一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]嘧菌酯是一種常用的甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥。該農(nóng)藥已被廣泛用于防治作物病害，是農(nóng)藥市場上的主要品種之一。但是，近年研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯殘留對非靶標生物具有潛在的危害，如對蜜蜂、魚類和水生無脊椎動物具有很高的毒性，對人類和其他哺乳動物具有慢性毒性，長期接觸或攝入將導(dǎo)致慢性疾病，甚至有致癌、致畸、致突變的危險。鑒于嘧菌酯使用的廣泛性及其殘留危害，消除嘧菌酯殘留污染顯得尤為必要。[0003]微生物降解技術(shù)目前已成為治理農(nóng)藥殘留污染的有效措施，與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比具有操作簡便、經(jīng)濟實用、環(huán)境友好等優(yōu)點，擁有廣闊的應(yīng)用前景。但是，微生物降解農(nóng)藥殘留受到諸多條件影響，如微生物接種量、溫度、pH、濕度和農(nóng)藥性質(zhì)等等。因此，如何優(yōu)化微生物的降解工藝條件，使其降解效果達到最大化是科研工作者亟待解決的具有重大經(jīng)濟和社會意義的科研命題。優(yōu)化微生物降解工藝的常規(guī)的方法是通過單因素試驗逐個評估，因而試驗次數(shù)多，工作量大，且因各因素之間可能存在交互作用，結(jié)果并不可靠。響應(yīng)曲面法（ResponseSurfaceMethodology,RSM)是國外近些年來開發(fā)出的一種基于統(tǒng)計技術(shù)的優(yōu)化方法，有試驗次數(shù)少、精度高、預(yù)測性好等優(yōu)點，可以有效優(yōu)化和評價影響生物效能的各種因變量水平和交互作用，利用其曲面圖及等高線圖可直觀地了解到自變量變化對因變量的影響過程，并可確定影響因素的最佳水平范圍。如今，響應(yīng)曲面雖已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)的各個領(lǐng)域，但用于優(yōu)化微生物降解嘧菌酯的工藝條件尚未有相關(guān)報道?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物降解嘧菌酯的效率低的缺陷，提供一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法。[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法，是將蒼白桿菌SH14在溫度30.2°C、pH7.9和接種量為0.2g/L的條件下降解嘧菌酯；所述蒼白桿菌SH14于2013年12月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCCM2013681，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)。[0006]本發(fā)明所述蒼白桿菌SH14來源于新加坡污水處理池中的活性污泥，是通過富集培養(yǎng)法分離、篩選獲得，過程如下：取活性污泥樣品5g加入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(配方為：2g(NH4)2S04、0.2gMgS04、0.01gCaCl2、0.005gFeS04、0.002gMnCl2、10.5gK2HP04、4.5gKH2PO4,蒸餾水1000mL，調(diào)整培養(yǎng)基的pH為7.5)，同時加入嘧菌酯原藥母液（DMSO為溶劑)，使嘧菌酯最終質(zhì)量濃度為50mg/L，于30°C、150r/min搖床下進行降解微生物富集培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后，按10%的接種量轉(zhuǎn)接到第二批含100mg/L嘧菌酯的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。相同條件培養(yǎng)7d后，再按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含嘧菌酯為200mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)7d。以此類推，不斷增加嘧菌酯的質(zhì)量濃度。最后取0.2mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵液均勻涂抹到含嘧菌酯的固體平板中反復(fù)進行劃線分離，直至得到單菌落，并使用高效液相色譜法（HPLC)驗證其降解效果。[0007]上述獲得的單菌落經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析及API20NE系統(tǒng)鑒定為蒼白桿菌a/?iAro/7i)，該菌株在LB固體平板中生長很快，呈現(xiàn)白色或淡黃色，菌落小而平、稍透明、邊緣整齊、表面較濕潤。通過生理生化特性測定，顯示該菌株屬于革蘭氏陰性桿菌，好氧，接觸酶、氧化酶陽性。該菌可利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、癸酸、檸檬酸、麥芽糖、萍果酸、硝酸鉀和展乙酰-D-葡萄糖胺；不利用精氨酸、明膠、七葉靈、己二酸、甘露醇、脲素、色氨酸、葡萄糖酸鹽、苯乙酸和對硝基-β-D-甲基半乳糖。[0008]本發(fā)明通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化了蒼白桿菌SH14降解嘧菌酯的降解工藝條件，響應(yīng)曲面法可以減少實驗次數(shù)，同時可進行因子的單次效應(yīng)、二次效應(yīng)以及交互效應(yīng)的分析，因此用響應(yīng)曲面法可以快速并高效獲得菌株SH14降解嘧菌酯的最優(yōu)降解工藝條件。[0009]具體地，所述響應(yīng)曲面法優(yōu)化包含以下步驟：51.將菌株SH14進行單因素降解試驗，通過依次改變影響降解的因素，如溫度、pH值、菌種接種量、裝液量、振蕩速率，測定菌株SH14對嘧菌酯降解率，確定影響菌株SH14降解率的顯著因素；52.選取顯著因素進行響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計（ResponseSurfaceMethodology,RSM)，根據(jù)中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計（CentralCompositeRotatableDesign,CCRD)原則進行試驗設(shè)計，以顯著因素為自變量（X1，忑，不)，以嘧菌酯降解率為響應(yīng)值（K)，建立多元二次回歸方程：Y1=86.49+1.39^+2.05J2+LOJ3-11.22^2--O-ISJ1J3-3.23J22-0.53J2J3-1.78J3253.利用SAS9.0統(tǒng)計軟件根據(jù)多元二次回歸方程進行繪圖分析，得到回歸方程的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖；54.對多元二次回歸方程求一階偏導(dǎo)，通過解方程得到該模型的極值點，即理論最優(yōu)降解工藝條件：溫度30.2°C、pH7.9和菌種接種量0.2g/L。[0010]優(yōu)選地，本發(fā)明所述蒼白桿菌SH14降解嘧菌酯的時間為5d。[0011]優(yōu)選地，上述高效降解嘧菌酯的方法中，所述蒼白桿菌SH14的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分為：2g(NH4)2S04、0.2gMgS04、0.0lgCaCl2、0.005gFeS04、0.002gMnCl2UO.5gΚ2ΗΡ04、4·5gKH2PO4,蒸餾水1000mL，調(diào)整培養(yǎng)基的pH為7.9。[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供了一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法，即將蒼白桿菌SH14在溫度30.2°C、pH7.9條件下降解嘧菌酯，所述蒼白桿菌SH14的接種量為0.2g/L;利用上述降解工藝條件，蒼白桿菌SH14對50mg/L的嘧菌酯的降解率達85%以上；本發(fā)明所述方法可以為以后大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供理論實踐依據(jù)，具有廣泛的意義?！靖綀D說明】[0013]圖1.主要因子影響菌株SH14降解效果的預(yù)測模型。[0014]圖2.溫度（Z1)與pH(Z2)交互影響菌株SH14降解效果的響應(yīng)曲面圖（a)及其等高線圖（b)。[0015]圖3.溫度（Z1)與接種量（不）交互影響菌株SH14降解效果的響應(yīng)曲面圖（a)及其等1?線圖（b)。[0016]圖4.pH(不）與接種量（不）交互影響菌株SH14降解效果的響應(yīng)曲面圖（a)及其等1?線圖（b)?！揪唧w實施方式】[0017]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。[0018]本發(fā)明所述菌株降解嘧菌酯的實驗過程如下：菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2g(NH4)2S04、0.2gMgS04、0.01gCaCl2、0.005gFeS04、0.002gMnCl2UO.5gΚ2ΗΡ04、4·5gKH2PO4,蒸餾水1000mL，調(diào)整培養(yǎng)基的pH為7.9。[0019]在菌株的液體培養(yǎng)基中加入嘧菌酯進行菌株SH14降解嘧菌酯的實驗，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC)測定菌株SH14對嘧菌酯的降解率。[0020]實施例1單因素考察實驗選取溫度、PH值、菌種接種量、裝液量、振蕩速率作為影響嘧菌酯降解率的主要因素，并依次改變上述各個因素，考察降解菌OcAro知cir腫SH14(蒼白桿菌SH14)對嘧菌酯的降解效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度、PH值和菌種接種量這三個因素對嘧菌酯的降解率影響顯著。[0021]實施例2響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取溫度、PH值和菌種接種量這三個因素進行響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計，利用SAS9.0統(tǒng)計軟件根據(jù)中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計（CentralCompositeRotatableDesign，CCRD)原則進行試驗設(shè)計(表1)，以溫度（Z1)、pH值（Z2)和菌種接種量（Z3)為自變量，以嘧菌酯的降解率為響應(yīng)值OO，建立多元二次回歸方程：Y1=86.49+1.39^+2.05J2+LOJ3-11.22^2--O-ISJ1J3-3.23J22-0.53J2J3-1.78J32【主權(quán)項】1.一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法，其特征在于，將蒼白桿菌SH14在溫度30.2°C、pH7.9和接種量為0.2g/L的條件下降解嘧菌酯，所述蒼白桿菌SH14于2013年12月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2013681。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蒼白桿菌SH14降解嘧菌酯的工藝條件由響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計得到。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蒼白桿菌SH14降解嘧菌酯的時間為5d〇4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述蒼白桿菌SH14的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分為：2g(NH4)2S04、0.2gMgS04、0.01gCaCl2、0.005gFeS04、0.002gMnCl2、10.5gK2HP04、4.5gKH2PO4,蒸餾水1000mL，調(diào)整培養(yǎng)基的pH為7.9?！緦＠勘景l(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體公開了一種利用蒼白桿菌高效降解嘧菌酯的方法。即將蒼白桿菌SH14在溫度30.2°C、pH7.9和接種量為0.2g/L的條件下降解嘧菌酯，蒼白桿菌SH14對50mg/L的嘧菌酯的降解率達85%以上；本發(fā)明所述方法為以后蒼白桿菌SH14大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論實踐依據(jù)，具有廣泛的意義。CCTCCNO:M201368120131220【IPC分類】A62D101-04,A62D101-28,A62D3-02,A62D101-26【公開號】CN104667475【申請?zhí)枴緾N201410774356【發(fā)明人】陳少華,廖立勝,陳昱帆,王惠杉,馮起順【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)【公開日】2015年6月3日【申請日】2014年12月16日