專利名稱：一種適用于海洋環(huán)境石油污染的微生物修復(fù)固化吸附菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)，涉及一種適用于海洋灘涂和海底沉積物環(huán)境石油污染修復(fù)的微生物固化吸附菌劑制備方法，及其在海洋灘涂和海底沉積物石油污染生物修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著海上石油開(kāi)發(fā)和油輪事故的頻發(fā)，海上石油污染日益嚴(yán)重，直接影響了海洋養(yǎng)殖和捕撈業(yè)的發(fā)展。海上溢油不僅直接造成污染危害，而且因無(wú)法完全清除，一些殘余油在自然條件下很難降解，有毒、有害成分具有積累性，因而對(duì)海洋生態(tài)造成長(zhǎng)期的損害。2005年國(guó)家監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，渤海海域，特別是黃河口和萊州灣生態(tài)監(jiān)控區(qū)，石油污染仍較嚴(yán)重，海洋生物種類和數(shù)量減少，產(chǎn)卵場(chǎng)嚴(yán)重退化，造成這種現(xiàn)象的因素很多，其中烴類污染的加劇不容忽視。因此，在大力發(fā)展海上石油開(kāi)采和運(yùn)輸?shù)耐瑫r(shí)，必須看到石油污染事件逐石油污染的技術(shù)研究刻不容緩。尤其是2010年7月16日在大連發(fā)生的溢油事故，及后來(lái)在山東蓬萊發(fā)生的溢油事故后，海洋年增多的事實(shí)，開(kāi)展減少或消除海洋石油污染的治理日益受到政府的高度重視。溢油事故發(fā)生后，經(jīng)物理方法(如機(jī)械回收等)可清除部分表面溢油，剩余的溢油在風(fēng)、浪、流的作用下，會(huì)漂移至灘涂，密度較大的會(huì)沉入海底。石油中難降解的芳烴組分(致癌物質(zhì))長(zhǎng)期滯留在灘涂土壤和海底沉積物環(huán)境中，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)及人體健康造成巨大的持久性損害。微生物治理技術(shù)是國(guó)際上公認(rèn)的高效修復(fù)石油污染的新技術(shù)，是指利用微生物來(lái)催化降解環(huán)境污染物，減小 或最終消除環(huán)境污染的受控或自發(fā)過(guò)程。微生物能適應(yīng)各種復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，其繁殖代謝能力極強(qiáng)，能快速降解石油中各種有毒物質(zhì)，而且具有價(jià)格低廉、自然環(huán)保、二次污染少、對(duì)人畜無(wú)害等諸多優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為現(xiàn)場(chǎng)去除溢油污染修復(fù)的重要選擇途徑。采用該技術(shù)處理物理方法無(wú)法清除的溢油是恢復(fù)生態(tài)環(huán)境的最佳途徑，已受到各國(guó)政府、科學(xué)家和企業(yè)家的高度重視。發(fā)展和推廣微生物治理技術(shù)適合我國(guó)的國(guó)情，對(duì)保護(hù)我國(guó)海洋生態(tài)環(huán)境，維持海洋資源的可持續(xù)性發(fā)展具有重大的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。在海洋石油污染生物修復(fù)處理的過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)用到低溫耐鹽的烴降解菌株，它們以自己的方式攝取烴類，然后參與自身代謝，最終生成小分子有機(jī)酸或氣體。針對(duì)生物添加法的研究有兩個(gè)發(fā)展趨勢(shì)一是針對(duì)微生物降解能力不足的生態(tài)系統(tǒng)，加入外源微生物做補(bǔ)充；二是針對(duì)土著微生物不能降解的原油類型或重要的石油成分，選擇或改造優(yōu)良性能的降解微生物。美國(guó)政府資助的“自然與加速生物治理研究項(xiàng)目”力圖通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，在闡明污染物代謝機(jī)理的基礎(chǔ)上發(fā)展適宜的分子調(diào)控手段，以降低生物修復(fù)過(guò)程中降解菌的營(yíng)養(yǎng)添加量和生物累積量；也有學(xué)者以銅綠假單胞菌作為受體，將惡臭假單胞菌等攜帶的各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其中，構(gòu)成了帶有多種質(zhì)粒的“超級(jí)嗜油工程菌”，用于海上溢油處理，其清除油污的能力比野生菌高幾十倍到幾百倍。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者利用混合菌協(xié)同作用加強(qiáng)石油烴的降解效果，王加寧等人公開(kāi)了一種降解石油污染物及石油產(chǎn)品的固體微生物混合菌劑及其制備方法(公開(kāi)號(hào)CN 101050435A)，可應(yīng)用于石油污染土壤及石油產(chǎn)品泄露等突發(fā)事故應(yīng)急處理的生物修復(fù)技術(shù)中，其中，微生物菌劑是由枯草芽孢桿菌和多食鞘氨醇單胞菌混合發(fā)酵制成。朱生鳳等人公開(kāi)了溢油污染海岸線生物修復(fù)用菌劑及制備方法(公開(kāi)號(hào)CN 101717725A)，利用硅藻土、高嶺土、草炭和甲殼質(zhì)等至少一種固定化載體包埋短小芽孢桿菌、威尼斯不動(dòng)桿菌、門多薩假單胞菌和皮氏羅爾斯通菌等微生物菌劑，以提高溢油污染海岸線生物降解效果。這些發(fā)明可以提高石油污染的生物修復(fù)效率，也可以應(yīng)用在淺海修復(fù)作業(yè)區(qū)，但是由于菌劑的密度較小，不能應(yīng)用于海底沉積物的修復(fù)區(qū)域，因此限制了其應(yīng)用范圍。加快國(guó)內(nèi)生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展，符合我國(guó)海洋環(huán)境保護(hù)發(fā)展的需要，加強(qiáng)低溫耐鹽烴降解菌、微生物降解機(jī)理、緩釋營(yíng)養(yǎng)劑和更多疏水固定化載體的研究，有利于海洋溢油生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展和工業(yè)化應(yīng)用。海洋灘涂石油污染的生物修復(fù)具有很好的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有微生物修復(fù)方法是使用的修復(fù)菌劑存在菌劑密度較小，不能應(yīng)用于海底沉積物的修復(fù)區(qū)域等，因此限制了菌劑應(yīng)用范圍的問(wèn)題，提供一種適用于海洋灘涂和海底沉積物等海洋環(huán)境石油污染的微生物修復(fù)固化吸附菌劑制備方法，及其在海洋灘涂和海底沉積物等海洋環(huán)境石油污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的適用于海洋灘涂和海底沉積物環(huán)境石油污染的微生物修復(fù)固化吸附菌劑，是由菌濃為IO8IOltl個(gè)/mL的適合降解目標(biāo)油品的微生物發(fā)酵菌液中加入100^1000g/L多孔介質(zhì)和f 2g/L絮凝劑，充分混合制成。所述的微生物包括紅球菌(Rhodococcus erythoropolis T7-3,保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC No. 6104，以下簡(jiǎn)稱T7-3)，或伯克霍爾德菌(Burkholderia mallei ATCC 23344，購(gòu)買于美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，其貨號(hào)為 ATCC23344,以下簡(jiǎn)稱 ATCC23344),或不動(dòng)桿菌(Acinetobacter haemolyticus ATCC19194，購(gòu)買于美國(guó)典型培 養(yǎng)物中心，其貨號(hào)為ATCC19194，以下簡(jiǎn)稱ATCC 19194)，或芽孢桿菌(Bacillus licheniformis ATCC 14580，購(gòu)買于美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，其貨號(hào)為ATCC14580,以下簡(jiǎn)稱ATCC 14580),或假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA01,購(gòu)買于美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，其貨號(hào)為ATCC15692，以下簡(jiǎn)稱ATCC 15692)，或這些菌的等比例混合物(以下簡(jiǎn)稱混合菌)。所述的多孔介質(zhì)為沸石或陶粒。本發(fā)明同時(shí)提供了一種適用于海洋灘涂和海底沉積物環(huán)境石油污染的微生物修復(fù)固化吸附菌劑制備方法，具體過(guò)程是第1、選取適合降解污染區(qū)域原油的微生物菌種(具體微生物如前所述)；第2、經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶種子發(fā)酵和發(fā)酵罐級(jí)聯(lián)放大獲得菌濃為IO8KT個(gè)/mL的發(fā)酵菌液；第3、向第2步的發(fā)酵菌液中添加10(Tl000g/L多孔介質(zhì)，充分混合；所述的多孔介質(zhì)為沸石或陶粒；第4、向第3步的混合物中添加絮凝劑f 2g/L，充分混合，混合后靜置O. 5^24h,制得菌體吸附率彡90%的固化吸附菌劑。本發(fā)明還提供了以上所述固化吸附菌劑在海洋灘涂或海底沉積物環(huán)境石油污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。具體應(yīng)用過(guò)程是，按f2kg/m2修復(fù)面積加入所述固化吸附菌劑，按O. 2^1kg/m2修復(fù)面積添加營(yíng)養(yǎng)鹽肥料。所述營(yíng)養(yǎng)鹽肥料為硫酸氨或磷酸氫二鈉。本發(fā)明固化吸附菌劑在室內(nèi)模擬、灘涂和海底現(xiàn)場(chǎng)條件下均有利于長(zhǎng)期持菌，并降解石油烴，因此可用于灘涂和海底現(xiàn)場(chǎng)石油污染的生物修復(fù)領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明提供一種利用沸石或陶粒吸附石油烴高效降解菌劑及其營(yíng)養(yǎng)劑的方法，能將石油烴高效降解菌及其營(yíng)養(yǎng)攜帶到海底沉積物中，并能延長(zhǎng)石油烴高效降解菌及其營(yíng)養(yǎng)劑在灘涂的滯留時(shí)間，明顯提高目標(biāo)菌在目標(biāo)地點(diǎn)的存活率，擴(kuò)大了修復(fù)菌劑的應(yīng)用范圍，因此具有海洋灘涂和海底沉積物石油污染生物修復(fù)能力。


圖1是烴降解菌對(duì)原油的降解率隨時(shí)間變化曲線圖。圖2是固體材料吸附前后上清液殘留微生物效果比較圖(A為未吸附的發(fā)酵液上清100 μ I涂平板效果，B為吸附后的發(fā)酵液上清100 μ I涂平板效果)。圖3是固體材料吸附前后發(fā)酵液外觀圖(Α為吸附后的發(fā)酵液，B為未吸附的發(fā)酵液)。圖4是固體材料吸附前后掃描電鏡(SBO圖(Α為吸附前的材料多孔介質(zhì)內(nèi)部，B為吸附后的材料多孔介質(zhì) 內(nèi)部)。圖5是室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)沉積物中細(xì)菌總數(shù)變化曲線圖。圖6是室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)沉積物中烴降解菌總數(shù)變化曲線圖。圖7是室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)的石油烴降解曲線圖。圖8是灘涂現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)沉積物中總石油烴變化曲線圖。圖9是灘涂現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)沉積物中總菌數(shù)變化曲線圖。圖10是灘涂現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)沉積物中烴降解菌的變化曲線圖。圖11是灘涂現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)沉積物中總石油烴60天降解率直方圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、紅球菌Τ7-3固化吸附菌劑的制備方法1、降解菌種的篩選以污染地域收集原油(本實(shí)施例暫以海二站混合原油為例，以下簡(jiǎn)稱原油)，以2%的質(zhì)量體積比加入到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(KH2PO4 3. 48g/L, Na2HPO41. 5g/L, MgSO4 O. 70g/L,(NH4)2SO4 4g/L，NaCl 20g/L，酵母粉0. 05g/L，pH 7. 0 7. 2)中，形成原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，篩選對(duì)原油降解性能好的菌種，培養(yǎng)條件為25°C，150r/min，接種量2%，培養(yǎng)時(shí)間為7d。本實(shí)施例從30種待選菌株中選擇紅球菌(Rhodococcus erythoropoIis)Τ7~3,(已于2012年5月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其保藏號(hào)為CGMCC No. 6104，建議分類命名為紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis)以下簡(jiǎn)稱T7-3)。接種至以滅菌的原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，測(cè)定了菌種在降解過(guò)程中的原油降解率，其中原油降解率％=(降解前原油含量一降解后原油含量)/降解前原油濃度X 100%，原油含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB17378. 4-2007法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1所示。從圖中可以看出，T7-3對(duì)原油的降解率為75%。2、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)本發(fā)明的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)方法經(jīng)過(guò)平板分純，斜面培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)四個(gè)步驟，最終菌體細(xì)胞密度達(dá)到2X IO8個(gè)/mL以上。下面選擇的是發(fā)明內(nèi)容中所述微生物中的一種，并不限制本發(fā)明。I)、平板分純將菌種T7-3以滅菌接種環(huán)挑取單菌落接種到I號(hào)固體培養(yǎng)基平板上，反復(fù)劃線，25°C下培養(yǎng)72h后，觀察有無(wú)雜菌，以驗(yàn)證目標(biāo)菌的純度。其中，I號(hào)固體培養(yǎng)基平板制備方法如下分別稱取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次攪拌溶解于IOOOmL陳化海水中，然后稱取18g瓊脂粉，煮沸溶解后，調(diào)pH7. 6^7. 8，于121°C下滅菌20min后降至50°C，以每20mL倒入并平鋪于培養(yǎng)皿(d=10cm)底部，冷卻后得到固體培養(yǎng)基平板。2)、斜面培養(yǎng) 將上述平板上驗(yàn)證正確的單菌落以滅菌接種環(huán)挑取一環(huán)，接種到I號(hào)固體培養(yǎng)基斜面上，反復(fù)劃線，25°C下培養(yǎng)72h后，備用。其中，I號(hào)固體培養(yǎng)基斜面制備方法如下分別稱取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次攪拌溶解于IOOOmL陳化海水中，然后稱取18g瓊脂粉，煮沸溶解后，調(diào)pH7. 6^7. 8，于121 °C下滅菌20min后降至50°C,以每5mL分裝于180mmX 18mm (長(zhǎng)X直徑)試管中，10° -20°傾斜室溫放置，冷卻后得到固體培養(yǎng)基斜面。3)、搖瓶種子培養(yǎng)將上述斜面上的菌種，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作接種到裝有200mL的I號(hào)液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，25°C，200r/min培養(yǎng)到細(xì)胞密度剛達(dá)到5 X IO8個(gè)/mL即停止培養(yǎng)，備用。其中I號(hào)液體培養(yǎng)基制備方法如下分別稱取5. Og蛋白胨，1. Og酵母粉，依次攪拌溶解于IOOOmL陳化海水中，每200mL分裝到500mL錐形瓶中，于121°C下滅菌20min。4)、發(fā)酵罐培養(yǎng)將上述種子液培養(yǎng)液以3-5%的接種量分別在裝有4(Γ60%液量已滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中逐級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過(guò)程中，控制PH為7. 2，培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為600r/min，通氣量為l.(T2. 0L/min，培養(yǎng)60h至菌體細(xì)胞密度達(dá)到2 X IO8個(gè)/mL以上。上述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下分別稱取30. Og葡萄糖、80. Og液體石蠟、4. Og磷酸二氫鉀、6. Og磷酸氫二鉀、10. Og硫酸銨、25. Og氯化鈉、0. 2g硫酸鎂、0. Olg氯化鈣、
0.005g生物素依次添加到IOOOmL的蒸餾水中，攪拌溶解后調(diào)pH至7. 2，于115°C滅菌15min。3、固化吸附菌劑的吸附下面公開(kāi)的是菌種T7-3與固體材料以幾種不同比例的制備過(guò)程，并不限制本發(fā)明。
將T7-3種子液與沸石(或陶粒)以表I所列的比例進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，其中1-9組加固體吸附介質(zhì)后攪拌2min再靜止1. 5h，吸附后的體系取上清液100 μ I稀釋涂營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)算剩余菌濃(cful)，并以初始種子液中的菌濃(cfu2)作對(duì)照，計(jì)算沸石吸附的菌體量(cfu3)和吸附率(％)(見(jiàn)圖2),其中吸附率的計(jì)算方法如下cfu3=cfu2-cful,吸附率％=cfu3/cfu2X 100%。以第3組實(shí)驗(yàn)形成的菌劑3號(hào)為例，沸石吸附前T7-3菌體濃度為9X108CFU/mL,吸附后菌體濃度為1. 9X 108CFU/mL，吸附率達(dá)到78. 9%，平均每g沸石吸附1.8 X IO9CFU 菌體。表I多孔介質(zhì)對(duì)T7-3菌體細(xì)胞的吸附作用
權(quán)利要求
1.一種適用于海洋灘涂和海底沉積物環(huán)境石油污染的微生物修復(fù)固化吸附菌劑的制備方法，其特征在于所述的固化吸附菌劑的制備過(guò)程是 第1、選取適合降解污染區(qū)域原油的微生物菌種； 第2、經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶種子發(fā)酵和發(fā)酵罐級(jí)聯(lián)放大獲得菌濃為IO8IOltl個(gè)/mL的發(fā)酵菌液； 第3、向第2步的發(fā)酵菌液中添加10(Tl000g/L多孔介質(zhì)，充分混合； 第4、向第3步的混合物中添加絮凝劑f 2g/L，充分混合，混合后靜置O. 5^24h,制得菌體吸附率彡90%的固化吸附菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的多孔介質(zhì)為沸石或陶粒。
3.一種適用于海洋灘涂和海底沉積物環(huán)境石油污染的微生物修復(fù)固化吸附菌劑，其特征在于所述的固化吸附菌劑是由菌濃為1(Τ101(Ι個(gè)/mL的適合降解目標(biāo)油品的微生物發(fā)酵菌液中加入10(Tl000g/L多孔介質(zhì)和f 2g/L絮凝劑，充分混合制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固化吸附菌劑，其特征在于所述的微生物包括 紅球菌(Rhodococcus erythoropolis T7-3),保藏號(hào)為 CGMCC No.6104;或伯克霍爾德菌(Burkholderia mallei ATCC23344);或不動(dòng)桿菌(Acinetobacter haemolyticusATCC19194);或芽抱桿菌(Bacillus licheniformis ATCC14580);或假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa PAOI);或這些菌的等比例混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的固化吸附菌劑，其特征在于所述的多孔介質(zhì)為沸石或陶粒。
6.權(quán)利要求1所述方法制備的或權(quán)利要求3所述的固化吸附菌劑在海洋灘涂或海底沉積物環(huán)境石油污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于按f2kg/m2修復(fù)面積加入所述固化吸附菌齊IJ，按O. 2^1kg/m2修復(fù)面積添加營(yíng)養(yǎng)鹽肥料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的營(yíng)養(yǎng)鹽肥料為硫酸氨或磷酸氫二鈉。
全文摘要
一種適用于海洋灘涂和海底沉積物環(huán)境石油污染修復(fù)的固化吸附菌劑制備方法及應(yīng)用。所述固化吸附菌劑制備過(guò)程是選取適合降解污染區(qū)域原油的微生物菌種；經(jīng)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)獲得菌濃為108~1010個(gè)/mL的發(fā)酵菌液；然后添加100~1000g/L的多孔介質(zhì)(沸石或陶粒)，進(jìn)一步可添加0.1~2g/L的絮凝劑，充分混合，靜置0.5~24h，制得菌體吸附率≥90%的固化吸附菌劑。所述固化吸附菌劑可應(yīng)用于海洋灘涂或海底沉積物等海洋環(huán)境石油污染的生物修復(fù)中，能將石油烴高效降解菌及其營(yíng)養(yǎng)攜帶到海底沉積物中，并能延長(zhǎng)石油烴高效降解菌及其營(yíng)養(yǎng)劑在灘涂的滯留時(shí)間，明顯提高目標(biāo)菌在目標(biāo)地點(diǎn)的存活率，擴(kuò)大了修復(fù)菌劑的應(yīng)用范圍。
文檔編號(hào)A62D3/02GK103045579SQ20121054904
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者馬挺, 李國(guó)強(qiáng), 梁鳳來(lái) 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)