解時間增加（測試實施例1 - (3))。另外， 即使當(dāng)無白蛋白溶液不包含鹽時實現(xiàn)了優(yōu)異的溶解時間和穩(wěn)定性，并且通過增加甘露醇的 濃度溶解速率可增加。并且，當(dāng)添加組氨酸時，可能降低溶解時間而不增加甘露醇的濃度 (測試實施例1_(4))。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)稀釋預(yù)制劑以降低密度時溶解速率被進(jìn)一步改 進(jìn)(測試實施例1-(5))，并且發(fā)明人確定了凍干物質(zhì)可完全干燥的最佳干燥條件(測試實施 例1-(6))。還證明了甘露醇的存在極大地影響溶解時間（測試實施例1-(7))，并且即使對于 58.5mg/mL的高濃度長效hGH綴合物而言當(dāng)甘露醇濃度為4-4.5 %時，30秒或更短的溶解時 間可實現(xiàn)等滲滲透壓(測試實施例1 _(8))。另外，即使在將制備的凍干制劑在4°C或25°C下 儲存6個月之后，穩(wěn)定性被維持為幾乎恒定。而且，即使在重構(gòu)之后將凍干制劑在25°C下儲 存2周之后，穩(wěn)定性被維持(測試實施例1-(9))。
[0107] 具體而言，制劑可以是長效hGH綴合物的液體制劑，其包括長效hGH綴合物一一其 中hGH作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和無白蛋白穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包括緩沖 液、非離子表面活性劑和糖醇。
[0108] 長效hGH綴合物與如上所述的相同。
[0109] 如本文所使用，術(shù)語"長效hGH綴合物的液體制劑"指包括長效hGH綴合物的液體制 劑。液體制劑包括用于內(nèi)部和外部應(yīng)用二者的液體制劑。在本發(fā)明中，長效hGH綴合物的液 體制劑可包括藥學(xué)上有效量的長效hGH綴合物。一般而言，藥學(xué)上有效量的hGH對應(yīng)于單一 用途小瓶中的約1至3mg，但不限于此。
[0110] 并且，包括在本發(fā)明的液體制劑中的長效hGH綴合物的濃度范圍具體地為5.0至 60.0 mg/mL，盡管不限于此。
[0111] 長效hGH綴合物的液體制劑包括藥學(xué)上有效量的長效hGH綴合物和無白蛋白穩(wěn)定 劑。
[0112] 如本文所使用，術(shù)語"穩(wěn)定劑"指使長效hGH綴合物穩(wěn)定儲存的物質(zhì)。具體而言，穩(wěn) 定劑包括緩沖液、糖醇和非離子表面活性劑。針對蛋白質(zhì)比如長效hGH綴合物，儲存穩(wěn)定性 對于確保劑量精確性和抑制針對長效hGH綴合物的潛在抗原的形成是重要的。
[0113] 如本文所使用，術(shù)語"緩沖液"指包括在本發(fā)明的穩(wěn)定劑中并且用來維持制劑的穩(wěn) 定pH水平，從而防止pH的急劇改變以維持長效hGH綴合物的活性穩(wěn)定的溶液。以上針對凍干 制劑陳述的緩沖液的描述也應(yīng)用于此。
[0114] 緩沖液可以是檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液，具體地是檸檬酸 鹽緩沖液，盡管不限于此。構(gòu)成緩沖液的鹽的濃度具體地在5至100mM的范圍內(nèi)，更具體地在 10至50mM的范圍內(nèi)，盡管不限于此。緩沖液的pH在4.0至7.0的范圍內(nèi)，更具體地在5.0至6.0 的范圍內(nèi)，進(jìn)一步更具體地在5.2至6.0的范圍內(nèi)，最具體地為5.2,盡管不限于此。
[0115] 如本文所使用，術(shù)語"糖醇"指包括在本發(fā)明的液體制劑中并且用來改進(jìn)長效hGH 綴合物的穩(wěn)定性的氫化的碳水化合物。用于本發(fā)明的糖醇的濃度具體地在制劑總體積的1 至10% (w/v)的范圍內(nèi)，并且更具體地在2% (w/v)至4.5% (w/v)的范圍內(nèi)，進(jìn)一步更具體地 為4%(w/v)，盡管不限于此。用于本發(fā)明的糖醇可以是選自甘露醇和山梨醇的至少一種，具 體地為甘露醇，盡管不具體限于此。
[0116] 如本文所使用，術(shù)語"非離子表面活性劑"指降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力以防止蛋 白質(zhì)吸附在疏水的表面上或聚集的物質(zhì)。可用于本發(fā)明的非離子表面活性劑的具體實例與 如上所述的相同。
[0117] 本發(fā)明的制劑可以是不包含等滲劑的一種。
[0118]等滲劑與如上所述的相同。
[0119] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包括作為緩沖液的pH 5.2的水性醋酸鹽或檸檬酸酯溶液并 且包括4% (w/v)甘露醇但不包括等滲劑的制劑展現(xiàn)優(yōu)異的穩(wěn)定性。具體而言，包括作為緩 沖液的pH 5.2的水性檸檬酸鹽溶液并且包括4% (w/v)甘露醇但不包括等滲劑的制劑在 10.0 mg/mL的長效hGH綴合物濃度下展現(xiàn)最高的穩(wěn)定性。
[0120] 可進(jìn)一步包括以增加長效hGH綴合物的儲存穩(wěn)定性的糖的具體實例與如上所述的 相同。另外，本發(fā)明的液體制劑可進(jìn)一步包括除上述緩沖液、糖醇和非離子表面活性劑以外 的本領(lǐng)域已知的其他成分或材料，只要它們不減弱本發(fā)明的效果。
[0121] 具體而言，本發(fā)明的液體制劑可進(jìn)一步包括防腐劑。
[0122 ]發(fā)現(xiàn)的是，當(dāng)其包括4 %甘露醇(w/v)時，不包含等滲劑的長效hGH綴合物的制劑在 pH 5.2的緩沖液中展現(xiàn)長效hGH綴合物的最佳穩(wěn)定性。具體而言，當(dāng)使用醋酸鹽緩沖液時， 在10.0 mg/mL的長效hGH綴合物濃度下實現(xiàn)最佳穩(wěn)定性(測試實施例2)。
[0123] 本發(fā)明的制劑可用于垂體性侏儒癥、生長激素缺乏、普-韋二氏綜合征或特發(fā)性身 材矮小癥的治療并且可在重構(gòu)之后注射以治療疾病。
[0124] 在下文中，詳細(xì)描述長效hGH綴合物。
[0125] 如本文所使用，術(shù)語"人生長激素(hGH)"指刺激人生長、細(xì)胞增殖和再生的肽激 素。hGH的序列上的信息可獲得自公用數(shù)據(jù)庫比如NCBI GenBank。另外，本發(fā)明中hGH的范圍 包括具有與野生型hGH的氨基酸序列具有70 %或更高、具體地80 %或更高、更具體地90 %或 更高、甚至更具體地95%或更高、和最具體地98%或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)，只要它具有hGH活性。而且，只要其生物活性不顯著改變，通過氨基酸殘基的置換、缺 失或插入的源自野生型hGH的任何突變體可用于本發(fā)明。
[0126] 用于本發(fā)明的hGH可具有野生型hGH、其變體、其衍生物或其片段的氨基酸序列。
[0127] 如本文所使用，術(shù)語"hGH變體"指具有不同于野生型hGH的氨基酸序列的至少一種 氨基酸序列同時展示hGH活性的肽。可通過野生型hGH的一些氨基酸的置換、添加、缺失或修 飾或其組合制備HGH變體。
[0128] 如本文所使用，術(shù)語"hGH衍生物"指與野生型hGH具有至少80%氨基酸序列同源性 并且展現(xiàn)hGH活性的肽，其中氨基酸殘基的一些基團(tuán)被化學(xué)置換（例如，α-甲基化，α-羥基 化）、缺失(例如，脫氨基)或修飾(例如，Ν-甲基化）。
[0129] 如本文所使用，術(shù)語"hGH片段"指其中在hGH的N-端或C-端添加或缺失至少一種氨 基酸同時保留hGH活性的肽。添加的氨基酸是非天然存在的氨基酸的一種（例如，D-氨基 酸)。
[0130] 另外，用于本發(fā)明的hGH可以獲得自天然或重組蛋白質(zhì)。具體而言，其為通過使用 大腸桿菌作為宿主細(xì)胞制備的重組體hGH，盡管不限于此。
[0131] 如本文所使用，術(shù)語"免疫球蛋白Fc區(qū)域"指排除重鏈和輕鏈的可變區(qū)的免疫球蛋 白部分一一免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)1(CH1)和輕鏈恒定區(qū)1(CU)。免疫球蛋白Fc區(qū)域可以 是免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)2(Ch2)和重鏈恒定區(qū)3(Ch3)，并且可進(jìn)一步包括重鏈恒定區(qū)的 鉸鏈區(qū)，盡管不限于此。而且，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域可以是包括除免疫球蛋白的重鏈 和輕鏈的可變區(qū)以外的重鏈恒定區(qū)1(Ch1)和/或輕鏈恒定區(qū)1(CU)的部分或全部的擴(kuò)展Fc 區(qū)域，只要其具有與野生型蛋白質(zhì)相比基本上相同或改進(jìn)的效果。而且，免疫球蛋白Fc區(qū)域 可以是其中對應(yīng)于Ch2和/或Ch3的氨基酸序列的相當(dāng)長的部分缺失的片段。也就是說，本發(fā) 明的免疫球蛋白Fc區(qū)域可包括1) ChI結(jié)構(gòu)域、Ch2結(jié)構(gòu)域、Ch3結(jié)構(gòu)域和Ch4結(jié)構(gòu)域，2) ChI結(jié)構(gòu) 域和Ch2結(jié)構(gòu)域，3)Ch1結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域，4)Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域，5)至少一種結(jié)構(gòu)域和 免疫球蛋白鉸鏈區(qū)（或部分鉸鏈區(qū)）的組合，和6)重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域的二聚 體，盡管不限于此。
[0132] 本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域包括天然氨基酸序列和其氨基酸序列衍生物（突變 體）。氨基酸序列衍生物指通過缺失、插入、非保守或保守置換天然氨基酸序列的至少一種 氨基酸殘基或其組合具有與天然序列不同序列的序列。例如，在IgG Fc中，已知對于蛋白質(zhì) 結(jié)合重要的214至238位、297至299位、318至322位或327至331位的氨基酸殘基可以是用于 修飾的適合的目標(biāo)。
[0133] 而且，可使用其他類型的衍生物，包括以下衍生物:其中缺失能夠形成二硫鍵的區(qū) 域，天然Fc的N-端的氨基酸殘基幾乎沒有被消除，或甲硫氨酸殘基被添加在天然Fc的N-端。 此外，為了消除效應(yīng)器(effector)的功能，可以缺失補(bǔ)體-結(jié)合位點，例如C1 q-結(jié)合位點或 抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)位點。在W0 97/34631和W0 96/32478中公開了用于制備免疫 球蛋白Fc區(qū)域的這種序列衍生物的技術(shù)。
[0134] 不改變整體蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)和肽中的氨基酸的置換在本領(lǐng)域是已知的 (H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最經(jīng)常發(fā)生的交 換是兩個方向的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Se;r、Ala/Gly、Ala/Th;r、Se;r/Asn、Ala/ Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly〇 在一些情況下，F(xiàn)c區(qū)域可以通過磷酸化、硫酸化、丙烯?；?、糖基化、甲基化、法呢?；⒁阴?化、酰胺化等修飾。上述Fc衍生物展現(xiàn)與本發(fā)明的Fc區(qū)域相同的生物活性，并且它們具有針 對熱、pH等的增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
[0135] 另外，這些Fc區(qū)域可以獲得自與人或包括奶牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠和 豚鼠的其他動物分離的天然蛋白質(zhì)，或可以是獲得自轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞或微生物或其衍生物的 重組體。這里，由天然免疫球蛋白獲得Fc區(qū)域的方法可包括從人體或動物體分離整個免疫 球蛋白，并且用蛋白酶處理它們。當(dāng)木瓜蛋白酶用于消化免疫球蛋白時，它們被分裂成Fab 和Fc區(qū)域，并且當(dāng)使用胃蛋白酶時，免疫球蛋白被分裂成pF'c和F(ab) 2。這些片段可以通過 尺寸排阻色譜分離以分離Fc或pF^。具體而言，源自人的Fc區(qū)域是獲得自微生物的重組免 疫球蛋白Fc區(qū)域。
[0136] 另外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域可以是天然糖鏈的形式、比天然形式長的糖鏈、 比天然形式短的糖鏈或去糖基化形式。通過使用本領(lǐng)域常用方法一一包括化學(xué)方法、酶方 法和使用微生物的基因工程化方法一一可進(jìn)行免疫球蛋白Fc糖鏈的延長或去除。糖鏈從免 疫球蛋白Fc區(qū)域的去除導(dǎo)致其與第一補(bǔ)體組分C1的Clq的結(jié)合親和力急劇降低，并且因此 抗體依賴性細(xì)胞毒作用或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性降低或去除，并且可以避免體內(nèi)不需要的免 疫應(yīng)答的發(fā)生。在這點上，去糖基化或無糖基化免疫球蛋白Fc區(qū)域作為用于本發(fā)明的對象 的藥物載體是更優(yōu)選的形式。
[0137] 另外，免疫球蛋白Fc區(qū)域可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的一種，或通過其組 合或雜種制備的那些。具體而目，其源自IgG或IgM，其為人血液中最豐富蛋白質(zhì)，和最具體 地源自IgG，已知其增強(qiáng)配體-結(jié)合蛋白質(zhì)的半衰期。免疫球蛋白Fc可通過用某些蛋白酶處 理天然IgG或通過使用遺傳重組技術(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生。具體而言，免疫球蛋白Fc是在大腸桿菌 中產(chǎn)生的重組人免疫球蛋白Fc。
[0138] 同時，如本文所使用，術(shù)語"組合"指當(dāng)形成二聚體或多聚體時編碼相同來源的單 鏈免疫球蛋白Fc區(qū)域的多肽和不同來源的單鏈多肽之間的綴合。也就是說，二聚體或多聚 體可由選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的兩個或更多個片段形成。
[0139] 如本文所使用，術(shù)語"雜種"指在單鏈免疫球蛋白Fc區(qū)域中存在對應(yīng)于不同來源的 免疫球蛋白Fc片段的至少兩個序列。在本發(fā)明中，可以使用各種類型的雜種。也就是說，結(jié) 構(gòu)域的雜種可以由選自 IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的Ch1、Ch2、Ch3和Ch4的一 個至四個結(jié)構(gòu)域組成，并且可包括鉸鏈區(qū)。
[0140]同時，IgG也可被分為子類，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，并且其組合或雜種在本發(fā)明 中也是可能的，具體地IgG2和IgG4子類，和最具體地缺少效應(yīng)器功能一一比如依賴補(bǔ)體的 細(xì)胞毒性--的IgG4的Fc區(qū)域。換句話說，本發(fā)明中綴合物的最優(yōu)選的免疫球蛋白Fc區(qū)域 是源自人IgG4的非糖基化的Fc區(qū)域。源自人的Fc區(qū)域優(yōu)選的是非人源的Fc區(qū)域，其可充當(dāng) 人體中的抗原并引起非期望的免疫應(yīng)答比如針對該抗原的新抗體的產(chǎn)生。
[0141 ]本發(fā)明的長效hGH綴合物可以通過組合hGH和免疫球蛋白Fc區(qū)域制備，該hGH通過 任何方法由天然或重組形式制備，該免疫球蛋白Fc區(qū)域通過用某些蛋白酶處理野生型IgG 制備或通過使用重組技術(shù)由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生。
[0142] 作為用于該目的的組合方法，綴合物可通過使用非肽基聚合物交聯(lián)hGH和免疫球 蛋白Fc區(qū)域制備，或可作為融合蛋白產(chǎn)生，其中hGH和免疫球蛋白Fc區(qū)域使用重組技術(shù)連 接。也就是說，綴合物可以以其中hGH和免疫球蛋白Fc經(jīng)非肽基連接體連接的形式，或以hGH 和免疫球蛋白Fc的融合蛋白的形式產(chǎn)生。融合蛋白包括其中hGH和免疫球蛋白Fc經(jīng)肽基連 接體組合的形式，盡管不限于此。
[0143] 如本文所使用，術(shù)語"非肽基聚合物"指其中兩個或更多個重復(fù)單元被組合并且重 復(fù)單元通過除肽鍵以外的任何共價鍵連接至彼此的生物相容性聚合物。在本發(fā)明中，術(shù)語 非肽基聚合物可與術(shù)語非肽基連接體互換使用。
[0144] 用于交聯(lián)的非肽基聚合物可選自生物可降解的聚合物，其包括聚乙二醇、聚丙二 醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚 乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸和其組合。具體而言，可 使用聚乙二醇(PEG)，盡管不限于此。另外，本領(lǐng)域已知的其衍生物和可通過本領(lǐng)域已知的 方法容易制備的衍生物可包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0145] 為了制備本發(fā)明的長效hGH綴合物，參考文獻(xiàn)比如韓國專利號0725315在本發(fā)明中 作為引用的參考文獻(xiàn)公開。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過查閱參考文獻(xiàn)可生產(chǎn)本發(fā)明的長效hGH綴 合物，盡管不限于此。
[0146] 在另一方面中，本發(fā)明提供長效hGH綴合物的凍干制劑，其包括水性溶液和無白蛋 白溶液的凍干混合物，該水性溶液包括長效hGH綴合物--其中hGH作為生理活性肽連接至 免疫球蛋白Fc區(qū)域，該無白蛋白溶液包括醋酸鹽緩沖液、聚山梨醇酯80和甘露醇。
[0147] hGH、免疫球蛋白Fc區(qū)域、長效hGH綴合物、無白蛋白溶液、凍干和凍干制劑與以上 描述的相同。
[0148]在另一方面中，本發(fā)明提供長效hGH綴合物的液體制劑，其包括藥學(xué)上有效量的長 效hGH綴合物一一其中hGH作為生理活性肽連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和包括檸檬酸鹽緩沖 液、聚山梨醇酯80和甘露醇的無白蛋白穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑不包括等滲劑。
[0149 ] hGH、免疫球蛋白Fc區(qū)域、長效hGH綴合物、無白蛋白穩(wěn)定劑和液體制劑與以上描述 的相同。
[0150] 在另一方面中，本發(fā)明提供用于制備凍干制劑的方法，包括凍干長效hGH綴合物和 包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇的無白蛋白溶液。
[0151] 長效hGH綴合物、緩沖液、非離子表面活性劑、糖醇、無白蛋白溶液、凍干和凍干制 劑與以上描述的相同。
[0152] 在另一方面中，本發(fā)明提供用于重構(gòu)凍干制劑的方法，其包括添加重構(gòu)溶液至凍 干制劑。
[0153] 凍干制劑和重構(gòu)與以上描述的相同。
[0154] 如本文所使用，術(shù)語"重構(gòu)溶液"指添加至固體狀態(tài)的凍干物質(zhì)以重構(gòu)該凍干物質(zhì) 的溶液。重構(gòu)溶液可以是注射用水，例如無菌蒸餾水，但是不具體限于此。
[0155] 而且，重構(gòu)溶液可進(jìn)一步包括防腐劑。
[0156] 如本文所使用，術(shù)語"防腐劑"指大幅度降低制劑中的細(xì)菌或真菌污染的物質(zhì)。尤 其，其包括在制劑中以促進(jìn)生產(chǎn)用于多次給藥的制劑。防腐劑的實例包括十八烷基二甲基 芐基氯化銨、六甲氯銨、苯扎氯銨(具有長烷基鏈的烷基芐基二甲基氯化銨的混合物)和芐 索氯銨。其他類型的防腐劑包括:芳族醇類比如苯酚、丁醇和苯甲醇;烷基對羥基苯甲酸酯 比如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯;鄰苯二酚；間苯二酚;環(huán)己醇;3-戊醇;和間甲 酚，但不限于此。本發(fā)明的液體制劑中的防腐劑具體地為苯甲醇、間甲酚或苯酚，更具體地 為苯甲醇，盡管不限于此。防腐劑的濃度具體地在0.001至0.9% (w/v)的范圍內(nèi)，更具體地 在0.1至0.9% (w/v)的范圍內(nèi)，盡管不限于此。
[0157] 如上所述重構(gòu)的本發(fā)明的制劑可包含的長效hGH綴合物的濃度范圍是10至1 OOmg/ mL，盡管不限于此。
[0158] 在另一方面中，本發(fā)明提供包括凍干制劑和重構(gòu)溶液的試劑盒。
[0159] 凍干制劑與如上所述的相同。
[0160] 試劑盒包括凍干制劑和重構(gòu)溶液，并且可進(jìn)一步包括由至少一種適于重構(gòu)的其他 成分組成的組合物、溶液或裝置。
[0161] 在下文中，將參考實施例更詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，這些實施例僅用于說明性目 的，并且本發(fā)明不旨在被這些實施例限制。
[0162] 制備實施例:長效人生長激素(hGH)綴合物的制備
[0163] ALD-PEG-ALD--其為在兩個端處具有醛基的分子量約3.4kDa的聚乙二醇--與 人生長激素(hGH，分子量:22kDa)綴合，并且然后連接至源自人IgG4的無糖基化Fc區(qū)域(約 50kDa)的N-端。通過此，制備和純化最終產(chǎn)物hGH-PEG-Fc綴合物(在下文中，稱為"長效hGH 綴合物"），其為本發(fā)明的代表性長效hGH綴合物。
[0164] 測試實施例1:長效hGH綴合物的凍干制劑的評估
[0165] (1)分析長效hGH綴合物的凍干制劑根據(jù)濃度和緩沖液的穩(wěn)定性
[0166] 在制備包括表1中描述的濃度的長效hGH綴合物的凍干制劑之后，在重構(gòu)之后分析 穩(wěn)定性。還分析了緩沖液和pH對長效hGH綴合物的穩(wěn)定性的作用。
[0167] 如表1中所描述，使用包括緩沖液、氯化鈉(NaCl)、甘露醇和聚山梨醇酯80的預(yù)凍 干制劑將長效hGH綴合物凍干為具有給定濃度，其然后使用蒸餾水重構(gòu)。凍干由初級干燥和 次級干燥步驟組成。凍干的溫度梯度被設(shè)定為冷凍，隨后是初級干燥(4°C)和次級干燥(20 °C)，如在圖1中所顯示。通過用與凍干前的制劑相同體積的蒸餾水溶解凍干制劑進(jìn)行重構(gòu)。 將重構(gòu)的液體制劑在40°C下儲存4周，并且通過離子交換色譜（IE-HPLC)分析穩(wěn)定性。結(jié)果 顯示在表2中。在表2中，IE-HPLC( % )指示在給定時間長效hGH綴合物的純度。
[0168] 表1
[0171]表2
[0172]
[0173 ]由表2可見，在40 °C下儲存4周之后，長效hGH綴合物的液體制劑顯示根據(jù)濃度的穩(wěn) 定性沒有差別。因此，證實了甚至可向高濃度的長效hGH提供穩(wěn)定性。而且，證實了當(dāng)緩沖液 和pH改變時穩(wěn)定性被維持(比較實施例2和3)。
[0174] (2)分析長效人生長激素(hGH)綴合物的凍干制劑根據(jù)防腐劑的穩(wěn)定性和溶解度
[0175] 使用測試實施例1 -(1)的實施例2的制劑（20mM檸檬酸鈉，pH 5.2，150mM氯化鈉， 5%甘露醇，0.005%聚山梨醇酯80)和實施例3的制劑（20mM醋酸鈉，pH 5.6，150mM氯化鈉， 5%甘露醇，0.005%聚山梨醇酯80)和由實施例3的制劑(20mM醋酸鈉，pH 5.6，4%甘露醇， 0.005%聚山梨醇酯80)制備的等滲制劑，將長效hGH綴合物混合為表3中描述的68.25mg/mL 和58.5mg/mL的濃度，其然后被凍干。在使用包括表3中描述的防腐劑的重構(gòu)溶液重構(gòu)之后， 測量溶解時間和穩(wěn)定性。用肉眼比較產(chǎn)品狀態(tài)。用與測試實施例1_(1)描述的相同方式進(jìn)行 凍干和重構(gòu)。重構(gòu)的液體制劑在25°C下儲存4周并且然后通過離子交換色譜（IE-HPLC)和目 測評估穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在表4中。在表4中，IE-HPLC( % )指示在給定時間長效hGH綴合物的 純度。
[0176] 表3
[0179]
[0180] 由表4可見，在實施例6和7中長效hGH綴合物的穩(wěn)定性比在實施例4和5中維持的 好。然而，由實施例6-9的結(jié)果可見，根據(jù)防腐劑的種類，長效hGH綴合物的穩(wěn)定性沒有差別。 但是，當(dāng)使用包含間甲酚的重構(gòu)溶液時，所得的液體制劑在溶解期間是有薄霧的。
[0181 ] (3)分析長效hGH綴合物的凍干制劑根據(jù)綴合物濃度的溶解度
[0182] 制備包括不同濃度的長效hGH綴合物的凍干制劑并且評估當(dāng)重構(gòu)時其產(chǎn)品狀態(tài)和 溶解度。使用測試實施例1 -(1)的實施例1的制劑(20mM檸檬酸鈉，pH 5.2，150mM氯化鈉，5% 甘露醇，0.005%聚山梨醇酯80)，將長效hGH綴合物混合為表5中描述的不同濃度，其然后被 凍干。在使用蒸餾水重構(gòu)之后，測量溶解時間。以與測試實施例1_(1)描述的相同方式進(jìn)行 凍干和重構(gòu)。用肉眼比較產(chǎn)品狀態(tài)。使用設(shè)定為60°和30rpm的自動振動器進(jìn)行重構(gòu)。在表6 中給出了完全溶解需要的時間。
[0183] 表5
[0184]
[0185]
[0188] 雖然無論濃度如何凍干物質(zhì)的產(chǎn)品狀態(tài)是穩(wěn)定的，但是在較高的濃度下可觀察到 更剛性的餅。由表6可見，溶解時間隨著濃度增加。
[0189] (4)分析長效人生長激素(hGH)綴合物的凍干制劑根據(jù)穩(wěn)定劑的穩(wěn)定性和溶解度
[0190] 使用不同的穩(wěn)定劑制備長效hGH綴合物的凍干制劑并且評估其溶解時間、溶解狀 態(tài)和長效hGH綴合物穩(wěn)定性。用表7中描述的組合物制備預(yù)制劑，其然后被用于冷凍干燥 78. Omg/mL的長效hGH綴合物。在使用蒸餾水重構(gòu)之后測量溶解時間。以與測試實施例1-( 1) 中描述的相同方式進(jìn)行凍干和重構(gòu)。用肉眼比較產(chǎn)品狀態(tài)。使用設(shè)定為60°和30rpm的自動 振動器進(jìn)行重構(gòu)。在表8中給出了完全溶解需要的時間。
[0191] 而且，重構(gòu)的液體制劑在40°C下儲存4周之后，通過離子交換色譜（IE-HPLC)評估 穩(wěn)定性。在表9中，IE-HPLC( % )指示在給定時間長效hGH綴合物相對于初始值的殘留率。
[0192] 表7
[0194]
[0199]由表8可見，當(dāng)甘露醇的濃度高時獲得高的溶解速率。還證實了添加5mM組氨酸導(dǎo) 致改進(jìn)的溶解速率。實施例15和17的制劑顯示在重構(gòu)期間相比于實施例19的制劑嚴(yán)重起 泡。由表9可見，每種制劑溶解之后的穩(wěn)定性相似。但是，當(dāng)包括氯化鈉作為穩(wěn)定劑時，長效 hGH綴合物的穩(wěn)定性略高。
[0200] (5)分析凍干制劑根據(jù)凍干物質(zhì)的密度和長效hGH綴合物的濃度的溶解度
[0201 ]使用測試實施例1 -(4)的實施例19的制劑(20mM檸檬酸鈉，pH 5.2，5 % (w/v)甘露 醇，5mM組氨酸，0.005% (w/v)聚山梨醇酯80)，分析凍干物質(zhì)根據(jù)長效hGH綴合物濃度的溶 解度。用表10中描述的組合物制備預(yù)制劑并且然后凍干。在凍干期間，使用蒸餾水將預(yù)制劑 稀釋1倍、1 / 2倍和1 / 4倍。凍干由初級干燥和次級干燥步驟組成。凍干的溫度梯度顯不在圖1 中。通過用與凍干前的制劑相同體積的蒸餾水溶解凍干制劑進(jìn)行重構(gòu)。使用設(shè)定為60°和 30rpm的自動振動器進(jìn)行重構(gòu)。在表11中給出了完全溶解需要的時間。
[0202]表1〇
[0206]由表11可見，證實了當(dāng)通過稀釋降低凍干物質(zhì)的密度時溶解速率被改進(jìn)。而且，當(dāng) 制劑(20mM檸檬酸鈉，5 %甘露醇，5mM組氨酸，0.005 %聚山梨醇酯80)中長效hGH綴合物的濃 度由39. Omg/mL增加至48.8mg/mL和至58.5mg/mL時溶解速率同樣增加。
[0207] (6)設(shè)定凍干過程的溫度梯度
[0208]通過使初級干燥時間由10小時增加至20小時和將初級干燥步驟(4°C)的溫度細(xì)分 為-20°C和_5°C的兩個階段(圖2)改變測試實施例1-(1)中的溫度梯度（圖1)。在前者溫度梯 度中，出現(xiàn)凍干物質(zhì)的破壞是因為3-5 %的水保留在凍干物質(zhì)中。當(dāng)溫度梯度變化為如圖2 所顯示時，即使具有較大的體積(~5mL)可實現(xiàn)完全的凍干。
[0209] (7)分析考慮滲透壓的長效hGH綴合物的凍干制劑的溶解度
[0210] 使用測試實施例1-(1)和⑵中的制劑（20mM醋酸鈉，pH 5.6，5 % (w/v)甘露醇， 150mM氯化鈉，0.005% (w/v)聚山梨醇酯80)，考慮滲透壓設(shè)定穩(wěn)定劑的濃度并且分析凍干 物質(zhì)的溶解度。如表12中所描述制備預(yù)制劑并且然后凍干。
[0211] 在凍干期間，使用蒸餾水將預(yù)制劑稀釋1/2倍。凍干由初級干燥和次級干燥步驟組 成。凍干的溫度梯度被設(shè)定為如圖2所顯示。使用包含0.9%苯甲醇的蒸餾水進(jìn)行重構(gòu)，其具 有與稀釋前的制劑相同的體積。
[0212] 使用設(shè)定為60°和30rpm的自動振動器進(jìn)行重構(gòu)。表13顯示了重構(gòu)之后完全溶解所 需要的時間和測量的滲透壓。
[0213] 表12
[0216]表13
[0218] 由表13可見，當(dāng)去除甘露醇時溶解時間大大增加。當(dāng)甘露醇的濃度為5%(w/v)時， 滲透壓高于280-320m0sm/Kg的等滲范圍。
[0219] (8)分析長效hGH綴合物的凍干制劑根據(jù)甘露醇濃度的溶解度和滲透壓
[0220] 使用測試實施例1-(7)的制劑(20mM醋酸鈉，pH 5.6,5%(w/v)甘露醇，0.005%(w/ v)聚山梨醇酯80)，分析凍干物質(zhì)根據(jù)甘露醇濃度的溶解度和滲透壓。
[0221] 如表14中描述制備預(yù)制劑并且然后凍干。凍干和重構(gòu)的方法和條件與測試實施例 1_(7)中描述的相同。表15顯示了重構(gòu)之后完全溶解所需要的時間和測量的滲透壓。
[0222] 表14
[0223]
[0224]
[0227] 由表15可見，當(dāng)甘露醇的濃度在4至4.5 %的范圍內(nèi)時觀察到等滲滲透壓。雖然隨 著甘露醇濃度越低，溶解時間越長，但是與包括氯化鈉時相比，該變化較小。
[0228] (9)分析在4 °C和25 °C下長效hGH綴合物的凍干制劑的儲存穩(wěn)定性
[0229] 使用測試實施例1-(8)的制劑(20mM醋酸鈉，pH 5.6,4%(w/v)甘露醇，0.005%(w/ v)聚山梨醇酯80 )，分析在4 °C和25 °C下凍干物質(zhì)的儲存穩(wěn)定性。在4 °C和25 °C下儲存凍干制 劑6個月以后，重構(gòu)之后通過離子交換色譜（IE-HPLC)評估穩(wěn)定性。初始重構(gòu)溶液在25°C下 以液體狀態(tài)儲存4周，并且然后在重構(gòu)之后通過離子交換色譜（IE-HPLC)評估。在表16中， IE-HPLC( % )指示在給定時間凍干物質(zhì)中長效hGH綴合物的純度。在表17中，IE-HPLC( % )指 示重構(gòu)的液體制劑中長效hGH綴合物的純度。
[0230]表16
[0234] 由表16可見，凍干物質(zhì)的穩(wěn)定性甚至在4°C和25°C下儲存6個月之后被維持。而且， 重構(gòu)制劑的穩(wěn)定性甚至在25°C儲存2周之后被維持。
[0235] 測試實施例2:評估長效hGH綴合物的液體制劑
[0236] (1)分析長效hGH綴合物的液體制劑根據(jù)pH、緩沖液、等滲劑和糖醇濃度的穩(wěn)定性
[0237] 測試了緩沖液、等滲劑和糖醇濃度對長效hGH綴合物的穩(wěn)定性的影響。將如表18中 描述制備的制劑在25°C下儲存0-4周并且然后通過離子交換色譜和尺寸排阻色譜分析。在 表19和20中，IE-HPLC( % )和SE-HPLC( % )分別指示長效hGH綴合物相對于初始值的殘留率 (面積％ /初始面積％ )。
[0238] 表18

[0245] 此_即^：結(jié)果顯示，長效1^!1綴合物在2〇11^醋酸鈉(？!15.2)的條件下顯示良好的穩(wěn) 定性。并且，SE-HPLC結(jié)果顯示長效hGH綴合物在20mM醋酸鈉(pH 5.2)和4%(w/v)甘露醇的 條件下最穩(wěn)定。
[0246] (2)分析長效hGH綴合物的液體制劑根據(jù)緩沖液的穩(wěn)定性
[0247] 測試作為穩(wěn)定劑的緩沖液對長效hGH綴合物的穩(wěn)定性的影響。使用測試實施例2-(1)的制劑(pH 5.2，4%甘露醇，0.005%聚山梨醇酯80)，如表21中描述制備制劑。在25°C下 儲存0-4周之后，通過IE-HPLC和SE-HPLC分析穩(wěn)定性。在表22和23中，IE-HPLC(%)和SE-HPLC( % )分別指示長效hGH綴合物相對于初始值的殘留率(面積％/初始面積％ )。

[0255] IE-HPLC結(jié)果顯示，在檸檬酸鈉的條件下10.0 mg/mL長效hGH綴合物最穩(wěn)定。并且， SE-HPLC結(jié)果顯示，10.0mg/mL長效hGH綴合物在組氨酸和檸檬酸鈉的組中顯示良好的穩(wěn)定 性。
[0256] IE-HPLC結(jié)果顯示，58.5mg/mL長效hGH綴合物在醋酸鈉和檸檬酸鈉的組中顯示良 好的穩(wěn)定性。并且，SE-HPLC結(jié)果顯示，58.5mg/mL長效hGH綴合物在組氨酸和檸檬酸鈉的組 中顯示良好的穩(wěn)定性。
[0257] 當(dāng)長效hGH綴合物的濃度在1 Omg/mL至58.5mg/mL的范圍內(nèi)時，在20mM檸檬酸鈉(pH 5.2)、4%甘露醇和0.005%聚山梨醇酯80的條件下觀察到最佳穩(wěn)定性。
[0258]對本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，可以做出各種改變和變化而不背離本發(fā)明的 范圍和精神。因此，應(yīng)理解，以上實施方式不是限制性的，而是在所有方面說明性的。本發(fā)明 的范圍由所附權(quán)利要求書而不是由在其之前的說明書限定，并且因此所有變化和改變落在 權(quán)利要求書的界限內(nèi)，或這種界限的等價物旨在包含在權(quán)利要求書中。
【主權(quán)項】
1. 一種長效人生長激素(hGH)綴合物的制劑，其包括長效人生長激素(hGH)綴合物一一 其中生理活性人生長激素(hGH)連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域、緩沖液、非離子表面活性劑和糖 醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述制劑是長效人生長 激素綴合物的凍干制劑，所述凍干制劑包括水性溶液和無白蛋白溶液的凍干混合物，所述 水性溶液包括長效人生長激素(hGH)綴合物--其中生理活性hGH連接至免疫球蛋白Fc區(qū) 域，所述無白蛋白溶液包括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述緩沖液是醋酸鹽緩 沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述緩沖液是醋酸鹽緩 沖液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述醋酸鹽是醋酸鈉，并 且所述檸檬酸鹽是檸檬酸鈉。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述緩沖液的pH在5.0至 6.0的范圍內(nèi)。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述糖醇是甘露醇或山 梨醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中包括的所述糖醇的濃度 范圍是所述水性溶液的總體積的1 % (w/v)至10 % (w/v)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中包括的所述糖醇的濃度 范圍是2.5% (w/v)至5% (w/v)。10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述非離子表面活性劑 是聚山梨醇酯80。11. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述非離子表面活性劑 的濃度范圍是所述水性溶液的總體積的0.001 % (w/v)至0.05% (w/v)。12. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述無白蛋白溶液進(jìn)一 步包括選自糖、多元醇和氨基酸的至少一種。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述氨基酸是組氨酸 或甘氨酸。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述組氨酸的濃度在1 至10mM的范圍內(nèi)。15. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述長效hGH綴合物的 濃度在10至l〇〇mg/mL的范圍內(nèi)。16. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述無白蛋白溶液進(jìn)一 步包括等滲劑。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述等滲劑是氯化鈉。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述氯化鈉的濃度在0 至200mM的范圍內(nèi)。19. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述凍干制劑的容器是 小瓶、雙腔式藥筒或雙腔式注射器。20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述制劑是長效人生長 激素綴合物的液體制劑，所述液體制劑包括藥學(xué)上有效量的長效人生長激素綴合物一一其 中生理活性人生長激素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和無白蛋白穩(wěn)定劑，其中所述穩(wěn)定劑包 括緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述制劑不包括等滲 劑。22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述緩沖液是檸檬酸 鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液。23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述糖醇是甘露醇或 山梨醇。24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中包括的所述糖醇的濃 度范圍是2% (w/v)至4.5% (w/v)。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中包括的所述糖醇的濃 度是 4%(w/v)。26. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述緩沖液的pH在5.0 至6.0的范圍內(nèi)。27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述緩沖液的pH是 5.2〇28. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述非離子表面活性 劑是聚山梨醇酯80。29. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述非離子表面活性 劑的濃度范圍是所述制劑總體積的〇. 001 % (w/v)至0.05% (w/v)。30. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述制劑中包括的所 述長效hGH綴合物的濃度在5. Omg/mL至60.0 mg/mL的范圍內(nèi)。31. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述人生長激素 (hGH)具有與野生型hGH相同的氨基酸序列。32. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述免疫球蛋白 Fc區(qū)域是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc區(qū)域。33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū) 域的每個結(jié)構(gòu)域是具有不同來源的結(jié)構(gòu)域的雜種，所述不同來源源自選自IgG、IgA、IgD、 IgE和IgM的免疫球蛋白。34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū) 域是由單鏈免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體，所述單鏈免疫球蛋白由具有相同來源的結(jié) 構(gòu)域組成。35. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū) 域是IgG4 Fc區(qū)域。36. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū) 域是無糖基化的人IgG4 Fc區(qū)域。37. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述綴合物是這 樣的形式，所述人生長激素經(jīng)作為連接體的非肽基聚合物或經(jīng)遺傳重組連接至免疫球蛋白 Fc〇38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述非肽基聚合物選 自生物可降解的聚合物比如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多 元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質(zhì) 聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸和其組合。39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述非肽基聚合物是 聚乙二醇。40. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或20所述的長效人生長激素綴合物的制劑，其中所述制劑用于治 療垂體性侏儒癥、生長激素缺乏、普-韋二氏綜合征或特發(fā)性身材矮小癥。41. 一種長效人生長激素綴合物的凍干制劑，其包括長效人生長激素綴合物一一其中 生理活性人生長激素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域一一和無白蛋白溶液的凍干混合物，所述無 白蛋白溶液包括醋酸鹽緩沖液、聚山梨醇酯80和甘露醇。42. -種長效人生長激素綴合物的液體制劑，其包括藥學(xué)上有效量的長效人生長激素 (hGH)綴合物一一其中生理活性人生長激素(hGH)連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和包括檸檬酸 鹽緩沖液、聚山梨醇酯80和甘露醇的無白蛋白穩(wěn)定劑，其中所述穩(wěn)定劑不包括等滲劑。43. 制備根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍干制劑的方法，其包括凍干長效人生長激素綴合 物一一其中生理活性人生長激素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，和包括緩沖液、非離子表面活 性劑和糖醇的無白蛋白溶液。44. 用于重構(gòu)根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍干制劑的方法，其包括添加重構(gòu)溶液至水性溶液 和無白蛋白溶液的凍干混合物，所述水性溶液包括長效人生長激素(hGH)綴合物一一其中 生理活性人生長激素(hGH)連接至免疫球蛋白Fc區(qū)域，所述無白蛋白溶液包括包含在根據(jù) 權(quán)利要求2所述的凍干制劑中的緩沖液、非離子表面活性劑和糖醇。45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述重構(gòu)溶液是注射用水。46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述重構(gòu)溶液進(jìn)一步包括防腐劑。47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述防腐劑是苯甲醇、間甲酚或苯酚。48. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中通過所述方法重構(gòu)的制劑包括的長效hGH綴合物 的濃度范圍是10至l〇〇mg/mL。49. 一種包括根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍干制劑和重構(gòu)溶液的試劑盒。
【文檔編號】A61K38/27GK105848645SQ201480064028
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年9月26日
【發(fā)明人】林和平, 金賢煜, 林昊澤, 金尚允, 林亨奎, 裴城敏, 權(quán)世昌
【申請人】韓美藥品株式會社