專利名稱：從微藻制備與提取角鯊烯的工藝方法
從微藻制備與提取角鯊烯的工藝方法本發(fā)明是關(guān)于一種從破囊壺菌微藻通過(guò)發(fā)酵作用制成角鯊烯的優(yōu)化生產(chǎn)工藝方法。從發(fā)明的意義上來(lái)說(shuō),“破囊壺菌微藻”屬于裂殖弧菌，Aurantiochytrium和破囊壺菌下物種。角鯊烯是一種三萜類化合物，分子結(jié)構(gòu)為三十碳五十氫的異戊二烯，其分子式為2,6,10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22 二十四碳六烯。
這是一種所有高等生物，包括在人類身上(皮脂中可以找到)自然分泌的脂質(zhì)。角鯊烯實(shí)際是膽固醇、類固醇激素和維生素D的一種生物合成的基礎(chǔ)中間體(一種膽固醇代謝酶，角鯊烯單加氧酶，在氧化角鯊烯分子的其中一個(gè)鏈的同時(shí)，誘導(dǎo)環(huán)化作用并產(chǎn)生羊毛固醇，后者將轉(zhuǎn)化為膽固醇和其他類固醇)。在工業(yè)中，角鯊烯主要用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)。作為食用添加，通常是被制成為角鯊烯膠囊或油制品。在化妝品領(lǐng)域，其分子可作為保濕霜里面的一種抗氧化劑，抗靜電劑和潤(rùn)膚保濕齊U，迅速滲透進(jìn)入皮膚，不留下痕跡，沒(méi)有油膩感，與其它油和維生素混合使用效果良好。在這個(gè)領(lǐng)域使用的時(shí)候，請(qǐng)注意，由于角鯊烯性質(zhì)極不穩(wěn)定出個(gè)不飽和烴)，飽和形式的角鯊?fù)?加氫反應(yīng)制得)是最佳的抗氧化劑，現(xiàn)在市場(chǎng)上售賣的也是這種，一般來(lái)說(shuō)其純度水平非常高(99% )。毒理學(xué)研究表明，按照目前在化妝品中使用的濃度，角鯊烯和角鯊?fù)椴](méi)有毒性，對(duì)人體皮膚無(wú)刺激，不致敏。在制藥領(lǐng)域，角鯊烯可以用作疫苗輔助佐劑。這些佐劑物質(zhì)能夠刺激免疫系統(tǒng)，增加對(duì)疫苗的反應(yīng)。以乳液形式添加到疫苗物質(zhì)里，使疫苗具有更強(qiáng)免疫力，自1977年以來(lái)，角鯊烯已用于流感疫苗(FLUAD復(fù)立達(dá)，奇龍公司[CHIRON]，預(yù)防季節(jié)性流感的疫苗)，每劑加入10毫克的角鯊烯。由于所有的疫苗都含有角鯊烯，其乳液呈乳白色。角鯊烯也用作疫苗佐劑，尤其是實(shí)驗(yàn)性疫苗，抗瘧疾藥物或針對(duì)H5N1和2009年HlNl新型病毒的抗流感疫苗，如下-葛蘭素史克公司所使用的佐劑系統(tǒng)AS03里用于對(duì)抗2009年流感大流行的Pandemrix和Arepanrix疫苗的專利成分，-諾華公司所使用的佐劑系統(tǒng)MF59里面的專利成分。角鯊烯也被用于添加到抗流感疫苗，通過(guò)產(chǎn)生記憶⑶4細(xì)胞刺激人體免疫反應(yīng)。在銷售中的產(chǎn)品中，這是對(duì)抗季節(jié)性流感的和病毒抗原聯(lián)合制成的抗流感疫苗的第一種水包油助劑。角鯊烯的純度在這一應(yīng)用領(lǐng)域至關(guān)重要。事實(shí)上，如果內(nèi)服，角鯊烯被視為完全安全的；但是作為注射劑，則備受質(zhì)疑。事實(shí)上，在醫(yī)療領(lǐng)域，對(duì)服用人群的傷害風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)劇增，如果角鯊烯含有雜質(zhì)，因?yàn)楦鶕?jù)其定義，這種助劑將會(huì)誘導(dǎo)人體對(duì)其雜質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。因此，必須獲得高品質(zhì)的、無(wú)雜質(zhì)(雜質(zhì)指極微量的金屬，尤其是汞和其它有毒物質(zhì))的角鯊烯。文獻(xiàn)中提出了幾種制備角鯊烯的途徑。人們常常在軟骨魚類的肝臟中發(fā)現(xiàn)這種化合物，如深海鯊魚(角鯊烯因此得名)。因此,這成為鯊魚被過(guò)度捕撈的原因之一，,鯊魚已經(jīng)因其珍貴的鰭而成為被獵殺的對(duì)象。此后，鯊魚的肝臟也被用于出售，以生產(chǎn)出“有益健康”的優(yōu)質(zhì)膠囊。但是，即使售賣的角鯊烯主要是從鯊魚肝臟中提取，也不能完全排除衛(wèi)生問(wèn)題。事實(shí)上，鯊魚可能被病原體感染，可能產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)。此外，其肝臟這樣一個(gè)消除毒素和凈化身體機(jī)能的器官，也可能含有對(duì)人體有害的毒素，例如CarChat0Xin。 這些令人憂慮的環(huán)境問(wèn)題(鯊魚的強(qiáng)烈嚴(yán)重退化)和衛(wèi)生問(wèn)題(魚肝也儲(chǔ)存著令人擔(dān)憂的、對(duì)健康有害的毒素)，促使人們從植物提取角鯊烯。因此，從橄欖油、棕櫚油、其他油類作物，或者從莧屬植物、種籽、米糠、小麥胚芽中將其分離出來(lái)是有可能的。然而，這種方法存在一個(gè)重大缺點(diǎn)，角鯊烯在植物中含量極低，大約以重量計(jì)算占比為O. I到O. 7%。作為從鯊魚肝臟或者植物中提取工藝的第一替代方法，往往由于需要實(shí)施大型的濃縮和凈化工藝而成本高企，因此人們提出了第一種從微生物入手進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)的工藝方法天然酵母或重組酵母，尤其是啤酒酵母(Saccharomyces)類型的。因此，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生產(chǎn)角S烯的能力已被熟知，但是其產(chǎn)出物含量仍然非常低大概是O. 041毫克/克生物量(保羅·巴塔查爾吉BHATTACHARJEE等人，2001年，《世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》，第17期，第811-816頁(yè))。通過(guò)遺傳重組，研究人員已經(jīng)將其生產(chǎn)性能進(jìn)行了優(yōu)化處理。因此，重組酵母生產(chǎn)角鯊烯具有如下優(yōu)勢(shì)-享受和宿主細(xì)胞同等的GRAS(公認(rèn)安全使用物質(zhì))地位，-無(wú)病原體，無(wú)傳染性蛋白微粒，無(wú)毒素，和宿主細(xì)胞一樣，并且-已經(jīng)被用于疫苗領(lǐng)域(如這些酵母的表達(dá)載體含有乙肝抗原)。然而，正如第WO 2010/023551號(hào)醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用專利申請(qǐng)所指出的那樣(生產(chǎn)的角鯊烯達(dá)到97%以上的純度，可以用作疫苗佐劑)，在人們研制出超高產(chǎn)量的角鯊烯重組酵母以前(超過(guò)15%細(xì)胞干重)，這種第一替代方案還不能被工業(yè)化。然而，獲取這些重組細(xì)胞需要通過(guò)分子生物學(xué)手段，實(shí)施許多重大、漫長(zhǎng)而又復(fù)雜的代謝工程步驟，誘導(dǎo)產(chǎn)生角鯊烯的生物合成作用和抑制角鯊烯的分解代謝作用。的確是的，此外，正如在第WO 2010/023551號(hào)專利申請(qǐng)?zhí)岢龅哪菢?，角鯊烯合成的相關(guān)基因有很多包括甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，焦磷酸鹽脫羧酶，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶，HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶)和角鯊烯合成酶。分解代謝作用后，轉(zhuǎn)化為含有角鯊烯環(huán)氧化酶(ERGl)的麥角留醇，羊毛留醇合成酶，C-14位脫甲基酶，dl4-還原酶，C4-甲基氧化酶和C4脫羧酶(ERG26)，3-酮還原酶，C24-甲基轉(zhuǎn)移酶，C8-異構(gòu)酶，C5-去飽和酶，d22-脫氫酶和d24_還原酶的過(guò)程中，牽涉到為數(shù)眾多的酶密碼基因。
此外，其他代謝酶也必須加以考慮LEU2基因([測(cè)試]-異丙基蘋果酸脫氫酶)，環(huán)氧化鯊烯環(huán)化酶，酵母固醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶和麥角留醇_5，7. 24 (28)-三烯酚-22-脫氫酶。第二替代方案鯊魚肝臟或植物提取工藝方面，人們已經(jīng)提出了從破囊壺菌目科里提取微藻的角S烯制備工藝方法，這種方法頗具前景(包括破囊壺菌，Aurantiochytrium和裂殖弧菌)，尤其是Schizochytrium mangrovei或裂殖弧菌。這些微藻在異養(yǎng)條件下生產(chǎn)出角鯊烯(暗室；提供葡萄糖作為碳源)，并且行內(nèi)的微生物發(fā)酵技師很容易操作。
0045]因此，通過(guò)控制發(fā)酵條件，這些工藝提供容易實(shí)現(xiàn)的提純步驟，使角鯊烯的品質(zhì)能夠滿足食品、化妝品和醫(yī)療領(lǐng)域的需求。從破囊壺菌科微藻身上產(chǎn)出的角鯊烯不過(guò)是和其它相關(guān)脂類化合物伴生的副產(chǎn)物，脂類舉例如二十二碳六烯酸(或者DHA)，ω3多不飽和脂肪酸。因此，角鯊烯通常被描述為DHA商業(yè)用油不可皂化部分的其中一個(gè)成分(和類胡蘿卜素和類固醇做比較)。在比較過(guò)程中，Schizochytrium mangrovei FBI的菌株生產(chǎn)出的DHA細(xì)胞干重大約為6. 2%，角鯊烯為0.017%。結(jié)論是，能夠自然生產(chǎn)角鯊烯的這些微生物，其產(chǎn)量是非常低的-大約為O.I毫克/克生物量，破囊壺菌ACEM 6063 (參見(jiàn)勒維斯等人《新生物技術(shù)》，2001年，第439-447頁(yè)。)-大約O. 162 毫克 / 克生物量，Schizochytrium mangrovei FBI (參見(jiàn)江等人，《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》，2004年，第52期，頁(yè)數(shù)1196至1200)為了提高產(chǎn)量，看來(lái)優(yōu)化發(fā)酵條件是勢(shì)在必行。在錢李等人發(fā)表在《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》2009年，第57期，第4267-4272頁(yè)的文章指出，角鯊烯是在留醇生物合成的關(guān)鍵中間體，角鯊烯轉(zhuǎn)化為類固醇的第一步關(guān)鍵步驟是加氧對(duì)角鯊烯進(jìn)行環(huán)氧酶催化。然而，如果人們希望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)角鯊烯的蓄積，應(yīng)當(dāng)避免高溶氧水平。因此，在低溶氧水平(0-5%飽和度)條件下，培養(yǎng)破囊壺菌ACEM6063可以使角鯊烯累積到超過(guò)I毫克/克生物量，而溶氧水平的升高(40-60% )，角鯊烯的含量也不過(guò)只達(dá)到0.01毫克/克。同樣,培養(yǎng)溫度為15°C,通過(guò)破囊壺菌ACEM 6063進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)，產(chǎn)量可以達(dá)到
I.2毫克/克，而在20°C的時(shí)候只有0.7毫克/克(參見(jiàn)勒維斯等人，《新生物技術(shù)》，2001年，第3期，第439-447頁(yè))。在G.陳等人發(fā)表在《新生物技術(shù)》2010年，第27-4期，第382-389頁(yè)的文章中，回顧了裂殖壺菌主要產(chǎn)自DHA，其途徑為聚酮合成方法(簡(jiǎn)稱PKS)，然而角鯊烯是通過(guò)膽固醇生物合成途徑合成的，這意味著生產(chǎn)這兩種化合物的時(shí)候，破囊壺菌的營(yíng)養(yǎng)需求是不同的。他們的工作目的是系統(tǒng)地尋找不同氮源對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響。G.陳等人發(fā)現(xiàn)，在含有谷氨酸鈉、酵母提取物和蛋白胨氮源混合物培養(yǎng)基中，裂殖壺菌可以快速生長(zhǎng)，并且蓄積“高”含量的角鯊烯。
盡管這樣，所謂的“高”含量角鯊烯是相對(duì)而言。事實(shí)上，和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)出值相比較，如果這個(gè)方法的設(shè)計(jì)人能夠顯著提高角鯊烯含量及產(chǎn)量，其提升比例分別為26. 3%和10. 1%，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件實(shí)際上可以提供含量為O. 72毫克/克和滴定濃度為5. 90毫克/升的角鯊烯。懷著同樣的優(yōu)化角鯊烯產(chǎn)量的目標(biāo)，K. W.范等人，在《世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》2010年第26-3期第1303至1309頁(yè)，使用了單加氧酶角鯊烯抑制劑(留醇生物合成的關(guān)鍵酶)特比萘芬(氫氧基氯化物)。行內(nèi)人都了解，角鯊烯的含量和產(chǎn)出率和微生物培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間越久，可以蓄積的角鯊烯就越少；實(shí)際上，培養(yǎng)基通過(guò)甾醇生物合成作用消耗更多角鯊烯。
特比萘芬的作用是，防止通過(guò)固醇途徑消耗角鯊烯，并刺激了角鯊烯在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，較試驗(yàn)組其增量達(dá)到36至40%。但是,在本文中使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株制得的角藍(lán)烯產(chǎn)量是最高的，甚至遠(yuǎn)高于釀酒酵母(O. 041毫克/克生物量),甚至高于鮑圓酵母Torulasporadebrueckii (O. 24毫克/克生物量)，即使這樣，這種方法也不過(guò)是O. 53毫克/克的生物量。此外，即使這種代謝作用衍生方法能夠生產(chǎn)出相對(duì)而言更高產(chǎn)量的角鯊烯，由于同時(shí)限制了對(duì)于同樣的細(xì)胞脂膜產(chǎn)生來(lái)說(shuō)不可缺少的甾醇，它可能會(huì)使細(xì)胞變得脆弱。在文獻(xiàn)中報(bào)告，使用微藻生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)量最高的結(jié)果中，C-JYUE和Y.姜在《生化反應(yīng)》2009年第44期第923-927頁(yè)，角鯊烯最大含量為I. 17±0. 6毫克/克生物量Schizochytrium mangrovei,使用的是甲基茉莉酸,通過(guò)直接作用于角S烯合成酶-代謝作用的關(guān)鍵酶，這種酸被用于調(diào)節(jié)角鯊烯合成代謝作用。因此，盡管人們所作的一切努力，這些值仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于橄欖油的參考值(大約為
4.24毫克/克)，離工業(yè)規(guī)模所需要的數(shù)值差距甚遠(yuǎn)。為了研制出一種比現(xiàn)存技術(shù)更有效和更廉宜的方法，申請(qǐng)人自身已經(jīng)進(jìn)行了開(kāi)發(fā)，其研究主要集中在優(yōu)化破囊壺菌微藻發(fā)酵條件。本發(fā)明是一種能夠從一百克生物量(干重)中提取以克計(jì)算重量的角鯊烯的工藝方法，也就是說(shuō)，比該領(lǐng)域的文獻(xiàn)中通常描述的含量高出一千倍。本發(fā)明還涉及這種方法制備發(fā)酵培養(yǎng)基，并從中提取和提純角鯊烯的工藝方法。通過(guò)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯首先，申請(qǐng)人的功績(jī)?cè)谟谒l(fā)現(xiàn)在所有的發(fā)酵控制參數(shù)，僅僅其中兩個(gè)參數(shù)能夠顯著增加微藻的角鯊烯產(chǎn)出率。這兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是培養(yǎng)基溫度和維生素添加劑，更明確地說(shuō)，是維生素BI，B6和尤其是維生素B12。本發(fā)明是關(guān)于一種從破囊壺菌微藻通過(guò)發(fā)酵取得角鯊烯的生產(chǎn)工藝方法，其特點(diǎn)是包括以下步驟-在25_35°C之間，在28_32°C之間更好，最好是在大約30°C左右，培養(yǎng)破囊壺菌微藻，并且-按每升培養(yǎng)基1-1000微克的比例向培養(yǎng)基添加維生素B12。
更好的做法是，正如下面所述，申請(qǐng)人建議添加〇每升培養(yǎng)液O. I毫克至200毫克的維生素BI，和/或〇每升培養(yǎng)液O. I毫克至200毫克的維生素B6。當(dāng)然，該方法還包含一個(gè)高角鯊烯生物量回收步驟和/或者角鯊烯的回收和提取步驟。具體來(lái)說(shuō)，下列市面上銷售的菌株經(jīng)過(guò)我們的測(cè)試-裂殖壺菌。參考號(hào)ATCC20888，-Aurantiochytrium。參考號(hào) ATCC PRA 276， 此外，申請(qǐng)人還擁有自己的生產(chǎn)菌株，裂殖壺菌菌株，裂殖壺菌，2011年4月14日于法國(guó)向法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心提交的第CNCMI-4469號(hào)菌種(裂殖壺菌R0Q425 (Schizochytrium sp. R0Q425)),以及于2009年6月2日向武漢大學(xué)(中華人民共和國(guó)武漢，郵政編碼430072)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提交的號(hào)碼為M 209118的菌種(裂殖壺菌 080129 (Schizochytrium sp. 080129))。還有一種Schizochytrium mangrovei菌株進(jìn)行了試樣測(cè)試,例證如下。特別值得一提的是，本發(fā)明使用的工藝方法，可以使每100克生物量干重生產(chǎn)出含量大于或等于2克的角鯊烯，傾向于每100克干重產(chǎn)出介于2和12g之間的角鯊烯。特別是，根據(jù)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法，可以實(shí)現(xiàn)角鯊烯量化生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明，該工藝的首要基本特點(diǎn)是溫度的選擇，溫度的選擇將根據(jù)微藻的培養(yǎng)和角鯊烯的產(chǎn)量一并決定。溫度范圍為25至35°C，28至32°C時(shí)更好，最好是維持在大約30°C左右。申請(qǐng)人:首先克服了技術(shù)偏見(jiàn)，這種偏見(jiàn)認(rèn)為微藻培養(yǎng)基不應(yīng)超過(guò)25°C。事實(shí)上，在大部分上面引用的使用破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的文章中，生產(chǎn)溫度被設(shè)定為先前的研究微藻生長(zhǎng)溫度，即15°C，22°C或25°C的溫度。根據(jù)本發(fā)明的工藝方法，申請(qǐng)人提出了相反的建議，在28_32°C之間培養(yǎng)這些微藻，因?yàn)樯暾?qǐng)人注意到-如果產(chǎn)出的角鯊烯細(xì)胞生物量濃度隨溫度增加到33°C而增加，超過(guò)30°C時(shí)的生物量顯著降低，從而限制了角鯊烯的滴定濃度，-在25°C的溫度，角鯊烯的濃度檢測(cè)不到或非常低。這個(gè)溫度范圍是微藻培養(yǎng)的最佳溫度和角鯊烯有效生產(chǎn)的最佳溫度之間的一個(gè)折中范圍。因此，高于25°C的溫度并不和目前普遍實(shí)施的技術(shù)背道而馳，這個(gè)溫度是有利于
角鯊烯產(chǎn)量的最佳溫度。根據(jù)本發(fā)明，其工藝方法的第二個(gè)基本特征是，為了生產(chǎn)角鯊烯而添加到裂殖弧菌的維生素B12的數(shù)量，每公升培養(yǎng)基添加大約1-1000微克的維生素B12。更好的做法是，除了添加維生素B12以外，還補(bǔ)充添加〇每升培養(yǎng)液0. I毫克至200毫克的維生素B 1，和/或〇每升培養(yǎng)液0. I毫克至200毫克的維生素B6。在上述有關(guān)通過(guò)微藻生產(chǎn)角鯊烯的文獻(xiàn)中，維生素的作用未被考慮在內(nèi)。供給維生素的傳統(tǒng)做法是添加酵母提取物。
實(shí)際上這早已經(jīng)是業(yè)內(nèi)人士所熟知的，維生素在酵母提取物中自然存在，其比例如下-50至120毫克/公斤的維生素BI (硫胺素)-40至80毫克/公斤的維生素B6 (吡哆醇)-I至5. 5毫克/公斤的維生素B12 (氰基鈷胺素cyanocobalamin)這里僅列出這三種B族維生素。然而，放入培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)物的酵母提取物，其比例每100毫升培養(yǎng)基只有I到2克(參見(jiàn)上述科學(xué)論文)，對(duì)應(yīng)的維生素劑量極其低(例如，維生素B12，通過(guò)酵母提取物提供的維生素B12含量?jī)H相當(dāng)于O. 07毫克/升)?？偠灾?，所有這些文件既未描述也未建議在使用微藻進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)的時(shí)候， 控制維生素BI，維生素B6和B12的含量。由于未受任何理論的約束，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在角鯊烯生產(chǎn)中維生素B12決定性作用(如下面舉例所示)，顯示其是參與角鯊烯生物合成的某些關(guān)鍵酶的輔助因子。至于維生素BI，它會(huì)促進(jìn)亮氨酸降解作用，這會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的角鯊烯前驅(qū)物數(shù)量，而維生素B6，會(huì)改變細(xì)胞色素的作用，避免角鯊烯降解。申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，供給維生素B12，并且將溫度調(diào)整到28-30°C，是大幅提高角鯊烯產(chǎn)量的關(guān)鍵(達(dá)到每一百克干重制取出克重級(jí)的規(guī)模)，并且供給維生素BI和B6，實(shí)際上可以增加角鯊烯的生產(chǎn)效率，如下顯示。根據(jù)本發(fā)明，其工藝方法的另外一個(gè)特點(diǎn)是，供給維生素是在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程實(shí)施的，或者在某些階段，而不僅僅是在生產(chǎn)階段。但是，在整個(gè)發(fā)酵工藝過(guò)程中，應(yīng)該遵守介于I和1000毫克/升的維生素B12的
添加量。傳統(tǒng)上來(lái)說(shuō)，在使用微藻進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室條件優(yōu)化工作相關(guān)的文獻(xiàn)里，研究人員是在接種程序和傳統(tǒng)微生物生產(chǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵，這些生產(chǎn)條件也是最普遍研究的方向。使用破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯實(shí)際上分為三個(gè)連續(xù)的階段從瓊脂平板上將菌落分離出來(lái)，預(yù)培養(yǎng)使菌株成活，最后是真正意義上的培養(yǎng)(=生產(chǎn))。舉例說(shuō)，在上述G.陳的文章中，我們發(fā)現(xiàn)他的方法包括以下連續(xù)的步驟-在含有葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母提取物和各種微量兀素的瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株，-在放置在軌道式振蕩器的錐形燒瓶里進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，pH值6，溫度為25°C，以獲得成活的生物量。-從培養(yǎng)中的錐形燒瓶里接種另外一個(gè)系列，使用和預(yù)培養(yǎng)基同樣的培養(yǎng)基，拿取約O. 5% (v/v)的上一個(gè)步驟得到的生物量，維持溫度為25°C。但是，正如人們可以從這篇文章中讀到的那樣(可以通過(guò)本領(lǐng)域其他文章證實(shí))，在培養(yǎng)的最后階段，專家們采取行動(dòng)，優(yōu)化發(fā)酵條件。換句話說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)下的優(yōu)化研究，主要變換一個(gè)或者多個(gè)培養(yǎng)基養(yǎng)分，以此研究其對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響。然而，正如下面將要討論的，申請(qǐng)人提出了相反的建議，即從最早期階段的發(fā)酵條件就開(kāi)始進(jìn)行控制，即使這樣做似乎會(huì)使實(shí)施工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)更復(fù)雜。在這個(gè)規(guī)模上，實(shí)事求是地說(shuō)，接種程序可以由生產(chǎn)本身步驟之前的數(shù)個(gè)預(yù)培養(yǎng)系列步驟組成。本發(fā)明使用的工藝方法的最佳實(shí)施方式可以包括以下的步驟序列-破囊壺菌科屬微藻在錐形燒瓶里面預(yù)培養(yǎng)大約24至36小時(shí)，溫度為28°C，使用瓊脂平板上分離出來(lái)的菌落，-在錐形燒瓶里面的第二個(gè)預(yù)培養(yǎng)階段為時(shí)24至36小時(shí)，溫度為28°C，接種體濃度1% (v/v)，從第一預(yù)培養(yǎng)基里接種，-在30°C下培養(yǎng)60至150小時(shí)，在空氣調(diào)節(jié)發(fā)酵裝置里面，以滿足最大為45毫摩爾/升/小時(shí)氧氣傳輸，接種濃度為O. 5至2% (v/v選擇)，從第二預(yù)培養(yǎng)基里接種。 在這個(gè)程序鏈中，根據(jù)作業(yè)條件，如下所述，添加維生素在預(yù)培養(yǎng)階段一次性完成，或者在兩步預(yù)培養(yǎng)程序中完成，或者整個(gè)培養(yǎng)程序中一直添加。正如下文將顯示；在預(yù)培養(yǎng)步驟里面一次性添加維生素已經(jīng)取得了顯著的效果，優(yōu)化后的模式要求在所有步驟里實(shí)施添加。 微藻生長(zhǎng)所必需的碳源最好是葡萄糖。申請(qǐng)人:則建議，控制葡萄糖的添加量，使得所提供的葡萄糖總量大約相當(dāng)于重量的 15 到 22. 5%0不管怎么說(shuō)，正如下文舉例說(shuō)明的那樣，針對(duì)選擇出來(lái)的裂殖弧菌菌株，首要的工作是使殘?zhí)呛糠橇?，以重量?jì)最多可以達(dá)到8%。至于氮源性質(zhì)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)它是可以選擇的，從酵母提取物，尿素，谷氨酸鈉，硫酸銨這個(gè)組合里面選擇單獨(dú)一項(xiàng)或者選擇組合。可能你傾向于選擇酵母提取物，傳統(tǒng)上現(xiàn)有技術(shù)所實(shí)施的工藝方法，尿素+維生素混合物，例如由西格瑪公司銷售的BME混合物試劑(β -巰基乙醇)，用量比例為5毫升/升。同樣地，可以全部或者部分使用谷氨酸鈉取代尿素，或使用谷氨酸鈉和硫酸銨的混合物。申請(qǐng)人:建議切勿使用硝酸鹽形式的碳源。至于培養(yǎng)基pH值，如下例所述，將保持在5. 5和6. 5，最好是固定在pH值6。pH值的調(diào)節(jié)可以使用業(yè)內(nèi)人士所了解的任何方式，例如，通過(guò)添加2N的硫酸，然后添加8N氫氧化鈉最后，溶氧率可以調(diào)節(jié)到20和0%之間的值，最好保持在5%作用，最初的階段維持24至48小時(shí)，最好是36小時(shí)，然后任其下降到0%。關(guān)于氧的傳輸，可以使用業(yè)內(nèi)人士所了解的任何方式調(diào)節(jié)使之不超過(guò)45毫摩爾/
升/小時(shí)。正如下文所舉例證，這些作業(yè)條件下發(fā)酵后，生物量超過(guò)50克/升，最好是50至100克/升，約80克/升。每100克生物量干重的角鯊烯含量大于I克，更好的是每100克生物量干重2至15克，最好是每100克生物量干重5至10克。發(fā)酵培養(yǎng)基上提取和提純角鯊烯
生物量的回收是使用行內(nèi)人士了解的任何方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收的，例如，生物量可以從發(fā)酵裝置中提取，僅僅需要微濾濃縮或離心濃縮，連續(xù)地使用水溶劑濃縮-稀釋法清洗。提取脂類進(jìn)行細(xì)胞破碎可以通過(guò)各種不同的途徑，這些途徑包括機(jī)械、化工、酶作用。通過(guò)幾個(gè)連續(xù)的提取過(guò)程，向細(xì)胞裂解液添加正己烷/乙醇提取。正己烷餾分是單獨(dú)的步驟，等正己烷蒸發(fā)后，將原油分離出來(lái)。最后，本發(fā)明還涉及到使用本發(fā)明的其中任意一個(gè)工業(yè)方法生產(chǎn)出來(lái)的角鯊烯的利用，如何將其用于醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品組成成分的制備。這樣，本發(fā)明還涉及到使用本發(fā)明的任意一種工藝方法，應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品組成成分的角鯊烯制備方法，這種方法包含應(yīng)用本發(fā)明的任意一種工藝進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)，以及應(yīng)用于醫(yī)療、化 妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品的組成成分的制備。為了更好的理解本發(fā)明，以下舉例其性質(zhì)是說(shuō)明性的，而不是限定性的。例I :研究添加維生素BI，B6和B12及溫度對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響預(yù)培養(yǎng)某和培養(yǎng)某這里所說(shuō)的微藻發(fā)酵分為兩個(gè)連續(xù)預(yù)培養(yǎng)階段，之后是培養(yǎng)/生產(chǎn)本身的階段。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在第一個(gè)預(yù)培養(yǎng)階段必須添加維生素，但在第二個(gè)預(yù)培養(yǎng)階段和生產(chǎn)階段中是可選的。預(yù)培養(yǎng)基的組成成分如下表一和下表二所示表一
第一個(gè)預(yù)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基％
葡萄糖__3_
—酵母提取物O. 4
谷氨酸鈉__6.42
'氯化鈉1.25
1 酸鎂O. 4
氯化鉀__O. 05
—氯化鈣O. 01
I氫酸鈉O. 05
磷酸二氫鉀__O. 4
維生素混合物^ O. 14
微量元素I 0.8 '表二
第二個(gè)預(yù)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基％
葡萄糖__8.57
I母提取物6. 42
'谷氨酸鈉O. 64
^氯化鈉2
_硫酸鎂O. 64
氯化鉀__2. 29
—氯化鈣O. 03
I氫酸鈉O. 03
_硫酸鈉O. 03
添加維生素混合物^ O. 14
微量元素I 0.2 —
通常使用Clerol消泡劑“FBA3107”，濃度為I毫升/升。最后，使用50毫克/升的青霉素G “鈉鹽“，防止細(xì)菌生長(zhǎng)，防止污染。葡萄糖與磷酸二氫鉀一起消毒，和剩余培養(yǎng)基的消毒分開(kāi)，這樣可以避免沉淀物(磷酸鎂銨)的形成。維生素混合物和微量元素進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾后添加。培養(yǎng)基/生產(chǎn)成分如表三所不。表三
權(quán)利要求
1.從屬于破囊壺菌目的微藻生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于所述方法包含以下步驟-在25至35°C，優(yōu)選在28至32°C，更優(yōu)選在大約30°C的溫度，培養(yǎng)屬于破囊壺菌目的微藻，以及 -在預(yù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中添加每升預(yù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基I到1000微克的維生素B12。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于添加 〇每升培養(yǎng)基中O. I毫克至200毫克的維生素BI，和/或 〇每升培養(yǎng)基中O. I毫克至200毫克的維生素B6。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于破囊壺菌目的微藻選自裂殖弧菌(Schizochytrium sp.), Aurantiochytrium sp·，和破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I到3任一項(xiàng)的方法，其特征在于破囊壺菌目的微藻選自保藏編號(hào)為ATCC 20888的裂殖弧菌，保藏編號(hào)為ATCC PRA276的Aurantiochytrium sp.和在法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心保藏的保藏編號(hào)為CNCM 1-4469的裂殖弧菌菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求I到4任一項(xiàng)的方法，其特征在于所獲得的角鯊烯含量為每100克干重的生物質(zhì)大于或者等于2克，優(yōu)選為每100克干重的生物質(zhì)2至12克。
6.根據(jù)權(quán)利要求I到5任一項(xiàng)的方法，其特征在于屬于破囊壺菌目的微藻經(jīng)以下連續(xù)的步驟進(jìn)行培養(yǎng) -使用錐形燒瓶從瓊脂平板上分離出來(lái)的菌落在28°C的溫度下進(jìn)行24至36小時(shí)的第一預(yù)培養(yǎng)， -使用錐形燒瓶用第一預(yù)培養(yǎng)物的I % (v/v)接種物，在28°C的溫度下進(jìn)行24至36小時(shí)的第二預(yù)培養(yǎng)， -用第二預(yù)培養(yǎng)物的O. 5至2% (v/v)接種物在調(diào)節(jié)到維持至多45毫摩爾/升/小時(shí)氧氣傳輸?shù)陌l(fā)酵器中，在30°C下進(jìn)行60至150小時(shí)的培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于維生素B12的添加是在兩個(gè)預(yù)培養(yǎng)步驟期間進(jìn)行的，使維生素的總含量為I至10微克/升培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于也在兩個(gè)預(yù)培養(yǎng)步驟期間添加維生素BI和維生素B6，使維生素總含量為100至200微克/升培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于維生素B12的添加如下進(jìn)行 -在兩個(gè)預(yù)培養(yǎng)步驟期間，使維生素的總含量為I至10微克/升培養(yǎng)基， -在生產(chǎn)步驟期間，使維生素的總含量為大約1000微克/升培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于也添加維生素BI和B6 -在兩個(gè)預(yù)培養(yǎng)步驟期間，使維生素的總含量為100至200微克/升培養(yǎng)基， -在生產(chǎn)步驟期間，使維生素的總含量為150至200毫克/升培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的角鯊烯在制備用于醫(yī)療、化妝品或食品工業(yè)的組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于應(yīng)用破囊壺菌微藻生產(chǎn)角鯊烯的工藝方法，每100克生物量干重產(chǎn)出的最佳角鯊烯含量為2-12克，其特點(diǎn)包含了以下步驟在25至35℃溫度之間，培養(yǎng)破囊壺菌微藻，28至32℃之間更佳，大約30℃最佳，在每升預(yù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中添加1到1000微克維生素B12。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK102787140SQ20111014705
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者伯納德·波拉, 伯納德·考利爾, 勞倫特·塞蓋拉, 塞吉·科米尼, 菲利皮·盧騰, 錢云 申請(qǐng)人:羅蓋特兄弟公司