一種對(duì)頸椎病和失眠均具有治療作用藥物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，提供了一種治療頸椎病與失眠的藥物組合物，發(fā)明名稱為一種對(duì)頸椎病和失眠均具有治療作用的藥物及其制備方法，該藥物組合物是由以下重量份的原料制成的：櫟葉槲蕨1～3、鐵馬豆1～3、東北衛(wèi)矛1～3。該藥物組合物采用中藥學(xué)中常規(guī)的制藥方法制備成片劑、丸劑、硬膠囊劑、顆粒劑。制法為：取櫟葉槲蕨、鐵馬豆、東北衛(wèi)矛，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小時(shí)，煎煮2～4次，每次0.5～2小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，即得。本發(fā)明還提供了采用高效液相色譜法和氣相色譜法對(duì)藥物組合物進(jìn)行含量測(cè)定的方法。研究表明，本發(fā)明藥物對(duì)頸椎病和失眠均具有顯著的治療效果。
【專利說明】
一種對(duì)頸椎病和失眠均具有治療作用藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及一種對(duì)頸椎病和失眠具有雙重治療作用的藥物組合 物，具體涉及一種由為櫟葉槲蕨、鐵馬豆、東北衛(wèi)矛為原料制成的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 椎動(dòng)脈型頸椎病是由于頸椎的不穩(wěn)定、頸椎正常曲線的改變、椎體以及鉤椎關(guān)節(jié) 的骨質(zhì)增生，直接刺激椎動(dòng)脈使之痙攣，或壓迫使之扭曲、狹窄、閉塞等，致使椎-基底動(dòng)脈 血流量減少，從而產(chǎn)生椎-基底動(dòng)脈供血不足的癥狀，主要表現(xiàn)為眩暈、血管性頭痛、視覺障 礙和上肢麻木，可伴有耳鳴、眼球震顫，還可出現(xiàn)一側(cè)肌力減弱及腱反射亢進(jìn)。
[0003] 椎動(dòng)脈型頸椎病較之脊髓型頸椎病略為多見因其中大多系由于椎節(jié)不穩(wěn)所致，易 經(jīng)非手術(shù)療法治愈或好轉(zhuǎn)，故住院及需手術(shù)者較少。椎動(dòng)脈型頸椎病是因?yàn)樽祫?dòng)脈受壓迫 或刺激而引起其供血不足所產(chǎn)生的一系列癥狀。頸椎是活動(dòng)量最大的脊柱節(jié)段，因而易產(chǎn) 生勞損，并隨著年齡的增長及損傷的積累而發(fā)生頸椎退行性變，尤其是4~5,5~6頸椎段是 個(gè)多事的椎段。因?yàn)轭i椎退變包括向后方突出的椎間盤，鉤椎關(guān)節(jié)或椎體骨刺，以及椎體半 脫位或上關(guān)節(jié)突向方滑脫，都可壓迫椎動(dòng)脈或刺激椎動(dòng)脈周圍之交感神經(jīng)叢，使椎動(dòng)脈痙 攣，管腔狹窄，造成椎基底動(dòng)脈供血不足，引起一系列臨床癥狀。椎動(dòng)脈型頸椎病是中老年 人的常見病。
[0004] 頸椎病患者中約70%有椎動(dòng)脈受累。50歲以上頭暈，頭痛者。50%以上與頸椎病引起 的椎基底動(dòng)脈受累有關(guān)。在臨床上易有"頸椎眩暈"，"椎動(dòng)脈壓迫綜合癥"等診斷，又稱為 "頸性偏頭痛"。椎動(dòng)脈型頸椎病的臨床特征，最常見的是頭痛，眩暈和視覺障礙等。頭痛主 要由于枕大神經(jīng)病變。常呈發(fā)作性疼痛，持續(xù)數(shù)分鐘，數(shù)小時(shí)乃至更長，偶爾也可為持續(xù)性 疼痛，陣發(fā)性加劇。疼痛的性質(zhì)各人的情況不一樣。一般稱跳痛(搏動(dòng)性痛)或灼熱痛，而且 局限于一側(cè)頸枕部或枕頂部，同時(shí)伴有酸，脹等異常感覺。疼痛多于早晨起床后，轉(zhuǎn)動(dòng)頭頸 部或乘車顛簸時(shí)發(fā)生或加劇。少數(shù)患者呈現(xiàn)疼痛過敏，觸及患不透皮時(shí)疼痛難忍，甚至觸碰 頭發(fā)時(shí)即感劇痛，十分苦惱。疼痛發(fā)作時(shí)，常起自頸部，迅速擴(kuò)展至耳后及枕頂部，或向眼眶 區(qū)和鼻根部發(fā)射。有的患者在發(fā)作前有先兆，如出現(xiàn)"眼前發(fā)黑"，"閃光"等視覺癥狀。
[0005] 失眠，即睡眠失常。表現(xiàn)為入睡困難，斷斷續(xù)續(xù)不連貫，而過早地醒來，醒后不能再 繼續(xù)睡，有睡眠不足，全身乏力，倦怠感覺，多因健康情況不佳，疼痛、感覺不適，生理節(jié)奏被 打亂，睡眠環(huán)境影響等，也有怕睡眠而失眠的。
[0006] 失眠是由于情志、飲食內(nèi)傷，或病后及年邁，稟賦不足，心虛膽怯等病因，引起心神 失養(yǎng)或心神不安，從而導(dǎo)致經(jīng)常不能獲得正常睡眠為特征的一類病癥。
[0007] 主要表現(xiàn)為睡眠時(shí)間深度的不足、以及不能消除疲勞、恢復(fù)體力與精力，輕者入睡 困難，或寐而不酣，時(shí)寐時(shí)醒，或醒后不能再寐，重則徹夜不寐。
[0008] 失眠是臨床常見病癥之一，雖不屬于危重疾病，但妨礙人們正常生活、工作、學(xué)習(xí) 和健康，并能加重或誘發(fā)心悸、胸痹、眩暈、頭痛、中風(fēng)病等病癥。頑固性的失眠，給病人帶來 長期的痛苦，甚至形成對(duì)安眠藥物的依賴，而長期服用安眠藥物又可引起醫(yī)源性疾病。
[0009]失眠在《內(nèi)經(jīng)》中稱為"目不瞑"、"不得眠"、"不得臥"，并認(rèn)為失眠原因主要有兩 種:一是其他病癥影響，如咳嗽、嘔吐、腹?jié)M等，使人不得安臥;二是氣血陰陽失和，使人不能 入寐。
[0010]本發(fā)明提供了一種對(duì)頸椎病和失眠均具有治療作用藥物，研究表明，本發(fā)明藥物 對(duì)頸椎病和失眠的治療效果顯著。
[0011]本發(fā)明藥物組合物的基原如下： 櫟葉槲蕨為槲蕨科槲蕨屬植物櫟葉槲蕨Pixoaria guerci/Wia α.Λ/. [polypodium quercifolium L.他敢蓋。
[0012] 鐵馬豆為豆科宿荀豆屬植物毛宿荀豆j〇afflpa/3i/3ia/3a Z/a/3c/.-ifazz.的全 草。
[0013] 東北衛(wèi)矛為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物毛脈衛(wèi)矛a_/aius Ka_r. jOt/Aescaos ifaxiffl.的帶翅莖枝或根。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供一種治療頸椎病和失眠的藥物組合物。
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供該藥物組合物的制備方法和質(zhì)量檢測(cè)方法。
[0016] 本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制藥用途。
[0017] 本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的： 一種對(duì)頸椎病與失眠具有雙重治療作用的藥物組合物，該藥物組合物是由以下重量份 的原料制成的:櫟葉槲蕨1~3、鐵馬豆1~3、東北衛(wèi)矛1~3。
[0018] 所述的藥物組合物優(yōu)選是由以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北 衛(wèi)矛1 〇
[0019] 所述的藥物組合物優(yōu)選是由以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆2、東北 衛(wèi)矛3。
[0020] 所述的藥物組合物采用中藥學(xué)中常規(guī)的制藥方法制備成片劑、丸劑、硬膠囊劑、顆 粒劑。
[0021] 所述的藥物組合物優(yōu)選采用如下方法制備:取櫟葉槲蕨、鐵馬豆、東北衛(wèi)矛，混合， 加入3~15倍量的水浸泡0.5~2小時(shí)，煎煮2~4次，每次0.5~2小時(shí)，提取液合并，濾過，濾 液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。
[0022] -種對(duì)頸椎病與失眠具有雙重治療作用的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組 合物是由以下重量份的原料制成的：櫟葉槲蕨1~3、鐵馬豆1~3、東北衛(wèi)矛1~3,可以采用 高效液相色譜法對(duì)藥物組合物中的穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮進(jìn)行含量測(cè)定： (1)色譜條件:Waters SunFire Cis色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為280~290nm;柱溫:25~35°C ;流 速:0.5~1.5mL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每 lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每 lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的備液； ③ 對(duì)照品混合溶液：分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取置容量瓶中，加甲醇，超聲處理，放置 至室溫后，用甲醇補(bǔ)充，經(jīng)離心，取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定:取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各2 ~10yL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。
[0023] 所述的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組合物是由以下重量份的原料制成 的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1，采用高效液譜法對(duì)穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基 丙酮進(jìn)行含量測(cè)定，優(yōu)選步驟為： (1) 色譜條件:Waters SunFire Cis色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為284nm;柱溫：30°C;流速： l.OmL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的貯備液； ③ 對(duì)照品混合溶液:分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備溶液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度， 150W，50kHz超聲處理10min，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充至刻度，經(jīng)3000r · min-1離心10min， 取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定:取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各5μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定。
[0024] -種對(duì)頸椎病與失眠具有雙重治療作用的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組 合物是由以下重量份的原料制成的：櫟葉槲蕨1~3、鐵馬豆1~3、東北衛(wèi)矛1~3,可以采用 氣相色譜法對(duì)藥物組合物中的2，3，6-三甲基茴香醚進(jìn)行含量測(cè)定： (1)色譜條件:SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50 °C，以15 °C · mirT1速率升到 150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比5~7:1;檢測(cè)器溫度200~240°C ;進(jìn)樣口溫 度 180 ~220°C; (2) 對(duì)照品溶液:精密稱取2,3,6_三甲基茴香醚，置容量瓶中，用環(huán)己烷溶解并定容，配 成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3) 供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物，加水，照《中國藥典》2015年版第四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入 燒瓶為止，加環(huán)己烷，連接回流冷凝管，加熱保持微沸，放冷，將測(cè)定器中的液體移至分液漏 斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液， 置容量瓶中，加環(huán)己烷，搖勻，即得； (4) 測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1~5yL，注入氣相色譜儀，測(cè)定。
[0025] 所述的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組合物是由以下重量份的原料制成 的：櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1，采用氣相色譜法對(duì)2,3,6_三甲基茴香醚進(jìn)行含量測(cè) 定，優(yōu)選步驟為： (1)色譜條件:SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50 °C，以15 °C · mirT1速率升到 150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比6:1;檢測(cè)器溫度220°C ;進(jìn)樣口溫度200°C ; (2 )對(duì)照品溶液:精密稱取2，3，6-三甲基茴香醚6.6mg，置1 OmL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解 并定容至刻度，配成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3 )供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物50mg，加水250mL，照《中國藥典》2015年版第四部 通則2204揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分， 并溢流入燒瓶為止，加環(huán)己烷3mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸4h，放冷，將測(cè)定器中的 液體移至分液漏斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取2次，每次3mL，用鋪有無水硫酸 鈉〇.5g的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液，置25mL容量瓶中，加環(huán)己烷至刻度，搖勻，即得； (4)測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各lyL，注入氣相色譜儀，測(cè)定。
[0026] -種藥物組合物在制備治療椎動(dòng)脈型頸椎病藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物是由以 下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1。
[0027] -種藥物組合物在制備治療肩周炎藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物是由以下重量份 的原料制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1。
[0028]通過如下實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果： 實(shí)驗(yàn)例一:本發(fā)明藥物組合物治療椎動(dòng)脈型頸椎病的臨床觀察 1資料與方法 1.1 一般資料 病例納入標(biāo)準(zhǔn)： (1) 臨床診斷為椎動(dòng)脈型頸椎病，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1992年第二屆頸椎病專題座談會(huì)制定 的標(biāo)準(zhǔn)(第二屆頸椎病專題座談會(huì)紀(jì)要.中華外科雜志，1993,31 (8): 472-476.); (2) 排除頸椎間盤突出、頸椎滑脫、頸椎占位病變、妊娠或哺乳期婦女、糖尿病、精神病 及出血傾向患者。共26患者符合病例納入標(biāo)準(zhǔn)，年齡22~50歲，平均38.5歲；病程最長5年， 最短8個(gè)月。
[0029] 1.2治療方法 患者自入院后予以本發(fā)明說明書中實(shí)施例1所述的本發(fā)明藥物組合物，口服，一次2片， 一日3次，服用1個(gè)月。
[0030] 1.3觀察項(xiàng)目及指標(biāo)參照文獻(xiàn)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(鄭筱萸.中藥新藥 臨床研究指導(dǎo)原則(試行）.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002.346-349)。
[0031] 1.3.1臨床癥狀及體征評(píng)分 (1)眩暈程度： ① 無眩暈，0分； ② 輕度眩暈尚可忍受，能正常行走，對(duì)工作生活無明顯影響，1分； ③ 中度眩暈，較難忍受，行走有困難，需扶持或坐下，對(duì)工作生活有較大影響，2分； ④ 重度眩暈，無法忍受，需臥床，對(duì)工作生活有嚴(yán)重影響，3分。
[0032] (2)眩暈時(shí)間： ① 無眩暈，0分； ② 〈60 min/d，l分； ③ 61 ~240 min/d，2分； ④ >240 min/d，3分。
[0033] (3)眩暈頻率： ① 無眩暈，0分； ② 〈5次/周，1分； ③ 6~20次/周，2分； ④ >20次/周，3分。
[0034] (4)頭痛： ① 無頭痛，〇分； ② 輕度疼痛，尚可忍受，對(duì)工作生活無明顯影響，1分； ③ 中度疼痛，較難忍受，對(duì)工作生活有較大影響，2分； ④ 重度疼痛，無法忍受，對(duì)工作生活有嚴(yán)重影響，3分。
[0035] (5)旋頸試驗(yàn)： ① 旋頸試驗(yàn)陰性，0分； ② 旋頸試驗(yàn)陽性，1分； ③ 旋頸試驗(yàn)強(qiáng)陽性，2分。
[0036] 1.3.2血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 取患者靜脈血4 ml，置于1:40烘干的肝素抗凝管中混勻，在4 h內(nèi)完成血液流變學(xué)指標(biāo) 檢測(cè)，血液標(biāo)本在用藥前后各收集1次。采用上海LIANG-100型血液黏度儀進(jìn)行檢測(cè)，BME-1 生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
[0037] 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)采用SAS 3.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均數(shù)用 g±s表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。
[0038] 2 結(jié)果 2.1椎動(dòng)脈型頸椎病患者治療前后臨床癥狀及體征的比較 本發(fā)明藥物組合物治療后，患者的臨床癥狀及體征均有明顯改善，與治療前比較差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 01)。見表1-1。
[0039] 表1-1本發(fā)明藥物組合物治療前后患者癥狀及體征評(píng)分的比較(I土s)
注:與治療前比較，**P〈〇. 01。
[0040] 2.2椎動(dòng)脈型頸椎病患者治療前后血液流變學(xué)指標(biāo)的比較 本發(fā)明藥物組合物治療后，患者全血黏度低、高切變率，血漿比黏度，血細(xì)胞壓積，紅細(xì) 胞電泳時(shí)間及血沉較治療前均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05或P〈0.01)。見表1-2〇
[0041] 表1-2本發(fā)明藥物組合物治療前后患者血液流變學(xué)指標(biāo)的比較(|土s)
注：與治療前比較，*P〈〇. 05，#P〈0.01。
[0042] 本研究結(jié)果顯示：26例椎動(dòng)脈型頸椎病患者經(jīng)本發(fā)明藥物組合物治療后，臨床癥 狀及體征均有明顯改善(P〈〇. 01);血液流變學(xué)指標(biāo)中全血黏度低、高切變率，血漿比黏度， 血細(xì)胞壓積，紅細(xì)胞電泳時(shí)間及血沉較治療前均有明顯下降(P〈〇. 05或P〈0.01)。表明本發(fā) 明藥物組合物可以通過改善椎-基底動(dòng)脈的微循環(huán)，從而緩解椎動(dòng)脈型頸椎病患者的臨床 癥狀及體征。
[0043] 實(shí)驗(yàn)二:本發(fā)明藥物治療失眠的實(shí)驗(yàn)研究 1實(shí)驗(yàn)材料 藥品： 本發(fā)明藥物:處方:櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g;制法:取櫟葉槲蕨333g、 鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為 1 OOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻， 壓片，即得。
[0044] 對(duì)比藥物甲：處方：鐵馬豆500g、東北衛(wèi)矛500g;制法：取鐵馬豆500g、東北衛(wèi)矛 500g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1小 時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。
[0045]對(duì)比藥物乙：處方:櫟葉槲蕨500g、東北衛(wèi)矛500g;制法:取櫟葉槲蕨500g、東北衛(wèi) 矛500g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1 小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。
[0046]對(duì)比藥物丙：處方：櫟葉槲蕨500g、鐵馬豆500g;制法：取櫟葉槲蕨500g、鐵馬豆 500g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1小 時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。
[0047]戊巴比妥鈉:北京大田豐拓化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)； 硝酸士的寧注射液:北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)； 安定注射液:天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)； 動(dòng)物:昆明種小鼠，體重18g~22g，雌性兼用，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。 [0048] 2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 2.1對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的研究 小鼠72只，雌雄不拘，隨機(jī)分為6組，即生理鹽水對(duì)照組、對(duì)比藥物甲組、對(duì)比藥物乙組、 對(duì)比藥物丙組、本發(fā)明藥物組，安定陽性對(duì)照組，每組12只。
[0049] 給藥前把小鼠投入動(dòng)物活動(dòng)箱中適應(yīng)5分鐘后，記錄2分鐘的動(dòng)物走動(dòng)時(shí)間和前肢 向上抬舉次數(shù)的數(shù)值作為正常值。
[0050] 然后分別給予： 對(duì)比藥物甲組:灌胃給對(duì)比藥物甲細(xì)粉l〇.〇g · kg'灌胃劑量為5ml · kg'給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物乙組:灌胃給對(duì)比藥物乙細(xì)粉l〇.〇g · kg'灌胃劑量為5ml · kg'給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物丙組:灌胃給對(duì)比藥物丙細(xì)粉l〇.〇g · kg<，灌胃劑量為5ml · kg<，給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 本發(fā)明藥物組:灌胃給化本發(fā)明藥物細(xì)粉l〇.〇g · kg<，灌胃劑量為5ml · kg<，給藥體 積為0.2ml/10g，灌胃； 安定陽性對(duì)照組給予lmg/kg安定，灌胃； 生理鹽水對(duì)照組給予同體積生理鹽水，灌胃。
[0051] 各組小鼠于給藥后60分鐘，按同法測(cè)定小鼠走動(dòng)時(shí)間及雙前肢向上抬舉次數(shù)。結(jié) 果以i 土 S表不，結(jié)果見表2_1。
[0052] 表2-1對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)的影響(_±S，n= 12)
注:與生理鹽水組比較，※P〈 0.05，* P〈 0.01; 與安定組比較P > 〇.〇5;OP〈 0.05。
[0053] 表中結(jié)果顯示：本發(fā)明藥物對(duì)小鼠均有明顯的鎮(zhèn)靜作用，與生理鹽水組比較有顯 著差異(P〈 0.01)。本發(fā)明藥物組鎮(zhèn)靜作用明顯，與安定組比較無差異(P> 0.05)。結(jié)果表 明：本發(fā)明藥物有明顯的鎮(zhèn)靜作用。而且，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，對(duì)比藥物甲（由鐵馬豆、東 北衛(wèi)矛制成）、對(duì)比藥物乙（由櫟葉槲蕨、東北衛(wèi)矛制成）以及對(duì)比藥物丙（由櫟葉槲蕨、鐵馬 豆制成）的治療效果不明顯，由此可見，本發(fā)明藥物中的櫟葉槲蕨、鐵馬豆和東北衛(wèi)矛三種 藥味，缺一不可，缺少任何一種藥味，其藥物組合物的作用效果都將大大降低，三種藥味組 合，產(chǎn)生了明顯的一加一大于二的協(xié)同增效作用。
[0054] 2.2對(duì)小鼠睡眠影響的研究 2.2.1對(duì)小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響 小鼠72只，隨機(jī)分為6組，即生理鹽水對(duì)照組，對(duì)比藥物甲組、對(duì)比藥物乙組、對(duì)比藥物 丙組、本發(fā)明藥物組，安定陽性對(duì)照組，每組12只。
[0055] 對(duì)比藥物甲組：灌胃給對(duì)比藥物甲細(xì)粉lO.Og · kg'灌胃劑量為5ml · 1^1，給藥 體積為〇 · 2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物乙組:灌胃給對(duì)比藥物乙細(xì)粉l〇.〇g · kg'灌胃劑量為5ml · kg'給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物丙組:灌胃給對(duì)比藥物丙細(xì)粉l〇.〇g · kg<，灌胃劑量為5ml · kg<，給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 本發(fā)明藥物組:灌胃給化本發(fā)明藥物細(xì)粉l〇.〇g · kg<，灌胃劑量為5ml · kg<，給藥體 積為0.2ml/10g，灌胃； 安定陽性對(duì)照組給予lmg/kg安定，灌胃； 生理鹽水對(duì)照組給予同體積生理鹽水，灌胃。
[0056]灌胃給藥60分鐘后，每組小鼠分別給予戊巴比妥鈉40mg/kg，腹腔注射。記錄小鼠 的睡眠時(shí)間（以翻正反射消失為入睡時(shí)間，從翻正反射消失至恢復(fù)時(shí)間為睡眠持續(xù)時(shí)間）。 結(jié)果見表2-2。
[0057] 表2-2對(duì)小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響fl±S，n= 12)
2.2.2對(duì)小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量的影響 小鼠72只，隨機(jī)分為6組，即生理鹽水對(duì)照組、對(duì)比藥物甲組、對(duì)比藥物乙組、對(duì)比藥物 丙組、本發(fā)明藥物組、安定陽性對(duì)照組，每組12只。
[0058] 對(duì)比藥物甲組：灌胃給對(duì)比藥物甲細(xì)粉10.0g · kg-S灌胃劑量為5ml · kg-S給藥 體積為〇 · 2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物乙組:灌胃給對(duì)比藥物乙細(xì)粉l〇.〇g · kg'灌胃劑量為5ml · kg'給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物丙組:灌胃給對(duì)比藥物丙細(xì)粉l〇.〇g · kg<，灌胃劑量為5ml · kg<，給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 本發(fā)明藥物組:灌胃給化本發(fā)明藥物細(xì)粉l〇.〇g · kg^1，灌胃劑量為5ml · kg^1，給藥體 積為0.2ml/10g，灌胃； 安定陽性對(duì)照組給予lmg/kg安定，灌胃； 生理鹽水對(duì)照組給予同體積生理鹽水，灌胃。
[0059]給藥30分鐘后，各組小鼠分別給予戊巴比妥鈉30mg/kg，腹腔注射，觀察并記錄入 睡動(dòng)物數(shù)（15分鐘內(nèi)小鼠翻正反射消失達(dá)1分鐘上的鼠數(shù)作為入睡動(dòng)物數(shù)），計(jì)算入睡率。結(jié) 果見表2-3。
[0060] 表2-3對(duì)小鼠戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響
以上兩實(shí)驗(yàn)均說明了本發(fā)明藥物對(duì)小鼠均有明顯的催眠作用，與生理鹽水組比較有顯 著差異(P〈 0.01)。本發(fā)明藥物組具有明顯的催眠作用，而且，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，對(duì)比 藥物甲（由鐵馬豆、東北衛(wèi)矛制成）、對(duì)比藥物乙（由櫟葉槲蕨、東北衛(wèi)矛制成）以及對(duì)比藥物 丙（由櫟葉槲蕨、鐵馬豆制成）的催眠作用效果不明顯，幾乎是沒有催眠作用。由此可見，本 發(fā)明藥物中的櫟葉槲蕨、鐵馬豆和東北衛(wèi)矛三種藥味，缺一不可，缺少任何一種藥味，其藥 物組合物的作用效果都將大大降低，三種藥味組合，產(chǎn)生了明顯的一加一大于二的協(xié)同增 效作用。
[0061] 2.3抗硝酸士的寧驚厥發(fā)作作用的研究 小鼠72只，雌雄不拘，隨機(jī)分為6組，即生理鹽水對(duì)照組、對(duì)比藥物甲組、對(duì)比藥物甲 組、本發(fā)明藥物組、安定陽性對(duì)照組，每組12只。
[0062] 對(duì)比藥物甲組：灌胃給對(duì)比藥物甲細(xì)粉10.0g · kg'灌胃劑量為5ml · kg'給藥 體積為〇 · 2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物乙組:灌胃給對(duì)比藥物乙細(xì)粉l〇.〇g · kg'灌胃劑量為5ml · kg'給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 對(duì)比藥物丙組:灌胃給對(duì)比藥物丙細(xì)粉l〇.〇g · kg<，灌胃劑量為5ml · kg<，給藥體積 為0.2ml/10g，灌胃； 本發(fā)明藥物組:灌胃給化本發(fā)明藥物細(xì)粉l〇.〇g · kg^1，灌胃劑量為5ml · kg^1，給藥體 積為0.2ml/10g，灌胃； 安定陽性對(duì)照組給予lmg /kg安定；灌胃；生理鹽水對(duì)照組給予同體積生理鹽水，灌 胃。各組小鼠于給藥60分鐘后，分別給予硝酸士的寧注射液1.5mg /kg，皮下注射，記錄小鼠 驚厥數(shù)(以小鼠出現(xiàn)全身強(qiáng)直性驚厥為指標(biāo)）。結(jié)果見表2-4。
[0063]表2-4抗硝酸士的寧驚厥發(fā)作的作用(n= 12)
注:與生理鹽水組比較:#P〈 0.05,*P〈 0.01;與安定組比較:※P > 0.05,#P〈 0.05 結(jié)果表明，安定組與對(duì)比藥物甲組、對(duì)比藥物乙組、對(duì)比藥物丙組、本發(fā)明藥物組均有 對(duì)抗硝酸士的寧驚厥發(fā)作的作用，各組與生理鹽水組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異均有顯著意 義。且發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物的抗驚厥作用最強(qiáng)，療效最好，說明本發(fā)明藥物有抗驚厥的作用。而 且，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，對(duì)比藥物甲（由鐵馬豆、東北衛(wèi)矛制成）、對(duì)比藥物乙（由櫟葉槲 蕨、東北衛(wèi)矛制成）以及對(duì)比藥物丙（由櫟葉槲蕨、鐵馬豆制成）的抗驚厥作用效果不明顯。 由此可見，本發(fā)明藥物中的櫟葉槲蕨、鐵馬豆和東北衛(wèi)矛三種藥味，缺一不可，缺少任何一 種藥味，其藥物組合物的作用效果都將大大降低，三種藥味組合，產(chǎn)生了明顯的一加一大于 二的協(xié)同增效作用。
[0064] 3 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物能抑制小鼠自發(fā)活動(dòng);對(duì)小鼠睡眠的影響與戊巴比妥鈉有協(xié) 同作用；有對(duì)抗硝酸士的寧驚厥發(fā)作的作用。說明本發(fā)明藥物有明顯的鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥 作用，具有開發(fā)治療失眠藥物或保健品的前景。而且，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，對(duì)比藥物甲（由 鐵馬豆、東北衛(wèi)矛制成）、對(duì)比藥物乙（由櫟葉槲蕨、東北衛(wèi)矛制成）以及對(duì)比藥物丙（由櫟葉 槲蕨、鐵馬豆制成)的作用效果都明顯降低，明顯劣于本發(fā)明的藥物組合物。由此可見，本發(fā) 明藥物中的櫟葉槲蕨、鐵馬豆和東北衛(wèi)矛三種藥味，缺一不可，缺少任何一種藥味，其藥物 組合物的作用效果都將大大降低，三種藥味組合，產(chǎn)生了明顯的一加一大于二的協(xié)同增效 作用。
[0065] 典型病例： 廖牟，男，65歲，退休工人，3個(gè)月前因腦血管病住進(jìn)醫(yī)院，因精神壓力大，引起失眠，出 院后，失眠不愈，又經(jīng)多方治療，效果不好，心慌、氣短、心悸、頭暈，檢查發(fā)現(xiàn)舌紅，心律不 齊，精神萎靡不振，確認(rèn)為輕度失眠?？诜景l(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中實(shí)施例1制得片劑 進(jìn)行治療，一日3次，每次口服2片，連續(xù)治療7天，失眠治愈，未見任何不良反應(yīng)。
[0066]實(shí)驗(yàn)三:HPLC法同時(shí)測(cè)定本發(fā)明藥物中穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮的 含量 為更好地控制本發(fā)明藥物的質(zhì)量，本發(fā)明以處方中櫟葉槲蕨的成分穗羅漢松樹脂酚苷 和鐵馬豆的成分六氫金合歡基丙酮為定量指標(biāo)，建立了一種HPLC法，用梯度洗脫的方法同 時(shí)測(cè)定穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮的含量，該方法準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好，可作為 本發(fā)明藥物的含量測(cè)定方法和質(zhì)量控制依據(jù)，現(xiàn)研究如下。
[0067] 1儀器與試藥 DGLC雙三元高效液相色譜儀(美國Thermo,雙三元梯度栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、多波長紫外檢 測(cè)器、柱溫箱）；Chromeleon色譜工作站；Waters SunFire Ci8色譜柱（美國WATERS公司， 150mmX 4 · 6mm，5μπι) ; TP150超聲清洗機(jī)(北京天鵬電子科技有限公司）;AUW120D電子分析天 平(十萬分之一，日本島津公司）；乙腈、甲醇為色譜純（美國TEDIA公司）；水為超純水;其他 試劑均為分析純。
[0068]穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院），六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 (中國食品藥品檢定研究院），本發(fā)明藥物：處方：櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛 333g;制法:取櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)， 煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥， 粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。
[0069] 2方法與結(jié)果 2.1色譜條件 Waters SunFire (：18色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，按表3-1中的規(guī) 定進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長為284nm;柱溫:30°C ;流速：1 .OmL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢 松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000。
[0070] 表3-1梯度洗脫程序
2.2溶液的制備 2.2.1穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品溶液 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品80 . Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻 度，即得每lmL穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液。
[0071] 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品80.0 mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的貯備液。
[0072] 2.2.2供試品溶液 取本發(fā)明藥物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲處理（150W，50kHz ) lOmin，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充至刻度，經(jīng)3000r · mirT1離心10min，取上清液，過濾，即得 供試品溶液。
[0073] 2.2.3陰性樣品溶液 穗羅漢松樹脂酚苷的陰性樣品溶液:按原處方量和工藝制備缺櫟葉槲蕨的本發(fā)明藥 物，依照"2.2.2"項(xiàng)下的方法制備陰性樣品溶液I。
[0074]六氫金合歡基丙酮的陰性樣品溶液:按原處方量和工藝制備缺鐵馬豆的本發(fā)明藥 物，依照"2.2.2"項(xiàng)下的方法制備陰性樣品溶液Π 。
[0075] 2.3干擾試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液(分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備溶液 1. OmL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL)、供試品溶液、陰性樣品溶液各5yL，注入液相色譜 儀，在"2. Γ色譜條件下，本發(fā)明藥物的供試品溶液在對(duì)照品色譜相同的位置有穗羅漢松樹 脂酚苷和六氫金合歡基丙酮的峰，兩成分峰與其相鄰峰的完全分離，理論塔板數(shù)以穗羅漢 松樹脂酚苷的峰計(jì)均大于5000,而且陰性樣品溶液中無相應(yīng)的穗羅漢松樹脂酚苷峰和六氫 金合歡基丙酮峰，對(duì)測(cè)定無干擾。見說明書附圖中的色譜圖：圖1、圖2、圖3、圖4。
[0076] 2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備液3.0,2.0,1.0,0.5,0.25mL和穗羅漢松 樹脂酚苷對(duì)照品儲(chǔ)備液6.0，4.0，2.0，1.0，0.5mL置同一20mL容量瓶中，混合均勻，用甲醇定 量稀釋成含六氫金合歡基丙酮240.0，160.0，80.0，32.0，16. Oyg · ml/1;含穗羅漢松樹脂酚 苷480.0，320.0，160.0，64.0，32. Oyg · mL-1的系列混合對(duì)照品溶液，精密取5yL，注入色譜 儀，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X，yg · ml/1)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程，Y(六氫金合歡基丙酮)=〇.1935X(六氫金合歡基丙酮）一 0.0235，r=1.0000,線性范圍 16.0~240 . Oyg · mL-1; Y(穗羅漢松樹脂酚苷）=0.2295X(穗羅漢松樹脂酚苷）+0.076，r= 1.0000，線性范圍32.0~480.0 yg · mL-1;結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，兩者線性關(guān)系良好。 [0077] 2.5精密度試驗(yàn) 取"2.3"項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液5yL，在"2. Γ色譜條件下，連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣5次，記錄六氫 金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷的峰面積，計(jì)算5個(gè)峰面積值的RSD，結(jié)果六氫金合歡基 丙酮峰面積的RSD為0.363%，穗羅漢松樹脂酚苷峰面積的RSD為0.294%;結(jié)果表明儀器精密 度良好。
[0078] 2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品，按"2.2.2"供試品溶液制備項(xiàng)下的方法，制備5份供試品溶液，分別 取5yL進(jìn)樣，記錄兩成分的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值，結(jié)果，六氫金合歡基丙酮的含量 平均值為〇.5783mg · mL-^RSD為1.79%;穗羅漢松樹脂酚苷的含量平均值為1.6386mg · mL 4，RSD為1.53%，表明該法重復(fù)性較好。
[0079] 2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取"2.9"項(xiàng)下的樣品溶液在室溫下放置1，6，12,2處，分別測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算六氫金 合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷峰面積的RSD分別為0.90%、0.32%，結(jié)果表明樣品在24h內(nèi) 穩(wěn)定。
[0080] 2.8回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品2.5mL，分別精密加入"2.2. Γ項(xiàng)下六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 貯備液lmL和穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品貯備液2.5mL，共制備6份;按"2.9"項(xiàng)下方法制備樣 品并測(cè)定六氫金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果六氫金合 歡基丙酮的平均加樣回收率為97.02%，RSD=1.03%(n=6)，穗羅漢松樹脂酚苷的平均加樣回 收率為 98 · 71 %，RSD=0 · 67%( n=6 )。
[0081 ] 2.9樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按"2.2.2"供試品溶液制備項(xiàng)下方法，制成樣品溶液，在"2. Γ色譜 條件下，分別取對(duì)照品混合溶液（含六氫金合歡基丙酮1.60mg · ml/1、穗羅漢松樹脂酚苷 1.60mg · ml/1)和樣品溶液各5yL，進(jìn)樣，測(cè)定兩成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算六氫金合歡基 丙酮、穗羅漢松樹脂酚苷的含量。結(jié)果見表3-2。
[0082] 表3-2樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg · mL-^11=3)
3結(jié)論 3.1在色譜條件篩選時(shí)，流動(dòng)相采用1%冰醋酸溶液-乙腈(80: 20)等度洗脫，六氫金合 歡基丙酮、穗羅漢松樹脂酚苷與相鄰雜質(zhì)分離不理想;采用梯度洗脫，流動(dòng)相極性由強(qiáng)到弱 (乙腈比例由15%增大到80%)，使兩成分與相鄰色譜峰完全分離，取得滿意結(jié)果。
[0083]本試驗(yàn)經(jīng)過測(cè)試，320nm、315nm、310nm、306nm、300nm、295nm、290nm、284nm、280nm、 275nm、270nm的檢測(cè)結(jié)果顯示，284nm波長可兼顧兩個(gè)被測(cè)成分的最大靈敏度，故采用284nm 作為檢測(cè)波長。
[0084] 3.2本發(fā)明建立的HPLC法可同時(shí)測(cè)定六氫金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷的 含量，操作簡便，準(zhǔn)確性高，為本發(fā)明藥物質(zhì)量控制提供可靠的方法。
[0085] 3.3根據(jù)3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果，以六氫金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷含 量平均值的80%作為最低標(biāo)準(zhǔn)限度來控制成品中兩組分的含量。即每lg樣品中六氫金合歡 基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷含量分別不得低于0.5mg和1.25mg。
[0086] 實(shí)驗(yàn)四：氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定本發(fā)明藥物中2,3,6_三甲基茴香醚的含量 本發(fā)明建立了 GC(氣相色譜)外標(biāo)法對(duì)本發(fā)明藥物中東北衛(wèi)矛的成分之一2,3,6_三甲 基茴香醚進(jìn)行了含量測(cè)定，以此控制本發(fā)明藥物的質(zhì)量。
[0087] 1儀器與試藥 G-3900日立氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器，Anastar色譜工作站。SPH-200氫氣發(fā)生器(北京中 惠普分析技術(shù)研究所），SPB-3全自動(dòng)空氣源(北京中惠普分析技術(shù)研究所）。
[0088]本發(fā)明藥物:處方:櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g;制法:取櫟葉槲蕨 333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)，煎煮3次，每次的加水量 均為lOOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料， 混勻，壓片，即得。
[0089] 2,3,6_三甲基茴香醚對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定研究院提供;環(huán)己烷為分析 純。
[0090] 2溶液制備 2.1對(duì)照品溶液 利用差量法精密稱取2，3，6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解并定 容至刻度，配成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液。
[0091] 2.2供試品溶液 精密量取本發(fā)明藥物50mg，加水250mL，照《中國藥典》2015年版第四部通則2204揮發(fā)油 測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為 止，加環(huán)己烷3mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸4h，放冷，將測(cè)定器中的液體移至分液漏 斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取2次，每次3mL，用鋪有無水硫酸鈉0.5g的漏斗濾 過，合并環(huán)己烷液，置25mL容量瓶中，加環(huán)己烷至刻度，搖勻，即得。
[0092] 3色譜條件 SE-30毛細(xì)管柱（30mX 0.32mm，0.25μπι);程序升溫：柱溫起始溫度50°C，以15°C · min-1 速率升到150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比6:1;檢測(cè)器溫度220°C ;進(jìn)樣口溫 度 200°C。
[0093] 在此色譜條件下，2,3,6_三甲基茴香醚峰與相鄰色譜峰完全分離，理論塔板數(shù)按 2，3，6-三甲基茴香醚峰計(jì)算應(yīng)不低于10000，見說明書附圖：圖5、圖6、圖7。
[0094] 4方法學(xué)考察 4.1線性關(guān)系考察 精密吸取濃度為0.20、0.34、0.52、0.69、0.82、1.0311^.1111/1的2,3,6-三甲基茴香醚對(duì) 照品溶液分別lyL注入氣相色譜儀，按照"3"項(xiàng)下色譜條件測(cè)定2,3,6_三甲基茴香醚峰面 積，以2，3，6-三甲基茴香醚濃度為橫坐標(biāo)，2，3，6-三甲基茴香醚吸收峰面積為縱坐標(biāo)作線 性回歸得方程： Y=2.514 X 104X -197.1，R2=0.9990，結(jié)果表明2，3，6_三甲基茴香醚進(jìn)樣濃度在0.20~ 0.98mg · ml/1范圍內(nèi)關(guān)系良好。
[0095] 4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取2,3，6_三甲基茴香醚對(duì)照品溶液lyL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積分別為 17532、17762、17714、17777、17843、17694，RSD為0.80%，說明儀器精密性良好。
[0096] 4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取本發(fā)明藥物樣品，按照"2.2"項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照上述色譜條件，進(jìn)樣 lyL測(cè)定峰面積。計(jì)算結(jié)果表明2，3，6_三甲基茴香醚峰含量的平均值為0.34mg · ml/1，RSD為 0.20%，說明本法重復(fù)性良好。
[0097] 4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本發(fā)明藥物樣品，按照"2.2"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后分別在0，2，6，10，16h進(jìn) 樣lyL，測(cè)定峰面積。計(jì)算結(jié)果表明2，3，6_三甲基茴香醚峰含量的平均值為0.35mg · mL一1， RSD為0.50%，表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定。
[0098] 4.5檢測(cè)限及定量限測(cè)定 取對(duì)照品溶液(濃度為0.80mg · ml/1)lmL，逐級(jí)稀釋，每稀釋1次，吸取lyL注入氣相色 譜儀，按照"3"項(xiàng)下色譜條件測(cè)定2,3,6_三甲基茴香醚峰面積。以S/N=3求得2,3,6_三甲基 茴香醚的檢測(cè)限為2.48 X l(T2mg · ml/1，以S/N=10求得2，3，6-三甲基茴香醚的定量限為 9.93X10-2mg · mL-1。
[0099] 4.6耐用性試驗(yàn) 為測(cè)試實(shí)驗(yàn)的耐用性，又使用PEG-20M毛細(xì)管色譜柱(外標(biāo)法），結(jié)果實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、穩(wěn) 定性均比較好;通過不同的操作人員，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。
[0100] 4.7回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的6份本發(fā)明藥物樣品各25mL，分別精密加入2，3，6-三甲基茴香醚 對(duì)照品7.38mg。按照"2.2"項(xiàng)下方法制備供試溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣lyL，計(jì)算加樣回 收率。計(jì)算結(jié)果表明平均回收率為99.46%，RSD為0.02%。
[0101] 5樣品測(cè)定 分別取6批樣品按照"2.2"項(xiàng)下方法，每批樣品平行制備2份供試品溶液。按上述色譜條 件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為20150223,20150224,20150225,20150207， 20150208,20150620的本發(fā)明藥物中2,3，6_三甲基茴香醚含量(n=2)分別為0.32、0.36、 0.33、0.27、0·24、0·35mg · mL-1。
[0102] 6 討論 6.1本發(fā)明采用外標(biāo)法測(cè)定本發(fā)明藥物中2,3,6_三甲基茴香醚的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方 法簡便，重復(fù)性好，可用來測(cè)定本發(fā)明藥物中2,3,6_三甲基茴香醚的含量。
[0103] 6.2采用本研究方法對(duì)本發(fā)明藥物中2,3,6_三甲基茴香醚的含量進(jìn)行測(cè)定，可以 有效控制藥物的質(zhì)量。
[0104] 實(shí)驗(yàn)五:本發(fā)明藥物治療大鼠骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究 本發(fā)明藥物對(duì)頸椎病有非常好的治療效果，研究人員預(yù)測(cè)，本發(fā)明藥物對(duì)骨質(zhì)疏松也 應(yīng)該具有一定的治療效果，于是便開展了嘗試性實(shí)驗(yàn)研究。
[0105] 1材料與方法 1.1動(dòng)物 32只4個(gè)月齡雌性SD大鼠，體重:260g±30g。購置于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 1.2試劑與藥品 本發(fā)明藥物:處方:櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g;制法:取櫟葉槲蕨333g、 鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為 1 OOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻， 壓片，即得。
[0106] 陽性藥物：苯甲酸雌二醇（2mg/ml )，上海第九制藥廠產(chǎn)品；血鈣測(cè)定試劑盒、血磷 測(cè)定試劑盒、ALP試劑盒，北京中生公司。戊巴比妥鈉，上海第六制藥廠。
[0107] 1.3主要儀器 BT224半自動(dòng)生化分析儀，雙能X線骨密度儀。
[0108] 1.4動(dòng)物造模 去勢(shì)手術(shù)：以2%戊巴妥鈉按40mg/kg體重腹腔注射麻醉，在背部中央十二肋下切開肌 肉、腹膜，揭開脂肪層，切除左右卵巢。其中8只僅作腹腔切開而不切除卵巢的假手術(shù)，作正 ?？瞻讓?duì)照組。
[0109] 1.5分組和給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組，每組8只： 正?？瞻讓?duì)照組，即假手術(shù)組，生理鹽水3ml/kg灌胃。
[0110] 另外24只切除卵巢的大鼠隨機(jī)分成3組，分別為： 模型組，以生理鹽水3ml/kg灌胃； 陽性藥對(duì)照組，用雌二醇溶解在3ml生理鹽水中，濃度200yg/kg灌胃； 本發(fā)明藥物組，將本發(fā)明藥物混懸于3ml生理鹽水中，濃度1.5g/kg灌胃； 每天灌胃1次，連續(xù)給藥90d。
[0111] 1.6觀察指標(biāo) 用藥結(jié)束后通過眼球后取血，根據(jù)試劑盒說明，用比色法測(cè)定Ca2+、P3+和ALPas陽性藥 對(duì)照活力。再取大鼠右側(cè)大股骨和脛骨，剃除軟骨組織，用雙能X線骨密度儀測(cè)定股骨和脛 骨的骨密度(Bone Mineral Density，BMD)〇
[0112] 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用（歷土S)表示，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件one way AN0VA，LSD方法分析，P< 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0113] 2 結(jié)果 2.1對(duì)Ca2+、P3+、ALPas陽性藥對(duì)照影響 模型組去勢(shì)大鼠血清中的Ca2+、P3+和ALPase活力與正常空白對(duì)照組相比均明顯升高。 服用陽性藥物后，Ca2+、P3+和ALPase活力與模型組相比，陽性藥物組有明顯著降低，而本發(fā) 明藥物組作用效果則不明顯。見表5-1。
[0114] 表5-1各組血清中Ca2+、P3+和ALPas陽性藥對(duì)照活力平均值比較土 s)
注：與模型組相比，#P〈〇. 01。
[0115] 2.2骨密度的測(cè)定 模型組去勢(shì)大鼠的股骨和脛骨的BMD與正常對(duì)照大鼠相比明顯降低。服用陽性藥物后， 股骨和脛骨的BMD與模型組相比顯著提高；與正?？瞻讓?duì)照組比較，其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。而本發(fā)明藥物組作用效果則不明顯。見表5-2。
[0116] 表5-2各組股骨和脛骨的BMD平均值比較(圓土 s)
注：與模型組比較，#P<〇. 01。
[0117] 3討論與結(jié)論 本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明藥物組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中Ca2+和P3+濃度沒有明顯降 低，說明本發(fā)明藥物不能減少骨中鈣和骨磷丟失，不能促進(jìn)鈣和磷在骨中的沉積。模型組動(dòng) 物由于骨高代謝，使破骨和成骨作用均旺盛，破骨作用超過成骨作用，所以出現(xiàn)骨質(zhì)疏松； 應(yīng)用本發(fā)明藥物后，ALPase沒有明顯下降，說明本發(fā)明藥物不能抑制骨代謝，不能增加骨穩(wěn) 定，也就不能阻止骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。應(yīng)用本發(fā)明藥物后，股骨和脛骨BMD較模型組動(dòng)物沒有 顯著增高，表明本發(fā)明藥物不能降低去勢(shì)大鼠的骨丟失，也不能促進(jìn)骨形成，對(duì)骨代謝平衡 也沒有調(diào)節(jié)作用。綜上，本發(fā)明藥物對(duì)骨質(zhì)疏松癥沒有治療作用，不能用于骨質(zhì)疏松癥的治 療。
[0118]
【附圖說明】： 圖1:對(duì)照品HPLC色譜圖，圖中1號(hào)峰為六氫金合歡基丙酮色譜峰，2號(hào)峰為穗羅漢松樹 脂酚苷色譜峰 圖2:供試品HPLC色譜圖，圖中1號(hào)峰為六氫金合歡基丙酮色譜峰，2號(hào)峰為穗羅漢松樹 脂酚苷色譜峰 圖3:陰性樣品溶液1(缺櫟葉槲蕨)HPLC色譜圖，圖中1號(hào)峰為六氫金合歡基丙酮色譜峰 圖4:陰性樣品溶液Π (缺鐵馬豆)HPLC色譜圖，圖中2號(hào)峰為穗羅漢松樹脂酚苷丙酮色 譜峰 圖5:本發(fā)明藥物樣品氣相色譜圖 圖6:對(duì)照品氣相色譜圖 圖7:空白對(duì)照氣相色譜圖
【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1: 處方:櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g。
[0119] 制法:取櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小 時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干 燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。
[0120]含量測(cè)定： 采用高效液譜法對(duì)穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮進(jìn)行含量測(cè)定： (1) 色譜條件:Waters SunFire Cis色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為284nm;柱溫：30°C;流速： l.OmL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的貯備液； ③ 對(duì)照品混合溶液:分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備溶液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度， 150W，50kHz超聲處理10min，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充至刻度，經(jīng)3000r · min-1離心10min， 取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定:取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各5μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定； (5) 測(cè)定結(jié)果:每lg樣品中六氫金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷含量分別為0.614mg 和1.32mg。
[0121]采用氣相色譜法對(duì)2，3，6-三甲基茴香醚進(jìn)行含量測(cè)定： (1)色譜條件:SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50°C，以15°C · mirT1速率升到 150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比6:1;檢測(cè)器溫度220°C ;進(jìn)樣口溫度200°C ; (2 )對(duì)照品溶液:精密稱取2，3，6-三甲基茴香醚6.6mg，置1 OmL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解 并定容至刻度，配成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3 )供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物50mg，加水250mL，照《中國藥典》2015年版第四部 通則2204揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分， 并溢流入燒瓶為止，加環(huán)己烷3mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸4h，放冷，將測(cè)定器中的 液體移至分液漏斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取2次，每次3mL，用鋪有無水硫酸 鈉〇.5g的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液，置25mL容量瓶中，加環(huán)己烷至刻度，搖勻，即得； (4)測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各UiL，注入氣相色譜儀，測(cè)定； (5)測(cè)定結(jié)果:每lg樣品中2,3,6_三甲基茴香醚含量為0.35mg。
[0122] 實(shí)施例2: 處方:櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g。
[0123] 制法:取櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小 時(shí)，煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干 燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，裝入膠囊，即得。
[0124]含量測(cè)定： 采用高效液譜法對(duì)穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮進(jìn)行含量測(cè)定： (1) 色譜條件:Waters SunFire Ci8色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為284nm;柱溫：30°C;流速： l.OmL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的貯備液； ③ 對(duì)照品混合溶液:分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備溶液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度， 150W，50kHz超聲處理10min，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充至刻度，經(jīng)3000r · min-1離心10min， 取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定:取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各5μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定； (5) 測(cè)定結(jié)果:每lg樣品中六氫金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷含量分別含量分別 為0·621mg和1·35mg。
[0125]采用氣相色譜法對(duì)2，3，6-三甲基茴香醚進(jìn)行含量測(cè)定： (1) 色譜條件:SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50°C，以15°C · mirT1速率升到 150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比6:1;檢測(cè)器溫度220°C ;進(jìn)樣口溫度200°C ; (2) 對(duì)照品溶液:精密稱取2，3，6_三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解 并定容至刻度，配成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3 )供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物50mg，加水250mL，照《中國藥典》2015年版第四部 通則2204揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分， 并溢流入燒瓶為止，加環(huán)己烷3mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸4h，放冷，將測(cè)定器中的 液體移至分液漏斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取2次，每次3mL，用鋪有無水硫酸 鈉〇.5g的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液，置25mL容量瓶中，加環(huán)己烷至刻度，搖勻，即得； (4) 測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各UiL，注入氣相色譜儀，測(cè)定； (5) 測(cè)定結(jié)果:每lg樣品中2,3,6_三甲基茴香醚含量為0.37mg。
[0126] 實(shí)施例3: 處方:櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g 制法：取櫟葉槲蕨333g、鐵馬豆333g、東北衛(wèi)矛333g，混合，加入lOOOOmL水浸泡1小時(shí)， 煎煮3次，每次的加水量均為lOOOOmL，每次煎煮1小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥， 粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，制成顆粒劑，即得。
[0127]含量測(cè)定： 采用高效液譜法對(duì)穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮進(jìn)行含量測(cè)定： (1) 色譜條件:Waters SunFire Cis色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為284nm;柱溫：30°C;流速： l.OmL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的貯備液； ③ 對(duì)照品混合溶液:分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備溶液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度， 150W，50kHz超聲處理10min，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充至刻度，經(jīng)3000r · min-1離心10min， 取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定:取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各5μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定； (5) 測(cè)定結(jié)果:每lg樣品中六氫金合歡基丙酮和穗羅漢松樹脂酚苷含量分別為0.603mg 和1.34mg。
[0128]采用氣相色譜法對(duì)2，3，6-三甲基茴香醚進(jìn)行含量測(cè)定： (1)色譜條件：SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50°C，以15°C · mirT1速率升 到150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比6:1;檢測(cè)器溫度220°C ;進(jìn)樣口溫度200 °C； (2)對(duì)照品溶液:精密稱取2，3，6_三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解 并定容至刻度，配成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3 )供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物50mg，加水250mL，照《中國藥典》2015年版第四部 通則2204揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分， 并溢流入燒瓶為止，加環(huán)己烷3mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸4h，放冷，將測(cè)定器中的 液體移至分液漏斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取2次，每次3mL，用鋪有無水硫酸 鈉〇.5g的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液，置25mL容量瓶中，加環(huán)己烷至刻度，搖勻，即得； (4) 測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各UiL，注入氣相色譜儀，測(cè)定； (5) 測(cè)定結(jié)果:每lg樣品中2,3,6_三甲基茴香醚含量為0.33mg。
[0129]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對(duì)頸椎病與失眠具有雙重治療作用的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物 是由以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1~3、鐵馬豆1~3、東北衛(wèi)矛1~3。2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物是由以下重量份的原料 制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1。3. 如權(quán)利要求1~2任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物采用中藥 學(xué)中常規(guī)的制藥方法制備成片劑、丸劑、硬膠囊劑、顆粒劑。4. 如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物采用如下方法制備：取 櫟葉槲蕨、鐵馬豆、東北衛(wèi)矛，混合，加入3~15倍量的水浸泡0.5~2小時(shí)，煎煮2~4次，每次 0.5~2小時(shí)，提取液合并，濾過，濾液濃縮，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入輔料，混勻，壓片，即得。5. -種對(duì)頸椎病與失眠具有雙重治療作用的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組合 物是由以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1~3、鐵馬豆1~3、東北衛(wèi)矛1~3,其特征在于， 采用高效液相色譜法對(duì)藥物組合物中的穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮進(jìn)行含量 測(cè)定： (1) 色譜條件:Waters SunFire Cis色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為280~290nm;柱溫:25~35°C ;流 速:0.5~1.5mL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每 lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品置容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每 lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的備液； ③ 對(duì)照品混合溶液：分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取置容量瓶中，加甲醇，超聲處理，放置 至室溫后，用甲醇補(bǔ)充，經(jīng)離心，取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定：取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各2 ~10yL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。6. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組合物是由以下重量份的 原料制成的：櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1，其特征在于，采用高效液譜法對(duì)穗羅漢松樹 脂酚苷和六氫金合歡基丙酮進(jìn)行含量測(cè)定： (1)色譜條件:Waters SunFire Cis色譜柱;流動(dòng)相A:乙腈，流動(dòng)相B: 1%冰醋酸溶液，梯 度洗脫：〇~15min，流動(dòng)相A從15%線性增加至20%，流動(dòng)相B從85%線性下降至80%; 15~ 20min，流動(dòng)相A從20%線性增加至25%，流動(dòng)相B從80%線性下降至75%;20~25min，流動(dòng)相A從 25%線性增加至30%，流動(dòng)相B從75%線性下降至70%; 25~35min，流動(dòng)相A保持在30%，流動(dòng)相B 保持在70%;35~4011^11，流動(dòng)相4從30%線性增加至80%，流動(dòng)相8從70%線性下降至20%;40~ 45min，流動(dòng)相A保持在80%，流動(dòng)相B保持在20%;檢測(cè)波長為284nm;柱溫：30°C;流速： l.OmL · mirT1;理論塔板數(shù)以穗羅漢松樹脂酚苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000; (2) 穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液的制備： ① 精密稱取穗羅漢松樹脂酚苷對(duì)照品80.Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含穗羅漢松樹脂酚苷1.60mg的貯備液； ② 精密稱取六氫金合歡基丙酮對(duì)照品80 . Omg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至 刻度，即得每lmL含六氫金合歡基丙酮1.60mg的貯備液； ③ 對(duì)照品混合溶液:分別取穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品貯備溶液 1.0mL、0.5mL混合后，用甲醇稀釋至10mL，得穗羅漢松樹脂酸苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品 混合溶液； (3) 供試品溶液的制備:取本發(fā)明藥物，精密量取5mg，置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度， 150W，50kHz超聲處理lOmin，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充至刻度，經(jīng)3000r · min-1離心10min， 取上清液，過濾，即得供試品溶液； (4) 測(cè)定:取供試品溶液、穗羅漢松樹脂酚苷和六氫金合歡基丙酮對(duì)照品混合溶液各5μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定。7. -種對(duì)頸椎病與失眠具有雙重治療作用的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組合 物是由以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1~3、鐵馬豆1~3、東北衛(wèi)矛1~3,其特征在于， 采用氣相色譜法對(duì)藥物組合物中的2，3，6-三甲基茴香醚進(jìn)行含量測(cè)定： (1) 色譜條件：SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50°C，以15°C · mirT1速率升到 150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比5~7:1;檢測(cè)器溫度200~240°C ;進(jìn)樣口溫 度 180 ~220°C; (2) 對(duì)照品溶液:精密稱取2,3,6_三甲基茴香醚，置容量瓶中，用環(huán)己烷溶解并定容，配 成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3 )供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物，加水，照《中國藥典》2015年版第四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入 燒瓶為止，加環(huán)己烷，連接回流冷凝管，加熱保持微沸，放冷，將測(cè)定器中的液體移至分液漏 斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液， 置容量瓶中，加環(huán)己烷，搖勻，即得； (4)測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1~5yL，注入氣相色譜儀，測(cè)定。8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物組合物是由以下重量份的 原料制成的：櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1，其特征在于，采用氣相色譜法對(duì)2，3，6_三甲 基茴香醚進(jìn)行含量測(cè)定： (1) 色譜條件：SE-30毛細(xì)管柱;程序升溫:柱溫起始溫度50°C，以15°C · mirT1速率升到 150°C保持4min;氮?dú)鉃檩d氣;FID檢測(cè)器;分流比6:1;檢測(cè)器溫度220°C ;進(jìn)樣口溫度200°C ; (2) 對(duì)照品溶液:精密稱取2，3，6-三甲基茴香醚6.6mg，置10mL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解 并定容至刻度，配成濃度為〇.66mg · ml/1的對(duì)照品溶液； (3 )供試品溶液:精密量取本發(fā)明藥物50mg，加水250mL，照《中國藥典》2015年版第四部 通則2204揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分， 并溢流入燒瓶為止，加環(huán)己烷3mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸4h，放冷，將測(cè)定器中的 液體移至分液漏斗中，分取環(huán)己烷液，水液再用環(huán)己烷提取2次，每次3mL，用鋪有無水硫酸 鈉〇.5g的漏斗濾過，合并環(huán)己烷液，置25mL容量瓶中，加環(huán)己烷至刻度，搖勻，即得； (4)測(cè)定:取對(duì)照品溶液和供試品溶液各lyL，注入氣相色譜儀，測(cè)定。9. 一種藥物組合物在制備治療椎動(dòng)脈型頸椎病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，該藥物組 合物是由以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1。10. -種藥物組合物在制備治療肩周炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，該藥物組合物是由 以下重量份的原料制成的:櫟葉槲蕨1、鐵馬豆1、東北衛(wèi)矛1。
【文檔編號(hào)】A61P19/08GK106038679SQ201610545599
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月12日
【發(fā)明人】高曦, 婁宏君, 陳俊有, 許漠沙, 任聰林, 孫永琪, 李陳雪, 楊玉赫
【申請(qǐng)人】黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)