專利名稱：：一種同步檢測AFP和AFP-IgM的TRFIA及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生化檢測領(lǐng)域，特別涉及一種同步檢測甲胎蛋白和甲胎蛋白-免疫球蛋白復(fù)合物的時間分辨熒光免疫分析方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌(HCC)是全世界最常見的致死性癌癥之一，其發(fā)病率排在第四位。迄今還沒有一理想的高靈敏、高特異的血清標(biāo)志物可以用于HCC的診斷，尤其是早期診斷。目前臨床常用的甲胎蛋白(AFP)，如將cutoff值定為20ng/ml，其診斷肝癌的靈敏度也僅有60-80%，對小肝癌僅為40%。在一些肝的良性病變中也會出現(xiàn)AFP增高現(xiàn)象，比如約有15-18%的慢性肝炎和11-47%的肝硬化患者其血清AFP在20-200ng/ml水平，所以造成AFP診斷肝癌的特異性不高。如果提高cutoff值雖然可以提高特異性，但其診斷靈敏度就會大幅下降。研究表明AFP在人體內(nèi)以與免疫球蛋白(AFP-lgM)和游離(FAFP)等形式存在，AFP-IgM可在肝臟疾病的早期存在，而且與肝損害相關(guān)。目前AFP-lgM已作為一種補(bǔ)充血清標(biāo)志物用于HCC的診斷。AFP-lgM的補(bǔ)充檢測，極大的提高了HCC的檢測靈敏度和特異性。但是現(xiàn)有的方法中，對AFP和AFP-lgM的檢測是作為兩個標(biāo)記物分別進(jìn)行的，檢測過程較為復(fù)雜和繁瑣，影響診斷效率。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)是上世紀(jì)八十年代初發(fā)展起來的新的免疫測定技術(shù)。實際上是在熒光免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光波長與其激發(fā)光波長的巨大差異，但當(dāng)進(jìn)行超微量分析時，激發(fā)光的雜散光會嚴(yán)重影響對熒光的檢測。解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測量時沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長，可達(dá)1/2ms，能夠滿足測量要求，因此而產(chǎn)生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強(qiáng)度的分析方法。TRFIA所用的熒光標(biāo)記物是鑭系元素螯合物，利用這類熒光物質(zhì)熒光壽命長及Stokes位移大的特點，通過波長和時間兩種分辨技術(shù)，有效排除了非特異本底熒光的干擾，具有靈敏度高，標(biāo)記物制備簡單，穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬，操作方便，成為最有發(fā)展前途的超微量分析技術(shù)和當(dāng)前標(biāo)記免疫分析發(fā)展到新階段的代表。在實際應(yīng)用中，通常還在熒光標(biāo)志物中加入一種增強(qiáng)液(Enhancementsolution)，可增強(qiáng)熒光效果上百萬倍。目前，已有采用TRFIA檢測AFP的技術(shù)，但還沒有采用TRFIA檢測AFP-lgM的技術(shù)，更缺乏同步檢測AFP和AFP-lgM的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的方法中，對HCC的腫瘤標(biāo)記物AFP和輔助標(biāo)記物AFP-lgM分別進(jìn)行檢測，檢測過程較為復(fù)雜和繁瑣，影響診斷效率的缺陷，提供一種同步檢測AFP和AFP-lgM的方法及其試劑盒，該檢測方法及其試劑盒靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，操作簡單、迅捷，能極大提高肝癌的診斷效率。4本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗和研究，驚喜的發(fā)現(xiàn)，利用TRFIA可以容易實現(xiàn)免疫雙標(biāo)記分析，同時測定AFP和AFP-IgM，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是，一種同步檢測甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白-免疫球蛋白(AFP-IgM)復(fù)合物的時間分辨熒光免疫分析方法的試劑盒，包括以下試劑1)第一抗原表位的AFP單克隆抗體，2)—種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體，3)另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體，4)AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，5)緩沖液，6)洗滌液，7)增強(qiáng)液，其中，所述的鑭系元素選自銪和釤，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體與所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體具有不同的抗原表位。根據(jù)本發(fā)明，試劑l)為第一抗原表位的AFP單克隆抗體。其較佳的為鼠抗人AFP單克隆抗體；更佳的為固相抗體，固相載體較佳的為反應(yīng)板，優(yōu)選96孔板或48孔板。所述的固相抗體可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的抗體包被固相載體的方法制備。較佳的包括如下步驟采用反應(yīng)板作為固相載體，用AFP單克隆抗體包被反應(yīng)板，再用封閉液封閉，然后真空抽干，即得固相抗體。包被時，AFP單克隆抗體較佳的用緩沖液稀釋至110mg/L作為包被液，所述的緩沖液較佳的為pH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液。封閉液較佳的為含0.2(w/v)%明膠和2(w/v)%蔗糖的50,1/LpH7.2的Tris-HCl緩沖液。真空抽干后，所得的固相抗體(如反應(yīng)板)較佳的可以在密封后置-2(TC冷凍保存。根據(jù)本發(fā)明，試劑2)為一種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體。其較佳的為鼠抗人AFP單克隆抗體。其可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白標(biāo)記方法制備，較佳的包括如下步驟用C廠[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(R3+-DTTA)與AFP單克隆抗體反應(yīng)，其中R代表銪或釤，反應(yīng)液經(jīng)過柱層析分離純化，即得。其中，所述的AFP單克隆抗體與R3+-DTTA的質(zhì)量比較佳的為1:0.20.5。根據(jù)本發(fā)明，試劑3)為另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體。其較佳的為鼠抗人IgM單克隆抗體。其可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)記方法制備，較佳的包括如下步驟用R"-DTTA與IgM單克隆抗體反應(yīng)，其中R代表釤或銪，反應(yīng)液經(jīng)過柱層析分離純化，即得。其中，所述的IgM單克隆抗體與R3+_DTTA的質(zhì)量比較佳的為1:0.20.5。其中，試劑2)所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體具有一種鑭系元素標(biāo)記，試劑3)所述的IgM單克隆抗體具有另一種鑭系元素標(biāo)記，所述的鑭系元素選自銪和釤。這兩種單克隆抗體具有的標(biāo)記都選自銪和釤中的任何一種，但是在同一試劑盒中，標(biāo)記第二抗原表位的AFP單克隆抗體的元素必須和標(biāo)記IgM單克隆抗體的元素是不相同的。根據(jù)本發(fā)明，試劑4)為AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品。其較佳的可以共6瓶，其中，AFP濃度分別為Ong/ml，1.21ng/ml，12.lng/ml，121ng/ml，605ng/ml，1210ng/ml;AFP—IgM濃度分別為OAU/mL，0.5AU/mL，5AU/mL，50AU/mL，250AU/mL，500AU/Ml，其中，AU設(shè)定為任意單位。根據(jù)本發(fā)明，試劑5)為緩沖液。其較佳的可以為含8mmol/LNaC1、0.lwt^明膠、0.2wt%IgG、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸、0.lml/LTween-80和0.lwt%NaN3的50mmo1/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，試劑6)為洗滌液。其較佳的可以為含14.5mmol/LNaC1、0.2ml/LTween-80和0.2wt%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，試劑7)為增強(qiáng)液。其較佳的可以為含15ymol/LP-萘甲酰三氟丙酮、50iimol/L三正辛基氧化膦和體積百分比0.1X曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是，一種根據(jù)上述的試劑盒同步檢測甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白-免疫球蛋白(AFP-IgM)復(fù)合物的時間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)，依次包括以下步驟1)在固相的第一抗原表位的AFP單克隆抗體中，加入AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品以及緩沖液，進(jìn)行孵育；2)用洗滌液洗滌步驟1)的孵育后的反應(yīng)液，然后加入一種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體和另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體，進(jìn)行孵育，其中，所述的鑭系元素選自銪(Eu)和釤(Sm)，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體與步驟1)所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體具有不同的抗原表位；3)用洗滌液洗滌步驟2)的孵育后的反應(yīng)液，然后加入增強(qiáng)液進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行時間分辨熒光檢測。本發(fā)明的同時檢測AFP和AFP-IgM的時間分辨熒光免疫分析方法的原理示意圖見圖1。根據(jù)本發(fā)明，步驟1)為在固相的第一抗原表位的AFP單克隆抗體中，加入AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品以及緩沖液，進(jìn)行孵育。其中，所述的固相的第一抗原表位的AFP單克隆抗體的固相載體較佳的為反應(yīng)板，即該第一抗原表位的AFP單克隆抗體包被在反應(yīng)板上。所述的緩沖液為常規(guī)的免疫反應(yīng)的緩沖液，較佳的可以為含8mmol/LNaCl、0.lwt%明膠、0.2wt%IgG、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸、0.lml/LTween-80和0.lwt%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。孵育的方法同常規(guī)，較佳的為37°C，12小時。孵育后AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品中的AFP與反應(yīng)板上的固相AFP單克隆抗體形成免疫復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，步驟2)為用洗滌液洗滌步驟1)的孵育后的反應(yīng)液，然后加入一種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體和另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體，進(jìn)行孵育，其中，所述的鑭系元素選自銪和釤，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體與步驟1)所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體具有不同的抗原表位。其中，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體具有一種鑭系元素標(biāo)記，所述的IgM單克隆抗體具有另一種鑭系元素標(biāo)記，所述的鑭系元素選自銪和釤。這兩種單克隆抗體具有的標(biāo)記都選自銪和釤中的任何一種，但是同一個檢測中，標(biāo)記AFP單克隆抗體的元素必須和標(biāo)記IgM單克隆抗體的元素是不相同的。因為鑭系元素(包括銪和釤)在受激發(fā)后發(fā)射波長和熒光壽命相對較大，時間分辨熒光免疫分析法可利用這些鑭系元素波長和熒光壽命的不同，將標(biāo)記物區(qū)別開來。從發(fā)射波長看，Eu3+(615nm)與Tb"544nm)作雙標(biāo)記配對，區(qū)分較明顯，但是要同時測定它們，就需用氟化脂肪e-二酮螯合劑，而其對Eu"的測定效果卻較差，因而，Eu3+與Tb3+作雙標(biāo)記配對時，測定結(jié)果不好。Eu3+與Sm3+的最大發(fā)射波長雖然只相差約30nm，但因多是窄發(fā)射峰，已能被充分分辨，在340nm激發(fā)光作用下，兩者都能與e-NTA(e-二酮)形成高度發(fā)熒光的螯合物，且它們的熒光壽命相差顯著(Sm"為50s，Eu3+為730s)，可通過時間延遲充分分辨。因此，較佳的Eu3+和Sm3+最適合于作為配對的雙標(biāo)記用于時間分辨熒光免疫分析法。用洗滌液是為了洗滌步驟1)的孵育后的反應(yīng)液。步驟1)所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體固載于反應(yīng)板上，其與加入的AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品中的AFP(即抗原)因抗原-抗體的作用而結(jié)合，而游離的未與固相抗體反應(yīng)的其他成份，用洗滌液洗滌去除。所述的洗滌液較佳的為含14.5,1/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2wt%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。作為抗原，AFP和AFP-IgM復(fù)合物中的AFP都與固相載體上的AFP抗體作用結(jié)合，但是這些AFP在其他的抗原表位還可以結(jié)合其他AFP抗體，即步驟2)所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體。而AFP-IgM復(fù)合物中的IgM也可以由抗原-抗體反應(yīng)和IgM單克隆抗體作用。經(jīng)過孵育后，分別形成了夾心復(fù)合物。孵育的方法同常規(guī)，較佳的為37t:，12小時。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)為用洗滌液洗滌步驟2)的孵育后的反應(yīng)液，然后加入增強(qiáng)液進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行時間分辨熒光檢測。其中，所述的洗滌液同上，用洗滌液洗滌去除游離的AFP單克隆抗體和IgM單克隆抗體。所述的增強(qiáng)液較佳的為含13-二酮的溶液，較佳的為含15iimol/Le-萘甲酰三氟丙酮、50iimol/L三正辛基氧化膦和體積百分比0.1%曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。增強(qiáng)液中的e-二酮可以倍增熒光信號。加入增強(qiáng)液進(jìn)行鑭系元素離子如Eu3+或Sm3+加入增強(qiáng)液如13-NTA振蕩反應(yīng)后，形成高度發(fā)熒光的螯合物。反應(yīng)的溫度和時間，較佳的為37t:，5分鐘。在340nm激發(fā)光作用下，所形成的螯合物發(fā)射很強(qiáng)的熒光，Sm3+的熒光壽命為50s，Eu3+的熒光壽命為730s，用時間分辨熒光儀器測定其熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與分別與樣品中的AFP和AFP-IgM濃度成正比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中抗原的量。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用高靈敏的時間分辨熒光免疫分析技術(shù)，建立同時檢測AFP和AFP-IgM方法。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，特別適用于肝癌患者血清或其他體液(如心包積液、腹水、尿液等)中AFP和AFP-IgM含量的檢測，可作為臨床肝癌診斷的輔助指標(biāo)。本發(fā)明試劑成本低，操作簡單，分析系統(tǒng)可實現(xiàn)高度自動化，可提高臨床檢驗結(jié)果的速度，又可大幅度降低人為誤差，增加檢出結(jié)果的可靠性。同時檢測AFP和AFP-IgM也可極大提高肝癌的診斷效率。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和有益效果。圖1時間分辨熒光免疫分析同時檢測AFP和AFP-IgM的原理。圖2為本發(fā)明AFP/AFP-IgM的TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線及精密度圖。A圖AFP-IgM，B圖AFP。圖3AFP-IgM和AFP在肝癌、慢性肝炎、肝硬化及正常人血清中的分布。圖4AFP-IgM和AFP在正常人、肝良性疾病和肝癌中的ROC曲線。具體實施例方式下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實施例中所述的"室溫"，為試驗操作的實驗室溫度，為1825°C。其中，下列實施例中的鼠抗人AFP單克隆抗體(克隆號分別為M19301和M94115，分別針對不同的抗原表位)購自Biodesign公司；鼠抗人IgM單克隆抗體(克隆號為M94181)也購自Biodesign公司；96孔微孔板(8X12)為labsystem公司產(chǎn)品；Eu3+和Sm3+標(biāo)記盒為PerkerElmer公司產(chǎn)品；S印hadexG-50為Amersham產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；全自動TRFIA檢測儀(AutoDELFIA1235)為Wallac產(chǎn)品。實施例l試劑盒的制備每一個盒中的試劑足夠進(jìn)行96個測量，盒中的材料如下(1)1X96孔板(8條X12孔，可以拆分為單孔)包被有抗鼠抗人AFP單克隆抗體。(2)6XAFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品。使用前每瓶各用lml蒸餾水溶解。(3)1X銪標(biāo)記抗體凍干品，使用時用0.5ml蒸餾水溶解。(4)1X釤標(biāo)記抗體凍干品，使用時用0.5ml蒸餾水溶解。(5)IX緩沖液，30ml。(6)1X洗滌液，30ml，使用時以蒸餾水按體積比1:25稀釋。(7)IX增強(qiáng)液，15ml。下面是試劑盒中的各材料所含的具體成分及其制備方法。1、微孔反應(yīng)板制備用50mmol/LpH9.6Na2C03_NaHC03的緩沖液將鼠抗人AFP單克隆抗體稀釋至1Pg/mL作為包被液，96孔微孔板每孔各加入100ii1，4t:放置過夜，棄去包被液，用洗滌液(14.5mmol/LNaC1、0.2ml/LTween—80和0.2wt%NaN3的50mmol/LTris—HClpH7.2)沖洗四次，加200iU含O.2wt^明膠和2wt^蔗糖的50mmol/LpH7.2的Tris-HCl緩沖液封閉，4t:放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(TC冷凍保存。2、AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品制備取10份肝癌患者(來自上海市腫瘤醫(yī)院)的血清，將其混合后離心(4000rpm20分鐘，離心后取上清)。用H印aAFP-ICKit(生產(chǎn)廠商X印taGen，意大利)和羅氏公司AFP電化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒分別對其中的AFP，AFP-IgM濃度進(jìn)行定值。其中，AFP-IgM含量用任意單位(AU)表示。用含0.2wt%BSA，O.lwt%NaN3的50mmol/LpH7.8Tris_Hcl緩沖液將上述定值血清配成AFP-IgM濃度分別為0、10、100、1000、5000、lOOOOAU/ml和AFP濃度分別為0、1.21、12.1、121、605、1210ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)液，每瓶lml分裝凍干，-2(TC干燥保存。該各瓶凍干保存的標(biāo)準(zhǔn)品，使用時可各用lml蒸餾水溶解，AFP濃度分別為Ong/ml，1.21ng/ml，12.lng/ml，121ng/ml，605ng/ml，1210ng/ml;AFP—IgM濃度分別為OAU/mL，10AU/mL，100AU/mL，1000AU/mL，5000AU/mL，10000AU/mL。3、Eu3+標(biāo)記的鼠抗人AFP單克隆抗體制備參照Eu3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取鼠抗人AFP單克隆抗體lmg溶于O.25mol/LNaHC03液200中，加入0.2mgEu3+-N2_[p_|^氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混勻，4t:反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用S印hadexG-50柱(IX20cm)層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Eu"標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Eu"濃度。所得的標(biāo)記率(Eu3+mol/IgGmol)是8.11，蛋白回收率為79%。將收集的溶液稀釋成Eu"標(biāo)記的抗人AFP單克隆抗體濃度為0.79mmol/L，每瓶0.5ml分裝，-20。C干燥保存。4、Sm3+標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體制備參照Sm3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取鼠抗人IgM單克隆抗體lmg溶于0.25mol/LNaHC03液200y1中，加入0.2mgSm3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用S印hadexG-50柱(IX20cm)層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Sm3+標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Sm"濃度。將收集的溶液稀釋成Sm"標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體濃度為0.79mmol/L，每瓶0.5ml分裝，-20°〇干燥保存，即為試劑盒中的Sm3+標(biāo)記IgM單克隆抗體凍干品。5、緩沖液8mmol/LNaCl、0.lwt^明膠、0.2wt%IgG、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸、0.lml/LTween-80和0.lwt%NaN3的50mmol/LTris-HClpH7.2。6、洗滌液14.5mmol/LNaC1、0.2ml/LTween-80和0.2wt%NaN3的50,1/LTris-HClpH7.2。7、增強(qiáng)液1升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15ymolP-萘甲酰三氟丙酮，50iimol三正辛基氧化膦和1ml曲拉通X-IOO。使用該試劑盒測定之前注意事項如下(1)使用之前將所有試劑取出回升至室溫(1830°C)(2)使用之后立即將所有試劑放回2『C保存。(3)如果樣品量大建議用多通道移移器，以減少各樣本反應(yīng)時間上的差異。(4)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。(5)取出需用數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于28°C。實施例2試劑盒的制備試劑盒中的材料除不含包被有抗鼠抗人AFP單克隆抗體96孔板(1)以外，其它的同實施例1。試劑盒中的各材料的制備方法如下(l)Eu3+標(biāo)記制備鼠抗人AFP單克隆抗體的制備參照Eu3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取鼠抗人AFP單克隆抗體lmg溶于0.25mol/LNaHC03液200中，加入0.5mgEu3+-N2_[p_|^氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混勻，4t:反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用S印hadexG-50柱(IX20cm)層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Eu"標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Eu"濃度。所得的標(biāo)記率(Eu3+mol/IgGmol)是8.21，蛋白回收率為80.4%。將收集的溶液稀釋成Eu3+標(biāo)記的抗人AFP單克隆抗體濃度為0.8mmol/L，每瓶0.5ml分裝，-2(TC干燥保存。(2)釤標(biāo)記的鼠抗人IgM單克隆抗體制備參照Sm3+標(biāo)記試劑盒(生產(chǎn)廠商PerkerElmer公司)說明書操作。具體為取鼠抗人IgM單克隆抗體lmg溶于0.25mol/LNaHC03液200y1中，加入0.5mgSm3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用S印hadexG-50柱(IX20cm)層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同時用PerkinElmer公司Eu"標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Sm"濃度。所得的標(biāo)記率(Sm3+mol/IgGmol)是8.30，蛋白回收率為78.2%。將收集的溶液稀釋成Sm3+標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體濃度為0.78mmol/L，每瓶0.5ml分裝，-20°0干燥保存，即為試劑盒中的Sm3+標(biāo)記IgM單克隆抗體凍干品。(3)試劑盒中的其他材料(AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，緩沖液，洗滌液，增強(qiáng)液)的制備方法均同實施例1。實施例3試劑盒的制備每一個盒中的試劑足夠進(jìn)行48個測量，盒中的材料如下(1)1X48孔板(4條X12孔，可以拆分為單孔)包被有鼠抗人AFP單克隆抗體。(2)6XAFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品。使用前每瓶各用1ml蒸餾水溶解。(3)1X銪標(biāo)記抗體凍干品，使用時用0.5ml蒸餾水溶解。(4)1X釤標(biāo)記抗體凍干品，使用時用0.5ml蒸餾水溶解。(5)IX緩沖液，30ml。(6)1X洗滌液，30ml，使用時以蒸餾水按體積比1:25稀釋。(7)IX增強(qiáng)液，15ml。試劑盒中的各材料的制備方法如下1、微孔反應(yīng)板制備用50mmol/LpH9.6Na2C03_NaHC03的緩沖液將抗鼠抗人AFP單克隆抗體稀釋至lOiig/mL作為包被液，48孔微孔板各加入100iil，4t:放置過夜，棄去包被液，沖洗四次，加200ill含0.2wt%明膠和2wt^蔗糖的50mmol/LpH7.2的Tris-HCl緩沖液封閉，4。C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-201:冷凍保存。2、試劑盒中的其他材料(AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，Eu3+標(biāo)記的鼠抗人AFP單克隆抗體，Sm3+標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體，緩沖液，洗滌液，增強(qiáng)液)的制備方法均同實施例1。實施例4采用TRFIA同步檢測AFP和AFP-IgM采用實施例1提供的試劑盒。—、實施例1的試劑盒中各材料的稀釋AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，為凍干品，共6瓶，分別用lml蒸餾水溶解成AFP濃度分別為0ng/ml，1.21ng/ml，12.lng/ml，121ng/ml，605ng/ml，1210ng/ml;AFP-IgM濃度分別為0AU/mL，10AU/mL，100AU/mL，1000AU/mL，5000AU/mL，10000AU/mL。銪標(biāo)記抗體凍干品，用0.5ml蒸餾水溶解。釤標(biāo)記抗體凍干品，用0.5ml蒸餾水溶解。洗滌液，用蒸餾水按l:25稀釋。二、檢測取上述制備的包被有抗鼠抗人AFP單克隆抗體的微孔反應(yīng)板，加50iUAFP/10AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品至各自的微孔中，加100ill緩沖液，室溫振蕩反應(yīng)1小時。洗滌后加200iU以緩沖液作稀釋劑，體積比l:IOO稀釋銪標(biāo)記的鼠抗人AFP單克隆抗體和釤標(biāo)記的鼠抗人IgM單克隆抗體，室溫振蕩反應(yīng)1小時。用洗滌液洗滌6次，加增強(qiáng)液200iU振蕩5分鐘后用全自動TRFIA檢測儀測量熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算樣品中的AFP禾PAFP-IgM的含量。三、AFP/AFP-IgM的TRFIA性能指標(biāo)考核1.靈敏度和線性范圍AFP/AFP-IgM的TRFIA典型標(biāo)準(zhǔn)曲線和各濃度值的變異系數(shù)見圖2。每個濃度點重復(fù)測10次，計算變變系數(shù)。圖2顯示各標(biāo)準(zhǔn)品濃度值的變異系數(shù)均小于10%。以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測量20次，計算其熒光均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以該點熒光測定值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出的濃度值為其靈敏度，經(jīng)測定本試驗靈敏度為0.41ng/ml(AFP)和0.OlAU/mL(AFP-IgM)。2.準(zhǔn)確度(回收試驗)將實施例1中的凍干的系列標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為AFP濃度11.89，51.06，110.33ng/mL，加入至5個已知AFP濃度的血清樣本中(其AFP濃度依次為28.65，56.74，90.92，154.56,299.68ng/mL)。AFP-IgM濃度:10.67，58.81,226.03AU/mL，加入至5個已知AFP-IgM濃度的血清樣品中(10.59，23.13，58.63，116.43,277.45AU/mL。通過計算實測值與理論值的比值，得出本實驗在可測范圍內(nèi)其回收率(見表l)。AFP為95.32%-101.6%;AFP-IgM為96.78%-101.24%。表l.回收試驗結(jié)果11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.精密度7份不同濃度的血清樣本按相同的實驗條件，在IO天內(nèi)重復(fù)檢測定10次，每次實驗時每份標(biāo)本重復(fù)測IO次，計算批內(nèi)批間的變異系數(shù)(見表2)。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%，符合試劑盒規(guī)定要求。表2.批內(nèi)批間變異系數(shù)測定結(jié)果AFPAFP-IgM平均值批內(nèi)CV%批間CV%總CV%平均值批內(nèi)CWo批間CVO/o總CWo16.784.541.094.9419.084.21.095.120.573.611.894.0750.562.972.663.1130.412.482.93.0663.833.92.964.0650.62.811.053.0590.563.781.053.5594.754.730.644.96136.73楊2.084.95186.84.092.794.88350.674.363.064.87389.414.712.055462.174.073.054.824.三個不同濃度的血清樣本，分別用分析緩沖液按體積比i:2，i:4，i:8，i:ie進(jìn)行稀釋，計算其回收率(見表3)。表3.平行稀釋試驗AFP(ng/mL)AFP-IgM(AU/mL)樣本稀釋倍數(shù)->■-預(yù)測值實測值回收率％預(yù)測值實測值回收率％1//76.1/50.6//1:238.039.9104.828.225.3111.31:419.019.3101.215.212.7119.71:89.58.892.27.76.3122.31:164.84.492.64.03.2125.3平均值//97.7平均值/123.32//117.9/272.6//1:258.960.1102.0137.4136.31011:429.530.0102.067.868.21001:814.715.1102.032.934.1961:167.46.99415.717.092平均值////245.1跳0/平均值383.1//97.3/1:2122.6125.8103跳9191.603.81:461.362.010197.295.8101.41:830.630.810049.947.9104.21:1615.314.49422.723.994.6平均值//99.5平均值/101.05.方法學(xué)比較分別將本發(fā)明的實施例1的試劑盒與ECLIAAFPtest(RocheDiagnosticsGmbH，German)(x)以及H印aAFP-ICKit(X印taGen，Italy)(z)進(jìn)行比較，分別用于測定實施例5中的118例(n=118)血清標(biāo)本中的AFP濃度和AFP-IgM濃度。經(jīng)相關(guān)性分析，得出本發(fā)明檢測AFP(yl)和AFP-IgM(y2)結(jié)果與所述的兩個現(xiàn)有的試劑盒的結(jié)果的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)如下AFP:y1=1.05x-0.07;r=0.9987(n=118);AFP-IgM:y2=0.97z+0.12;r=0.9854(n=118)?？梢姡景l(fā)明的試劑盒的檢測結(jié)果和現(xiàn)有的兩個試劑盒的檢測結(jié)果的相關(guān)性極高，本發(fā)明的試劑盒及其方法十分可靠。實施例5試劑盒的臨床應(yīng)用采用實施例1提供的試劑盒。臨床資料118例原發(fā)性肝細(xì)胞癌[HCC，年齡(48.62±3.42)歲，男76例，女42例]，60例肝硬化[年齡(52.70±1.62)歲，男33例，女27例]，63例慢性肝炎[CH，年齡(56.17±1.62)歲，男50例，女13例]患者血清標(biāo)本均由上海市腫瘤研究所提供，所有病例均經(jīng)手術(shù)或相關(guān)檢查確診。286例健康對照者[年齡(50.00±5.00)歲，男180例，女106例]為近期來上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院進(jìn)行體格檢查者，經(jīng)血液、B超、X線等檢查未發(fā)現(xiàn)良惡性腫瘤。所有研究對象于清晨空腹抽取靜脈血2ml，低速離心后分離血清，置-2(TC保存待測。具體檢測步驟取包被有抗AFP-IgM單克隆抗體的微孔反應(yīng)板，加AFP50ii1AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品至各自的微孔中，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭，加100ii1緩沖液，室溫振蕩反應(yīng)1小時，洗滌四次。再加200ii1以緩沖液作稀釋劑，按體積比1:IOO稀釋的銪標(biāo)記抗體和釤標(biāo)記抗體，加樣時移液器吸頭不要接觸到微孔中的液體，25-37t:振蕩反應(yīng)1小時，用洗滌液洗滌六次，加增強(qiáng)液200iU振蕩5分鐘后測量熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的AFP和AFP-IgMAFP含量。AFP-IgM和AFP在HCC、CH、肝硬化及健康人血清中的分布如圖3所示。AFP[4.19(5.60-2.92)iig/L]及AFP_IgM[72.79(95.07-43.97)U/L]在正常人血清中可檢測出。肝癌組AFP[6.20(81.70-4.58)iig/L]和AFP_IgM[152.55(233.68-77.90])U/L]均明顯高于正常對照組(p<0.001)、CH組[AFP:3.27(4.63-1.96)yg/L，AFP-IgM:74.20(109.05-47.65)U/L，p<0.001]以及肝硬化組[AFP:3.38(5.04-1.96)iig/L，AFP-IgM:75.70(118.0-27.45)U/L，p<0.001]，肝炎組和肝硬化組無顯著差異(AFP:CHISQ=12.44，P=0.09;AFP-IgM:CHISQ=10.83，P=0.991)。AFP和AFP-IgM在本研究對象中無相關(guān)性(r=1.82，P=0.15)。以健康對照組AFP或AFP-IgM水平值的95%可信區(qū)間為正常值范圍，診斷HCC的臨床界值A(chǔ)FP為7.23iig/L，AFP-IgM為127.52kU/L。在HCC組中AFP-IgM的陽性率為63.56%(75/118)，AFP的陽性率為46.61%(55/118);在肝硬化化組中AFP-IgM的陽性率為23.33%(14/60)，AFP的陽性率20%(12/60);在CH組中AFP-IgM的陽性率為14.29%(9/63)，AFP的陽性率7.94%(5/63);在健康對照組中AFP及AFP-IgM的陽性率分別為3.15%(9/286)和4.20%(12/286)。經(jīng)ROC曲線分析(圖4)AFP和AFP-IgM對HCC的診斷效率兩者無顯著差異(x2=5.02，p=0.939)，聯(lián)合檢測AFP-IgM和AFP可以提高肝癌的診斷靈敏度和準(zhǔn)確率(見表4)。AFP-IgM是HCC新型血清標(biāo)志物，同時檢測AFP和AFP-IgM能極大提高HCC的診斷靈敏度和診斷準(zhǔn)確性，有利于HCC的早期診斷。本發(fā)明同時檢測AFP和AFP-IgM穩(wěn)定可靠，可以滿足臨床使用需要。表4.AFP和AFP-IgM及兩者聯(lián)檢診斷肝癌效率比較靈敏度特異性陽性預(yù)測值陰性預(yù)測值A(chǔ)UCAFP45.7693.4066.7085.700.771AFP-IgM65.2590.9567.5090.10.70.774AFP&AFP-IgM72.8887.2962.3191.770.84權(quán)利要求一種同步檢測甲胎蛋白和甲胎蛋白-免疫球蛋白復(fù)合物的時間分辨熒光免疫分析的試劑盒，包括以下試劑1)第一抗原表位的AFP單克隆抗體，2)一種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體，3)另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體，4)AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，5)緩沖液，6)洗滌液，7)增強(qiáng)液，其中，所述的鑭系元素選自銪和釤，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體與所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體具有不同的抗原表位。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑1)所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體為鼠抗人AFP單克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑1)所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體為固相抗體，其固相載體為反應(yīng)板。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑2)所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體為鼠抗人AFP單克隆抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑3)所述的IgM單克隆抗體為鼠抗人IgM單克隆抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑4)所述的AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，共6瓶，其中，AFP濃度分別為0ng/mL，1.21ng/mL，12.lng/mL，121ng/mL，605ng/mL，1210ng/mL;AFP-IgM濃度分別為0AU/mL，0.5AU/mL，5AU/mL，50AU/mL，250AU/mL，500AU/mL，其中，AU設(shè)定為任意單位。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑5)所述的緩沖液為含8mmo1/LNaCl、0.lwt%明膠、0.2wt%IgG、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸、0.lml/LTween-80和0.lwt%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑6)所述的洗滌液為含14.5mmo1/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2wt%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑7)所述的增強(qiáng)液為含15iimo1/LP_萘甲酰三氟丙酮、50mol/L三正辛基氧化膦和體積百分比0.1%曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。10.—種根據(jù)權(quán)利要求19任一項所述的試劑盒同步檢測甲胎蛋白和甲胎蛋白_免疫球蛋白復(fù)合物的時間分辨熒光免疫分析方法，依次包括以下步驟1)在固相的第一抗原表位的AFP單克隆抗體中，加入AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品以及緩沖液，進(jìn)行孵育；2)用洗滌液洗滌步驟l)的孵育后的反應(yīng)液，然后加入一種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體和另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體，進(jìn)行孵育，其中，所述的鑭系元素選自銪和釤，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體與步驟1)所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體具有不同的抗原表位；3)用洗滌液洗滌步驟2)的孵育后的反應(yīng)液，然后加入增強(qiáng)液進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行時間分辨熒光檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種同步檢測AFP和AFP-IgM的時間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)及其試劑盒，該試劑盒包括以下試劑1)第一抗原表位的AFP單克隆抗體，2)一種鑭系元素標(biāo)記的第二抗原表位的AFP單克隆抗體，3)另一種鑭系元素標(biāo)記的IgM單克隆抗體，4)AFP/AFP-IgM混合標(biāo)準(zhǔn)品，5)緩沖液，6)洗滌液，7)增強(qiáng)液，其中，所述的鑭系元素選自銪和釤，所述的第二抗原表位的AFP單克隆抗體與所述的第一抗原表位的AFP單克隆抗體具有不同的抗原表位。本發(fā)明采用高靈敏的TRFIA，建立同時檢測AFP和AFP-IgM方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，操作簡單，可實現(xiàn)高度自動化，提高臨床檢驗的速度，大幅度降低人為誤差，增加檢出結(jié)果的可靠性，極大提高診斷效率。文檔編號G01N33/577GK101750502SQ20081020733公開日2010年6月23日申請日期2008年12月19日優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日發(fā)明者王青,盛世樂,黃鋼申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院