用于在具有升高水平的tlr4配體和其它生物標(biāo)記的患者中診斷和治療病癥的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明總體上涉及用于診斷和治療與Toll?樣受體4 (TLR4)配體和其它生物標(biāo)記的水平升高有關(guān)的病癥的方法和組合物。本發(fā)明還涉及使用干擾或者以其它方式拮抗TLR4信號傳導(dǎo)的藥劑，包括中和性抗?TLR4抗體，治療與TLR4配體和其它生物標(biāo)記的水平升高有關(guān)的病癥、延遲其進展或者以其它方式改善其癥狀的方法。
【專利說明】用于在具有升高水平的TLR4配體和其它生物標(biāo)巧的患者中診 斷和治療病癥的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請 本申請要求2013年10月22日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /894，042的權(quán)益。該申請的內(nèi)容 通過引用W其整體結(jié)合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總體上設(shè)及用于診斷和治療與升高水平的Ton-樣受體4 (TLR4)配體和其 它生物標(biāo)記有關(guān)的病癥的方法和組合物。本發(fā)明還設(shè)及使用干擾或者W其它方式括抗化R- 4信號傳導(dǎo)的藥劑，包括中和性抗-TLR4抗體，在具有升高水平的化R4配體和其它生物標(biāo)記 的患者中治療病癥、延遲其進展或者W其它方式改善其癥狀的方法。
[0003] 發(fā)明背景 To 11受體，首先在果蛹(化OSO如)中發(fā)現(xiàn)，是具有在蛋白的胞外部分中的富含亮氨 酸重復(fù)序列化RR)和一個或者兩個富含半脫氨酸結(jié)構(gòu)域的I型跨膜蛋白。果蛹Toll受體的哺 乳動物同源物被稱為叮oU-樣受體"（TLR)。化R通過識別微生物顆粒和針對運些微生物顆 粒源激活免疫細(xì)胞而在先天性免疫中起作用。在人中，已經(jīng)鑒定了 11種Toll-樣受體，TLR 1-11，并通過它們的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與IL-1受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的同源性和通過胞外富含亮氨酸 重復(fù)序列的存在進行表征。不同類型的化R被不同類型的微生物顆粒激活。例如，TLR4主要 被脂多糖化PS)激活。TLR4已經(jīng)顯示與輔助蛋白骨髓樣分化蛋白-2 (MD-2)有關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 該蛋白與化R4直接相互作用，和MD-2具有能夠翻譯后修飾化R4W及促進其運輸至細(xì)胞表面 的能力。TLR4和MD-2在細(xì)胞表面上形成復(fù)合物。
[0004] 化R4牽設(shè)到許多病癥;并且正在開發(fā)抗-TLR4劑作為治療劑。并非所有的患者對目 前的護理療法標(biāo)準(zhǔn)有反應(yīng)。因此，對用于鑒定可能為特定治療（例如用特定抗-TLR4療法治 療)的候選者的患者的組合物和方法存在需要。
[0005] 發(fā)明簡述 本文提供的組合物和方法可用于鑒定或者W其它方式精修患有病癥的患者群，其中所 述患者具有升高水平的一種或多種化R4配體或者其它化R4-相關(guān)生物標(biāo)記。運些患者被鑒 定為用干擾或者W其它方式括抗化R4信號傳導(dǎo)和中和化R4的至少一種生物活性(單獨或者 在輔助蛋白MD-2的情況下作為TLR4/MD-2復(fù)合物）的藥劑(例如，抗體或者其它基于多膚的 治療劑、基于膚的治療劑、小分子抑制劑、基于核酸的治療劑和其衍生物)治療的合適的候 選者。
[0006] 在患有或者疑似患有病癥的一些患者中，流體和其它生物樣品包含升高水平的 化R4配體和其它生物標(biāo)記。運些化R4配體和其它生物標(biāo)記刺激細(xì)胞產(chǎn)生促-炎性細(xì)胞因子。 然而，本文表明，使用干擾、抑制、降低或者W其它方式括抗化R4信號傳導(dǎo)的抗-化R4括抗 劑，例如中和性抗-TLR4抗體或者其它基于多膚的治療劑、基于膚的治療劑、小分子抑制劑、 基于核酸的治療劑和其衍生物，在來自對一種或多種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記顯示升 高表達水平的患者的樣品中阻斷該刺激。因此，所述組合物和方法可通過給予對一種或多 種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記顯示升高表達水平的患者抗-化R4括抗劑，例如中和性抗- 化R4抗體或者其它基于多膚的治療劑、基于膚的治療劑、小分子抑制劑、基于核酸的治療劑 和其衍生物，用于治療病癥、延遲其進展或者W其它方式改善其癥狀，所述病癥依賴于TLR4 信號傳導(dǎo)、異常(例如升高）的化R4配體表達和/或活性、異常的促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或 其組合，受其驅(qū)動，與其有關(guān)或者W其它方式受其影響?？赡苁怯每?TLR4括抗劑，例如中和 性抗-TLR4抗體例如本文描述的那些治療的合適的候選者的患者，通過檢測一種或多種 化R4配體或者其它生物標(biāo)記的水平來鑒定。在一些實施方案中，不具有升高水平的一種或 多種化R4配體或者其它生物標(biāo)記的患者可仍用抗-TLR4括抗劑，包括本文描述的任何中和 性抗-TLR4抗體或者其它基于多膚的治療劑、基于膚的治療劑、小分子抑制劑、基于核酸的 治療劑和其衍生物治療。
[0007]用于鑒定可能候選者的運些方法中的合適化R4配體和其它生物標(biāo)記包括抗-瓜氨 酸化蛋白抗體(ACPA)、瓜氨酸化蛋白、在免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化蛋白（例如在與IgG蛋白 (cFb-IC)或者I巧蛋白的免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化纖維蛋白原（cFb))、HMGBl、S100A8/A9、 生腫蛋白C、LPS、熱休克蛋白化SP)、纖連蛋白、透明質(zhì)燒、Der P2、呼吸合胞病毒F (RSV) F 蛋白、表面活性蛋白A、柯薩奇病毒B4 (CSV B4)、CXCL10、抵抗素、胎球蛋白A、飽和脂肪酸 (SFA)、二聚糖、修飾的低密度脂蛋白（mLDL)、高級糖化末端產(chǎn)物(AGE)和其組合。在一些實 施方案中，瓜氨酸化蛋白是瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化纖維蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、 瓜氨酸化組蛋白（例如瓜氨酸化組蛋白2b)、瓜氨酸化締醇酶或者瓜氨酸化趨化因子(例如 瓜氨酸化CX化10)。在一些實施方案中，檢測化R4配體和/或其它生物標(biāo)記的組合，例如檢測 至少兩種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，檢測至少Ξ種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，檢測 至少四種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，檢測至少五種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，檢測 至少六種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，檢測至少八種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，檢測 至少九種化R4配體和/或其它生物標(biāo)記，或者檢測至少十種或更多種化R4配體和/或其它生 物標(biāo)記。
[000引在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9。在一些實施方案 中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是cFb-IC。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記 是ACPA。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是HMGB1。在一些實施方案中，TLR4 配體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9和HMGB1的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其 它生物標(biāo)記是S100A8/A9和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記 是S100A8/A9和ACPA的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是ACPA和cFb- IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是ACPA和HMGB1的組合。在一些 實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是麗GB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中， 化R4配體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9、ACPA和HMGB1的組合。在一些實施方案中，TLR4配 體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9、ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或 者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9、cFb-IC和HMGB1的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其 它生物標(biāo)記是ACPA、HMGB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo) 記是 S100A8/A9、c訊-IC、ACPA和HMGB1 的組合。
[0009]在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是對暴露于抗-TLR4劑例如抗- 化R4 mAb例如NI-0101的單核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的單 核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的單核細(xì)胞反應(yīng)的 預(yù)測物是ACPA。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的單核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是HMGB1。在一 些實施方案中，對抗-TLR4治療的單核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是C訊-1C。
[0010] 在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是對暴露于抗-TLR4劑例如抗- 化R4 mAb例如NI-0101的成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的 成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是cFb-IC。
[0011] 在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是對暴露于抗-TLR4劑例如抗- 化R4 mAb例如NI-0101的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物。在一些實施方案中，單核細(xì) 胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的 預(yù)測物是cFb-IC。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9。 在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是HMGB1。在一些實施方案中，單 核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì) 胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9和ACPA的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和 成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維 細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng) 的預(yù)測物是HMGB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測 物是S100A8/A9、ACPA和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù) 測物是S100A8/A9、ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng) 的預(yù)測物是S100A8/A9、cFb-IC和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞 反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA、HMGB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞 反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9、c訊-IC、ACPA和HMGB1的組合。
[0012] 具有升高水平的一種或多種運些標(biāo)記的患者被鑒定為用本文描述的一種或多種 抗-TLR4括抗劑例如中和性抗-化R4抗體治療的合適的候選者。如本文所用，詞語巧高的表 達水平"是指高于在來自未患有或者未疑似患有病癥的患者的樣品或者其它對照樣品中 化R4配體或者其它生物標(biāo)記的基線表達水平的表達水平。通過非限制性實例的方式，幾種 化R4配體的基線水平顯示在圖2A-2E中。例如，ACPA表達的基線水平小于約2000叫/ml,例 如小于約1500叫/ml、小于約1000 Ul/m巧日/或小于約750 Ul/ml (圖2A、表1)dC即-1C的基 線水平，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)化ISA測量時（用50 μL孔的山g/mL的小鼠抗-人瓜氨酸化纖維蛋白原 (C即）抗體3D1 (抗-C即，克隆3D1, # AM32004PU-N, AcrisVPBS包被板；添加50 pL的 1/10 稀釋的（在PBS中）來自RA患者的滑液樣品；檢測與抗-人IgG-Fc-HRP的結(jié)合（SIGMA，# A0170)，1/10000在PBS中，在所有孔中5化L/孔，接著50 μL孔的TMB)，為例如1.5或者更小 的0D 450ηΜ讀數(shù)，例如1.0或者更小的0D 450ηΜ讀數(shù)，和/或0.5或者更小的0D 450ηΜ讀數(shù) (圖2Β、表1KHMGB1的基線水平小于約100 ng/ml，例如小于約75 ng/ml、小于約50 ng/ml 和/或小于約25 ng/ml (圖2C、表1)dS100A8/A9的基線水平小于約500 ng/ml，例如小于約 400 ng/ml、小于約300 ng/ml、小于約200 ng/ml和/或小于約100 ng/ml (圖2D、表1)。生腫 蛋白C的基線水平小于約100 ng/ml，例如小于約75 ng/ml、小于約50 ng/ml、小于約25 ng/ ml和/或小于約10 ng/ml (圖2C、表1)。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記的 升高的表達水平是顯著的升高水平。
[0013] 與各標(biāo)記的截止水平相比，根據(jù)標(biāo)記的檢出水平，具有一定檢測水平的一種或多 種運些標(biāo)記的患者被鑒定為"有反應(yīng)者"或者"無反應(yīng)者"。通過非限制性實例的方式，幾種 化R4配體的截止水平顯示在實施例5中。例如，對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評分，具有 大于或者等于387 ng/ml的檢測水平的S100A8/A9的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法例如中 和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評分 具有小于387 ng/ml的檢測水平的S100A8/A9的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無 反應(yīng)者"。對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評分具有大于或者等于1000 Ul/ml的檢測水平 的ACPA的患者被鑒定為對用抗-化R4療法例如中和性抗-化R4抗體例如NI-0101治療的''有 反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評分具有小于1000 Ul/ml的檢測水平的ACPA 的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng)者"。對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評 分具有大于或者等于50 ng/ml的檢測水平的HMGB1的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法例如 中和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評 分具有小于50 ng/ml的檢測水平的HMGB1的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng) 者"。對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評分具有大于或者等于1.2的檢測的cFb-IC 0D 450nm讀數(shù)的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法例如中和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療的 "有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的單核細(xì)胞反應(yīng)評分具有小于1.2的檢測的cFb-IC 0D 450nm讀數(shù)的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng)者"。
[0014] 對于滑液樣品中的成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分具有大于或者等于1.2的檢測的cFb-IC 0D 450皿讀數(shù)的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法例如中和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療 的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分具有小于1.2的檢測的cFb-IC 0D 45化m讀數(shù)的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng)者"。對于滑液樣品中的成纖維 細(xì)胞反應(yīng)評分具有大于或者等于1000 Ul/ml的檢測水平的ACPA的患者被鑒定為對用抗- 化R4療法例如中和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的成 纖維細(xì)胞反應(yīng)評分具有小于1000 Ul/ml的檢測水平的ACPA的患者被鑒定為對用抗-TLR4療 法治療的"無反應(yīng)者"。
[0015] 對于滑液樣品中組合的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分(cMFRS)具有大于或者等 于0.55的檢測的cFb-IC 0D 450nm讀數(shù)的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法例如中和性抗- 化R4抗體例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的cMFRS具有小于0.55的檢測 的cFb-IC 0D 450皿讀數(shù)的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng)者"。對于滑液樣 品中的cMFRS具有大于或者等于330 Ul/ml的檢測水平的ACPA的患者被鑒定為對用抗-TLR4 療法例如中和性抗-化R4抗體例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的cMFRS 具有小于330 Ul/ml的檢測水平的ACPA的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng) 者"。對于滑液樣品中的cMFRS具有大于或者等于45 ng/ml的檢測水平的HMGB1的患者被鑒 定為對用抗-TLR4療法例如中和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑 液樣品中的cMFRS具有小于45 ng/ml的檢測水平的HMGB1的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法 治療的"無反應(yīng)者"。對于滑液樣品中的cMFRS具有大于或者等于387 ng/ml的檢測水平的 S1008A8/A9的患者被鑒定為對用抗-化R4療法例如中和性抗-化R4抗體例如NI-0101治療的 "有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的cMFRS具有小于387 ng/ml的檢測水平的S1008A8/A9的患 者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng)者"。
[0016] 對于滑液樣品中組合的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分(cMFRS)具有大于或者等 于0.55的檢測的cFb-IC 0D 450nm讀數(shù)和對于滑液樣品中的cMFRS具有大于或者等于387 ng/ml的檢測水平的S1008A8/A9的患者被鑒定為對用抗-TLR4療法例如中和性抗-TLR4抗體 例如NI-0101治療的"有反應(yīng)者"，而對于滑液樣品中的cMFRS具有小于0.55的檢測的cFb-IC 0D 450皿讀數(shù)和對于滑液樣品中的cMFRS具有小于387 ng/ml的檢測水平的S1008A8/A9的 患者被鑒定為對用抗-TLR4療法治療的"無反應(yīng)者"。
[0017] 所述樣品為例如血液或者血液組分，例如血清、血漿。在一些實施方案中，樣品為 尿。在一些實施方案中，所述流體為滑液。在一些實施方案中，所述流體為支氣管肺泡液。在 一些實施方案中，所述流體為腦脊液。在一些實施方案中，所述流體為唾液。
[0018] 除了檢測一種或多種運些化R4配體和/或生物標(biāo)記的水平之外，用抗-TLR4括抗劑 治療的合適的患者還可通過評價許多其它生物和臨床參數(shù)的任一種來鑒定，所述參數(shù)將改 進用于鑒定或者W其它方式精修患者群的生物標(biāo)記的靈敏度和特異性?；蛘?，運些其它生 物和臨床參數(shù)可單獨用作鑒定為用抗-TLR4括抗劑或者其它合適的療法治療的合適候選者 的患者的工具。通過非限制性實例的方式，運些生物和臨床參數(shù)包括W下任一種:類風(fēng)濕因 子水平、C反應(yīng)蛋白（CRP)水平、血液細(xì)胞計數(shù)、血細(xì)胞亞群中TLR4受體的存在、TLR4多態(tài)性、 人白細(xì)胞抗原化LA)多態(tài)性、膚基精氨酸脫亞氨酶(PAD)酶和PAD酶多態(tài)性、Fc 丫受體Ila (化丫 Ila)多態(tài)性、MD-2水平、可溶性CD14水平、基線患者人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)（例如體重指數(shù) (BMI)、性別、年齡等）和/或患者病史(例如診斷時的失能評價表(DAS 28)、治療開始時的 DAS 28、疾病持續(xù)時間、疾病發(fā)生時的年齡、對基于DAS28的先前治療的反應(yīng)、美國風(fēng)濕病學(xué) 會(ACR)和/或歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會化ULAR)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)等）。
[0019] 可用于本發(fā)明的組合物和方法的病癥包括其中化R4表達和/或活性異常例如升高 W及化R4/MD-2活化異常和/或TLR4配體活性異常(例如，促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激異常 例如IL-6、TN化和/或IL-8產(chǎn)生的刺激異常）的任何病癥。例如，一些化R4配體被認(rèn)為與多種 病癥有關(guān)。通過非限制性實例的方式，LPS已知與病癥例如脈毒癥、急性肺損傷和/或RA有 關(guān);生腫蛋白C已知與病癥例如關(guān)節(jié)炎、肝臟和/或屯、臟缺血性再灌注有關(guān);HMGB1已知與病 癥例如RA、骨關(guān)節(jié)炎（0A)、缺血/再灌注、1型糖尿病、膜島移植、狼瘡和/或脈毒癥有關(guān)； S100A8/A9已知與病癥例如RA、0A、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、糖尿病、移植排斥、狼瘡、動 脈粥樣硬化、脈毒癥和/或癌癥有關(guān);瓜氨酸化纖維蛋白原已知與病癥例如RA和動脈粥樣硬 化有關(guān);ACPA已知與病癥例如RA、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、斯耶格倫氏綜合 征、阿爾茨海默病和/或動脈粥樣硬化有關(guān)。
[0020] 通過非限制性實例的方式，本文提供的方法和組合物合適用于診斷和/或治療病 癥例如自身免疫和/或炎性病癥。通過非限制性實例的方式，合適的自身免疫和/或炎性病 癥包括與化R4信號傳導(dǎo)異常有關(guān)的自身免疫和/或炎性病癥、與化R4配體表達和/或活性異 常例如升高有關(guān)的自身免疫和/或炎性病癥、與促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生異常有關(guān)的自身免疫 和/或炎性病癥和其組合。
[0021] 在一些實施方案中，所述病癥是關(guān)節(jié)炎病況，通過非限制性實例的方式，包括RA、 骨關(guān)節(jié)炎(0A)、銀屑病關(guān)節(jié)炎或者青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)。在一些實施方案中，病癥是 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。在一些實施方案中，病癥是癌癥。在一些實施方案中，病癥是炎性腸 病(IBD)。在一些實施方案中，病癥是動脈粥樣硬化。在一些實施方案中，病癥與缺血性再灌 注(通過非限制性實例的方式，包括肝臟和/或屯、臟缺血/再灌注)有關(guān)。在一些實施方案中， 病癥是脈毒癥。在一些實施方案中，病癥是急性肺損傷。在一些實施方案中，病癥是1型糖尿 病。在一些實施方案中，病癥與膜島移植有關(guān)。在一些實施方案中，病癥是狼瘡。在一些實施 方案中，病癥與移植排斥或者與細(xì)胞、組織和/或器官移植物有關(guān)的其它病癥有關(guān)。在一些 實施方案中，病癥是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。在一些實施方案中，病癥是斯耶格倫氏綜合征。 在一些實施方案中，病癥是阿爾茨海默病。
[0022] 一旦患者被鑒定為具有升高水平的一種或多種化R4配體或者其它生物標(biāo)記，則他 們用抗化R4括抗劑治療。例如，抗化R4括抗劑是中和性抗化R4抗體或者其免疫活性(例如抗 原結(jié)合)片段。合適的中和性抗化R4抗體包括本文描述的任何抗-TLR4抗體和具有對Fc受體 (FcR)增加的親和力和/或通過與FcR相互作用對細(xì)胞表面結(jié)合增加的親合力的其它抗體。
[0023] 在一些實施方案中，結(jié)合化R4的抗體或者其免疫活性片段包含可變重鏈互補決定 區(qū)1 (VH CDR1)，其包含與氨基酸序列GGYSWH (沈Q ID NO: 1)具有至少90%、92%、95%、96〇/〇、 97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列；VH CDR2區(qū)，其包含與氨基酸序列 YI肌SGYTDFNPSLKT (沈Q ID NO: 2)具有至少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多同 一性的氨基酸序列；和VH CDR3區(qū)，其包含與氨基酸序列KDPSDAFPY (SEQ ID NO: 3)具有至 少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列；可變輕鏈互補決定區(qū)1 (VL CDR1)區(qū)，其包含與氨基酸序列RASQSISDHLH (沈Q ID NO: 4)具有至少90%、92%、95〇/〇、 96%、97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列；化〔032區(qū)，其包含與氨基酸序列￥45齡15 (沈Q ID NO: 5)具有至少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列； 和化CDR3區(qū)，其包含與氨基酸序列QQ細(xì)SF化T (SEQ ID NO: 6)具有至少90%、92%、95〇/〇、 96%、97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，結(jié)合化34的抗體或者 其免疫活性片段還包含與重鏈可變氨基酸序列 QV 化犯 SGP 化 VKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPSLKTRITIS 畑 TSKN QF化KLSSVTAVDTAVYYCA服DPSDAFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7)具有至少90%、92%、95〇/〇、 9 6 %、9 7 %、9 8 %、9 9 %或者更多同一性的氨基酸序列和與輕鏈可變氨基酸序列 EIVLTQSPDFQSVTP邸KVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSP化LIKYASHAISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINS LEAEDAATYYCQQGHSF化TFGGGTKVEIK (沈Q ID NO: 8)具有至少90%、92%、95%、96%、97%、98〇/〇、 99%或者更多同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，結(jié)合化R4的抗體或者其免疫活性片 段還包含與重鏈氨基酸序列 MGWSWIFLF 化 SGTAGVHCQV 化犯 SGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYS WHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPSLKTRmS 畑 TSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSDAFPYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG化V邸YF陽PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY化SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP化LGGPSV化FPPKP邸TLMISRT陽VTCVVV DVS肥DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS化TVL冊DWLNGKEYKCKVSSKAFPAPKKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQV化TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF化YSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM肥ALHN肌TQK化化SPGK (沈Q ID NO: 9)具有至少90%、92%、95%、96%、97%、98〇/〇、 99%或者更多同一性的氨基酸序列和與輕鏈氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEIVLTQSPDFQ SVTPKEKVUTCRASQSISDHLHWYQQKPDQSP化LIKYASHAISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC QQGHSF化TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW化LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS犯SVTE QDSKDSTY化SSTLTLSKADYEK服VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (沈Q ID NO: 10)具有至少90〇/〇、 92%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列。
[0024] 在一些實施方案中，抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段是或者源自2005年6月14日 提交和作為W0 20071110678公布的PCT/IB2005/004206中描述的抗體，其內(nèi)容通過引用W 其整體結(jié)合到本文中。
[0025] 在一些實施方案中，抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段是或者源自2008年5月14日 提交和作為W0 2009/101479公布的PCT申請PCT/IB2008/003978中描述的抗體，其內(nèi)容通過 引用W其整體結(jié)合到本文中。
[0026] 在一些實施方案中，抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段是或者源自稱為HTA125的 抗-TLR4抗體，其描述于例如aiimazu等，J. E邱.Med.，val. 189:1777-1782 (1999); Nijhuis 等，Clin Diag. Lab. Immunol., val. 10(4): 558-63 (2003);和 Pivarcsi 等， Inti. Immunopharm.，vol. 15(6):721-730 (2003)，其各自的內(nèi)容通過引用W其整體結(jié) 合到本文中。
[0027] 在一些實施方案中，抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段是或者源自結(jié)構(gòu)域抗體，例 如2009年5月15日提交和作為W0 2009/13848公布的PCT申請PCT/EP2009/055926中描述的 結(jié)合TLR4的結(jié)構(gòu)域抗體，其內(nèi)容通過引用W其整體結(jié)合到本文中。
[0028] 在一些實施方案中，抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段是或者源自識別細(xì)胞表面 上表達的人和/或雜猴kynomolgus monkey) TLR4/MD-2受體的單克隆抗體。所述抗體能夠 阻斷，例如中和，受體活化，和隨后胞內(nèi)信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的TLR4配體，例如WS或者本文描述的 任何其它化R4配體。本發(fā)明的抗體包括結(jié)合人和雜猴化R4/MD-2受體復(fù)合物和還不依賴于 MD-2的存在而結(jié)合TLR4的抗體。
[0029] 在一些實施方案中，抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段干擾或者W其它方式括抗 經(jīng)過細(xì)胞表面上表達的人和/或雜猴化R4/MD-2受體的信號傳導(dǎo)，例如通過阻斷受體活化和 隨后LPS誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。運些實施方案的示例性的單克隆抗體包括：1A1、1A6、1B12、 1C7、1C10、1C12、1D10、1E11、1E11 N103D、1G12、1E11.C1、1E11.C2、1E11.C3、1E11.C4、 1E11.C5、1E11.C6、1E11.E1、1E11.E2、1E11.E3、1E11.E4、1E11.E5、1E11.CW1、1E11.C2E3、 1E11.C2E4和lEll.C沈5。
[0030] 運些抗體具有不同的特異性。一些抗體顯示對人和雜猴化R4兩者和/或人和雜猴 化R4/MD-2受體復(fù)合物兩者的特異性，和它們已經(jīng)表明抑制受體活化和隨后通過LPS的胞內(nèi) 信號傳導(dǎo)。例如，1C12、化1U1E11 N103D、化11.C1、化11.C2、1E11.C3JE11.C4JE11.C5、 化11.〔6、化11.〔261、1611.〔262、化11.〔263、化11.〔264和化11.(：沈5不依賴于人或者雜猴 MD-2的存在而結(jié)合人和雜猴TLR4兩者。1A1、1A6、1B12、1C7、1C10、1D10和1G12不依賴于雜猴 MD-2的存在僅結(jié)合雜猴化34?；?1.61、1611.62、1611.63、化11.6巧日化11.65不依賴于人 MD-2的存在僅結(jié)合人TLR4。
[0031] 本發(fā)明的人源化抗體包含具有本文所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明的人 源化抗體包含具有本文所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0032] Ξ 個重鏈 CDR 包括與選自 G(F/Y)PI(R/G/W)(Y/F/G)GYS (SEQ ID NO: 14)、 GYSITGGYS (SEQ ID NO: 15)、GFPIRYGYS (SEQ ID NO: 16)、GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 17)、GYPIRHGYS (SEQ ID NO: 18)、GFPIGQGYS (SEQ ID NO: 19)、GYPIWGGYS (SEQ ID NO: 20)和GYPIGGGYS (SEQ ID NO: 21)的可變重鏈互補決定區(qū)1 (VH CDRl，在本文亦稱為 CDRHl)氨基酸序列；IHYSGYT (SEQ ID NO: 22)的可變重鏈互補決定區(qū)2 (VH CDR2,在本文 亦稱為CD畑2)氨基酸序列；和選自A服DSG(N/Q/D/E)XiX2PY. (SEQ ID NO: 23)其中Xi和X2 各自獨立地是任何疏水氨基酸、ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 24)、A服DSGRIXPY (SEQ ID NO: 25)、A服DSGKWLPY (沈Q ID NO: 26)、A服DS細(xì)LMPY (SEQ ID NO: 27)、A服DSGHNYPY (SEQ ID NO: 28)、ARKDSGKNFPY (SEQ ID NO: 29)、ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 30)、 A服DSGHNLPY (沈Q ID NO: 31)、A服DSGDYFPY (沈Q ID NO: 32)和A服DSGRYWPY (沈Q ID NO: 33)的可變重鏈互補決定區(qū)3 (VH CDR3,在本文亦稱為CDRH3)氨基酸序列具有至少 90%、92%、95%、97%、98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列。Ξ個輕鏈CDR包括與QSISDH (SEQ ID NO: 34)的可變輕鏈互補決定區(qū)1 (VL CDR1，在本文亦稱為CD化1)氨基酸序列； YAS (SEQ ID NO: 35)的可變輕鏈互補決定區(qū)2 (VL CDR2,在本文亦稱為CD化2)氨基酸序 列；和選自QQG(Y/N)(D/E)(F/Y)PXT (SEQ ID NO: 36)其中X是任何疏水氨基酸、QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)、QQGNDFPVT (沈Q ID NO: 37)、QQGYDEPFT (沈Q ID NO: 38)、QQGYDFPFT (沈Q ID NO: 39)、QQGYDYPFT (沈Q ID NO: 40)和QQGYEFPFT (沈Q ID NO: 41)的可變輕 鏈互補決定區(qū)3 (VL CDR3,在本文亦稱為CD化3)氨基酸序列具有至少90%、92%、95%、97%、 98%、99%或者更多同一性的氨基酸序列。所述抗體結(jié)合人和雜猴化R4/MD-2復(fù)合物，當(dāng)未與 人和雜猴MD-2復(fù)合時結(jié)合人和雜猴化R4，結(jié)合人化R4/MD-2復(fù)合物，當(dāng)未與人MD-2復(fù)合時結(jié) 合人TLR4，結(jié)合雜猴TLR4/MD-2復(fù)合物或者當(dāng)未與雜猴MD-2復(fù)合時結(jié)合雜猴TLR4。
[0033] 本發(fā)明的抗-TLR4抗體還包括包含與本文所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、 95%、97%、98%、99%或者更多同一性的重鏈可變氨基酸序列和/或與本文所示的氨基酸序列 具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或者更多同一性的輕鏈可變氨基酸的抗體。
[0034] 在一些實施方案中，本文描述的抗-TLR4抗體還包括在例如化區(qū)或者其FcR結(jié)合片 段內(nèi)的至少一個特定的氨基酸置換(例如具有在IgG恒定結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸置換的多膚）， W致與未改變的抗體相比，修飾的抗體引起抗原-依賴性效應(yīng)器功能的改變，同時保留與抗 原結(jié)合。例如，改變的抗體引起阻止促炎性介質(zhì)釋放。在優(yōu)選的實施方案中，改變的抗體是 人的，并具有IgGl同種型。
[0035] 本發(fā)明的抗-TLR4抗體包括改變的抗體，其中抗體的化部分的恒定區(qū)中的至少一 個氨基酸殘基被修飾。例如，F(xiàn)c部分的CH2結(jié)構(gòu)域中至少一個氨基酸被替換為不同的殘基， 即氨基酸置換。在本文所述的改變的抗體中，與未改變的抗體相比，對應(yīng)于殘基325、326和 328的一個或多個氨基酸殘基被置換為不同的殘基。在丫重鏈中殘基的編號為抓索引的編 號（參見 Edelman, G.M.等，1969; Kabat, E, A.，T.T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman,和C. Foeller., 1991 . Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 片反.U.S. Dept, of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH 化blication n. 91-3242)。在優(yōu)選的實施方案中，丫重鏈恒定區(qū)的抓氨基酸位置325被置 換為絲氨酸，和丫重鏈恒定區(qū)的抓氨基酸位置328被置換為苯丙氨酸，W致改變的人IgGl抗 體的丫重鏈恒定區(qū)的抓位置325至328包含氨基酸序列SKAF (SEQ ID NO: 137)。
[0036] 本發(fā)明還提供通過鑒定合適于用中和性抗-TLR4劑例如中和性抗-TLR4抗體的療 法的患者和給予其中需要所述治療或者預(yù)防的受試者藥劑例如本發(fā)明的單克隆抗體(例如 鼠單克隆或者人源化單克隆抗體），治療或者預(yù)防與化R4/MD-2活化異常、TLR4信號傳導(dǎo)異 常、TLR4配體表達和/或活性異常例如升高、促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生異常和其組合有關(guān)的病 理的方法，或者減輕與所述病理有關(guān)的癥狀的方法。待治療的受試者是例如人。單克隆抗體 W足W治療、預(yù)防或者減輕與所述病理有關(guān)的癥狀的量給予。足W治療或者預(yù)防受試者的 所述病理的單克隆抗體的量為，例如足W減少化R4配體-誘導(dǎo)的一種或多種促-炎性細(xì)胞因 子(例如IL-6、化-8、TNFa)的產(chǎn)生的量。如本文所用，術(shù)語"減少"是指在存在本發(fā)明的單克 隆抗體的情況下降低促-炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中所述產(chǎn)生是例如，局部促-炎性細(xì)胞因 子產(chǎn)生(例如在發(fā)炎組織的部位處)或者系統(tǒng)性促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。當(dāng)在存在本發(fā)明的 單克隆抗體的情況下促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平比促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的對照水平（即 在不存在單克隆抗體的情況下促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平)低大于或者等于5%、10%、20%、 25〇/〇、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或者100%時，化34配體-誘導(dǎo)的促-炎性 細(xì)胞因子的產(chǎn)生降低。測量促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，促-炎性 細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平可使用多種測定法測量，包括例如本文描述的方法W及市售可得的 ELISA試劑盒。
[0037] 本發(fā)明的藥物組合物可包括本發(fā)明的抗化R4抗體和載體。運些藥物組合物可包括 在試劑盒中，例如診斷試劑盒。
[0038] 本發(fā)明還提供用于實施本文提供的任何方法的試劑盒。例如，在一些實施方案中， 試劑盒包括對一種或多種TLR4配體或者其它生物標(biāo)記有特異性的檢測試劑和用于檢測所 述檢測試劑的工具。
[0039] 附圖簡述 圖1是描述通過免疫復(fù)合的瓜氨酸化纖維蛋白原（cFb-IC)的人血液-來源的巨隧細(xì)胞 化抓M)的活化，和依賴于化R4的作用機制和部分貢獻來自Fc 丫受體的一系列圖。如子圖A中 所示，cFb不誘導(dǎo)通過皿DM的促炎性細(xì)胞因子TNFa的分泌，而當(dāng)作為與兔抗-纖維蛋白原多 克隆抗體(肺aFb pAb)的免疫復(fù)合物呈現(xiàn)時，cFb-IC激活。在存在皿DM、沁b-IC和抗-人 化R4 mAb (例如NI-0101)的情況下，活化可能性被顯著阻斷。在存在皿DM、c即-1C和抗-人 化RII mAb的情況下，觀察到部分減少。當(dāng)加入兩種mAb至皿DM和cFb-IC時，對抗-人化R4 mAb (例如NI-0101)未觀察到另外的抑制。MgGl與皿DM和C即-1C一起用作同種型對照。如 子圖B中所示，當(dāng)免疫復(fù)合物的來源是來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清的純化的人IgG時， 運些刺激和阻斷的結(jié)果得到重復(fù)。進行Student's t檢驗。* p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001, ns:不顯著。
[0040] 圖2是描述在健康受試者(N滑液)或者具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者(RA滑液）的滑 液中包含的抗瓜氨酸化蛋白抗體和不同的TLR4配體的水平的實例的一系列圖。子圖4，抗- 瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA);子圖B，包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物（cFb-IC);子圖 C，高遷移率族蛋白B1 (HMGB1);子圖D，S100A8/A9;子圖E，生腫蛋白C。
[0041] 圖3是描述不同的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RASF)對自RA患者分離的滑液成纖維細(xì)胞 的活化概況的實例和刺激對化R4的依賴性的一系列圖。子圖A描述的確刺激RA滑液成纖維 細(xì)胞W產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子化-6的RASF (來自患者#1; RASF 1)。該刺激顯著被抗-人化R4 mAb (例如，NI-0101)的存在阻斷。相比之下，子圖B描述不能自RA滑液成纖維細(xì)胞刺激IL- 6產(chǎn)生的RASF樣品（來自患者#2; RASF 2)和抗-TLR4 mAb在該情況下沒有作用。MgGl用作 同種型對照。進行Student's t檢驗。*** p<0.001, ns:不顯著。
[0042] 圖4是描述不同的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RASF)對自RA患者分離的人單核細(xì)胞的活 化概況的實例和刺激對TLR4的依賴性的一系列圖。子圖A、B和C描述RASF樣品（來自患者#3; RASF 3)分別刺激來自RA患者分離的人單核細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子IL-6JL8和TN化的產(chǎn)生 的能力。該刺激通過抗-人化R4mAb (例如，NI-0101)的存在而顯著阻斷。相比之下，子圖 D、E和F描述不能刺激來自RA患者分離的人單核細(xì)胞的IL-6JL8和TN化的產(chǎn)生的RASF樣品 (來自患者#4; RASF 4)和抗-TLR4 mAb在該情況下沒有作用。hlgGl用作同種型對照。進行 Sl:udent's t檢驗。* p<0.05,林 p<0.01,林* p<0.001, ns:不顯著。
[0043] 圖5是描述類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液（RASF)中的抗-瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)或者 化R4配體的表達水平和細(xì)胞刺激受抗-人化R4 mAb抑制的能力之間的相關(guān)性的一系列圖。 TLR4配體包括包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物（沁b-IC)、高遷移率族蛋白B1 (HMGB1KS100A8/A9和生腫蛋白C。細(xì)胞類型包括RA患者滑液成纖維細(xì)胞(A)和RA患者單核 細(xì)胞(B)。進行Student's t檢驗。* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, ns:不顯著。
[0044] 圖6A和6B是在單核細(xì)胞（圖6A)或者成纖維細(xì)胞（圖6B)中通過對用抗-人化R4 mAb, NI-0101的治療的細(xì)胞反應(yīng)評分說明標(biāo)記水平的一系列圖。細(xì)胞反應(yīng)評分:0、1或者2 個細(xì)胞供體響應(yīng)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RAS巧刺激，并通過用NI-0101治療而被抑制。
[0045] 圖7是通過組合的對用抗-人化R mAb, NI-0101治療的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反 應(yīng)評分(cMFRS)說明標(biāo)記水平的圖。生物反應(yīng)評分:0、1、2、3或者4個細(xì)胞供體響應(yīng)于類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎滑液(RAS巧刺激，并通過用NI-0101治療而被抑制。
[0046] 圖8是說明ACPA /cFb-IC和S100A8/A9 / HMGB1形成獨立的串列的圖，所述串列顯 示測試的RASF樣品中的相關(guān)性趨勢。
[0047] 圖9是說明S100A8/A9和cFb 1C的組合是對于組合的對用抗-人化R mAb, NI-0101 治療的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分(cMFRS)的預(yù)測物的圖。
[004引發(fā)明詳述 本文提供的組合物和方法可用于鑒定或者W其它方式精修患有病癥的患者群，其中所 述患者具有升高水平的一種或多種化R4配體或者其它生物標(biāo)記。運些患者被鑒定為用干擾 或者W其它方式括抗TLR4信號傳導(dǎo)和中和化R4的至少一種生物活性(單獨或者在輔助蛋白 MD-2的情況下作為化R4/MD-2復(fù)合物）的藥劑(例如抗體或者其它基于多膚的治療劑、基于 膚的治療劑、小分子抑制劑、基于核酸的治療劑和其衍生物)治療的合適的候選者。
[0049]在患有或者疑似患有病癥的一些患者中，流體和其它生物樣品包含升高水平的 化R4配體和其它生物標(biāo)記。運些化R4配體和其它生物標(biāo)記刺激細(xì)胞W產(chǎn)生促-炎性細(xì)胞因 子。然而，使用干擾或者W其它方式括抗化R4信號傳導(dǎo)的抗-TLR4括抗劑，例如中和性抗- 化R4抗體或者其它抗-TLR4劑，在本文表明在顯示升高水平的一種或多種TLR4配體和/或其 它生物標(biāo)記的表達的患者中阻斷該刺激。因此，所述組合物和方法通過給予顯示升高水平 的一種或多種化R4配體和/或生物標(biāo)記的表達的患者抗-TLR4括抗劑，例如中和性抗-TLR4 抗體或者其它基于多膚的治療劑、基于膚的治療劑、小分子抑制劑、基于核酸的治療劑和其 衍生物，可用于治療病癥、延遲其進展或者W其它方式改善其癥狀，所述病癥依賴于TLR4信 號傳導(dǎo)、TLR4配體表達和/或活性異常例如升高、促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生異常和/或其組合， 受其驅(qū)動或者W其它方式與其相關(guān)。可能是用抗-TLR4括抗劑例如中和性抗-TLR4抗體例如 本文描述的那些治療的合適候選者的患者，通過檢測一種或多種化R4配體或者其它生物標(biāo) 記的水平來鑒定。
[0050] 之前的研究證實，免疫復(fù)合物(cFb-IC)中的瓜氨酸化纖維蛋白原（cFb)刺激促-炎 性細(xì)胞因子的分泌，該刺激可通過抗-TLR4括抗劑而被抑制。參見Soko love等，"Immune Complexes Containing Citrullinated Fibrinogen Costimulate Macrophages via Toll-like 民eceptor 4 and Fcg 民eceptor，，， Arthritis & 民heumatism, vol. 63， No. 1，Janua巧2011，pp 53-62。類似的研究使用本文所述的稱為NI-0101的抗-TLR4抗體進 行（圖1)。人血液-來源的巨隧細(xì)胞化BDM)被免疫復(fù)合的瓜氨酸化纖維蛋白原（沁b-IC)活 化，和作用機制依賴于化R4和部分貢獻來自化丫受體。如圖1A中所示，C即不誘導(dǎo)通過皿DM 的促-炎性細(xì)胞因子TWa的分泌，而當(dāng)作為與兔抗-纖維蛋白原多克隆抗體(Rb α Fb pAb) 的免疫復(fù)合物呈現(xiàn)時，證b-IC活化。在存在HBDM、證b-IC和抗-人化R4 mAb (例如，NI- 0101)的情況下，活化可能性被顯著阻斷。在存在皿DM、cFb-IC和抗-人FcRII mAb的情況下， 觀察到部分減少。當(dāng)加入兩種mAb至皿DM和cFb-IC時，對抗-人化R4 mAb (例如，NI-0101) 未觀察到另外的抑制。
[0051] 通過確定可用于鑒定可能是用抗-TLR4括抗劑治療的候選者的患者的另外的化R4 配體和其它生物標(biāo)記，本文提供的研究建立于和擴充了運些起始研究中的發(fā)現(xiàn)結(jié)果。
[0052] 用于鑒定可能候選者的合適化R4配體和其它生物標(biāo)記包括抗-瓜氨酸化蛋白抗體 (ACPA)、瓜氨酸化蛋白、在免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化蛋白，例如在與IgG蛋白（cFb-IC)或者 I巧蛋白的免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化纖維蛋白原(〇尸6);歷681、510048/^9、生腫蛋白(：、1^^、 熱休克蛋白化SP)、纖連蛋白、透明質(zhì)燒、Der P2、呼吸合胞病毒F (RSV) F蛋白、表面活性蛋 白A、柯薩奇病毒B4 (CSV B4)、CX化10、抵抗素、胎球蛋白A、飽和脂肪酸(SFA)、二聚糖、修飾 的低密度脂蛋白（mLDL)、高級糖化末端產(chǎn)物(AGE)和其組合。在一些實施方案中，瓜氨酸化 蛋白是瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化纖維蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化組蛋白（例 如瓜氨酸化組蛋白2b)、瓜氨酸化締醇酶或者瓜氨酸化趨化因子(例如瓜氨酸化CXCL10)。除 了檢測一種或多種運些化R4配體和/或生物標(biāo)記的水平之外，用抗-TLR4括抗劑治療的合適 患者還可通過評價許多另外的生物和臨床參數(shù)中的任一種來鑒定，所述參數(shù)將提高用于鑒 定或者W其它方式精修患者群的生物標(biāo)記的靈敏度和特異性?；蛘?，運些另外的生物和臨 床參數(shù)可單獨用作鑒定為用抗-TLR4括抗劑或者其它合適療法治療的合適候選者的患者的 工具。通過非限制性實例的方式，運些生物和臨床參數(shù)包括W下任一種:類風(fēng)濕因子水平、 C-反應(yīng)蛋白（CRP)水平、血液細(xì)胞計數(shù)、血液細(xì)胞亞群中化R4受體的存在、TLR4多態(tài)性、人白 細(xì)胞抗原化LA)多態(tài)性、膚基精氨酸脫亞氨酶(PAD)酶和PAD酶多態(tài)性、Fc 丫受體Ila (化丫 Ila)多態(tài)性、MD-2水平、可溶性CD14水平、基線患者人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)(例如體重指數(shù)(BMI)、 性別、年齡等)和/或患者病史(例如診斷時的失能評價表(DAS 28)、治療開始時的DAS 28、 疾病持續(xù)時間、疾病發(fā)生時的年齡、對基于DAS28的先前治療的反應(yīng)、美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR) 和/或歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會化ULAR)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)等）。在一些實施方案中，檢測化R4配體、其 它生物標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)的組合，例如檢測至少兩種化R4配體、其它生物標(biāo) 記和/或另外的生物/臨床參數(shù)，檢測至少Ξ種化R4配體、其它生物標(biāo)記和/或另外的生物/ 臨床參數(shù)，檢測至少四種化R4配體、其它生物標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)，檢測至少五 種化R4配體、其它生物標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)，檢測至少六種化R4配體、其它生物 標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)，檢測至少屯種化R4配體、其它生物標(biāo)記和/或另外的生 物/臨床參數(shù)，檢測至少八種化R4配體、其它生物標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)，檢測至 少九種化R4配體、其它生物標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)，或者檢測至少十種化R4配體、 其它生物標(biāo)記和/或另外的生物/臨床參數(shù)或者更多。
[0053] 在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9。在一些實施方案 中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是cFb-IC。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記 是ACPA。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是HMGB1。在一些實施方案中，TLR4 配體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9和HMGB1的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其 它生物標(biāo)記是S100A8/A9和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記 是S100A8/A9和ACPA的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是ACPA和cFb- IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是ACPA和HMGB1的組合。在一些 實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是HMGB1和cFb 1C的組合。在一些實施方案中， 化R4配體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9、ACPA和HMGB1的組合。在一些實施方案中，TLR4配 體或者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9、ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或 者其它生物標(biāo)記是S100A8/A9、cFb-IC和HMGB1的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其 它生物標(biāo)記是ACPA、HMGB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo) 記是 S100A8/A9、c訊-IC、ACPA和HMGB1 的組合。
[0054] 在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是對暴露于抗-TLR4劑例如抗- 化R4 mAb例如NI-0101的單核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的單 核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的單核細(xì)胞反應(yīng)的 預(yù)測物是ACPA。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的單核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是HMGB1。在一 些實施方案中，對抗-TLR4治療的單核細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是C訊-1C。
[0055] 在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是對暴露于抗-TLR4劑例如抗- 化R4 mAb例如NI-0101的成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物。在一些實施方案中，對抗-TLR4治療的 成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是cFb-IC。
[0056] 在一些實施方案中，TLR4配體或者其它生物標(biāo)記是對暴露于抗-TLR4劑例如抗- 化R4 mAb例如NI-0101的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物。在一些實施方案中，單核細(xì) 胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的 預(yù)測物是cFb-IC。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9。 在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是HMGB1。在一些實施方案中，單 核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和 成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成 纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是S100A8/A9和ACPA的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維 細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反 應(yīng)的預(yù)測物是ACPA和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測 物是HMGB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是 S100A8/A9、ACPA和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物 是S100A8/A9、ACPA和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù) 測物是S100A8/A9、cFb-IC和HMGB1的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng) 的預(yù)測物是ACPA、HMGB1和cFb-IC的組合。在一些實施方案中，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng) 的預(yù)測物是S100A8/A9、c訊-IC、ACPA和HMGBl的組合。
[0057] 本文提供的研究證實，中和化R4活性例如化R4-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的藥劑有效地基 本上或完全阻斷通過在來自患有病癥或者有病癥風(fēng)險的患者的樣品中活化細(xì)胞的促炎性 細(xì)胞因子產(chǎn)生。本文提供的研究還證實，僅祀向Fc區(qū)，例如通過使用中和化活性的藥劑例如 抗-CD32抗體，有效地部分阻斷通過患有病癥或者有病癥風(fēng)險的患者的活化細(xì)胞的促-炎性 細(xì)胞因子產(chǎn)生。與在不存在與抗-TLR4括抗劑相互作用例如結(jié)合的情況下通過活化細(xì)胞的 促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平相比，當(dāng)在存在抗-TLR4的情況下通過活化細(xì)胞的促炎性細(xì)胞 因子產(chǎn)生的水平降低至少95%、例如96%、97%、98%、99%或者100%時，抗-化34括抗劑被認(rèn)為完 全阻斷通過活化細(xì)胞的促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。與在不存在與抗-TLR4括抗劑相互作用例如 結(jié)合的情況下通過活化細(xì)胞的促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平相比，當(dāng)在存在抗-TLR4的情況 下通過活化細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平降低至少50%、例如55%、60%、75%、80%、85%或 者90%時，抗-TLR4括抗劑被認(rèn)為部分阻斷通過活化細(xì)胞的促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。與在不存 在僅祀向Fc區(qū)的情況下例如在不存在與抗-Fc劑的相互作用例如結(jié)合的情況下通過活化細(xì) 胞的促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平相比，當(dāng)在僅祀向化區(qū)后通過活化細(xì)胞的促-炎性細(xì)胞因 子產(chǎn)生的水平降低小于95%、例如 10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、7 5%、80%、85% 或者90% 時， 僅祀向化區(qū)，例如通過使用抗-Fc劑，被認(rèn)為部分阻斷通過活化細(xì)胞的促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn) 生。
[0058] 可用于本發(fā)明的組合物和方法的病癥包括任何病癥，其中化R4表達和/或活性異 常例如升高，W及化R4/MD-2活化異常和/或化R4配體活性異常(例如促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生 的刺激異常，例如化-6、TN化和/或IL-8產(chǎn)生的刺激異常）。例如，認(rèn)為一些化R4配體與多種 病癥有關(guān)。
[0059] 通過非限制性實例的方式，已知LPS與病癥例如脈毒癥、急性肺損傷和/或RA有關(guān) (參見例如，Opal, S.M. 2007. The host response to endotoxin, 曰ntilipopolys曰cch曰ride strategies, and the management of severe sepsis. Int. J. Med. Microbial. 297: 365-377;Wahamaa, H.等.High mobility group box protein 1 in complex with lipopolysaccharide or IL-1 promotes an increased inflammatory phenotype in synovial fibroblasts. Arthritis Res. Ther. 13: R136)〇
[0060] 通過非限制性實例的方式，已知生腫蛋白C與病癥例如關(guān)節(jié)炎、肝臟和/或屯、臟缺 血性再灌注有關(guān)（參見例如，Kuriyama, N.等 2011. Tenascin-c: A novel mediator of hepatic ischemia and reperfusion injury. Hepatology；Midwood , K.等2009. Ten曰scin-C is 曰n endogenous 曰ctiv曰tor of Toll-like receptor 4 th曰t is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nat. Med. 15: 774-780;Taki, J.等2010. Dynamic expression of tenascin-C after myocardial ischemia and reperfusion: assessment by 125I-anti-tenascin-C antibody imaging. J. Nucl. Med. 51: 1116-1122)。
[0061] 通過非限制性實例的方式，已知HMGBl與病癥例如RA、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、缺血性再灌 注、1型糖尿病、膜島移植、狼瘡和/或賊毒癥有關(guān)(參見例如，Chen, J.等2011. Toll-like receptor 4 regulates early endothelial activation during ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 79: 288-299;Wahamaa， H.等High mobility group box protein 1 in complex with lipopolysaccharide or IL-1 promotes an increased inflammatory phenotype in synovial fibroblasts. Arthritis Res. Ther. 13: 民136);Abdulahad, D. A.等2011. High mobility group box 1 (HMGBl) and anti- HMGBl antibodies and their relation to disease characteristics in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 13:民71;Chen, J.等2011. Early interleukin 6 production by leukocytes during ischemic acute kidney injury is regulated by TLR4. Kidney Int. 80: 504-515;Huang, W.等2010. HMGBl, a potent proinflammatory cytokine in sepsis. Cytokine 51: 119-126;Jiang, W.和D. S. Pisetsky. 2008. Expression of high mobility group protein 1 in the sera of patients and mice with systemic lupus erythematosus. Ann. Rheum. Dis. 67: 727-728;Li， M.等2012. Toll-like receptor 4 on beta cells senses expression changes in high-mobility group box 1 and contributes to the initiation of type 1 diabetes. Exp. Mol. Med;Matsuoka， N.等2010. High-mobility group box 1 is involved in the initial events of early loss of transplanted islets in mice. J. Clin. Invest 120:735-743;Nogueira-Machado, J. A.等2011. HMGBl, TLR and 民AGE: a functional tripod that leads to diabetic inflammation. Expert. Opin. Ther. Targets. 15: 1023-1035;Schierbeck， H.等2011. Monoclonal anti- HMGBl antibody protection in two experimental arthritis models. Mol. Med. Sep-0ct;17(9-10):1039-44. Epub 2011 化n 7;Urbonaviciute，V.和R. E. Voll. 2011. High-mobility group box 1 represents a potential marker of disease activity and novel therapeutic target in systemic lupus erythematosus. J. Intern. Med. 270: 309-318;Wu, H.等2010. HMGBl contributes to kidney ischemia reperfusion injury. J. Am. Soc. Nephrol. 21: 1878-1890)〇 [0062]通過非限制性實例的方式，已知S100A8/A9與病癥例如RA、0A、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié) 炎(JIA)、糖尿病、移植排斥、狼瘡、動脈粥樣硬化、賊毒癥和/或癌癥有關(guān)(參見例如Arai， Κ·等2008. S100A8 and S100A9 overexpression is associated with poor pathological parameters in invasive ductal carcinoma of the breast. Curr. Cancer Drug Targets. 8: 243-252;Bouma， G.等2004. Increased serum levels of M民P-8114 in type 1 diabetes induce an increased expression of CDllb and an enhanced adhesion of circulating monocytes to fibronectin. Diabetes 53: 1979- 1986;Frosch, M.等2009. The myeloid-related proteins 8 and 14 complex, a novel ligand of toll-like receptor 4， and interleukin-lbeta form a positive feedback mechanism in systemic-onset juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 60: 883-891;Ionita, M. G.等2009. High levels of myeloid-related protein 14 in human atherosclerotic plaques correlate with the characteristics of rupture-prone lesions. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 29: 1220-1227;化ng, D. Y.等2008. Combined use of myeloid-related protein 8114 and procalcitonin as diagnostic markers for acute allograft rejection in kidney transplantation recipients. Transpl. Immunol. 18: 338-343;Kawai，H.等 2011. Prognostic impact of S100A9 overexpression in non-small cell lung cancer. Tumour. Biol. 32: 641-646;Loser， K.等2010. The Toll-like receptor 4 ligands Mrp8 and Mrpl4 are crucial in the development of autoreactive CD8+ T cells. Nat. Med. 16: 713-717;Peng, W. H.等2011. Increased serum myeloid- related protein 8/14 level is associated with atherosclerosis in type 2 diabetic patients. Cardiovasc. Diabetol. 10: 41；Schulze zur, W. A.等2004. Myeloid related proteins M民P8/M民P14 may predict disease flares in juvenile idiopa化ic arthritis. Clin. Exp. Rheumatol. 22: 368-373;Soyfoo, M. S.等 2009. Phagocyte-specific S100A8/A9 protein levels during disease exacerbations and infections in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 36: 2190-2194; Sunahori, K.等2006. The S100A8/A9 heterodimer amplifies proinflammatory cytokine production by macrophages via activation of nuclear factor kappa B and p38 mitogen-activated protein kinase in rheumatoid arthritis. Arthritis 民es. Ther. 8: R69;van Lent, P. L.等2010. S100A8 causes a shift toward expression of activatory Fcgamma receptors on macrophages via toll-like receptor 4 and regulates Fcgamma receptor expression in synovium during chronic experimental arthritis. Arthritis Rheum. 62: 3353-3364;van Zoelen, M. A.等2009. Expression and role of myeloid-related protein-14 in clinical and experimental sepsis. Am. J.民espir. Crit Care Med. 180: 1098-1106；Zreiqat, H. 等2010. S100A8 and S100A9 in experimental osteoarthritis. Arthritis Res. Ther. 12: R16)〇
[0063] 通過非限制性實例的方式，已知瓜氨酸化纖維蛋白原與病癥例如RA和動脈粥樣硬 化有關(guān)（參見例如，Kuhns，D. B.等2007. Induction of human monocyte interleukin (IL)-8 by fibrinogen through the toll-like receptor pathway. Inflamination 30: 178-188;Smiley， S. T.等2001. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through toll-like receptor 4. J. Immunol. 167: 2887-2894;Sokolove， J.^2011. Immune complexes containing citrullinated fibrinogen costimulate macrophages via Toll-like receptor 4 and Fcgamma receptor. Arthritis Rheum. 63: 53-62)。
[0064] 通過非限制性實例的方式，已知ACPA與病癥例如RA、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼 瘡(SLE)、斯耶格倫氏綜合征、阿爾茨海默病和/或動脈粥樣硬化有關(guān)(參見例如，Nicholas AP. Dual immunofluorescence study of citrullinated proteins in Alzheimer diseased frontal cortex. Neurosci Lett. 2013 Jun 17;545:107-11. Epub 2013 May 3. PubMed PMID: 23648390);Giles JT等Association of fine specificity and repertoire expansion of anticitrullinated peptide antibodies with rheumatoid arthritis associated interstitial lung disease. Ann 民heum Dis. 2013 May 28. 化pub ahead of print) PubMed PMID: 23716070);G6mara MJ, Haro I. Citrullinated peptides in the diagnosis of rheumatoid arthritis. Curr Top Med Chem. 2013;13 (6):743-51.化bMed PMID: 23574523);Dalmady S等Hi曲er levels of autoantibodies targeting mutated citrullinated vimentin in patients with psoriatic arthritis than in patients with psoriasis vulgaris. Clin Dev Immunol. 2013;2013:474028. Mar 18. PubMed PMID: 23573111; PubMed Cen化al PMCID: PMC3614022);胎rrera- Esparza R等Posttranslational Protein Modification in the Salivary Glands of Sjogren's Syndrome Patients. Autoimmune Dis. 2013;2013:548064. Epub 2013 Mar 5.化bMed PMID: 23533719; PubMed Cen化al PMCID: PMC3603161);和Cambridge G等 Antibodies to citrullinated peptides and risk of coronary heart disease. Atherosclerosis. 2013 May;228(1):243-6. Epub 2013 Feb 18. PubMed PMID: 23474125)〇
[0065] 在其它非限制性實例中，認(rèn)為TLR4配體例如熱休克蛋白（HSP)、HMGB1和/或 S100A8/A9與缺血/再灌注損傷（I/R損傷)有關(guān)。通過非限制性實例的方式，認(rèn)為化R4配體例 如HMGBUS100A8/A9、纖連蛋白、瓜氨酸化纖維蛋白原和/或生腫蛋白C與關(guān)節(jié)炎有關(guān)。通過 非限制性實例的方式，認(rèn)為化R4配體例如熱休克蛋白化SP)、透明質(zhì)燒、Der P2、呼吸合胞病 毒F (RSV) F蛋白、表面活性蛋白A和/或LPS與肺疾病有關(guān)。通過非限制性實例的方式，認(rèn)為 TLR4配體例如柯薩奇病毒B4 (CSV B4)、CXCL10、抵抗素、胎球蛋白A、飽和脂肪酸（SFA)、 HMGB1和/或S100A8/A9與糖尿病有關(guān)。通過非限制性實例的方式JLR4配體例如熱休克蛋白 化SP)、透明質(zhì)燒、Der P2、呼吸合胞病毒F (RSV) F蛋白、表面活性蛋白A和/或WS與肺疾病 有關(guān)。通過非限制性實例的方式，認(rèn)為化R4配體例如HMGBUS100A8/A9二聚糖、修飾的低密 度脂蛋白(mLDL)和/或高級糖化末端產(chǎn)物(AGE)與腎疾病有關(guān)。
[0066] 本發(fā)明的中和性抗-化R4抗體包括，例如下表2A所示的重鏈互補決定區(qū)（CDR)、表 2B所示的輕鏈CDR和其組合。
[0067] 表2A.來自結(jié)合和中和TLR4的抗體克隆的VH CDR序列
表2B.來自結(jié)合和中和化R4的抗體克隆的化CDR序列 ! ^-S-SNN^^-S-SN-VN^-VN'.NN-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-SN-SN-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S^-S-VS^-S'.N-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S'.'.N-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-SNN-SN^-S'.^N-SN-S-S-S-S-SN-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-SNNN-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-VS-SN^-S-S-VS-nN'^-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-VNN
.-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s^N-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-sNNN-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-v^NN-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s-s·.·'
本發(fā)明的化R4抗體包括，例如具有下文所示的重鏈和輕鏈序列的組合的抗體。
[0068] 本發(fā)明的示例性的抗體包括，例如2005年6月14日提交和作為W0 2007/110678公 布的PCT/IB2005/004206中所述的抗-TLR4抗體、2008年5月14日提交和作為W0 2009/ 101479公布的PCT申請PCT/IB2008/003978中描述的抗-TLR4抗體，其各自的內(nèi)容通過引用 W其整體結(jié)合到本文中；和市售可得的抗體例如HTA125。
[0069] 本發(fā)明的示例性的抗體包括，例如本文稱為NI-0101的抗體，其在本文和附圖中亦 稱為"hul5cr，其結(jié)合人TLR4/MD2復(fù)合物和亦不依賴于MD-2的存在而結(jié)合TLR4dN1-0101 化ul5cl)抗體的序列顯示在下文，其中VH和化氨基酸序列中的CDR序列用下劃線表示： NI-0101重鏈核巧酸序列：
NI-0101 化ul5cl)抗體包括具有序列GGYSWH (SEQ ID NO: 1)、ΥΙ肌SGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 2)和KDPSDAFPY (SEQ ID NO: 3)的VH CDR，和具有序列RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 4)、YASHAIS (沈Q ID NO: 5)和QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)的化 CDR。
[0070]抗-TLR4/MD2抗體的重鏈可變(VH)和輕鏈可變(VL)區(qū)的氨基酸和核酸序列顯示在 下文。包含如通過Qiothia等1989、E.A. Rabat等1991定義的互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸在 下文用下劃線和斜體字突出顯示（參見畑othia, C等，Nature 342:877-883 (1989); Rabat, EA 等，Sequences of Protein of immunological interest,第五片反，US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991))。
[0071 ] 抗-TLR4抗體包括同時在審的2004年12月10日提交的美國申請11/009939和2004 年6月15日提交的11/151916和2004年12月10日提交的W0 05/065015和2004年6月15日提交 的PCT/US2005/020930中描述的抗體，其各自通過引用W其整體結(jié)合到本文中。幾種示例性 的抗體包括在本文稱為18化0、1607、15C1和7E3的抗體。
[0072]抗-TLR4抗體包括同時在審的2004年6月15日提交的美國申請11/151916 (美國專 利公開號US 2008-0050366 A1)和2004年6月 15 日提交的PCT/IB2005/004206 (PCT公開號 wo 07/110678)中描述的抗體，其各自通過引用w其整體結(jié)合到本文中。幾種示例性的抗體 的序列在下文顯不。
[0073] 15C1 Hu Vh型式4-28
其中拉是Tyr或者化e 抗-TLR4抗體包括2008年5月14日提交的PCT/IB2008/003978 (PCT公開號WO 2009/ 101479)中描述的抗體，其內(nèi)容通過引用W其整體結(jié)合到本文中。運些抗-TLR4抗體經(jīng)修飾 W在CDR3部分中包括一個或多個突變。幾種示例性的抗體的序列顯示在下文。
[0074] 15C1人源化VH突變體1氨基酸序列：
本發(fā)明的抗體干擾或者W其它方式括抗通過人和/或雜猴化R4和/或人和/或雜猴 TLR4/MD-2復(fù)合物的信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，所述抗體結(jié)合包括具有W下序列的人 和/或雜猴TLR4上的一個或多個氨基酸殘基的表位： 〉人化R4氨基酸序列
LHKLTLRSN 抑 DLNVMKTCIQGLAGLEVHRLVLGEFR 肥 RNLEE 抑 KS 化 EGLCNLUE 邸化 TYU)CYU)…IDLF N化ANVSSF化VSVNIKRVEDFSYNFRW卵LELVNCKFEQFPTLELKSL邸LTFTANKGGNAF沈VDLPSLE化DLS RNGLSFKGCCSQSDFGTTSLKYLDLSFNDVITMSSNFLGLEQLEHLDFQ服NLKQMSQFSV化SLRNLIYLDI甜ΤΗ TRVAFNGI 抑化 LSLKVLKMAGNSF 犯N化PDIFTDLK化Τ化DLSQC化EQLSPTA 抑 TLNKLQVLNM 甜NNFF 化 DTFPYK化P化QVLDYSLNHIMTSNN犯LQHFPSSLAFLNLTQNDFACTCE冊S化QWI邸QR化LVEAERMECATP SDKQGMP 化化 NITCQMNKTIIGVSVFS 化 WSVVA 化 VYKFYFHLM 化 AGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQD 邸 WVR 肥 LVKNLEEGVPPF 化化 HY 畑 FIPGVAIAANII 肥 GFHKS 服 VIVVVSQHFIQSRWCI 陽 YEIAQTWQFLSSRAGI I巧化WVEKTLLRQQVELYR化SRNTYLEW邸SVLG卵IFWRRL服ALLDGKSWNP邸Q (沈Q ID NO: 77) 本發(fā)明的抗體干擾或者W其它方式括抗通過人和/或雜猴化R4和/或人和/或雜猴 TLR4/MD-2復(fù)合物的信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，所述抗體結(jié)合包括人和/或雜猴化R4上 的在SEQ ID NO: 76 (人TLR4)和/或SEQ ID NO: 77 (雜猴TLR4)的殘基289和375之間的一 個或多個氨基酸殘基的表位。例如，TLR4抗體特異性結(jié)合包括SEQ ID NO: 76 (人）和/或 SEQ ID NO: 77 (雜猴）的殘基349的表位。在一些實施方案中，表位還包括其它殘基，例如 選自沈Q ID NO: 76 (人）和/或沈Q ID NO: 77 (雜猴）的至少殘基328和329;沈Q ID NO: 76 (人)和/或SEQ ID NO: 77 (雜猴）的至少殘基351;和SEQ ID NO: 76 (人)和/或SEQ ID NO: 77 (雜猴)的至少殘基369至371;和其任何組合的殘基。
[0075] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合Ton-樣受體4 (TLR4)的分離的抗體， 其中所述抗體結(jié)合包括SEQ ID NO: 76的至少殘基349的表位和包括SEQ ID NO: 76的至少 殘基349的表位。在一些實施方案中，所述抗體包括具有Ξ個互補決定區(qū)(CDR)的重鏈，其包 括可變重鏈互補決定區(qū)1 (CDRH1)氨基酸序列GYSITGGYS (SEQ ID NO: 15);可變重鏈互補 決定區(qū)2 (CDRH2)氨基酸序列IHYSGYT (SEQ ID NO: 22);和可變重鏈互補決定區(qū)3 (CD畑3)氨基酸序列A服DSG(Xi)(X2)(X3)PY (SEQ ID NO: 14)，其中Xi是N、Q、D或者E，拉是任 何疏水氨基酸，和X3是任何疏水氨基酸；和具有Ξ個CDR的輕鏈，其包括可變輕鏈互補決定 區(qū)1 (CD化1)氨基酸序列QSISDH (SEQ ID NO: 34);可變輕鏈互補決定區(qū)2 (CD化2)氨基酸 序列YAS (SEQ ID NO: 35);和可變輕鏈互補決定區(qū)3 (CD化3)氨基酸序列QQG服FPLT (SEQ ID NO: 6)。在一些實施方案中，表位還包括SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 76的至少殘基 328和329。在一些實施方案中，表位還包括SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 76的至少殘基 351。在一些實施方案中，表位還包括在沈Q ID NO: 76和沈Q ID NO: 76的殘基369至371之 間的一個或多個殘基。在一些實施方案中，表位還包括SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 76的 至少殘基369至371。在一些實施方案中，所述抗體特異性結(jié)合包括SEQ ID NO :76和SEQ ID NO: 76的至少殘基328、329、349、351和369至371的表位。在一些實施方案中，所述抗體還包 括在丫重鏈恒定區(qū)中在抓氨基酸位置325處的氨基酸置換和在抓氨基酸位置328處的氨基 酸置換。在一些實施方案中，在抓氨基酸位置325處置換的氨基酸是絲氨酸，和其中在抓氨 基酸位置328處置換的氨基酸是苯丙氨酸。
[0076] 示例性的化R4單克隆抗體是本文所述的1E11抗體。如下文所示，1E11抗體包括由 SEQ ID NO: 79所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 78)，和由SEQ ID N0:80所 示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0077] 〉1E11 VH 核酸序列 CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCT
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。lEll抗體的重鏈CDR具有 W下序列:GYS口GGYS (沈Q ID NO: 15); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)<JE11 抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0078] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的lAl抗體。如下文所示，1A1抗體包括由SEQ ID NO: 81所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 82)，和由SEQ ID NO: 80所示 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0079] 〉1A1 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。lAl 抗體的重鏈 CDR 具有 W 下序列:GYSITGGYS (SEQ ID NO: 15); I肌SGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSG化LPY (沈Q ID NO: 25)d1A1 抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0080]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的1A6抗體。如下文所示，1A6抗體包括由SEQ ID NO: 83所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 84)，和由SEQ ID NO: 80所示 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0081 ] 〉1A6 VH核酸序列
〉1A6化氨基酸序列 El化TQSPDFQSVTPK邸VTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKliJKYASHAISGVPSRFSGSGSGTDFTL TINSLEAEDAATYYCQQG服FPLTFGGGTKVEIK (沈Q ID NO: 8) 包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.IP.37 (2000) LIGM:230)定義。1A6 抗體的重鏈 CDR 具有 W 下序列:GYSITGGYS (SEQ ID NO: 15); I肌SGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGKWLPY (沈Q ID NO: 26)d1A6抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0082]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的1B12抗體。如下文所示，1B12抗體包括由 沈Q ID NO: 85所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 86)，和由SEQ ID NO: 80 所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[008：3] 〉1B12 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1A6 抗體的重鏈 CDR 具有 W 下序列:GYSITGGYS (SEQ ID NO: 15); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGHLMPY (沈Q ID NO: 27)。1812抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0084]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的1C7抗體。如下文所示，1C7抗體包括由SEQ ID NO: 87所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 88)，和由SEQ ID NO: 80所示 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[00化]〉1C7 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1C7 抗體的重鏈 CDR 具有 W 下序列:GYSITGGYS (SEQ ID NO: 15); I肌SGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DS細(xì)NYPY (沈Q ID NO: 28)d1C7抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0086] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的ICIO抗體。如下文所示，1C10抗體包括由 SEQ ID NO: 89所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 90)，和由SEQ ID N0:80所 示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0087] 〉1C10 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。ICIO抗體的重鏈CDR具有 W下序列:GYS口GGYS (沈Q ID NO: 15); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGKNFPY (沈Q ID NO: 29)aC10抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0088] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的1C12抗體。如下文所示，1C12抗體包括由 SEQ ID NO: 91所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 92)，和由SEQ ID N0:80所 示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0089] 〉1C12 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1C12抗體的重鏈CDR具有 W下序列:GYS口GGYS (沈Q ID NO: 15); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGQLFPY (沈Q ID NO: 30)aC12抗體的輕鏈 CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSFPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0090] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的IDIO抗體。如下文所示，1D10抗體包括由 SEQ ID NO: 93所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 94)，和由SEQ ID N0:80所 示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0091] 〉IDIO VH核酸序列
〉IDIO VH氨基酸序列 QV 化犯 SGP 化 VKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPSLKTRITIS 畑
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.IP.37 (2000) LIGM:230)定義。IDIO抗體的重鏈CDR具有 W下序列：GYSITGGYS (沈Q ID NO: 15); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGHNLPY (沈Q ID NO: 31)d1D10抗體的輕鏈 CDR具有W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: ：M); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGHSF化Τ (沈Q ID NO: 6)。
[0092] 示例性的TLR4單克隆抗體是本文描述的lEll N103D抗體。如下文所示，lEll N103D抗體包括由SEQ ID NO: 95所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 96)，和 由SEQ ID NO: 80所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[009引〉1E11 N103D VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。lEll N103D抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYS口GGYS (SEQ ID NO:15); I肌SGYT (SEQ ID NO: 22);和A服DSGDYFPY (SEQ ID NO: 32)?；?1 N103D抗體的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: 34); YAS (沈Q ID NO: 35); 和QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0094]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的1G12抗體。如下文所示，1012抗體包括由 SEQ ID NO: 97所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 98)，和由SEQ ID N0:80所 示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[00巧]〉1G12 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1012抗體的重鏈CDR具有 W下序列：GYSITGGYS (沈Q ID NO: 15); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGRYWPY (沈Q ID NO: 33)d1E11 N103D抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0096] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11.Cl抗體。如下文所示，1E11.Cl抗體 包括由SEQ ID NO: 99所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 100)，和由SEQ ID N0:80所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0097] MEll.Cl VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。lEll.Cl 抗體的重鏈 CDR 具有 W 下序列：GFPIRYGYS (SEQ ID NO: 16); IHYSGYT (SEQ ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)JE11.C1 抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0098] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C2抗體。如下文所示，lEl 1. C2抗體 包括由SEQ ID NO: 101所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 102)，和由SEQ ID NO: 8所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 80)。
[0099] 〉1E11.C2 VH核酸序列
TINSLEAEDAATYYCQQG服FPLTFGGGTKVEIK (沈Q ID NO: 8) 包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C2抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 17); IHYSGYT (SEQ ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)JE11.C1 抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0100] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C3抗體。如下文所示，lEl 1. C3抗體 包括由SEQ ID NO: 103所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 104)，和由SEQ ID N0:80所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0101] 〉1E11.C3 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C3抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIRHGYS (SEQ ID N0:18); I肌SGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)d1E11.C1 抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0102] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C4抗體。如下文所示，lEl 1. C4抗體 包括由SEQ ID NO: 105所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 1 06)，和由SEQ ID N0:80所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0…引 〉wn.C4 VH核酸序列 CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCT
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C4抗體的重鏈CDR具有W下序列：GFPIGQGYS (SEQ ID NO: 19); IHYSGYT (SEQ ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)JE11.C1 抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0104]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C5抗體。如下文所示，lEl 1.巧抗體 包括由SEQ ID NO: 107所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 108)，和由SEQ ID N0:80所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0…引 〉1E11.巧VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.IP.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C5抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIWGGYS (SEQ ID N0:20); I肌SGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)d1E11.C1 抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0106]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C6抗體。如下文所示，lEl 1. C6抗體 包括由SEQ ID NO: 109所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 110)，和由SEQ ID N0:80所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 8)。
[0…7] 〉1E11.C6 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C6抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIGGGYS (SEQ ID N0:21); I肌SGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)d1E11.C1 抗體 的輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQG服FPLT (沈Q ID NO: 6)。
[0108]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11.El抗體。如下文所示，1E11.El抗體 包括由SEQ ID N0:77所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 78)，和由SEQ ID NO: 111所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 112)。
[0…9] 〉1E11.E1 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。lEll.El 抗體的重鏈 CDR 具有 W 下序列：GYS 口 GGYS (SEQ ID NO: 15); IHYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)?；?11 抗體的 輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: ：M); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGNDFPVT (沈Q ID NO: 37)。
[0110] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. E2抗體。如下文所示，lEl 1. E2抗體 包括由SEQ ID N0:79所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 78)，和由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 114)。
[0111] 〉1E11.E2 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.E2抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYS口GGYS (SEQ ID NO: 15); IHYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)?；?11 抗體的 輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: ：M); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGYDEPFT (沈Q ID NO: 38)。
[0112]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. E3抗體。如下文所示，lEl 1. E3抗體 包括由SEQ ID N0:79所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 78)，和由SEQ ID NO: 115所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 116)。
[。…]〉1E11.E3 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.E3抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYS口GGYS (SEQ ID NO: 15); IHYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)?；?11 抗體的 輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: ：M); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGYDFPLT (沈Q ID NO: 39)。
[0114]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. E4抗體。如下文所示，lEl 1. E4抗體 包括由SEQ ID N0:79所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 79)，和由SEQ ID NO: 117所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 118)。
[01巧]〉1E11.E4 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.E4抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYS口GGYS (SEQ ID NO: 15); IHYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)。化 11 抗體的 輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: ：M); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGYDYPLT (沈Q ID NO: 40)。
[0116]示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11 .E5抗體。如下文所示，lEll .E5抗體 包括由SEQ ID N0:79所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 78)，和由SEQ ID NO: 119所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 120)。
[0117] 〉1E11.E5 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.E5抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYS口GGYS (SEQ ID NO: 15); IHYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)。化 11 抗體的 輕鏈CDR具有 W下序列：QSISDH (沈Q ID NO: ：M); YAS (沈Q ID NO: 35);和QQGYEFPLT (沈Q ID NO: 41)。
[0118] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11.C2E1抗體。如下文所示，1E11.C2E1 抗體包括由SEQ ID NO: 101所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 102)，和由 SEQ ID NO: 121所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 122)。
[0119] 〉1E11.C2E1 VH 核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C2E1 抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIRFGYS (沈Q ID NO:17); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (SEQ ID NO: 24)?；?11 抗 體的輕鏈CDR具有W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQGNDFPVT (沈Q ID NO: 37)。
[0120] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C2E3抗體。如下文所示，lEl 1. C2E3 抗體包括由SEQ ID NO: 101所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 102)，和由 SEQ ID NO: 123所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 124)。
[0121] 〉1E11.C2E3 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.1P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C2E3抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIRFGYS (沈Q ID N0:17); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (SEQ ID NO: 24)?；?11 抗 體的輕鏈CDR具有W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQGYDFPLT (沈Q ID NO: 39)。
[0122] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C2E4抗體。如下文所示，lEl 1. C2E4 抗體包括由SEQ ID NO: 101所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 102)，和由 SEQ ID NO: 125所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 126)。
[012引〉1E11.C2E4 VH核酸序列
包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.l P.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C2E4抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIRFGYS (沈Q ID NO: 17); IHYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (沈Q ID NO: 24)d1E11 抗 體的輕鏈CDR具有W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQGYDYPLT (沈Q ID NO: 40)。
[0124] 示例性的化R4單克隆抗體是本文描述的化11. C2E5抗體。如下文所示，lEl 1. C2E5 抗體包括由SEQ ID NO: 101所示的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 102)，和由 SEQ ID NO: 127所示的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 128)。
[01巧]〉wn.c沈5 VH核酸序列
TINSLEAEDAATYYCQQGYEFPLTFGGGTKVEIK (沈Q ID NO: 128) 包含互補決定區(qū)（CDR)的氨基酸通過M.P. Le打anc (參見Lefranc, M.-P., Qirrent Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, New York supplement 40, Al.P.l- A.IP.37 (2000) LIGM:230)定義。1E11.C2E5抗體的重鏈CDR具有W下序列：GYPIRFGYS (沈Q ID N0:17); mYSGYT (沈Q ID NO: 22);和A服DSGNYFPY (SEQ ID NO: 24)?；?11 抗 體的輕鏈CDR具有W下序列：QSISDH (SEQ ID NO: 34); YAS (SEQ ID NO: 35);和 QQGYEFPLT (沈Q ID NO: 41)。
[01%]在一些實施方案中，TLR4抗體呈IgG同種型的形式。在一些實施方案中，TLR4抗體 呈IgGl同種型的形式。
[0127]示例性的IgGl-形式的抗體是IgGl-形式的化11抗體，包含重鏈序列SEQ ID NO: 130和輕鏈序列SEQ ID NO: 132,如下文所示： 〉1E11軍鏈氨某酸序列
示例性的IgGl-形式的抗體是IgGl-形式的lEll.Cll抗體，包含重鏈序列SEQ ID NO: 134和輕鏈序列SEQ ID NO: 136,如下文所示：
在一些實施方案中，本發(fā)明的化R4抗體特異性結(jié)合人和/或雜猴化R4/MD-2復(fù)合物，其 中所述抗體結(jié)合包括人和/或雜猴化R4上在SEQ ID NO: 76 (人)和SEQ ID NO: 77 (雜猴） 的殘基325和374之間的一個或多個氨基酸殘基的表位?；蛘?，單克隆抗體是與1AU1A6、 1B12、1C7、1C10、1C12、1D10、1E11、1E11 N103D、1G12、1E11.C1、1E11.C2、1E11.C3、1E11.C4、 1E11.C5、1E11.C6、1E11.E1、1E11.E2、1E11.E3、1E11.E4、1E11.E5、1E11.CW1、1E11.C2E3、 lEl 1. C2E4和化11. C沈5結(jié)合相同表位的抗體。
[0128] 本發(fā)明的抗-TLR4抗體包括改變的抗體，其中所述抗體的化部分的CH2結(jié)構(gòu)域中至 少抓位置325的氨基酸殘基和至少抓位置328的氨基酸殘基已被修飾。例如，至少抓位置325 的氨基酸殘基已被絲氨酸置換，和至少抓位置328的氨基酸殘基已被苯丙氨酸置換。
[0129] 與未改變的抗體相比，運些具有修飾的化部分的抗-TLR4抗體引起改變的效應(yīng)器 功能，例如改變的化受體活性。例如，人化受體是CD32A。在一些實施方案中，與未改變的抗 體相比，運些抗-TLR4抗體在與CD32A連接后引起防止促炎性介質(zhì)釋放。因此，運些抗-TLR4 抗體引起改變的化受體活性，例如防止促炎性介質(zhì)釋放同時保留結(jié)合祀抗原的能力。在一 些實施方案中，運些抗-TLR4抗體是中和性抗體，其中所述抗-TLR4抗體引起改變的化受體 活性，同時保留中和祀抗原的一種或多種生物活性的能力。
[0130] 例如，本發(fā)明的抗-TLR4抗體包括結(jié)合人化R4/MD-2受體復(fù)合物的單克隆抗體。該 受體復(fù)合物被脂多糖(LPS)活化，所述脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜的主要組分。本發(fā)明 的抗-TLR4抗體抑制通過LPS的受體活化和隨后的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。因此，抗-TLR4抗體中和 TLR4/MD-2受體復(fù)合物的活化。具體而言，本發(fā)明提供識別細(xì)胞表面上表達的化R4/MD-2受 體復(fù)合物的抗化R4抗體。運些抗-TLR4抗體阻斷LPS-誘導(dǎo)的和其它化R4配體-誘導(dǎo)的促-炎 性細(xì)胞因子（例如IL-6、化-8、TNFa)產(chǎn)生。此外，本發(fā)明的一些抗-TLR4抗體還識別當(dāng)未與 MD-2復(fù)合時的TLR4。改變的抗體是例如，人源化抗體。
[0131]定義; 除非定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 常理解的含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，和復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括 單數(shù)。通常，結(jié)合本文描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)和寡核巧酸或多核巧酸 化學(xué)和雜交使用的命名法和其中的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和常用的那些。對于重組DNA、寡 核巧酸合成和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染），使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。酶反應(yīng)和純化技術(shù)按 照制造商的說明書或者按本領(lǐng)域通常實施的或者按本文描述的進行。前述技術(shù)和程序通常 按照本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法和按本說明全文中引用和論述的各種一般性和更具體參 考資料中所述的進行。參見例如Sambrook等Molecular Cloning: A LaboratoiT Manual (第2片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))。結(jié)合本文描述的分析化學(xué)、合成有機化學(xué)和醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的命名法和其中 的實驗室程序和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和常用的那些。對于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制 備、制劑和遞送W及患者的治療，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
[0。?？筎LR4抗體的使用 將理解的是，根據(jù)本發(fā)明的治療實體的給予將與合適的載體、賦形劑和其它滲入制劑 的藥劑一起給予，W提供改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受等。許多合適的制劑可W見于所有藥劑師 已知的處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版，Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))，特別是其中Blaug, Seymour的第87章。運些制劑包括，例 如，粉劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟劑、油劑、脂質(zhì)、包含脂質(zhì)（陽離子或陰離子）的囊泡（如 Lipofectin?)、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油和油包水乳劑、聚乙二醇乳劑(各種分子 量的聚乙二醇）、半固體凝膠W及包含聚乙二醇的半固體混合物。任何上述混合物可W適合 于根據(jù)本發(fā)明的治療和療法，條件是在制劑中的活性成分不被制劑滅活并且制劑與給藥途 徑在生理上是相容的和可耐受的。還參見，Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.'' Regul. Toxicol Pharmacol. 32 (2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Qiarman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.'' J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell 掌乂 ompendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)?及其中對于關(guān)于藥劑 師熟知的制劑、賦形劑和載體的額外信息的引用。
[0133]本發(fā)明的治療制劑，其包括本發(fā)明的抗化R4抗體，用于治療或減輕與免疫相關(guān)病 癥相關(guān)的癥狀。本發(fā)明還提供了治療或減輕與免疫相關(guān)病癥相關(guān)的癥狀的方法。通過使用 標(biāo)準(zhǔn)的方法鑒定受試者，例如，患有(或處于發(fā)展風(fēng)險中）免疫相關(guān)病癥的人患者來執(zhí)行治 療方案。例如，本發(fā)明的抗化R4抗體是在自身免疫性疾病和/或炎性病癥的治療中有用的治 療工具。在某些實施方案中，考慮使用調(diào)節(jié)，例如，抑制、中和或干擾化R信號傳導(dǎo)的抗化R4 抗體用于治療自身免疫性疾病和/或炎性病癥。
[0134] 自身免疫性疾病包括，例如，獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS，其是具有自身免疫成 分的病毒性疾?。咝?、強直性脊柱炎、抗憐脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫 性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性淋己增生綜合征 (ALPS)、自身免疫性血小板減少性紫齋(ATP)、白塞氏病、屯、肌病、口炎性腹瀉-瘤疹樣皮炎； 慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓銷性多發(fā)性神經(jīng)病(CIPD)、癒痕性 類天瘤瘡、冷凝集素病、CREST綜合征、克羅恩氏病、Degos氏病、幼年型皮肌炎、盤狀狼瘡、原 發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯病、格林-己利綜合征、橋本氏甲 狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫齋(ITP)、IgA腎病、膜島素依賴型糖尿病、 幼年型慢性關(guān)節(jié)炎(Still氏?。?、幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、梅尼埃氏病、混合性結(jié)締組織病、多 發(fā)性硬化、重癥肌無力、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體綜合征、風(fēng)濕性多肌 痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、銀屑病關(guān) 節(jié)炎、雷諾氏現(xiàn)象、萊特爾氏綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病(進行性系統(tǒng) 性硬化癥(PSS)，也被稱為系統(tǒng)性硬化癥(SS))、干燥綜合征、僵人綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 多發(fā)性大動脈炎、顛動脈炎/巨細(xì)胞動脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、白齋風(fēng)和韋格納肉芽 腫。
[0135] 炎性病癥包括，例如，慢性和急性炎性病癥。炎性病癥的例子包括阿耳茨海默氏 病、哮喘、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、動脈粥樣硬化、支氣管哮喘、濕疹、腎小球腎炎、移植 物抗宿主病、溶血性貧血、骨關(guān)節(jié)炎、敗血癥、中風(fēng)、組織和器官移植、血管炎、糖尿病性視網(wǎng) 膜病和通氣機誘導(dǎo)的肺損傷。
[0136] 例如，抗化R4抗體可用于治療微生物產(chǎn)物（如LPS)誘導(dǎo)的急性炎癥和脈毒癥和由 此急性炎癥引起的加重，例如慢性阻塞性肺疾病和哮喘（參見O'Neill，Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003)，通過引用W其整體在此并入）。運些抗體還可W用于治療 神經(jīng)退行性自身免疫性疾病。（Lehnardt 掌，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8514- 8519(2003)，由此通過引用W其整體并入）。
[0137] 此外，本發(fā)明的抗體也可W用作治療劑治療疾病，例如骨關(guān)節(jié)炎，其由應(yīng)激引起， 例如，細(xì)胞應(yīng)激，運反過來又誘導(dǎo)觸發(fā)化R4的內(nèi)源性可溶的"應(yīng)激"因子。內(nèi)源可溶性應(yīng)激因 子包括，例如 Hsp60(參見 Ohashi 掌，J. Immunol. 164: 558-561 (2000))和纖連蛋白（參 見Okamura 掌，J. Biol.化em. 276: 10229-10233 (2001))?及硫酸肝素、透明質(zhì)酸、 即96、β-防御素-2或表面活性蛋白A(參見例如，Johnson等，Crit. Rev. Immunol., 23 (1-2):15-44 (2003)，其每個都由此通過引用W其整體并入）。本發(fā)明的抗體，還可W用于 治療各種與應(yīng)激相關(guān)的疾病，例如，置于呼吸機、通氣機和其它呼吸輔助裝置的受試者和患 者相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)激。例如，本發(fā)明的抗體還可用于治療通氣機誘導(dǎo)的肺損傷（"VILI")，也稱 為通氣相關(guān)性肺損傷（"VALI")。
[0138] 其中抑制化R4功能可能是有益的其它疾病領(lǐng)域包括，例如，慢性炎癥(例如，與過 敏性狀況和哮喘相關(guān)的慢性炎癥）、自身免疫性疾病(例如，炎性腸病)和動脈粥樣硬化(參 見0'化ill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003)，在此通過引用W其整體并入 本文）。
[0139] 運些免疫相關(guān)病癥相關(guān)的癥狀包括例如炎癥、發(fā)熱、全身不適、發(fā)熱、疼痛、常常定 位于發(fā)炎區(qū)域、快速脈搏、關(guān)節(jié)疼痛或酸痛(關(guān)節(jié)痛）、呼吸急促或其它異常呼吸模式、寒戰(zhàn)、 精神錯亂、定向力障礙、躁動、頭暈、咳嗽、呼吸困難、肺部感染、屯、力衰竭、呼吸衰竭、水腫、 體重增加、粘液脈性復(fù)發(fā)、惡病質(zhì)、喘鳴、頭痛和腹部癥狀例如腹痛、腹瀉或便秘。
[0140] 結(jié)合用于診斷或治療特定免疫相關(guān)病癥的任何已知方法來確定治療的功效。免疫 相關(guān)病癥的一種或更多種癥狀的減輕表明抗體賦予臨床益處。
[0141] 本發(fā)明的抗體，包括多克隆、單克隆、人源化和全人抗體，可W用作治療劑。運樣的 試劑通常用于治療或預(yù)防受試者中與給定祀的異常表達或激活相關(guān)的疾病或病理?？贵w制 劑，優(yōu)選一種對其祀抗原具有高特異性和高親和力的抗體制劑，給予受試者，并通常由于其 與祀標(biāo)結(jié)合而具有效果?？贵w的給予可W廢除或抑制或干擾祀的信號傳導(dǎo)功能?？贵w的給 予可W廢除或抑制或干擾祀與其天然結(jié)合的內(nèi)源性配體的結(jié)合。例如，抗體結(jié)合祀并中和 TLR4配體誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
[0142] 本發(fā)明的抗體的治療有效量通常設(shè)及實現(xiàn)治療目標(biāo)所需要的量。如上面所指出 的，運可W是抗體和其祀抗原之間的結(jié)合相互作用，其在某些情況下，干擾祀發(fā)揮功能。給 予所需的量將進一步取決于抗體對其特異性抗原的結(jié)合親和力，并且也將取決于所給予的 抗體從其給予的其它受試者的自由體積耗盡的速率。用于本發(fā)明的抗體或抗體片段的治療 有效給藥的共同范圍可W是，通過非限制性實例的方式，從約0.1 mg/kg體重至約50mg/kg體 重。共同給藥頻率范圍可W為，例如，每天兩次至每周一次。
[0143] 可藥物組合物的形式給予本發(fā)明的抗體或其片段，用于多種疾病和病癥的治 療。例如在Remington: The Science And Practice Of Pharma巧第19版（Alfonso R. Gennaro等編車茸）Mack Pub. Co. , Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts , Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, L 曰 nghorne, Pa., 1994; l^^,Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In F*arenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,化w 化rk中提供了 在制備此類組合物中設(shè)及的原則和考慮，W及組分選擇中的指導(dǎo)。
[0144] 藥物組合物可連同給藥說明書一起包括在容器、包裝或者分配器中。
[0145] 制劑還可包含一種W上活性化合物，例如所治療的特定適應(yīng)癥需要的抗化R4括抗 劑，優(yōu)選未不利彼此影響的具有互補活性的那些。備選地或者另外，組合物可包含提高其功 能的試劑，例如細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、化學(xué)治療劑或者生長抑制劑。運樣的分子合適W有 效用于預(yù)期目的的量組合存在。
[0146] 在一個實施方案中，活性化合物，例如抗-TLR4括抗劑，在組合療法中給予，即與可 用于治療病理病況或者病癥(例如各種形式的癌癥、自身免疫性病癥和炎性疾?。┑囊环N或 多種其它藥劑組合。在該背景中術(shù)語"組合"意指基本上同時（同時或者序貫）給予藥劑。如 果序貫給予，在開始給予第二種化合物時，兩種化合物中的第一種優(yōu)選在治療部位處W有 效濃度仍可檢出。
[0147] 例如，組合療法可包括本發(fā)明的一種或多種中和性抗化R4抗體，其與一種或多種 另外的治療劑，例如下文更詳細(xì)描述的一種或多種細(xì)胞因子和生長因子抑制劑、免疫抑制 劑、抗-炎性藥劑、代謝抑制劑、酶抑制劑和/或細(xì)胞毒性劑或者細(xì)胞生長抑制劑共配制和/ 或共給予。運樣的組合療法可有利地利用較低劑量的給予的治療劑，從而避免與各種單一 療法有關(guān)的可能的毒性或者并發(fā)癥。
[0148] 與本發(fā)明的中和性抗-TLR4抗體組合使用的優(yōu)選的治療劑是在不同階段干擾炎性 反應(yīng)的那些藥劑。在一個實施方案中，本文描述的一種或多種中和性抗-TLR4抗體可與一種 或多種另外的藥劑例如其它細(xì)胞因子或者生長因子括抗劑(例如可溶性受體、膚抑制劑、小 分子、配體融合物）；或者結(jié)合其它祀標(biāo)的抗體或者其抗原結(jié)合片段(例如結(jié)合其它細(xì)胞因 子或者生長因子、其受體或者其它細(xì)胞表面分子的抗體）；和抗-炎性細(xì)胞因子或者其激動 劑共配制和/或共給予。
[0149] 在使用抗體片段時，特異性結(jié)合到祀蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小抑制性片段和/或 干擾或W其它方式括抗化R4信號傳導(dǎo)的最小抑制性片段是優(yōu)選的。例如，基于抗體的可變 區(qū)序列，可設(shè)計膚分子，其保留結(jié)合祀蛋白序列的能力。此類膚可W化學(xué)合成和/或通過重 組DNA技術(shù)產(chǎn)生。（參見，例如Marasco 等，Proc.化tl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993))。制劑還可W包含一種W上的對于被治療的具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選 不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些。可選地，或另外地，所述組合物可包含增強其 功能的藥劑，例如細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、化療劑或生長抑制劑。運類分子W對于預(yù)定目的 有效的量適合地存在于組合中。
[0150] 化R4配體和其它生物標(biāo)記的水平使用各種標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)中的任一種來檢測。檢測 試劑可用于檢測樣品中給定祀標(biāo)(或其蛋白片段)的存在。在一些實施方案中，檢測試劑包 含可檢測標(biāo)記。在一些實施方案中，檢測試劑是抗體(或其片段)或者探針。在一些實施方案 中，所述試劑或者探針被標(biāo)記。關(guān)于探針或抗體的術(shù)語"標(biāo)記的"，旨在涵蓋通過偶聯(lián)（即物 理連接)可檢測物質(zhì)至探針或抗體的探針或抗體的直接標(biāo)記，W及通過與直接標(biāo)記的另一 種試劑的反應(yīng)性的探針或抗體的間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的實例包括使用巧光標(biāo)記的第二抗體 檢測第一抗體，和用生物素末端標(biāo)記DNA探針，使得它可W用巧光標(biāo)記的鏈霉親和素檢測。
[0151] 術(shù)語"生物樣品"旨在包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，W及受試者內(nèi) 存在的組織、細(xì)胞和流體。因此包括在術(shù)語"生物樣品"的使用內(nèi)的是血液和血液的級分或 成分，包括血清、血漿或淋己。體液可W是自受試者的身體內(nèi)的任何地方(優(yōu)選外周位置)分 離的流體，包括但不限于例如血液、血漿、血清、滑液、尿、疲、脊髓液、腦脊液、胸膜液;呼吸 道、腸道和泌尿生殖道的流體;唾液、器官系統(tǒng)內(nèi)流體、腹水、腫瘤囊液、羊水和其組合。生物 樣品還包括所有前述流體的實驗分離的部分。生物樣品還包括包含勻質(zhì)化固體材料例如糞 便、組織和生物活檢樣品的溶液或者混合物。本發(fā)明的檢測方法可用于在體外和體內(nèi)檢測 生物樣品中的分析物mRNA、蛋白或基因組DNA。例如，用于檢測分析物mRNA的體外技術(shù)包括 Nodhern雜交和原位雜交。用于檢測分析物蛋白的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定 (化ISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫巧光。用于檢測分析物基因組DNA的體外技術(shù)包括 Southern雜交。用于進行免疫測定的方法描述于，例如巧LISA: TheoiT and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (編輯）Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis和T. Christopoulus, Academic Press , Inc. , San Diego, CA, 1996 ;和"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays"， P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。此夕K 用于檢測分析物蛋白的體內(nèi)技術(shù)包括將標(biāo)記的抗分析物蛋白抗體引入受試者。例如，所述 抗體可用放射性標(biāo)記物標(biāo)記，所述放射性標(biāo)記物在受試者中的存在和位置可w通過標(biāo)準(zhǔn)成 像技術(shù)來檢測。
[0礎(chǔ)藥物組合物 本發(fā)明的抗體或可溶性嵌合多膚(本文也稱為"活性化合物"）及其衍生物、片段、類似 物和同源物可W滲入適合于給藥的藥物組合物。此類組合物典型地包含抗體或可溶性嵌合 多膚和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"旨在包括任何和 所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，與藥物給予相 容。合適的載體描述于該領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻最近版本的Remington' S Pharmaceutical Sciences,在此通過引用并入。運些載體或稀釋劑的優(yōu)選實例包括，但不限于，水、鹽水、林 格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用脂質(zhì)體和非水性載體，如固定油。用于 藥學(xué)活性物質(zhì)的運些介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域熟知的。除非在任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活 性化合物不相容的情況下，否則其在組合物中的使用是預(yù)期的。補充的活性化合物也可W 滲入組合物。
[0153] 本發(fā)明的藥物組合物被配制成與其預(yù)期給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括腸胃 夕h例如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服(例如，吸入）、經(jīng)皮（即，局部）、經(jīng)粘膜和直腸給藥。用于 腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可包括W下組分:無菌稀釋劑諸如注射用水、鹽水 溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑;抗菌劑諸如節(jié)醇或?qū)交郊姿峒?醋;抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氨鋼;馨合劑諸如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖劑諸如醋 酸鹽、巧樣酸鹽或憐酸鹽，和用于調(diào)整張度的試劑，諸如氯化鋼或葡萄糖。抑可W用酸或堿， 諸如鹽酸或氨氧化鋼調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可W封裝在由玻璃或塑料制成的安飯、一次性注射 器或多劑量小瓶中。
[0154] 適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(其中水可溶)或分散體和用于無菌 注射溶液或分散體的臨時制備的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑 菌水、聚氧乙締藍麻油化TM(BASF, Parsippany，N.J.)或憐酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況 下，組合物必須是無菌的，并且應(yīng)該是達到存在易注射性程度的流體。它必須在制造和儲存 條件下是穩(wěn)定的，并且必須防止微生物諸如細(xì)菌和真菌的污染作用下保存。載體可W是包 含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等），及其合適的混合物的溶劑 或分散介質(zhì)?？蒞保持適當(dāng)?shù)牧鲃有裕?，通過使用包衣如卵憐脂，通過在分散體的情況 下保持所需顆粒大小W及通過使用表面活性劑。防止微生物的作用可W通過各種抗細(xì)菌劑 和抗真菌劑來實現(xiàn)，例如對徑基苯甲酸醋類、氯下醇、苯酪、抗壞血酸、硫柳隸等。在許多情 況下，在組合物中將優(yōu)選包括等滲劑，例如糖類，多元醇諸如甘露醇、山梨醇，氯化鋼?？勺?射組合物的延長吸收可W通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸侶和明膠 來實現(xiàn)。
[0155] 可通過在適當(dāng)?shù)娜軇┲蠾所需量滲入活性化合物W及上面列舉的成分之一或組 合，根據(jù)需要，然后過濾滅菌來制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物滲入到含有基本 分散介質(zhì)的和來自上述列舉的那些所需其它成分的無菌媒介物來制備分散體。在用于制備 無菌注射液的無菌粉末的情況下，制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從其先前無菌過濾的 溶液獲得活性成分加上任何額外所需成分的粉末。
[0156] 口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可W封裝在明膠膠囊中或壓 成片劑。對于口服治療性給藥目的，活性化合物可w與賦形劑滲合并w片劑、錠劑或膠囊的 形式使用?？诜M合物也可W使用流體載體制備用作漱口水，其中在該流體載體中的化合 物經(jīng)口應(yīng)用并測洗及吐出或吞下。藥學(xué)上相容的粘合劑和/或佐劑材料可W包含作為組合 物的一部分。所述片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可含有任何W下成分或類似性質(zhì)的化合物:粘 合劑如微晶纖維素、黃著膠或明膠;賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如藻酸、Primogel或玉米 淀粉;潤滑劑如硬脂酸儀或Sterotes;助流劑如膠體二氧化娃;甜味劑如薦糖或糖精；或調(diào) 味劑如薄荷、水楊酸甲醋或澄調(diào)味劑。
[0157] 對于通過吸入給藥，化合物從加壓容器或分配器W氣溶膠噴霧的形式遞送，所述 加壓容器或分配器包含合適的推進劑，例如氣體如二氧化碳，或噴霧器。
[0158] 全身給藥也可通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，在制劑中使用對 待滲透的障礙合適的滲透劑。此類滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，用于經(jīng)粘 膜給藥，去垢劑，膽汁鹽和夫西地酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥可通過使用鼻噴霧劑或栓劑來實 現(xiàn)。對于經(jīng)皮給藥，將活性化合物配制成如本領(lǐng)域通常已知的軟膏、藥膏、凝膠或乳膏。
[0159] 所述化合物也可栓劑(例如，與常規(guī)的栓劑基質(zhì)一起，例如可可脂和其它甘油 醋)或滯留型灌腸劑的形式制備，用于直腸遞送。
[0160] 在一個實施方案中，與載體一起制備活性化合物，所述載體將保護化合物免于快 速從體內(nèi)消除，諸如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)?？蒞使用可生物降解的、生 物相容的聚合物，例如乙締乙酸乙締醋、聚酢、聚乙醇酸、膠原、聚原酸醋和聚乳酸。制備運 類制劑的方法對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。該材料也可W從Alza Corporation和Nova陸armaceuticals, Inc.商購獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括用針對病毒抗 原的單克隆抗體祀向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可W用作藥學(xué)上可接受的載體?？蒞根據(jù)本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備運些，例如如描述于美國專利號4,522,811。
[0161] W劑量單位形式配制口服或胃腸外組合物W易于給藥和使劑量均勻是特別有利 的。如本文所用劑量單位形式是指適合作為單一劑量用于待治療受試者的物理上離散的單 位;每個單位含有預(yù)定量的經(jīng)計算與所需的藥物載體聯(lián)合W產(chǎn)生期望治療效果的活性化合 物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格是由活性化合物的獨特性質(zhì)和要實現(xiàn)的特定治療效果W 及配制運種活性化合物用于個體治療的領(lǐng)域中固有的限制來決定，并直接取決于活性化合 物的獨特性質(zhì)和要實現(xiàn)的特定治療效果W及配制運種活性化合物用于個體治療的所述領(lǐng) 域中固有的限制。
[0162] 藥物組合物可W連同給藥說明書包括在容器、包裝或分配器中。
[0163] 本發(fā)明將在下面的實施例中進一步描述，其不限制權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范 圍。 實施例
[0164] 實施例1.材料和方法 通過包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物(cFb-IC)刺激的化R4活化的阻斷飛巧巧 法用于制備免疫復(fù)合物。在第一種方法中，兔多克隆抗體用于制備免疫復(fù)合物。簡言之，將 體外瓜氨酸化抗原(纖維蛋白原)鋪板和解育過夜，然后洗涂和封閉，之后在37°C與50 ug/ ml多克隆兔抗-纖維蛋白原抗體(Dako) -起解育2小時，接著洗涂。然后，將50,000個人單核 細(xì)胞來源的巨隧細(xì)胞(其用抗-TLR4括抗劑例如NI-0101抗體或者抗-Fc 丫 Rn抗體或者相關(guān) 的同種型對照抗體預(yù)處理)添加到板中。最后，解育16小時后，收獲上清液，和通過化ISA測 量促炎性細(xì)胞因子例如TNFa。
[0165] 在第二種方法中，自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者分離的IgG用于制備免疫復(fù)合物。簡 言之，將體外瓜氨酸化抗原(纖維蛋白原)鋪板和解育過夜，然后洗涂和封閉，之后在37Γ與 人RA-IgG (Img/ml) -起解育2小時，接著洗涂。然后，將50,000個人單核細(xì)胞來源的巨隧細(xì) 胞(其用抗-TLR4括抗劑例如NI-0101抗體、抗-化丫 RII抗體或者相關(guān)的同種型對照抗體預(yù) 處理)添加至板中。最后，解育16小時后，收獲上清液，和通過ELISA測量促炎性細(xì)胞因子例 如TN陽。
[0166] 測量包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物(ICc即)的水平掠、'mEXASk投禾稅予 測定來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的滑液樣品中包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物 (IC-cFb)的水平。簡言之，將小鼠抗-人瓜氨酸化纖維蛋白原（cFb)抗體3D1 (抗-cFb，克隆 3D1，# AM32004PU-N，來自AcriS)鋪板，解育過夜，洗涂和封閉，然后與來自RA患者的滑液 樣品一起在Ξ個重復(fù)孔中解育。抗-人-IgG-Fc-HRP (SIGMA, #A0170)用于檢測免疫復(fù)合 物。
[0167] 用來自RA患者的滑液刺激來自RA患者的滑液成纖維細(xì)胞 '篇液約獲城觀翰敬， 解育兩天，然后除去上清液，并加入新鮮的培養(yǎng)基。對于處理孔加入NI-0101或者同種型對 照(60 pg/mL，在培養(yǎng)基中，40化/孔），并將等體積的培養(yǎng)基加入未處理的對照孔。在解育 30分鐘后，將來自RA患者的滑液加入各孔，至在最終測定混合物中2.5%的濃度(40 μL孔的 7.5%滑液）。作為陽性對照，將1^^加入至1〇11旨/1111(40化/孔的30叫/1^1?5)。解育24小 時后，收集上清液和通過化ISA檢測促-炎性細(xì)胞因子例如白介素-6 (IL-6)。
[016引用來自Μ患者的滑液刺激來自Μ患者的外周血的單核細(xì)胞腳W單朦城觀趙m 患者的外周血使用MACS珠純化和用新鮮的培養(yǎng)基調(diào)整至1.25X106細(xì)胞/mL。然后將單核細(xì) 胞鋪板，并且對于處理孔，向處理孔中加入NI-0101或者同種型對照（60 pg/mL，在培養(yǎng)基 中，40化/孔），并將等體積的培養(yǎng)基加入未處理對照孔。解育30分鐘后，將來自RA患者的稀 釋的滑液加入至在最終測定混合物中20%、10%、5%或者2.5%的濃度。作為陽性對照，在Ξ個 重復(fù)孔中將LP巧日入至10 ng/mL (40 μL孔的30 ng/mL LPS)。解育24小時后，收集上清液， 和通過Luminex測定法檢測促-炎性細(xì)胞因子例如白介素-6 (化-6)、TNFa、化-ie、GM-CSF 和/或比-8。
[0169] 實施例2.患者樣品中升高水平的TLR4配體刺激細(xì)胞產(chǎn)生促-炎性細(xì)胞因子 檢測健康受試者(N滑液)或者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者(RA滑液)的滑液中包含的抗-瓜氨 酸化蛋白抗體(ACPA)和不同的TLR4配體(〇尸6-1(：、麗681、510048/^9和生腫蛋白〇的水平 (圖2A-2E)。在來自RA患者的樣品中檢測到升高水平的ACPA和TLR4配體。
[0170] 實施例3.使用抗-TLR4括抗劑抑制促-炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生 測量和分析不同的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RASF)對自RA患者分離的滑液成纖維細(xì)胞的 活化概況和刺激對運些樣品中化R4的依賴性。如圖3A中所示，發(fā)現(xiàn)來自患者# 1的RASF (RASF 1)刺激RA滑液成纖維細(xì)胞W產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子IL-6。該刺激通過存在抗-人化R4 mAb (例如NI-0101)而顯著阻斷。相比之下，圖3B顯示來自患者#2的RASF樣品(RASF 2)不能 刺激自RA滑液成纖維細(xì)胞的IL-6產(chǎn)生，和抗-TLR4 mAb在該情況下沒有作用。因此，患者樣 品刺激促-炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的能力可用作特定患者可能合適于用抗-TLR4括抗劑例如 中和性抗-TLR4抗體例如NI-0101治療的指示劑。
[0171] 進行類似的研究W檢測和分析不同的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RASF)對自RA患者分 離的人單核細(xì)胞的活化概況和刺激對化R4的依賴性（圖4)。圖4A、4B和4C描述來自患者#3的 RASF樣品（RASF 3)分別刺激自RA患者分離的人單核細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子IL-6JL8和TNF α的產(chǎn)生的能力。該刺激通過存在抗-人化R4 mAb (例如NI-0101)而顯著阻斷。相比之下，圖 4D、4E和4F描述來自患者#4的RASF樣品（RASF 4)不能刺激自RA患者分離的人單核細(xì)胞的 IL-6、IL8和TN化的產(chǎn)生，并且抗-TLR4 mAb在該情況下沒有作用。再次，運些研究表明，患者 樣品刺激促-炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的能力可用作特定患者可能合適于用抗-TLR4括抗劑例 如中和性抗TLR4抗體例如NI-0101治療的指示劑。
[0172] 實施例4.化R4配體和其它標(biāo)記的表達水平與被抗-TLR4括抗劑抑制的細(xì)胞刺激 的能力之間的相關(guān)性 圖5是一系列圖，其描述類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RASF)中抗-瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)或 者化R4配體的表達水平與被抗-人化R4 mAb抑制的細(xì)胞刺激的能力之間的相關(guān)性。TLR4配 體包括包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物（證b-IC)、高遷移率族蛋白B1化MGB1)、 S100A8/A9和生腫蛋白C。細(xì)胞類型包括RA患者滑液成纖維細(xì)胞(A)和RA患者單核細(xì)胞(B)。
[0173] 表1概述和關(guān)聯(lián)了 14名患者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液(RASF)中抗-瓜氨酸化蛋白抗 體(ACPA)、包含瓜氨酸化纖維蛋白原的免疫復(fù)合物(cFb-IC)、高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)、 S100A8/A9和生腫蛋白C的水平W及RASF誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力與RA血液單核細(xì)胞和RA 滑液成纖維細(xì)胞中被抗-人TLR4 mAb例如NI-0101處理阻斷的能力。
[0174] 表1
表1中使用的陰影表示使用W下任意闊值對ACPA和化R4配體陽性的RASF樣品:ACPA (〉 2000 叫/ml)，c即-Ic (〉1.5 0D)，HMGB1 (〉100 ng/ml)，S100 (〉500 nmg/ml)和生腫蛋白C (〉100 ng/ml)。
[01巧]實施例5. TLR4配體和其它生物標(biāo)記的統(tǒng)計分析 使用遞歸劃分和回歸樹(rpad)算法W得到最佳闊值，W便根據(jù)其分?jǐn)?shù)來分類數(shù)據(jù)。各 樹的性能通過檢查其混亂矩陣來評價。當(dāng)可獲得多個方案時，選擇具有最低復(fù)雜性的樹，即 具有最小數(shù)量的節(jié)點和分裂的那些。Ξ個重復(fù)的均值用作生物標(biāo)記值。
[0176] 對于用抗-TLR4抗體NI-0101治療的單核細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分，分析最佳 個體分類器。對于單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)包括ACPA、cFb-IC、HMGBl和S100A8/A9的幾種標(biāo)記物是單 核細(xì)胞反應(yīng)評分的優(yōu)良預(yù)測物，其中S100A8/A9是最佳個體分類器。如果滑液中檢測的 S100A8/A9的水平設(shè)定在387 ng/ml，該標(biāo)記物W80%準(zhǔn)確率預(yù)測對NI-0101治療的100%的無 反應(yīng)者和W89%準(zhǔn)確率預(yù)測100%的有反應(yīng)者。在試驗樣品中，36% (4/5)的鑒定的受試者不 具有單核細(xì)胞中檢測的大于或者等于387的S100A8/A9的水平，而64% (8/9)的受試者的確 具有滑液中檢測的大于或者等于387的S100A8/A9的水平。
[0177] 對于成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)cFb-IC是成纖維細(xì)胞反應(yīng)的最佳個體預(yù)測物。如果滑液中 檢測的cFb-IC的水平(0D 45化m讀數(shù))設(shè)定為1.2，則該標(biāo)記物W90%準(zhǔn)確率預(yù)測對NI-0101 治療的100%的無反應(yīng)者和W100%準(zhǔn)確率預(yù)測80%的有反應(yīng)者。在試驗樣品中，73% (10/11) 的鑒定的受試者不具有成纖維細(xì)胞中檢測的大于或者等于1.2的cFb-IC的水平，而27% (4/ 4)的受試者的確具有滑液中檢測的大于或者等于1.2的cFb-IC的水平。
[017引通過響應(yīng)用NI-0101治療的組合的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分（cMFRS)的標(biāo) 記物水平按圖7中所示進行評價。
[0179] 進一步評價鑒定了標(biāo)記物ACPA和cFb-IC顯示RASF樣品中的相關(guān)性趨勢，類似地， 標(biāo)記物S100A8/A9和HMGB1顯示RASF樣品中的相關(guān)性趨勢（圖8)。發(fā)現(xiàn)運兩種串列互不依賴。
[0180] 還發(fā)現(xiàn)對于用抗-人化R mAb NI-0101治療的組合的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng) 評分（cMFRS)，標(biāo)記物ACPA、證b-IC、HMGBl和S100A8/A9各自單獨是優(yōu)良的預(yù)測物。發(fā)現(xiàn) ACPA、c即-1C和HMGB1的每一個顯示相同的預(yù)測能力，其中發(fā)現(xiàn)每個標(biāo)記物W100%準(zhǔn)確率預(yù) 測對NI -0101治療的75%的無反應(yīng)者和W 91%準(zhǔn)確率預(yù)測100%的有反應(yīng)者。具體而言，在試驗 樣品中，21% (3/3)的鑒定的受試者不具有滑液中檢測的大于或者等于330 Ul/ml的ACPA的 水平，而79% (10111)的受試者的確具有滑液中檢測的大于或者等于330 Ul/ml的ACPA的水 平。在試驗樣品中，21% (3/3)的鑒定的受試者不具有滑液中檢測的大于或者等于0.55的 cFb-IC的水平，而79% (10111)的受試者的確具有滑液中檢測的大于或者等于0.55的cFb- IC的水平(0D 450nm讀數(shù)）。在試驗樣品中，21% (3/3)的鑒定的受試者不具有滑液中檢測的 大于或者等于45 ng/ml的HMGB1的水平，而79% (10/11)的受試者的確具有滑液中檢測的大 于或者等于45的HMGB1的水平。
[0181] S100A8/A9和cFb-IC的組合提供用于預(yù)測對用抗-人化R mAb NI-0101治療的組合 的單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)評分(cMFRS)的最佳分類器。如果發(fā)現(xiàn)滑液中檢測的S100A8/ A9的水平大于或者等于387 ng/ml并且發(fā)現(xiàn)滑液中檢測的cFb-IC的水平大于或者等于1.2 (0D 450nm讀數(shù)），發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記物組合W80%準(zhǔn)確率預(yù)測對NI-0101治療的100%的無反應(yīng)者和 W100%準(zhǔn)確率預(yù)測90%的有反應(yīng)者（圖9)。盡管各單獨標(biāo)記物S100A8/A9和cFb-IC是cMFRS的 優(yōu)良的預(yù)測物，但兩者的組合是最佳的預(yù)測物。
[0182] 其它標(biāo)記物組合是單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的合適的預(yù)測物。例如，單核細(xì)胞 和成纖維細(xì)胞反應(yīng)的預(yù)測物是選自W下的組合：（i) S100A8/A9和HMGB1; (ii) S100A8/A9 和cFb-IC;(iii) S100A8/A9和ACPA;(iv) ACPA和cFb-IC;(v) ACPA和HMGBl;(vi) HMGBl和 c即-IC;(vii) S100A8/A9、ACPA和HMGBl;(viii) S100A8/A9、ACPA和cFb-IC;(ix) S100A8/ A9、c訊-IC和HMGB1;(X) ACPA、HMGB1和c訊-IC;和（Xi) S100A8/A9、c訊-IC、ACPA和HMGB1。
[0183]其它實施方案 盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)描述進行了描述，但前述描述意欲說明而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的范圍通過隨附權(quán)利要求書的范圍來定義。其它方面、優(yōu)勢和改變在隨附權(quán)利 要求書的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種減輕病癥的癥狀的方法，所述方法包括檢測來自受試者的生物樣品中一種或多 種TLR4配體或者一種或多種其它生物標(biāo)記的水平，將檢測的一種或多種TLR4配體或者一種 或多種生物標(biāo)記的水平與對照表達水平相比較，和當(dāng)檢測的水平升高時，給予所述受試者 足以減輕所述病癥的癥狀的量的抗-TLR4拮抗劑。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種TLR4配體或者一種或多種生物標(biāo)記選自抗-瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)、瓜氨酸化蛋白、HMGBl、S100A8/A9、生腱蛋白C和其組合。3. 權(quán)利要求2的方法，其中瓜氨酸化蛋白是瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化纖維蛋白、 瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化組蛋白、瓜氨酸化烯醇酶或者瓜氨酸化趨化因子。4. 權(quán)利要求3的方法，其中瓜氨酸化組蛋白是瓜氨酸化組蛋白2b。5. 權(quán)利要求3的方法，其中瓜氨酸化趨化因子是瓜氨酸化CXCLlO。6. 權(quán)利要求2的方法，其中瓜氨酸化蛋白在免疫復(fù)合物中。7. 權(quán)利要求6的方法，其中在免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化蛋白是在與IgG蛋白的免疫復(fù)合 物(cFb-IC)中的瓜氨酸化纖維蛋白原(cFb)。8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是血液或者源自血液。9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是尿或者源自尿。10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是滑液或者源自滑液。11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-TLR4拮抗劑是抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段。12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段包含可變重鏈互 補決定區(qū)I (VH CDR1)，其包含氨基酸序列GGYSWH (SEQ ID NO: 1);VH CDR2區(qū)，其包含氨 基酸序列YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 2);VH CDR3區(qū)，其包含氨基酸序列KDPSDAFPY (SEQ ID NO: 3);可變輕鏈互補決定區(qū)I (VL CDRl)區(qū)，其包含氨基酸序列RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 4);VL CDR2區(qū)，其包含氨基酸序列YASHAIS (SEQ ID NO: 5);和VL CDR3區(qū)， 其包含氨基酸序列QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 6)。13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段包含重鏈可變氨 基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPSLKTRIT ISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSDAFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7)和輕鏈可變氨 基酸序列 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFSGSGSGT DFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 8)〇14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述抗-TLR4抗體或者其免疫活性片段包含重鏈氨基酸 序列 MGWSWIFLFLLSGTAGVHCQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHY SGYTDFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSDAFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9)和輕鏈氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEIVLTQSPDFQSVTPKEK VTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFP LTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 10)〇15. 權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是人。16. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是自身免疫病癥或者炎性病癥。17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與TLR4信號傳導(dǎo)異常、TLR4配體表達或者活性升 高、促-炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生異常和其組合有關(guān)。18. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。19. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是動脈粥樣硬化。20. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與器官或組織移植有關(guān)。21. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與急性肺損傷有關(guān)。22. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與缺血/再灌注損傷有關(guān)。
【文檔編號】C07K16/28GK105899231SQ201480070143
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月22日
【發(fā)明人】C.德敏, L.商, E.蒙內(nèi), G.埃爾森, E.哈特雷爾
【申請人】諾夫免疫股份有限公司