一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法。將培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到培養(yǎng)液上培養(yǎng)；吸出培養(yǎng)液，再加入復(fù)合培養(yǎng)液感染4小時(shí)；補(bǔ)充復(fù)合培養(yǎng)液繼續(xù)感染24h；吸去復(fù)合培養(yǎng)液，換上含10%FBS培養(yǎng)液繼續(xù)感染20小時(shí)，得到帶GFP的報(bào)告基因的細(xì)胞液；將實(shí)現(xiàn)表達(dá)GFP的細(xì)胞移入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到帶有GFP?BMSCs的種子細(xì)胞；將人工肌腱支架，浸泡在DMEM低糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h時(shí)將GFP?BMSCs細(xì)胞種植到支架上繼續(xù)培養(yǎng)48h，再轉(zhuǎn)移到肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)1～2周，得到人工肌腱的移植物。本發(fā)明制備的可作為組織工程化人工肌腱移植物植入體內(nèi)損傷肌腱的修復(fù)。
【專利說明】
一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程化的技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，涉及一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)研究資料報(bào)道:肌腱損傷常發(fā)生在日常的工作和運(yùn)動(dòng)中，世界范圍內(nèi)每年有超過3000萬人肌腱損傷。依靠傳統(tǒng)治療手段的修復(fù)后的肌腱很難恢復(fù)到損傷前的功能狀態(tài)。肌腱損傷的治療也成了運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程化肌腱為解決這一難題提供途徑。其與傳統(tǒng)的肌腱損傷的治療手段相比，不再有自體供區(qū)功能缺失，及異體移植肌腱的排異等問題。
[0003]組織工程化肌腱原理是將分離的高濃度有活力的肌腱種子細(xì)胞種植于生物相容性好、可生物降解的細(xì)胞載體即支架材料，體外培養(yǎng)后回植入到缺損部位，形成新的、自身的、具有功能的肌腱組織，最終達(dá)到生物學(xué)意義上的完全修復(fù)。該技術(shù)與傳統(tǒng)肌腱損傷的治療方法相比優(yōu)點(diǎn)在于:①修復(fù)用種子細(xì)胞和支架材料沒有來源限制、無免疫排斥反應(yīng)。②所形成新的肌腱組織在具有活力和功能上，可以達(dá)到完全替代。③種子細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增重建的肌腱可以按缺損肌腱形態(tài)進(jìn)行預(yù)制，可修復(fù)嚴(yán)重的肌腱缺損。
[0004]組織工程化肌腱的構(gòu)建成功與否，主要決定于一是種子細(xì)胞，二是組織工程支架材料，三是誘導(dǎo)因素。種子細(xì)胞是一群具有多相分化潛能的細(xì)胞，取材方便、易分離純化，可以多次傳代并保持分化能力，移植不發(fā)生或程度很輕地發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，具有多相分化的潛能，適用于多種組織的修復(fù)重建。較為理想的組織工程支架材料具有生物相容性及細(xì)胞親和性好，來源廣泛，能夠?yàn)榉N子細(xì)胞的粘附、增殖、分化和分泌細(xì)胞外基質(zhì)提供三維空間結(jié)構(gòu)，并具有加工性能和力學(xué)性能滿足修復(fù)后肌腱運(yùn)動(dòng)。種子細(xì)胞的分化受細(xì)胞周圍環(huán)境中物理、化學(xué)及生物因素的調(diào)控。誘導(dǎo)因素主要包括生長因子都能促進(jìn)種子細(xì)胞增殖并向腱細(xì)胞方向分化，強(qiáng)化組織工程肌腱的生物力學(xué)的活性。除了上述三個(gè)因素以外，還有一個(gè)過程關(guān)鍵因素是組織工程化肌腱體外培養(yǎng)或植入體內(nèi)后，如何便于體外觀察種子細(xì)胞是否成活生長及了解肌腱損傷的修復(fù)情況。目前開發(fā)出的組織工程化肌腱不具備這種的體外觀察的功能。
[0005]在組織工程支架材料的制備方面，福建師范大學(xué)黃祖新等人研制成功了“一種細(xì)菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法”并申請了發(fā)明專利(與本發(fā)明同日申請)。該專利采用木糖葡糖醋桿菌(Glucoacetobacter xyli/3us)，首先制備細(xì)菌纖維素膜(BC膜)，再采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的不銹鋼模具，將制備的BC膜壓制定型成組織工程化人工肌腱支架。所制備的支架孔隙率、持水性、復(fù)水性、力學(xué)性能、細(xì)胞毒性和細(xì)胞相容性等技術(shù)指標(biāo)符合的要求，可應(yīng)用于組織工程化人工肌腱的制備。
[0006]組織工程學(xué)研究是一項(xiàng)重大工程，真正要實(shí)現(xiàn)體外預(yù)制有生命的種植體完全替代人體組織、器官功能，組織工程化肌腱要真正應(yīng)用于臨床，進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)，最終解決人類病損肌腱的修復(fù)問題，不但是人工肌腱支架材料，還要解決種子細(xì)胞和誘導(dǎo)因素關(guān)鍵技術(shù)問題。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)問題，選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為種子細(xì)胞、以細(xì)菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架為載體，將綠色熒光蛋白(GFP)通過Lv病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并種植在人工肌腱支架上，經(jīng)過體外培養(yǎng)，構(gòu)建含有GFP-BMSCs-BC的組織工程化的人工肌腱移植物。該GFP-BMSCs-BC組織工程化人工肌腱移植物植入體內(nèi)后，能夠在熒光顯微鏡下看到細(xì)胞發(fā)出的熒光，說明種子細(xì)胞能夠在生物支架上生長，可體外觀察種子細(xì)胞是否在體內(nèi)成活并生長，同時(shí)可了解肌腱損傷的修復(fù)情況。
[0008]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用技術(shù)方案如下:
1、種子細(xì)胞的制備
(I)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞準(zhǔn)備:將培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)接種到6孔板中DMEM低糖培養(yǎng)液上，接種的細(xì)胞濃度為I X 106/mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)到細(xì)胞匯合率達(dá)50%至70%。
[0009](2)慢病毒LV-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs:將帶有匯合率達(dá)到50%至70%的BMSCs的DMEM低糖培養(yǎng)液吸出，再加入復(fù)合培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37 °C溫度，5%C02濃度培養(yǎng)條件，感染4小時(shí)；4小時(shí)時(shí)補(bǔ)充復(fù)合培養(yǎng)液至原體積，繼續(xù)感染24h;吸去復(fù)合培養(yǎng)液，換上新鮮的含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)，并經(jīng)過消化，得到帶GFP的報(bào)告基因的BMSCs液。
[0010]所述的復(fù)合培養(yǎng)液，是指在含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每毫升基礎(chǔ)液分別添加5?8yg的5-二氮^ 亞甲基聚甲溴化物(口01}^1^6116)和5?848的慢病毒1^-6??原液。
[0011](3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選:將帶GFP的報(bào)告基因的BMSCs液，通過熒光顯微鏡觀測GFP表達(dá)情況，將實(shí)現(xiàn)表達(dá)GFP的BMSCs移入到已添加5?8yg/mL puromycin的含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每12h更換上述培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)48h后篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，即制備成GFP-BMSCs的種子細(xì)胞。
[0012]2、GFP-BMSCs-BC組織工程化人工肌腱移植物:
將組織工程化人工肌腱支架，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使組織工程化人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)液。將GFP-BMSCs細(xì)胞以I?2 X 105/ml的細(xì)胞濃度種植到已充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)液的支架上。以37 °C溫度，5%C02濃度培養(yǎng)條件經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)箱先培養(yǎng)48h，再轉(zhuǎn)移到肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)I?2周，得到本發(fā)明所述的含有GFP-BMSCs-BC的組織工程化人工肌腱的移植物;可作為GFP-BMSCs-BC的組織工程化人工肌腱移植物植入體內(nèi)損傷肌腱的修復(fù)。
[0013]采用本發(fā)明方法制備得到含有GFP-BMSCs-BC的組織工程化人工肌腱的移植物，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定用于修復(fù)SD大鼠受損肌腱。即在大鼠肌腱中間，切除
0.5cm的肌腱，制造缺損模型;植入本發(fā)明制備的含有GFP- BMSCs-BC的組織工程化人工肌腱的移植物，使用3-0縫合線，使組織工程化人工肌腱和SD大鼠受損自體肌腱緊密縫合相連，縫合線縫合皮膚，放入鼠籠里。術(shù)后3d，手術(shù)部位腫脹消除，無排斥反應(yīng)和無炎癥反應(yīng)。IW后，傷口愈合。兩周后，表皮連線已經(jīng)脫落，后肢可支撐，但不能正常彎曲。3W后，大鼠可用后肢支撐但不可以正常彎曲行走。傷口沒有撕裂，也沒有炎癥反應(yīng)。5W后，大鼠可用后肢支撐但仍然不能彎曲行走，傷口沒有撕裂，也沒有炎癥反應(yīng)。術(shù)后12W，大鼠后肢可支撐穩(wěn)、可彎曲，并可行走，表面?zhèn)谝呀?jīng)完全康復(fù)，手術(shù)部位的毛發(fā)也重新長出。
[0014]上述修復(fù)過程，通過在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況，顯示植入的GFP-BMSCs細(xì)胞能正常生長在BC支架上。
[0015]本發(fā)明所述的組織工程化人工肌腱支架，是通過如下方式得到的:
一、BC膜的制備
(一)制備
1、將木糖葡糖醋桿菌(Glucoace tobacter xylinus)菌種接種到固體培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)的活化后，從固體培養(yǎng)基上挑選活化的菌種，接入裝有I OOmL液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶，在28°C和160r/min搖床的條件下培養(yǎng)24?32h制成木糖葡糖醋桿菌種子液，備用。
[0016]2、木糖葡糖醋桿菌種子液以每升酒糟降解液復(fù)合液接入6 -8%體積的接種量，接入到酒糟降解液復(fù)合液中，充分震蕩，使菌液均勻后，放置于28°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)4?6天后，可見液體培養(yǎng)基液面浮有細(xì)菌纖維素膜，此時(shí)細(xì)菌纖維素膜厚度為2.5?4.5 mm0
[0017]3、取出浮于培養(yǎng)基表面的細(xì)菌纖維素膜，用自來水多次沖洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加熱并煮沸l(wèi)Omin，去除膜中的培養(yǎng)基和菌體等雜質(zhì)。取出，加蒸餾水漂洗10 min。再將細(xì)菌纖維素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸1min，用蒸餾水多次漂洗細(xì)菌纖維素膜，直至洗滌水pH值為7.0為止。
[0018]4、將細(xì)菌纖維素膜用蒸餾水浸24?28h，得到白色半透明的細(xì)菌纖維素膜。此時(shí)，所制備的細(xì)菌纖維素膜由細(xì)小的纖維束交錯(cuò)形成中間為大量納米級孔隙的纖維素膜。
[0019]所述的菌種為木糖葡糖醋桿菌(6^ucoace1/?acier，編號為I.1812，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。
[0020]所述的固體培養(yǎng)基制備配方為:3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.6%磷酸氫二鈉，0.2%硫酸鎂，2%瓊脂粉。按常規(guī)配制，滅菌備用。
[0021 ]所述的液體培養(yǎng)基，其配方為:2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.2%磷酸氫二鈉，0.1%硫酸鎂;液體培養(yǎng)基pH 6.0-6.5。
[0022]所述的酒糟降解液復(fù)合液，以酒糟降解液為母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%檸檬酸，0.02%磷酸氫二鈉，0.01%硫酸鎂；酒糟降解液復(fù)合液pH6.0?6.5，滅菌備用。
[0023 ]酒糟降解液的制備:將10重量份機(jī)榨黃酒酒糟中加入50?60重量份5 5 V熱水，攪拌混合，再加I重量份復(fù)合酶酶解5?6小時(shí)，酶解條件:品溫為45°C?50°C，pH 6.0?6.5。酶解后經(jīng)過濾機(jī)過濾的液體為酒糟降解液，滅菌備用。
[0024]所述的復(fù)合酶，其重量組分比為中溫α-淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶=3:4:3。
[0025]所述的中溫α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。
[0026]二、支架成型
(一)制備
采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分開不銹鋼模具，將本發(fā)明制備的孔隙率、持水性、復(fù)水性、力學(xué)性能技術(shù)指標(biāo)符合要求的BC膜，填充于模具內(nèi)，壓制定型成組織工程化人工肌腱支架，將壓制定型后支架放在高壓滅菌鍋中進(jìn)行溫度121°C、15min的滅菌處理，滅菌處理后降到室溫后，放入4°C冰箱保存、備用。由于模具內(nèi)底部刻有單向凹凸淺花紋，因而壓制定型成組織工程化人工肌腱支架表面也具有單向淺花紋。
[0027]所述的肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)液以10 %FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每毫升基礎(chǔ)液分別添加100U鏈霉素、100U青霉素、10 mmol β_甘油磷酸鈉、10 mol地塞米松、50mg維生素C、50mg人骨形態(tài)發(fā)生蛋白12(BMP12)、5yg人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、20yg人表皮生長因子(EGF)。
[0028]所述的慢病毒LV-GFP購自漢恒生物科技(上海)有限公司；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)購自賽齊(上海)生物工程有限公司。
[0029]所述人骨形態(tài)發(fā)生蛋白12(BMP12)、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(EGF)購自北京中科物源生物技術(shù)有限公司。
【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明制備的組織工程化人工肌腱移植物GFP-BMSCs-BC細(xì)胞HE染色8周后細(xì)胞受力方向排列圖。
[0031]圖2是本發(fā)明制備的組織工程化人工肌腱移植物術(shù)后2周膠原蛋白I型免疫組化顯示圖。
[0032]圖3是本發(fā)明制備的組織工程化人工肌腱移植物膠后2周原蛋白ΙΠ型大量表達(dá)顯示圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1
1、種子細(xì)胞的制備
(I)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞準(zhǔn)備:將培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)接種到6孔板中DMEM低糖培養(yǎng)液上，接種的細(xì)胞濃度為I X 106/ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)到細(xì)胞匯合率達(dá)55 %。
[0034](2)慢病毒LV-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs:將帶有匯合率達(dá)到50 °/c^BMSCs的DMEM低糖培養(yǎng)液吸出，再加入復(fù)合培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37 °C溫度，5%C02濃度培養(yǎng)條件，感染4小時(shí);4小時(shí)時(shí)補(bǔ)充復(fù)合培養(yǎng)液至原體積，繼續(xù)感染24h;吸去復(fù)合培養(yǎng)液，換上新鮮的含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)，經(jīng)過消化，得到帶GFP的報(bào)告基因的BMSCs液。
[0035](3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選:將帶GFP的報(bào)告基因的BMSCs液，通過熒光顯微鏡觀測GFP表達(dá)情況，將實(shí)現(xiàn)表達(dá)GFP的BMSCs移入到已添加5yg/mL puromycin的含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每12h更換上述培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)48h后篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，即制備成GFP-BMSCs的種子細(xì)胞。
[0036]2、GFP-BMSCs-BC組織工程化肌腱移殖物:
將組織工程化人工肌腱支架(BC膜支架)，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使BC膜支架充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)液。將GFP-BMSCs細(xì)胞以2 X105/ml的細(xì)胞濃度種植到已充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)液的BC膜支架上。經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，然后肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)I周，得到含有GFP-BMSCs-BC的組織工程化肌腱移植物。
[0037]采用本發(fā)明方法制備得到含有GFP-BMSCs-BC的組織工程化肌腱移植物，用于修復(fù)SD大鼠受損肌腱。即在大鼠肌腱中間，切除0.5cm的肌腱，制造缺損模型;植入本發(fā)明制備的含有GFP- BMSCs-BC的組織工程化肌腱移植物，使用O號或3號縫合線，使組織工程化肌腱和SD大鼠受損自體肌腱緊密縫合相連，縫合線縫合皮膚，放入鼠籠里。術(shù)后3d，手術(shù)部位腫脹消除，無排斥反應(yīng)和無炎癥反應(yīng)。IW后，傷口愈合。兩周后，表皮連線已經(jīng)脫落，后肢可支撐，但不能正常彎曲。3W后，大鼠可用后肢支撐但不可以正常彎曲行走。傷口沒有撕裂，也沒有炎癥反應(yīng)。5W后，大鼠可用后肢支撐但仍然不能彎曲行走，傷口沒有撕裂，也沒有炎癥反應(yīng)。術(shù)后12W，大鼠后肢可支撐穩(wěn)、可彎曲，并可行走，表面?zhèn)谝呀?jīng)完全康復(fù)，手術(shù)部位的毛也重新長出。
[0038]上述修復(fù)過程，通過在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)情況，顯示GFP-BMSCs細(xì)胞能正常生長在BC支架上。
[0039]GFP-BMSCs-BC細(xì)胞HE染色結(jié)果證明:術(shù)后8周細(xì)胞數(shù)量減少到正常水平且呈受力方向排列(見圖1);免疫組化顯示:術(shù)后2周膠原蛋白I型(見圖2)和膠原蛋白m型(見圖3)大量表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法，其特征是: (1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞準(zhǔn)備:將培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板中DMEM低糖培養(yǎng)液上，接種的細(xì)胞濃度為I X 106/mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)到細(xì)胞匯合率達(dá)50%至70%; (2)慢病毒LV-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs:將DMEM低糖培養(yǎng)液吸出，再加入復(fù)合培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37 °C溫度，5%C02濃度培養(yǎng)條件，感染4小時(shí);4小時(shí)時(shí)補(bǔ)充復(fù)合培養(yǎng)液至原體積，繼續(xù)感染24h;吸去復(fù)合培養(yǎng)液，換上新鮮的含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)，經(jīng)過消化，得到帶GFP的報(bào)告基因的BMSCs液； (3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選:將實(shí)現(xiàn)表達(dá)GFP的BMSCs移入到已添加5?8yg/mlpuromycin的含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每12h更換上述培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)48h后篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，得到GFP-BMSCs的種子細(xì)胞； (4)將組織工程化人工肌腱支架，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使組織工程化人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)液;將GFP-BMSCs細(xì)胞以I?2 X 105/mL的細(xì)胞濃度種植到人工肌腱支架上；以37°C溫度，5%C02濃度培養(yǎng)條件，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)箱先培養(yǎng)48h，再轉(zhuǎn)移到肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)I?2周，得到含有GFP-BMSCs-B(^9組織工程化人工肌腱的移植物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法，其特征是所述的復(fù)合培養(yǎng)液，是指在含10 %FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每毫升基礎(chǔ)液分別添加5?8yg的5-二氮^^一亞甲基聚甲溴化物和5?8yg的LV-GFP病毒原液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法，其特征是所述的組織工程化人工肌腱支架，是通過如下方式得到的: 1)將木糖葡糖醋桿菌((Wucoace1/?acierifius)菌種接種到固體培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)的活化后，從固體培養(yǎng)基上挑選活化的菌種，接入裝有I OOmL液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶，在28°C和160r/min搖床的條件下培養(yǎng)24?32h制成木糖葡糖醋桿菌種子液，備用； 2)木糖葡糖醋桿菌種子液以每升酒糟降解液復(fù)合液接入6?8%體積的接種量，接入到酒糟降解液復(fù)合液中，充分震蕩，使菌液均勻后，放置于28°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)4?6天后，可見液體培養(yǎng)基液面浮有細(xì)菌纖維素膜，此時(shí)細(xì)菌纖維素膜厚度為2.5?4.5 mm； 3)取出浮于培養(yǎng)基表面的細(xì)菌纖維素膜，用自來水多次沖洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加熱并煮沸l(wèi)Omin，去除膜中的培養(yǎng)基和菌體等雜質(zhì)。取出，加蒸餾水漂洗10 min，再將細(xì)菌纖維素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水多次漂洗細(xì)菌纖維素膜，直至洗滌水pH值為7.0為止； 4)將細(xì)菌纖維素膜用蒸餾水浸24?28h，得到白色半透明的細(xì)菌纖維素膜； 5)采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分開不銹鋼模具，將本發(fā)明制備的BC膜填充于模具內(nèi)，壓制定型成組織工程化人工肌腱支架，將壓制定型后支架放在高壓滅菌鍋中進(jìn)行溫度12rC、15min的滅菌處理，滅菌處理后降到室溫后，放入4°C冰箱保存、備用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法，其特征是所述的固體培養(yǎng)基制備配方為:3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.6%磷酸氫二鈉，0.2%硫酸鎂，2%瓊脂粉，按常規(guī)配制，滅菌備用； 所述的液體培養(yǎng)基，其配方為:2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.2%磷酸氫二鈉，0.1%硫酸鎂;液體培養(yǎng)基pH 6.0-6.5； 所述的酒糟降解液復(fù)合液，以酒糟降解液為母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%檸檬酸，0.02%磷酸氫二鈉，0.01%硫酸鎂；酒糟降解液復(fù)合液pH6.0?6.5，滅菌備用；其中酒糟降解液的制備:將100重量份機(jī)榨黃酒酒糟中加入50?60重量份55 0C熱水，攪拌混合，再加I重量份復(fù)合酶酶解5?6小時(shí)，酶解條件:品溫為45 °C?500C，pH 6.0?6.5;酶解后經(jīng)過濾機(jī)過濾的液體為酒糟降解液，滅菌備用； 所述的復(fù)合酶，其重量組分比為中溫淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶= 3:4:3。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于人工肌腱支架材料的組織工程化人工肌腱移植物的制備方法，其特征是所述肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)液以含10 %FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每毫升基礎(chǔ)液分別添加100U鏈霉素、100U青霉素、10 mmol β-甘油磷酸鈉、1mol地塞米松、50mg維生素C、50mg人骨形態(tài)發(fā)生蛋白12(BMP12)、5yg人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、20yg人表皮生長因子(EGF)。
【文檔編號】A61L27/38GK106075585SQ201610534817
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】黃鎮(zhèn), 黃祖新, 周文浩
【申請人】福建師范大學(xué)