Znf367基因在制備治療乳腺癌藥物、診斷及預(yù)后評(píng)估試劑中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了ZNF367基因在制備治療乳腺癌藥物、診斷及預(yù)后評(píng)估試劑中的應(yīng)用。發(fā)明人的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ZNF367在乳腺癌組織中高表達(dá)，且生存分析表明ZNF367基因的表達(dá)水平與乳腺癌的分期、預(yù)后密切相關(guān)。因此，可以合成或制作此基因的抑制物，作為乳腺癌潛在的靶向治療藥物；由于該基因在乳腺癌中存在DNA擴(kuò)增和表達(dá)升高，故可制作檢測(cè)該基因DNA變異和表達(dá)變化的試劑盒以用于診斷乳腺癌；由于該基因表達(dá)的升高與差的預(yù)后相關(guān)，故檢測(cè)其表達(dá)水平變化的試劑盒也可用于其預(yù)后的評(píng)估，以指導(dǎo)臨床的治療。
【專利說明】
ZNF367基因在制備治療乳腺癌藥物、診斷及預(yù)后評(píng)估試劑中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明具體涉及ZNF367基因在制備治療乳腺癌藥物、診斷及預(yù)后評(píng)估試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，我國(guó)每年癌癥發(fā)病人數(shù)約307萬人，而每年因癌癥死亡的人數(shù)約220萬人。世界衛(wèi)生組織2012年《世界癌癥報(bào)告》指出中國(guó)新診斷癌癥病例為307萬，占到全球總數(shù)的21.8%;而年死亡人數(shù)220萬，占到全球癌癥年死亡人數(shù)的26.9%。更為嚴(yán)重的是這些數(shù)據(jù)正以驚人的速度逐年增長(zhǎng)。惡性腫瘤已超過心血管疾病成為致死的首要原因。因此，探索癌癥發(fā)生的分子機(jī)制研究及尋找其有效治療手段對(duì)人類健康具有重大意義。
[0003]乳腺癌是全球第二大常見惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中致死率居首位，全球每年有將近130萬女性患上乳腺癌，并且有超過40萬女性因?yàn)槿橄侔┑霓D(zhuǎn)移復(fù)發(fā)而死亡。乳腺癌是一種異質(zhì)性非常強(qiáng)的腫瘤，不同類型的乳腺癌可具有顯著不同的生物學(xué)特性與臨床表現(xiàn)。因此，對(duì)患者的乳腺癌進(jìn)行分類已成為用于確定治療方案的重要組成部分。目前，臨床上主要應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和HER-2的檢測(cè)結(jié)果，將乳腺癌分為4種分子亞型:luminal A型(ER陽性或PR陽性，HER-2陰性，Ki67低表達(dá))、luminal B型(ER陽性或PR陽性，HER-2也陽性)、HER-2過表達(dá)型(ER、PR陰性，HER-2陽性，Ki67多為高表達(dá))和basal-like型(ER、PR、HER-2均陰性)。
[0004]雖然針對(duì)不同亞型的乳腺癌有著各異的治療策略，如針對(duì)ER受體陽性的乳腺癌可以使用他莫昔芬等ER受體抑制劑，針對(duì)HER2陽性的乳腺癌可以使用曲妥珠單抗等HER2受體封閉抗體，針對(duì)三陰乳腺癌可以使用聯(lián)合化療等方案，但是現(xiàn)有的治療策略并沒有針對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，無法克服腫瘤治療中最大的臨床問題一一復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。
[0005]ZNF367基因，全名zinc finger protein 367，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫的登錄號(hào)為Gene ID: 195828，位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂9q22位點(diǎn)。ZNF367是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，已知其在發(fā)育中具有重要作用。然而ZNF367在腫瘤中的作用，以及是否可作為腫瘤診斷治療靶標(biāo)目前仍未研究透徹。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)乳腺癌標(biāo)志物ZNF367基因，以區(qū)分乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，并將其作為新的治療靶點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
抑制ZNF367基因表達(dá)或翻譯的試劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0008]優(yōu)選的，抑制ZNF367基因表達(dá)或翻譯的試劑為ZNF367基因啟動(dòng)子抑制劑、ZNF367基因轉(zhuǎn)錄抑制劑或ZNF367蛋白合成抑制劑。
[0009]優(yōu)選的，抑制ZNF367基因表達(dá)或翻譯的試劑為ZNF367基因的dsRNA、ZNF367基因的siRNA、或 ZNF367基因的 shRNA。
[0010]優(yōu)選的，所述ZNF367基因的dsRNA、ZNF367基因的siRNA、或ZNF367基因的shRNA部分堿基用鎖核酸進(jìn)行修飾。
[0011]在體內(nèi)使ZNF367蛋白活性降低或失活的試劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0012]優(yōu)選的，在體內(nèi)使ZNF367蛋白活性降低或失活的試劑選自ZNF367蛋白抗體、ZNF367酶活性抑制劑。
[0013]定量ZNF367基因DNA擴(kuò)增量或表達(dá)量的試劑作為乳腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估試劑的應(yīng)用。
[0014]定量ZNF367蛋白DNA擴(kuò)增量或表達(dá)量的試劑作為乳腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估試劑的應(yīng)用。
[0015]—種乳腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估試劑，該試劑含有定量ZNF367基因或蛋白表達(dá)量的試劑。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供了一種用于乳腺癌診斷和治療的靶基因ZNF367。利用生物信息學(xué)的方法分析乳腺癌基因表達(dá)高通量數(shù)據(jù)，體外實(shí)驗(yàn)(熒光定量PCR、免疫組化、克隆形成)結(jié)果表明ZNF367在乳腺癌組織中高表達(dá)，且生存分析表明ZNF367基因的表達(dá)水平與乳腺癌的分期、預(yù)后密切相關(guān)。此外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還表明沉默ZNF367基因的表達(dá)水平能顯著抑制乳腺癌的成瘤及轉(zhuǎn)移能力。本發(fā)明提供的ZNF367基因的兩段發(fā)夾RNA(shRNA)和針對(duì)ZNF367基因的鎖核酸(LNA)序列可用于制備治療乳腺癌疾病的藥物。例如，采用基因治療的方法，以質(zhì)粒或者病毒為表達(dá)載體，使其在癌變部位沉默ZNF367的表達(dá)。
【附圖說明】
[0017]圖1、ZNF367基因mRNA高表達(dá)于乳腺癌組織并與差的預(yù)后相關(guān):(A)臨床組織樣品的芯片數(shù)據(jù)中，腫瘤組織的ZNF367基因RNA水平高于正常乳腺組織；(B)高表達(dá)的ZNF367基因與乳腺癌患者差的總生存時(shí)間相關(guān)；(C) ZNF367基因的高表達(dá)預(yù)示著更短的無病生存時(shí)間；(D)定量PCR結(jié)果顯示，腫瘤組織的ZNF367基因高表達(dá)于癌旁正常組織；(E)相對(duì)于非惡性的乳腺上皮細(xì)胞(MCF-10A)，ZNF367基因在多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)；
圖2、ZNF367基因蛋白高表達(dá)于乳腺癌組織并與差的預(yù)后相關(guān):(A) ZNF367染色強(qiáng)度隨乳腺癌患者的臨床分期升高而加深；(B-C)高表達(dá)的ZNF367基因的乳腺癌患者，其總生存時(shí)間(B)和無病生存時(shí)間(C)均較短；(D) ZNF367的高表達(dá)水平，預(yù)示患者更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此可作為判斷患者預(yù)后的獨(dú)立因素；
圖3、利用小發(fā)夾RNA穩(wěn)定沉默ZNF367能抑制乳腺癌的惡性表型:(A)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)兩段shRNA均能有效沉默乳腺癌細(xì)胞中ZNF367的表達(dá)；(B)沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)；(C)與多柔比星聯(lián)用的條件下，沉默ZNF367能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡；
(D)沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)形成腫瘤的大?。?E)沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力；
圖4、利用靶向ZNF367的LNA能抑制乳腺癌的惡性表型:(A)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)兩段LNA均能有效沉默乳腺癌細(xì)胞中ZNF367的表達(dá)；(B)沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)；(C)與多柔比星聯(lián)用的條件下，沉默ZNF367能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡；(D)沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)形成腫瘤的大?。?E)沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力。
【具體實(shí)施方式】
[0018]反基因治療(ant1-gene therapy)是由特定寡聚脫氧核苷酸與革El雙鏈DNA同聚啼啶或同聚嘌呤區(qū)專一性結(jié)合形成局部三螺旋結(jié)構(gòu)，阻止靶DNA與聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)抑制靶基因的復(fù)制和表達(dá)的目的。
[0019]鎖核酸(lock mucleic acid，LNA)是新發(fā)現(xiàn)的一種帶環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核苷酸衍生物，與其他寡核苷酸相比，具有更高的熱穩(wěn)定性、更好的分子雜交能力、更強(qiáng)的抗核酸酶降解能力、更好的脂溶性和更低的細(xì)胞毒性等優(yōu)勢(shì)。
[0020]發(fā)明人通過利用多個(gè)乳腺癌及正常乳腺組織的mRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)ZNF367基因高表達(dá)于乳腺癌組織，且ZNF367的高表達(dá)預(yù)示著較差的總生存時(shí)間及無病生存時(shí)間。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZNF367基因的mRNA在三陰乳腺癌細(xì)胞系BT-549、HCC1937、MDA-MB-231、MDA-MB-468中高表達(dá)，而其他乳腺癌細(xì)胞系相對(duì)表達(dá)較低。發(fā)明人進(jìn)一步設(shè)計(jì)并合成能檢測(cè)ZNF367基因RNA表達(dá)水平的熒光定量PCR引物及探針序列用于三陰乳腺癌的診斷；還設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)ZNF367基因的兩段發(fā)夾RNA(shRNA)序列，通過基因克隆的方法，將shRNA序列克隆至pSUPER-pure載體。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系，構(gòu)建了沉默ZNF367表達(dá)的shRNA 乳腺癌細(xì)胞系(SKBR3-shZNF367#l、SKBR3-shZNF367#2、BT549-shZNF367#l 和 BT549-shZNF367#2);發(fā)明人還設(shè)計(jì)針對(duì)ZNF367基因的鎖核酸(LNA)序列，并針對(duì)LNA序列中脫氧核酸進(jìn)行硫代磷酸修飾設(shè)計(jì)，通過化學(xué)合成得到針對(duì)ZNF367的兩條LNA序列(LNA-ZNF367#1和LNA-ZNF367#2)。本發(fā)明提供的兩段發(fā)夾RNA(shRNA)序列和針對(duì)ZNF367的兩條LNA序列可用于乳腺癌的治療。
[0021]現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0022]實(shí)施例1:ZNF367在乳腺癌中表達(dá)上調(diào) (I)芯片篩選
通過利用多個(gè)乳腺癌及正常乳腺組織的mRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行整合分析。
[0023]結(jié)果:從整合的臨床組織樣品芯片數(shù)據(jù)中，可以明確腫瘤組織的ZNF367基因RNA水平高于正常乳腺組織(圖1-A);將有臨床預(yù)后數(shù)據(jù)的患者樣品挑出，分析ZNF367的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的ZNF367基因預(yù)示著乳腺癌患者差的總生存時(shí)間(圖1-B)及更短的無病生存時(shí)間(圖1-C)。
[0024](2)qRT_PCR檢測(cè)乳腺癌組織以及配對(duì)癌旁組織中ZNF367基因的mRNA水平進(jìn)一步對(duì)乳腺癌組織以及配對(duì)癌旁組織中的ZNF367進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證。
[0025]方法:
I)乳腺癌組織來源:從中山大學(xué)腫瘤防治中心收集乳腺癌患者的配對(duì)的癌與癌旁組織樣本(η = 8，包括Ρ1-Ρ8)。
[0026]2)細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng):12株乳腺癌細(xì)胞系:10^1(^、8了474、10^7、10^-冊(cè)-361、10^-ΜΒ-453、SK-BR-3、T-47D、ZR-75-1、BT_549、HCC1937、MDA_MB_231、MDA_MB_468。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有 10%FBS的DMEM(Dulbecco，s Minimum Essential Medium,Invitrogen, Carlsbad,USA)培養(yǎng)基中，放置37°C的5% CO2培養(yǎng)箱。
[0027]3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:收集上述組織和12種細(xì)胞，分別利用Trizol提取RNA，使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用2 X SYBR mix (Roche)對(duì)各組細(xì)胞中ZNF367的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。
[0028]以GAPDH做內(nèi)參。所用q-PCR引物為:
ZNF367-QF:AATCGCGGACAGTATCTGCT(SEQ ID NO:1);
ZNF367-QR:GTGAGGACGAGGAGGAAGCCSEQ ID N0:2)；
GAPDH-QF:GCACCGTCAAGGCTGAGAACCSEQ ID N0:3)；
GAPDH-QR:TGGTGAAGACGCCAGTGGACSEQ ID NO:4);
將每個(gè)樣本獲得的ZNF367基因的Ct值減去其內(nèi)參基因GATOH的Ct值得到ACt，結(jié)果用2—Aet表示，ACt值越高，表示該基因的表達(dá)水平越低。
[0029]結(jié)果:定量PCR結(jié)果顯示，腫瘤組織的ZNF367基因高表達(dá)于癌旁正常組織(圖1-D);相對(duì)于非惡性的乳腺上皮細(xì)胞(MCF-1OA)，ZNF367基因在乳腺癌細(xì)胞系，尤其是三陰乳腺癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)(圖1-E)。
[0030](3)免疫組化法檢測(cè)ZNF367基因蛋白在乳腺癌組織切片中的表達(dá)水平
對(duì)選取的207例乳腺癌組織切片，使用ZNF367抗體進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化方法為:
1)烤片60°(:，11130min；
2)脫蠟及復(fù)水:二甲苯兩缸，15min/次；100%乙醇兩次，95%乙醇一次，75%乙醇一次，蒸餾水洗兩次，每次各3min;
3)切片于濕盒內(nèi)，加3%雙氧水，室溫25min，蒸饋水洗兩次，每次各3min；
4)朽1檬酸鹽修復(fù)液，高壓修復(fù)，冒氣后3min；
5)切片在修復(fù)液中自然冷卻至室溫；
6)lXPBST，3minX3次;
7)甩干，加A液(非特異性染色阻斷劑)于室溫，濕盒內(nèi)15min;
8)棄封閉液，加一抗；
9)lXPBST，3minX3次，甩干;
10)加B液(生物素羊抗兔八氧IgG)15min，IX PBST，3min X 3次，甩干；
11)加C液(鏈霉卵白素)15min，IXPBST，3min X 3次；
12)DAB顯色，自來水終止染色；
13)自來水流水漂洗；
14)蘇木素復(fù)染3min，自來水刷洗至無紫色；
15 ) 95%鹽酸酒精分化1?15 s，自來水漂洗返藍(lán)45min ；
16)60%乙醇，80%乙醇，100%乙醇脫水2min ；
17 )放入二甲苯2min，透明化后，未干時(shí)滴加10uL樹酯，封片。
[0031 ]由兩位觀察者對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察，腫瘤細(xì)胞比例由以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià):
O(無陽性腫瘤細(xì)胞)，1(陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)〈10%)，2(陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)占10-50%)，3(陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)〉50%)。
[0032]結(jié)果:ZNF367染色強(qiáng)度隨乳腺癌患者的臨床分期升高而加深(圖2-A)，高表達(dá)ZNF367基因(ZNF-H)的乳腺癌患者，其總生存時(shí)間(圖2-B)和無病生存時(shí)間(圖2-C)相比低表達(dá)患者(ZNF-L)均較短，多因素分析證實(shí)(n=207)，ZNF367的高表達(dá)水平，預(yù)示患者更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此可作為判斷患者預(yù)后的獨(dú)立因素(圖2-D)。
[0033]實(shí)施例2:利用小發(fā)夾RNA(shRNA)穩(wěn)定沉默ZNF367能抑制乳腺癌的惡性表型
(I)細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定株構(gòu)建
方法:分別用陰性對(duì)照PSUPER-V及可以沉默ZNF367的81^熟(8112,367#1、8112肥367#
2)處理三陰乳腺癌細(xì)胞SKBR3和BT549，工作濃度為5nM。通過收相應(yīng)蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證。
[0034]shZNF367#l 的序列為:ccgggcagatactgtccgcgatttactcgagtaaatcgcggacagtatctgcttttt(SEQ ID N0:5)；
shZNF367#2 的序列為:ccgggagcagattcacccatgcaaactcgagtttgcatgggtgaatctgctctttttCSEQ ID N0:6)；
結(jié)果:如圖3-A所示，分別獲得對(duì)照組細(xì)胞SKBR3 pSUPER-V、BT549 pSUPER-V和沉默ZNF367的細(xì)胞SKBR3 shZNF367#l、SKBR3 shZNF367#2和BT549 shZNF367#l、BT549shZNF367#2微管蛋白做為對(duì)照。
[0035](2)克隆形成實(shí)驗(yàn)
方法:將5X 12個(gè)細(xì)胞分別接種于六孔板中，并培養(yǎng)10天后，經(jīng)10%甲醛固定5分鐘，再用1%的結(jié)晶紫染色30s。
[0036]結(jié)果:如圖3-B所示，與對(duì)照組SKBR3pSUPER-V、BT549 pSUPER-V相比，沉默ZNF367的SKBR3 shZNF367#l、SKBR3 shZNF367#2和BT549 shZNF367#l、BT549 shZNF367#2乳腺癌細(xì)胞能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)。
[0037](3)藥物誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)
方法:將5 X 15個(gè)細(xì)胞分別接種于六孔板中，12 h后加入I ymol/L的多柔比星(Doxorubicin ΙμΜ)處理細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒處理細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。
[0038]結(jié)果:如圖3-C所示，抑制ZNF367能顯著增加多柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例。
[0039](4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
I)小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)
方法構(gòu)建小鼠體內(nèi)癌癥模型，將I X 16個(gè)乳腺癌細(xì)胞BT549 pSUPER-V和BT549shZNF367#l、BT549 shZNF367#2進(jìn)行小鼠皮下注射，5周后用活體成像系統(tǒng)觀察熒光強(qiáng)度，并解剖動(dòng)物測(cè)量腫瘤重量。
[0040]結(jié)果:如圖3-D所示，處理組與對(duì)照組相比，腫瘤體積和重量明顯小于對(duì)照組，表明與多柔比星聯(lián)用的條件下，沉默ZNF367能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡及抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)形成腫瘤的大小。
[0041 ] 2)小鼠肺轉(zhuǎn)移模型
方法:經(jīng)小鼠尾靜脈注射BT549 pSUPER-V、BT549 shZNF367#l、BT549 shZNF367#2乳腺癌細(xì)胞，5周后用活體成像系統(tǒng)觀察熒光強(qiáng)度，并解剖動(dòng)物觀察肺內(nèi)節(jié)結(jié)數(shù)目。
[0042]結(jié)果:如圖3-E所示，統(tǒng)計(jì)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目，得知用BT549 shZNF367#l、BT549shZNF367#2處理的小鼠的肺轉(zhuǎn)移癌的生長(zhǎng)能力下降，表明沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力。
[0043]實(shí)施例3:利用靶向ZNF367的鎖核酸(LNA)穩(wěn)定沉默ZNF367能抑制乳腺癌的惡性表型
(I)細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定株構(gòu)建
方法:分別用陰性對(duì)照LNA-NC及可以沉默ZNF367的LNA(LNA-ZNF367# 1、LNA-ZNF367#2 )處理乳腺癌細(xì)胞SKBR3和BT549，工作濃度為50 nM。通過收相應(yīng)蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證。
[0044]LNA-NC序列為:TGagaagaccgttcttccaactTgG(SEQ ID NO:7);
LNA_ZNF367#1 序列為:TGaaccagcttgcctttcaaagTgG(SEQ ID NO:8);
LNA_ZNF367#2序列為:TCtcatttcccaatacctcgccTgC(SEQ ID N0:9)；
注:小寫字母為硫代磷酸修飾的RNA堿基，大寫字母為L(zhǎng)NA堿基。
[0045]結(jié)果:如圖4-A所示，相對(duì)于LNA-NC處理組，在兩乳腺癌細(xì)胞中用LNA_ZNF367#1和LNA-ZNF367#2處理細(xì)胞，能顯著降低ZNF367的表達(dá)水平。
[0046](2)克隆形成實(shí)驗(yàn)
方法:將5X 12個(gè)細(xì)胞分別接種于六孔板中，并培養(yǎng)10天后，經(jīng)10%甲醛固定5分鐘，再用1%的結(jié)晶紫染色30s。
[0047]結(jié)果:如圖4-B所示，相對(duì)于LNA-NC處理組，用LNA_ZNF367#1和LNA_ZNF367#2處理細(xì)胞，能顯著抑制兩乳腺癌的克隆形成能力。
[0048](3)藥物誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)
方法:將5 X 15個(gè)細(xì)胞分別接種于六孔板中，12 h后加入I ymol/L的多柔比星和50nmol/L的LNA-NC、LNA-ZNF367#1 或LNA-ZNF367#2，用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒處理細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。
[0049]結(jié)果:如圖4-C所示，將多柔比星與針對(duì)ZNF367的LNA聯(lián)用能顯著誘導(dǎo)兩乳腺癌細(xì)胞的凋亡。
[0050](4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
I)小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)
方法:首先進(jìn)行構(gòu)建小鼠體內(nèi)癌癥模型，將I X 16個(gè)乳腺癌細(xì)胞BT549進(jìn)行小鼠乳房脂肪墊注射，在接種細(xì)胞后3天開始，每周注射2次LNA-NC、LNA-ZNF367#1或LNA-ZNF367#2，體積為100 yl，濃度為I mmol/L，連續(xù)注射4周后，用活體成像系統(tǒng)觀察熒光強(qiáng)度，并解剖動(dòng)物測(cè)量腫瘤重量。
[0051 ] 結(jié)果:如圖4-D所示，與LNA-NC處理組相比，用LNA_ZNF367#1或LNA_ZNF367#2處理荷瘤小鼠，能顯著抑制腫瘤的體積。
[0052]2)小鼠肺轉(zhuǎn)移模型
方法:經(jīng)小鼠尾靜脈注射BT549乳腺癌細(xì)胞后3天開始，每周注射2次LNA-NC、LNA-ZNF367#1或LNA-ZNF367#2，體積為100 μ?，濃度為I mmol/L，連續(xù)注射4周后，用活體成像系統(tǒng)觀察熒光強(qiáng)度，并解剖動(dòng)物觀察肺內(nèi)節(jié)結(jié)數(shù)目。
[0053]結(jié)果:如圖4-E所示，統(tǒng)計(jì)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目，與LNA-NC組相比，用LNA_ZNF367#1和LNA-ZNF367#2處理的小鼠，其腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移癌的生長(zhǎng)能力下降，表明靶向沉默ZNF367能抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力。
[0054]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.抑制ZNF367基因表達(dá)或翻譯的試劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:抑制ZNF367基因表達(dá)或翻譯的試劑為ZNF367基因啟動(dòng)子抑制劑、ZNF367基因轉(zhuǎn)錄抑制劑或ZNF367蛋白合成抑制劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:抑制ZNF367基因表達(dá)或翻譯的試劑為ZNF367基因的 dsRNA、ZNF367基因的 siRNA、或 ZNF367基因的 shRNA。4.在體內(nèi)使ZNF367蛋白活性降低或失活的試劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:在體內(nèi)使ZNF367蛋白活性降低或失活的試劑選自ZNF367蛋白抗體、ZNF367酶活性抑制劑。6.定量ZNF367基因DNA擴(kuò)增量或表達(dá)量的試劑作為乳腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估試劑的應(yīng)用。7.定量ZNF367蛋白DNA擴(kuò)增量或表達(dá)量的試劑作為乳腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估試劑的應(yīng)用。8.—種乳腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估試劑，該試劑含有定量ZNF367基因或蛋白表達(dá)量的試劑。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK106039312SQ201610357423
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】宋立兵, 李雋 , 張?chǎng)? 王曦, 林楚勇, 葉麗平
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)腫瘤防治中心