鈣黃綠素和奧司他韋聯(lián)合在防治h7n9型流感藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】鈣黃綠素和奧司他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感藥物中的應(yīng)用，是通過以下技術(shù)方案實施的：首先將H7N9野生型或突變型流感病毒神經(jīng)氨酸酶液和鈣黃綠素以及奧司他韋得混合液孵育30分鐘，再加入底物進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果表明兩種藥物聯(lián)合使用對H7N9野生型和突變型流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性的均有抑制作用，而后檢測了鈣黃綠素與奧司他韋聯(lián)合使用在細(xì)胞水平上的抗流感作用，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用能對感染H7N9野生型和突變型流感病毒的細(xì)胞起到治療作用，最后，檢測了兩者聯(lián)合使用對小鼠流感模型的影響，發(fā)現(xiàn)加入鈣黃綠素與奧司他韋混合物后，可以明顯緩解流感小鼠體重的減輕，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平，并且能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
【專利說明】
鈣黃綠素和奧司他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明具體涉及鈣黃綠素和奧司他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感是由流感病毒引起的一種急性病毒性呼吸道傳染性疾病，傳染性強(qiáng)，傳播迅 速，每年都給全球人類健康帶來了嚴(yán)重的威脅和經(jīng)濟(jì)的巨大損失，是人類至今尚不能有效 控制的世界性傳染病。流感爆發(fā)的隨機(jī)性，并沒有規(guī)律可言更無法對下次行病毒預(yù)知。所以 到目前為止，無法通過疫苗的方式有效預(yù)防未知流感的發(fā)生，而抗流感病毒藥物便成為治 療流感發(fā)生展的最有效手段。近年來靶向研究抑制劑藥物有了顯著進(jìn)展，其中主要有基質(zhì) 蛋白2(M2)離子通道抑制劑金剛烷胺和金剛乙胺、神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑奧司米韋（達(dá)菲） 和扎那米韋及廣譜抗病毒藥利巴韋林等三類藥物。金剛烷胺臨床上應(yīng)用了多年，多種亞型 流感毒株對其已產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，而達(dá)菲價格昂貴，且病毒對其耐藥性的報道也日漸增 多。2013年，在我國爆發(fā)的可以傳染人類的新型H7N9甲型禽流感病毒，其神經(jīng)氨酸酶突變型 病毒株對奧司他韋的耐受性是野生型病毒株的10000多倍。為提高藥物療效，減緩流感毒株 耐藥性的產(chǎn)生，抗流感藥物的聯(lián)合使用成為近年來國際醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn)。
[0003] 鈣黃綠素 (Calcein)是一種小分子水溶性熒光素，具有絡(luò)合指示劑、熒光指示劑和 測定鈣、銘、鋇、和錳等用途。鈣黃綠素經(jīng)常作為脂質(zhì)體載藥模型，評價藥物泄露情況。目前 并沒有其有抗流感病毒方面功效的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供鈣黃綠素和奧司他韋聯(lián)合使用在防治H7N9型流感藥物中 的應(yīng)用。鈣黃綠素與羧酸奧斯他韋聯(lián)合使用能夠有效的抑制H7N9野生型和突變型流感病毒 神經(jīng)氨酸酶的活性，從而抑制流感病毒在體內(nèi)的繁殖，進(jìn)而減輕或治愈流感患者。本發(fā)明對 鈣黃綠素和羧酸奧斯他韋對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行了體外酶學(xué)抑制性的 檢測，發(fā)現(xiàn)羧酸奧斯他韋對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度（IC 5q)分別 為1.75±0.12nmol/L和26.52 ± 1.06ymol/L;鈣黃綠素對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸 酶的IC5q分別為12.68 ± 2.26μπιοI/L和30.19 ± 1.61 μπιοI/L。而后進(jìn)行了鈣黃綠素與羧酸奧 司他韋聯(lián)合使用體外酶學(xué)抑制性的檢測，聯(lián)合用藥的作用效果用聯(lián)合指數(shù)值表示:聯(lián)合指 數(shù)值小于1表明兩種藥物聯(lián)合使用起到協(xié)同作用。實驗結(jié)果表明兩種藥物對Η7Ν9野生型神 經(jīng)氨酸酶的抑制起到協(xié)同作用，且對Η7Ν9突變型神經(jīng)氨酸酶抑制的協(xié)同效果更加明顯。我 們又對這兩種Η7Ν9流感病毒感染MDCK細(xì)胞并加入鈣黃綠素與羧酸奧司他韋混合物進(jìn)行了 細(xì)胞存活率的測定，發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素與羧酸奧司他韋混合物均能提高Η7Ν9病毒感染后細(xì)胞的 存活率。最后，我們對鈣黃綠素與奧司他韋混合物對Η7Ν9野生型和突變型流感病毒對小鼠 的體重變化、致死率及肺指數(shù)進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素與奧司他韋混合物能明顯緩解 Η7Ν9型流感病毒對小鼠的癥狀。本發(fā)明為開發(fā)以神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)的新藥提供基礎(chǔ)，為鈣 黃綠素與奧司他韋聯(lián)合使用應(yīng)用于人類流感的治療提供了參考。
【附圖說明】
[0005] 圖1是不同濃度鈣黃綠素與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對H7N9野生型流感病毒神經(jīng)氨 酸酶的抑制作用。
[0006] 圖2是不同濃度鈣黃綠素與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對H7N9突變型流感病毒神經(jīng)氨 酸酶的抑制作用。
[0007] 圖3是不同濃度鈣黃綠素與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9野生型流感病毒的 MDCK細(xì)胞的治療作用。
[0008] 圖4是不同濃度鈣黃綠素與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9突變型流感病毒的 MDCK細(xì)胞的治療作用。
[0009] 圖5是鈣黃綠素與奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9野生型流感病毒的小鼠體重的影 響。
[0010] 圖6是鈣黃綠素與奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9突變型流感病毒的小鼠體重的影 響。
[0011] 圖7是鈣黃綠素與奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9野生型或突變型流感病毒小鼠肺 中病毒載量的影響。
【具體實施方式】
[0012] 以下通過實例形式的【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0013] 實施例1
[0014] H7N9野生型或突變型神經(jīng)氨酸酶溶液用pH 6.5MES緩沖液(32.5mM)進(jìn)行配制，將 一定量的神經(jīng)氨酸酶加入到反應(yīng)緩沖液中，使得總體積為40yL，再分別加入IOyL不同濃度 的鈣黃綠素或羧酸奧斯他韋。在37°C孵箱中放置30min，然后加入50yL 20μΜ MU-NANA底物 緩沖液，終反應(yīng)體系為l〇〇yL，反應(yīng)液置于黑色酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為 360nm，發(fā)射波長為450nm，檢測時長8min。檢測的熒光強(qiáng)度變化就代表酶降解底物活力的強(qiáng) 弱。檢測結(jié)果為:羧酸奧斯他韋對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶的IC 5q分別為1.75土 0 · 12nmol/L和26 · 52± 1 · 06ymol/L;鈣黃綠素對H7N9野生型以及突變型的IC5Q分別為12 · 68 ± 2·26ym/L和30·19 ±1·61ymol/L。
[0015] 實施例2
[0016]根據(jù)測定的鈣黃綠素與羧酸奧司他韋對H7N9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶的1(：50來 確定鈣黃綠素與羧酸奧司他韋的加入濃度。鈣黃綠素與羧酸奧司他韋的濃度選擇為各自相 對于H7N9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶的0.25，0.5，1，2和4倍的IC 5q濃度。并且所加入的鈣黃 綠素的濃度與羧酸奧司他韋的濃度的比例是維持一致的，為其IC5Q值的比值。首先在96孔酶 標(biāo)板中加入30yL的稀釋后的H7N9野生型或突變型神經(jīng)氨酸酶液，而后在每個孔中加入10μ1 不同濃度的鈣黃綠素和IOyL對應(yīng)濃度的羧酸奧司他韋，每個濃度做4次重復(fù)。在37°C下孵育 30min后，再加入50μ1 20μΜ的NA特異性底物MU-NANA，檢測H7N9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶 的熒光強(qiáng)度。記錄數(shù)據(jù)，然后運(yùn)用CalcuSyn軟件計算這兩種藥物的聯(lián)合指數(shù)(Cl值），結(jié)果如 下：
[0018] 〈注>:ED50、ED75和ED90分別表示酶活性被抑制50%、75%和90%。
[0019] CI值小于1說明兩種藥物聯(lián)合起到協(xié)同作用，且CI值越小協(xié)同效果越好。由表中數(shù) 據(jù)可知兩種藥物聯(lián)合使用對H7N9神經(jīng)氨酸酶的抑制起到協(xié)同作用。
[0020] 實施例3
[0021]為了檢測鈣黃綠素與羧酸奧司他韋混合物在MDCK細(xì)胞上抗H7N9野生型與突變型 流感病毒的效果，選取對數(shù)生長期MDCK細(xì)胞。鋪96孔板，3000個/孔，37°C，5 %⑶:^溫箱中培 養(yǎng)24h，至單層細(xì)胞融合度達(dá)50-60%。次日，棄培養(yǎng)液，用無血清DMEM洗2次除去殘留血清。 再用IOOyL的H7N9野生型或突變型流感病毒尿囊液(濃度為100倍的TCID 5q濃度)和不同濃度 下的鈣黃綠素與羧酸奧司他韋混合物100μΙ 37°C下混合2h，鈣黃綠素與羧酸奧司他韋的濃 度選擇為各自相對于H7N9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶的0.25，0.5，1，2和4倍的IC50濃度， 所加入的鈣黃綠素的濃度與羧酸奧司他韋的濃度的比例維持一致，為其IC 5Q值的比值。之 后，分別將孵育混合液分別加入已鋪好細(xì)胞的96孔，每孔200yL，每種孵育液做3個復(fù)孔，置 于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，此為病毒吸附感染過程。2h后，棄掉各孔的上清，各孔MDCK細(xì)胞用無血清 DMEM培養(yǎng)基清洗3次，每孔加入IOOyL病毒稀釋液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，之后棄上清，各孔用 無血清DMEM培養(yǎng)基清洗3次，每孔加入IOOyL細(xì)胞維持液(含2%血清的DMEM培養(yǎng)液+lyg/mL 胰酶），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，觀察各孔的CPE，結(jié)合MTT法檢測各孔細(xì)胞病變程度，這同時反 映了檢測藥物對流感病毒的抑制程度。將終止觀察的96孔培養(yǎng)板孔中每孔加入15yL MTT (5mg/mL)溶液，輕輕混勻，置37 °C培養(yǎng)箱中孵育4h后，棄上清，每孔加入IOOyL DMSO，輕輕混 勾，30min內(nèi)于酶聯(lián)免疫測定儀上讀取570nm處的OD值，計算細(xì)胞的活力的百分比，活力百分 比在一定程度上代表了藥物對病毒致MDCK細(xì)胞損傷的保護(hù)程度。
[0022] 結(jié)果如圖3和圖4所示，在不同處理條件下，加入鈣黃綠素與羧酸奧司他韋混合液 與H7N9野生型或突變型流感病毒時，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率也隨之增加。說明鈣 黃綠素與奧司他韋混合液可以抑制H7N9野生型與突變型流感病毒，保護(hù)MDCK細(xì)胞免受病毒 破壞，而且保護(hù)效應(yīng)也隨著鈣黃綠素與羧酸奧司他韋混合物濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴性。
[0023] 實施例4
[0024]為了檢測鈣黃綠素與奧司他韋混合物對感染了 H7N9野生型流感病毒的小鼠是否 有治療作用，18_20g雌性BABL/c小鼠50只，用0.2%的戊巴比妥鈉溶液50yL/只麻醉，再通過 滴鼻的方式將10倍LD 5q濃度的Η7Ν9野生型流感病毒稀釋液滴入小鼠鼻腔內(nèi)建立小鼠流感模 型，以滴入50yL PBS緩沖液的小鼠作為對照組。我們將50只小鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照 組(PBS組）；病毒組（10倍LD5QH7N9野生型流感病毒）；鈣黃綠素組（10倍LD 5QH7N9野生型流感 病毒+25mg/kg|丐黃綠素）；奧司他韋組（10倍LD5〇H7N9野生型流感病毒+25mg/kg奧司他韋）； 鈣黃綠素與奧司他韋混合物組（10倍LD5〇H7N9野生型流感病毒+251]?/!?^黃綠素與25mg/kg 奧司他韋混合物）。每組10只。對小鼠接種病毒2天前開始給藥，每天2次，連續(xù)灌胃10天，每 只小鼠一次給藥〇.2mL。每天記錄每組小鼠的體重及死亡情況。在第15天時，對小鼠斷食斷 水8h后，進(jìn)行脫臼處死，取出小鼠的肺臟并進(jìn)行稱重。按照公式進(jìn)行計算：
[0025] 肺指數(shù)=X Tra佯?
[0026] 結(jié)果如圖7所示，說明鈣黃綠素與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9野生型流感病 毒感染小鼠的肺指數(shù)，可以緩解H7N9野生型流感病毒感染小鼠體重的減輕，改善小鼠的生 存狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0027]結(jié)果如下表所示，說明鈣黃綠素與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9野生型流感小 鼠的肺指數(shù)。
[0029]以上結(jié)果均說明，鈣黃綠素與奧司他韋混合液能對感染H7N9野生型流感的小鼠起 到治療的作用，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0030] 實施例5
[0031]為了檢測鈣黃綠素與奧司他韋混合物對感染了 H7N9突變型流感病毒的小鼠是否 有治療作用，18_20g雌性BABL/c小鼠50只，用0.2%的戊巴比妥鈉溶液50yL/只麻醉，再通過 滴鼻的方式將10倍LD 5q濃度的Η7Ν9突變型流感病毒稀釋液滴入小鼠鼻腔內(nèi)建立小鼠流感模 型，以滴入50yL PBS緩沖液的小鼠作為對照組。我們將50只小鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照 組(PBS組）；病毒組（10倍LD5QH7N9突變型流感病毒）；鈣黃綠素組（10倍LD 5QH7N9突變型流感 病毒+25mg/kg鈣黃綠素）；奧司他韋組（10倍LD5QH7N9突變型流感病毒+25mg/kg奧司他韋）； 鈣黃綠素與奧司他韋混合物組（10倍LD5QH7N9突變型流感病毒+2511^/1^11?黃綠素與25mg/kg 奧司他韋混合物）。每組10只。對小鼠接種病毒2天前開始給藥，每天2次，連續(xù)灌胃10天，每 只小鼠一次給藥〇.2mL。每天記錄每組小鼠的體重及死亡情況。在第15天時，對小鼠斷食斷 水8h后，進(jìn)行脫白處死，取出小鼠的肺臟并進(jìn)行稱重。按照實施例4所示公式進(jìn)行計算。 [0032]結(jié)果圖7所示，說明鈣黃綠素與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9突變型流感病毒 感染小鼠的肺指數(shù)，可以緩解H7N9突變型流感病毒感染小鼠體重的減輕，改善小鼠的生存 狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0033]結(jié)果如下表所示，說明鈣黃綠素與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9突變型流感小 鼠的肺指數(shù)。
[0035]以上結(jié)果均說明，鈣黃綠素與奧司他韋混合液能對感染H7N9突變型流感的小鼠起 到治療的作用，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
【主權(quán)項】
1. 鈣黃綠素和奧斯他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素和奧斯他韋聯(lián)合以口服給藥方式的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素和奧斯他韋聯(lián)合以注射給藥方式的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/16GK106074498SQ201610550473
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】王燁, 房學(xué)迅, 于淼, 李源博, 張金瑞, 李響, 于大海
【申請人】吉林大學(xué)