專利名稱：一種用于研究精子發(fā)生的動(dòng)物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種以小鼠睪丸顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，涉及該動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精子發(fā)生是由精原細(xì)胞增殖分化形成精子的過程。在此過程中，精原干細(xì)胞通過有絲分裂使其數(shù)量得到擴(kuò)增，經(jīng)減數(shù)分裂，隨后再經(jīng)歷單倍體精子細(xì)胞的變形，發(fā)育為成熟精子。就其本質(zhì)而言，精子發(fā)生是在生精調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下，特異基因在特定的時(shí)空秩序上，精密有序的表達(dá)和相互作用的結(jié)果。對(duì)這些基因的深入研究對(duì)于闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制，以及對(duì)人類的生殖健康、避孕疫苗的研制及男性不育的防治都有著十分重要的意義。
多年以來，在體外培養(yǎng)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子發(fā)生并產(chǎn)生形態(tài)功能正常的成熟精子細(xì)胞是很多人的研究目標(biāo)，但是由于精子發(fā)生的高度復(fù)雜性和對(duì)體內(nèi)微環(huán)境的依賴性，所以迄今為止尚無滿意的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠在體外完成精子發(fā)生。采用永生化的方法得到了一系列的生精細(xì)胞系，解決了原代生精細(xì)胞體外培養(yǎng)困難的問題，但是這些永生化的生精細(xì)胞系在體外培養(yǎng)環(huán)境中往往還是停留在精母細(xì)胞階段，不能完成精子發(fā)生的全過程?；蚯贸夹g(shù)是研究精子發(fā)生相關(guān)基因的功能的最常用的方法之一，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大量基因的研究，而且，如果目的基因定位于Y染色體上，或者目的基因單倍劑量不足，或?qū)е戮硬荒馨l(fā)生或功能不正常，均會(huì)導(dǎo)致雄性不育，也就無法以常規(guī)方法獲得基因敲除小鼠。因此，探索研究精子發(fā)生的新研究方法是急待解決的課題。
1994年，Brinster等首次通過曲細(xì)精管顯微注射的方法將供體小鼠的精原干細(xì)胞移植進(jìn)入不育的受體小鼠的睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，使受體小鼠恢復(fù)生精并產(chǎn)生供體基因型的成熟精子，這標(biāo)志了精原干細(xì)胞移植技術(shù)的建立。供體精原干細(xì)胞在注射入受體小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)之后，能夠被受體小鼠的Sertoli細(xì)胞識(shí)別接納，進(jìn)入sertoli細(xì)胞所形成的巢(niche)中，在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)增殖、分化，生成供體基因型的生精克隆。此后，精原干細(xì)胞移植研究日益成為闡明精子發(fā)生機(jī)制的有力工具。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的同源mRNA特異降解，從而導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)的現(xiàn)象。RNA干擾自其發(fā)現(xiàn)之日起就成為基因功能研究的一個(gè)重要工具，目前它已經(jīng)廣泛地用于線蟲、果蠅、小鼠、人以及植物的基因功能的研究，成為功能基因組學(xué)的重要手段之一。siRNA應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能研究后，由于它不能完全抑制目的基因的表達(dá)，大多數(shù)情況下只是導(dǎo)致目的基因表達(dá)量的顯著降低，因此這種方法也稱為knock down。雖然如此，siRNA產(chǎn)生的表型足以滿足基因功能的研究，因此在短短幾年時(shí)間內(nèi)，這種方法就成為基因功能研究的常規(guī)方法之一。但是迄今為止，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在體研究精子發(fā)生相關(guān)基因功能尚無成熟的技術(shù)和方法。
發(fā)明目的為了探索研究精子發(fā)生的新研究方法，本發(fā)明結(jié)合精原干細(xì)胞移植技術(shù)、RNA干擾技術(shù)和抗體注射技術(shù)，建立并完善了以小鼠睪丸顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，對(duì)闡明精子發(fā)生過程中的重要基因和蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
內(nèi)容與要求本發(fā)明首先成功地建立和完善了小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺(tái)。在該技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上成功建立了原代精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞株移植技術(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步應(yīng)用此平臺(tái)建立了體內(nèi)RNA干擾實(shí)驗(yàn)方法，在本發(fā)明建立的動(dòng)物模型中，原代供體生精細(xì)胞經(jīng)體外轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒敲減某基因?qū)⑵湟浦踩胄∈笄?xì)精管可連續(xù)進(jìn)行在體觀察。應(yīng)用該動(dòng)物模型在體驗(yàn)證了在精子發(fā)生過程中HSD-11基因可能和精原細(xì)胞自我更新和分化有關(guān)系。本發(fā)明建立了小鼠曲細(xì)精管顯微注射特異性抗體研究其相關(guān)基因?qū)影l(fā)生的影響的方法，通過該動(dòng)物模型，進(jìn)一步確證了rtSH3p13和RSD-9基因與精子頂體形成有密切關(guān)系。本發(fā)明建立的上述動(dòng)物模型為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)研究基因功能的新方法奠定了牢固的基礎(chǔ)。
該動(dòng)物模型達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1、本發(fā)明成功地建立和完善了以通過睪網(wǎng)穿刺注射為主要注射方法的小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺(tái)(圖1)。
2、本發(fā)明成功建立了原代精原干細(xì)胞移植技術(shù)(圖2、3、4)。
3、本發(fā)明成功建立了精原細(xì)胞系GC-1spg細(xì)胞的移植技術(shù)(圖5、6)。
4、本發(fā)明應(yīng)用精原干細(xì)胞移植技術(shù)平臺(tái)建立了實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)RNA干擾的動(dòng)物模型，在該動(dòng)物模型中，原代供體生精細(xì)胞經(jīng)體外轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒敲減某基因?qū)⑵湟浦踩胄∈笄?xì)精管可連續(xù)進(jìn)行在體觀察。應(yīng)用該動(dòng)物模型在體驗(yàn)證了在精子發(fā)生過程中HSD-11基因可能和精原細(xì)胞自我更新和分化有關(guān)系(圖7、8)。
5、本發(fā)明建立了小鼠曲細(xì)精管顯微注射特異性抗體研究其相關(guān)基因?qū)影l(fā)生的影響的動(dòng)物模型，通過該動(dòng)物模型，進(jìn)一步確證了rtSH3p13和RSD-9基因與精子頂體形成有密切關(guān)系(圖9、10、11)。


圖1小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射操作1顯微注射針穿刺睪丸網(wǎng)；2在睪丸表面可觀察到含有臺(tái)盼蘭的液體注射時(shí)沿著曲細(xì)精管的走向而流動(dòng)；3通過睪網(wǎng)注射后睪丸表面90％的曲細(xì)精管充滿注射液體。
圖2用于精原干細(xì)胞移植的受體小鼠準(zhǔn)備與供體細(xì)胞的制備1Busulfan處理后的睪丸體積變化。正常小鼠睪丸，生精過程旺盛(1a)；Busulfan 40mg/kg，腹腔注射一次，4周后小鼠睪丸(1b)；Busulfan 10～15mg/kg，2次腹腔注射，間隔14～16天，第一次注射4周后小鼠睪丸(1c)。
2Busulfan處理4周后的小鼠睪丸切片HE染色。正常小鼠睪丸(2a)；Busulfan 40mg/kg，腹腔注射一次，4周后小鼠睪丸，大部分曲細(xì)精管內(nèi)只有Sertoli細(xì)胞，內(nèi)源生精細(xì)胞被去除(2b)；Busulfan10～15mg/kg，2次腹腔注射，間隔14～16天，第一次注射4周后小鼠睪丸，曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少，管腔內(nèi)的成熟精子明顯減少，但是各個(gè)管腔內(nèi)都可以見到少量成熟精子，生精過程明顯減弱(2c)。
3從胚胎小鼠睪丸分離供體細(xì)胞。15天小鼠胚胎(3a)；15天小鼠胚胎的睪丸和卵巢，左側(cè)為睪丸；右側(cè)為卵巢(3b)；細(xì)胞移植之前以PKH26標(biāo)記細(xì)胞膜，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞染色均勻，染色較強(qiáng)(3c)。
圖3精原干細(xì)胞移植后2mon在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)定位、增殖圖中a、b、c分別是實(shí)驗(yàn)組(1、2)和對(duì)照組(3)睪丸冰凍切片的熒光、相差和二者的疊加圖。
1實(shí)驗(yàn)組睪丸冰凍切片，曲細(xì)精管橫切面，紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，形成單細(xì)胞層；2實(shí)驗(yàn)組睪丸冰凍切片，曲細(xì)精管縱切面，紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，并面向管腔生長；3對(duì)照組冰凍切片，曲細(xì)精管內(nèi)沒有紅色熒光陽性的細(xì)胞。
圖4精原干細(xì)胞移植后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)已經(jīng)發(fā)生分化形成生精克隆1精原干細(xì)胞移植后2mon在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)已經(jīng)發(fā)生了分化。曲細(xì)精管縱切面，紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，并面向管腔生長形成細(xì)胞團(tuán)(1a)；同一張切片同一位置的HE染色圖(1b)；1b圖內(nèi)方框內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的放大圖，該細(xì)胞具有精母細(xì)胞或者圓形精子細(xì)胞以及變形期精子細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(1c)。
2精原干細(xì)胞移植后4.5mon在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)分化產(chǎn)生成熟精子。圖中2a、2b、2c分別是PKH26、Hoechst33258染細(xì)胞核和二者疊加圖。激光共聚焦顯微鏡觀察紅色熒光陽性的曲細(xì)精管，顯示在精原干細(xì)胞移植4.5mon后，供體細(xì)胞已經(jīng)在受體曲細(xì)精管內(nèi)增殖分化，形成生精克隆，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)，可以找到各期生精細(xì)胞，包括成熟精子。
3 精原干細(xì)胞移植后7mon在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)形成生精旺盛的成熟生精克隆。圖中3a、3b、3c分別是PKH26、Hoechst33258染色的細(xì)胞核和二者疊加圖。供體細(xì)胞在受體曲細(xì)精管內(nèi)形成了旺盛的生精克隆，曲細(xì)精管更加飽滿，形態(tài)與正常曲細(xì)精管一致。
圖5GC-1spg細(xì)胞移植后2mon、3.5mon在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)定位、增殖圖中a、b、c分別是GC-1spg細(xì)胞移植后2mon、3.5mon受體小鼠睪丸冰凍切片的熒光、相差和二者的疊加圖。
1GC-1spg細(xì)胞移植后2mon，受體小鼠睪丸冰凍切片，紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，形成單細(xì)胞層(1a、1b、1c)；2GC-1spg細(xì)胞移植后3.5mon，受體小鼠睪丸冰凍切片睪丸冰凍切片，紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，部分曲細(xì)精管內(nèi)充滿陽性細(xì)胞(2a、2b、2c)。
圖6GC-1spg細(xì)胞移植后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)生長分化情況1GC+1spg細(xì)胞移植后2mon、3.5mon在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)生長分化情況。1a、1b、1c分別是對(duì)照組、GC-1spg細(xì)胞移植后2mon取材、GC-1spg細(xì)胞移植3.5mon后取材的睪丸曲細(xì)精管冰凍切片橫切面，激光共聚焦顯微鏡圖。對(duì)照組睪丸曲細(xì)精管橫切面，內(nèi)源生精被Busulfan破壞后尚未恢復(fù)，曲細(xì)精管內(nèi)沒有精子發(fā)生過程(1a)；GC-1spg細(xì)胞移植后2mon，受體小鼠睪丸曲細(xì)精管橫切面，紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，形成單細(xì)胞層，部分紅色熒光陽性細(xì)胞面向管腔生長，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)，該細(xì)胞團(tuán)類似生精克隆(1b)；GC-1spg細(xì)胞移植后3.5mon，受體小鼠睪丸曲細(xì)精管橫切面，供體細(xì)胞已經(jīng)在受體曲細(xì)精管內(nèi)增殖分化，形成生精旺盛的生精克隆，曲細(xì)精管生精上皮飽滿，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)，可以找到各期生精細(xì)胞(1c)；1c圖中方框內(nèi)位置的相差圖，可觀察到成熟精子尾(1d)。
2GC-1spg細(xì)胞移植3.5mon后，受體睪丸冰凍切片固定后以Hoechst33258染細(xì)胞核，F(xiàn)ITC-PNA染精子頂體，激光共聚焦顯微鏡觀察圖。曲細(xì)精管橫切面，在紅色熒光陽性的細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)中，觀察到精子頂體染色陽性(2a)；2a圖中方框部分的放大圖，清晰顯示紅色熒光陽性的精子細(xì)胞(2b)。
圖7western blot檢測(cè)RNA干擾質(zhì)粒對(duì)精原細(xì)胞系內(nèi)源HSD-11的RNA干擾作用1、2是轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11組；3是轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/Hygro-negtive組；4是沒有轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的GC-1spg組。1、2、3的GFP條帶亮度相同，提示轉(zhuǎn)染效率是相同的；1、2的HSD-11的條帶亮度明顯低于3、4的條帶亮度，提示pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11對(duì)精原細(xì)胞系GC-1spg的內(nèi)源HSD-11有明顯的敲減作用。
圖8敲減HSD-11影響供體精原干細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)的定位與增殖行為
1RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胚胎小鼠睪丸細(xì)胞。1a、1b、1c分別是同一視野的小鼠胚胎睪丸細(xì)胞以PKH26熒光標(biāo)記、以NucleofectorTM轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/-ygro-HSD-11質(zhì)粒，培養(yǎng)8h后的相差和熒光圖像。相差圖像，提示細(xì)胞狀態(tài)良好(1a)；PKH26標(biāo)記細(xì)胞，紅色熒光明亮均勻(1b)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，達(dá)到60～70％(1c)；2敲減HSD-11影響供體精原干細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)的定位與增殖行為。2a、2b、2c分別是對(duì)照組和試驗(yàn)組的熒光、相差、二者疊加圖像。對(duì)照組，曲細(xì)精管橫切面，供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/Hygro-negtive質(zhì)粒后移植2mon(2a)；實(shí)驗(yàn)組，分別是曲細(xì)精管橫切面和縱切面，供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11質(zhì)粒后移植2mon，供體細(xì)胞的生長分化行為異常(2b、2c)。
圖9注射rtSH3p13抗體5天后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組睪丸組織HE染色圖分別是注射免疫前血清的對(duì)照組和注射rtSH3p13抗體的實(shí)驗(yàn)組的睪丸組織結(jié)構(gòu)，冰凍切片，4％甲醛固定，HE染色，顯微鏡照像，放大×450。
1注射免疫前血清的對(duì)照組和注射抗體的實(shí)驗(yàn)組的睪丸切片中，都可以觀察到三種不同的曲細(xì)精管管腔；2極度擴(kuò)張的管腔箭頭所示對(duì)照組精子發(fā)生正常；實(shí)驗(yàn)組精子發(fā)生紊亂，精子細(xì)胞減少；3中度擴(kuò)張的管腔箭頭所示對(duì)照組精子發(fā)生正常；實(shí)驗(yàn)組精子發(fā)生紊亂，有精子細(xì)胞壞死；4附睪腔對(duì)照組有數(shù)量較多的正常成熟精子；實(shí)驗(yàn)組附睪內(nèi)的精子數(shù)量減少，而且可觀察到脫落的圓形精子細(xì)胞。
圖10注射rtSH3p13抗體特異性影響精子頂體實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的睪丸冰凍切片固定后以Hoechst33258染細(xì)胞核，然后以FITC-PNA染精子頂體，激光共聚焦顯微鏡下觀察1對(duì)照組所有的曲細(xì)精管內(nèi)精子頂體染色都很強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組頂體的染色明顯減少減弱，尤其在一些極度擴(kuò)張的管腔內(nèi)(×100)；2在擴(kuò)張管腔內(nèi)，對(duì)照組頂體形態(tài)正常；實(shí)驗(yàn)組很多精子頂體形態(tài)不正常，可觀察到一些點(diǎn)狀的頂體解體現(xiàn)象(×600)；3對(duì)照組附睪內(nèi)精子的頂體正常；實(shí)驗(yàn)組附睪內(nèi)不但成熟精子數(shù)量少，而且大部分精子頂體缺失(×600)；圖11注射RSD-9抗體可能影響精子頂體形成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的睪丸冰凍切片固定后以Hoechst33258染細(xì)胞核，然后以FITC-PNA染精子頂體，激光共聚焦顯微鏡下觀察(×600)1注射免疫前血清的對(duì)照組的一個(gè)擴(kuò)張曲細(xì)精管管腔，精子頂體染色很強(qiáng)，形態(tài)正常；2注射RSD-9抗體組的一個(gè)擴(kuò)張曲細(xì)精管管腔，精子頂體染色明顯減弱；3注射RSD-9抗體組的一個(gè)未擴(kuò)張的曲細(xì)精管管腔，精子頂體染色與對(duì)照相同。
實(shí)施例1、建立和完善了以通過睪網(wǎng)穿刺注射為主要注射方法的小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺(tái)顯微注射針穿刺曲細(xì)精管一共有三種位點(diǎn)1、將穿刺針直接穿刺入曲細(xì)精管，被注射的液體能夠從針的尖端向曲細(xì)精管的雙向流動(dòng)，但是向前方的流動(dòng)更快，液體在管腔內(nèi)流動(dòng)，常?？梢缘竭_(dá)睪網(wǎng)，并通過睪網(wǎng)進(jìn)入其他的曲細(xì)精管；2、將穿刺針穿刺進(jìn)入位于睪丸與附睪頭之間的輸出管，并向睪丸方向進(jìn)入3～5mm，穿刺針內(nèi)的壓力使液體流入睪網(wǎng)，并充盈大部分或者全部的曲細(xì)精管；3、將穿刺針刺入睪網(wǎng)，睪網(wǎng)是一個(gè)較小的池狀區(qū)域，位于睪丸被膜的正下方，連通所有曲細(xì)精管的末端，細(xì)胞懸液通過睪網(wǎng)能進(jìn)入所有的曲細(xì)精管內(nèi)。三種穿刺位點(diǎn)都能夠順利注射成功。
經(jīng)過比較，通過睪網(wǎng)穿刺注射一次就能夠充盈大部分曲細(xì)精管管腔，而且熟練掌握后手術(shù)時(shí)間較短，所以選擇該方法作為本發(fā)明的主要注射方法。該方法需要準(zhǔn)確掌握睪網(wǎng)的解剖位置，睪網(wǎng)主要位于和睪丸表面連接的血管叢的正下方，血管叢最明顯的是大靜脈，最易接近睪網(wǎng)的位點(diǎn)是血管叢的正下方。較厚的被膜覆蓋了睪網(wǎng)表面的大部分區(qū)域，但是一個(gè)小區(qū)域延伸出了血管叢的下方，此處被膜較薄，睪丸輸出小管和此區(qū)域相連，所以，我們可以觀察輸出小管與睪丸表面的連接處來定位睪網(wǎng)。在小鼠，輸出小管在一個(gè)很小的區(qū)域進(jìn)入睪網(wǎng)，這為我們提供了初步的位點(diǎn)標(biāo)志。注射時(shí)，穿刺針刺入血管叢的正下方緊鄰輸出小管的地方，穿刺針幾乎與睪丸表面平行(小于30度角)。因?yàn)椴G網(wǎng)的深度只有0.2mm或者更少，如果角度過大或者穿刺過深的話，穿刺針將會(huì)刺穿睪網(wǎng)在睪丸內(nèi)的邊界，細(xì)胞懸液將會(huì)滲漏入曲細(xì)精管之間的區(qū)域，而不是進(jìn)入曲細(xì)精管腔內(nèi)。一旦針尖刺入睪網(wǎng)內(nèi)，增加注射壓力使液體流入睪網(wǎng)并流向曲細(xì)精管，注射成功后可以充盈雙側(cè)睪丸表面50％～100％的曲細(xì)精管。(圖1)2、精原干細(xì)胞移植技術(shù)的建立2.1用于精原干細(xì)胞移植的受體小鼠準(zhǔn)備與供體細(xì)胞的制備精原干細(xì)胞移植的基本方法就是利用顯微注射的方法將供體小鼠的睪丸細(xì)胞注射進(jìn)入受體小鼠的睪丸曲細(xì)精管中，從而誘導(dǎo)受體睪丸曲細(xì)精管管腔內(nèi)出現(xiàn)供體精子發(fā)生。
為了提高生精干細(xì)胞移植的成功率，要清除受體小鼠內(nèi)源的生精細(xì)胞，為植入的供體精原干細(xì)胞提供一個(gè)開放的巢(niche)，以利于供體細(xì)胞在曲細(xì)精管內(nèi)的定位和生精克隆的形成。使用Busulfan處理供體小鼠能夠破壞內(nèi)源生精細(xì)胞，Busulfan是一種抗癌藥物，不但能夠破壞精原干細(xì)胞，也能夠破壞造血干細(xì)胞，所以Busulfan處理后的小鼠易發(fā)生貧血而死亡，找到最佳的處理方法可以在較好地破壞內(nèi)源生精細(xì)胞的基礎(chǔ)上盡可能降低死亡率。本發(fā)明采取兩種Busulfan處理方法1)40mg/kg，腹腔注射一次；2)10～15mg/kg，2次腹腔注射，間隔14～16天。第一次注射4周后取小鼠睪丸，觀察睪丸大小變化，并作組織切片觀察生精變化。Busulfan處理后4周，第一組有接近30％的小鼠在注射兩周內(nèi)死亡，兩周后仍然存活的小鼠不會(huì)再發(fā)生死亡，小鼠睪丸體積明顯縮小；第二組小鼠死亡率為0，小鼠睪丸體積也有比較明顯的縮小(圖2.1)。
睪丸切片做HE染色后，顯微鏡下觀察并拍照。正常小鼠睪丸曲細(xì)精管可見各級(jí)生精細(xì)胞，管腔內(nèi)有大量成熟精子，生精上皮厚，生精旺盛。Busulfan 40mg/kg腹腔注射一次，4周后小鼠睪丸切片經(jīng)過HE染色后觀察，多數(shù)曲細(xì)精管內(nèi)只剩下Sertoli細(xì)胞，由于生精細(xì)胞缺失，包裹生精細(xì)胞的Sertoli細(xì)胞間形成較大空隙，曲細(xì)精管上皮很薄，僅僅在極少數(shù)的地方可見少量成熟精子。Busulfan 10～15mg/kg 2次腹腔注射4周后小鼠睪丸切片經(jīng)過HE染色后觀察，曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少，生精上皮較薄，管腔內(nèi)的成熟精子明顯減少，但是各個(gè)管腔內(nèi)都可以見到少量成熟精子，生精過程明顯減弱。鑒定結(jié)果表明，Busulfan40mg/kg腹腔注射一次組對(duì)內(nèi)源性生精干細(xì)胞的去除更加充分，滿足實(shí)驗(yàn)的要求，因此，決定在后續(xù)試驗(yàn)中采取該劑量制備受體小鼠(圖2.2)。
從胚胎小鼠和新生小鼠(胚胎15天～出生3天)的睪丸中分離細(xì)胞，作為精原干細(xì)胞移植的供體細(xì)胞。該階段的小鼠睪丸內(nèi)的的生精細(xì)胞只有未分化的精原干細(xì)胞和A型精原細(xì)胞，雖然從胚胎小鼠和新生小鼠睪丸中分離的細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)少，但是有效的細(xì)胞多，適合作為移植供體細(xì)胞。分離胚胎小鼠睪丸和去除睪丸白膜都在解剖顯微鏡下操作，因?yàn)榕咛バ∈蟛G丸和卵巢的位置、形態(tài)相似，因此分離時(shí)需要仔細(xì)區(qū)分。在細(xì)胞移植之前以PKH26標(biāo)記細(xì)胞膜，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞染色均勻，染色較強(qiáng)(圖2.3)。
細(xì)胞分離方法如下1)在無菌室內(nèi)將懷孕母鼠處死后，以碘伏消毒下腹部，剪開皮膚迅速取出小鼠胚胎，置于盛有D-Hanks液的小平皿中。如果是新生小鼠的話，將小鼠斷頭處死后放入盛有D-Hanks液的小平皿中，清洗去除血液。
2)在解剖顯微鏡下打開腹腔，仔細(xì)分離雄性小鼠胚胎的睪丸，置于盛有D-Hanks液的小平皿中，去除睪丸白膜。
3)在超凈臺(tái)中，用小鑷子將睪丸組織盡量分散，吸入小管內(nèi)，離心后保留小量D-Hanks液，用小玻璃杵盡可能分散組織。
4)離心棄去D-Hanks液，加入膠原酶溶液，36℃孵育10～15min。
7)離心棄去消化液，加入D-Hanks液用加樣器用力吹打，使細(xì)胞重新懸浮。
8)用300目的濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。胚胎生殖腺的體細(xì)胞比生精干細(xì)胞小，所以此步不能把體細(xì)胞除去，但可除去細(xì)胞團(tuán)塊。
9)D-Hanks液洗滌細(xì)胞，DMEM重懸。
PKH26紅色熒光染料標(biāo)記細(xì)胞方法如下1)反應(yīng)體系總體系1ml，細(xì)胞濃度105～106/ml，PKH26 dye 10×10-6M。
2)將細(xì)胞重懸于500μl Diluent C中，確保細(xì)胞為單細(xì)胞懸液。
以Diluent C制備500μl的20×10-6M的PKH26 dye(原液濃度為1×10-3M，稀釋50倍后成為20×10-6M。即490μl的Diluent C+10μl的PKH26 dye原液)3)快速將細(xì)胞懸液加入PKH26 dye溶液中，迅速混合。25℃孵育2～5min，不斷翻轉(zhuǎn)反應(yīng)管以混合液體。
4)加入等體積的FBS(1ml)終止反應(yīng)。
5)以等體積的培養(yǎng)基(2ml DMEM，10％FBS)稀釋反應(yīng)體系，400g×10min離心。
6)將細(xì)胞移至新管，以培養(yǎng)基(DMEM，10％FBS)洗3遍。
7)以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入臺(tái)盼藍(lán)使其終濃度為0.4mg/ml。細(xì)胞置于冰上等待注射(2h之內(nèi)注射)。
8)取少量細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光強(qiáng)度和染色是否均勻。
基本手術(shù)操作如下將麻醉好的小鼠仰臥于操作臺(tái)上，固定好四肢，以碘酒消毒腹部皮膚，行腹部正中切口，約1～1.5cm，手術(shù)切口周圍鋪消毒紗布，用小鑷子輕輕夾出一側(cè)睪丸。以小鑷子固定睪丸，使睪丸白膜保持一定的張力。將玻璃穿刺針固定于持針器上，持針器與Eppendorf壓力注射器相連接，通過Eppendorf顯微注射器吸入注射的液體備用，在解剖顯微鏡下完成小鼠曲細(xì)精管顯微注射，注射完畢后將小鼠睪丸放同腹腔，對(duì)側(cè)睪丸作為對(duì)照?？p合手術(shù)切口，縫合處再次以碘酒消毒，小鼠移回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。
2.2精原干細(xì)胞移植后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)定位、增殖精原干細(xì)胞移植后，受體小鼠睪丸分別在2mon、4.5mon、7mon取材鑒定。每個(gè)取材睪丸做20～30張連續(xù)冰凍切片，為防止PKH26熒光染料減弱，冰凍切片不做固定，直接在熒光顯微鏡下觀察。觀察結(jié)果顯示，在所有的受體睪丸切片中全部觀察到了PKH26熒光陽性的細(xì)胞，紅色熒光陽性的細(xì)胞定位于曲細(xì)精管管腔內(nèi)，證明供體精原干細(xì)胞能夠在受體睪丸內(nèi)定位、生存，移植成功率達(dá)到100％。
圖3所示為精原干細(xì)胞移植2mon后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)定位、增殖。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠睪丸冰凍切片中，睪丸血管上皮細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞位于曲細(xì)精管之間，有微弱的自發(fā)熒光，但是該熒光較弱，而且在綠色激發(fā)光和藍(lán)色激發(fā)光下觀察，發(fā)光強(qiáng)度是相同的，所以很容易與PKH26標(biāo)記的特異性紅色熒光相區(qū)別。對(duì)照組小鼠睪丸冰凍切片的曲細(xì)精管管腔內(nèi)沒有紅色熒光陽性的細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)組，所有的受體睪丸切片中全部觀察到了PKH26熒光陽性的細(xì)胞，紅色熒光陽性的細(xì)胞定位于曲細(xì)精管管腔內(nèi)。在每一個(gè)睪丸切片中，含有陽性細(xì)胞的曲細(xì)精管占50％以上，大部分紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，形成單細(xì)胞層，部分管腔內(nèi)可觀察到紅色熒光陽性細(xì)胞面向管腔生長，形成細(xì)胞團(tuán)，證明供體細(xì)胞在移植2mon后已經(jīng)在受體睪丸內(nèi)定位、增殖。
2.3精原干細(xì)胞移植后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)已經(jīng)發(fā)生分化形成生精克隆為了進(jìn)一步明確供體細(xì)胞移植2mon后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)是否已經(jīng)發(fā)生分化，將冰凍切片在熒光顯微鏡下詳細(xì)拍照記錄曲細(xì)精管內(nèi)紅色熒光陽性的細(xì)胞團(tuán)的位置和形態(tài)，然后將該切片做HE染色，觀察陽性細(xì)胞形成的克隆的生精情況。結(jié)果HE染色后，在紅色熒光較強(qiáng)的陽性細(xì)胞位置上找到細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞具有精母細(xì)胞或者圓形精子細(xì)胞以及變形期精子細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，證明移植的細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了分化，但未見成熟精子。(圖4)PKH26穩(wěn)定標(biāo)記于細(xì)胞膜的脂質(zhì)鏈上，細(xì)胞分裂后平均分配到子代細(xì)胞，隨著細(xì)胞的不斷分裂將會(huì)不斷稀釋，所以在移植4.5mon、7mon后紅色熒光略有減弱。將冰凍切片在熒光顯微鏡下詳細(xì)拍照記錄曲細(xì)精管內(nèi)紅色熒光陽性的曲細(xì)精管的位置和形態(tài)，然后將該切片固定后以Hoechst染細(xì)胞核后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。如圖4所示，在精原干細(xì)胞移植4.5mon后，供體細(xì)胞已經(jīng)在受體曲細(xì)精管內(nèi)增殖分化，形成生精克隆。根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)，可以找到各期生精細(xì)胞，包括成熟精子；相差顯微鏡觀察到陽性克隆的管腔內(nèi)成熟精子尾。在精原干細(xì)胞移植7mon后，供體細(xì)胞在受體曲細(xì)精管內(nèi)形成了旺盛的生精克隆，曲細(xì)精管更加飽滿，形態(tài)與正常曲細(xì)精管一致。本發(fā)明成功建立了精原干細(xì)胞移植技術(shù)。
3、精原細(xì)胞系GC-1spg移植后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)恢復(fù)分化能力以Busulfan 40mg/kg腹腔注射后3～5周雄性小鼠為受體小鼠，以精原細(xì)胞系GC-1spg作為供體細(xì)胞，PKH26紅色熒光標(biāo)記后通過精原干細(xì)胞移植的方法移植回睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，受體小鼠睪丸分別在2mon、4.5mon取材鑒定。取材方法和鑒定方法同精原干細(xì)胞移植的方法，觀察結(jié)果顯示，在所有的受體睪丸切片中全部觀察到了PKH26熒光陽性的細(xì)胞，紅色熒光陽性的細(xì)胞定位于曲細(xì)精管管腔內(nèi)，證明GC-1spg細(xì)胞能夠在受體睪丸內(nèi)存活。
從移植2mon睪丸冰凍切片中隨機(jī)選取30張觀察，在每個(gè)睪丸切面中有至少20％的曲細(xì)精管管腔含有紅色熒光陽性的細(xì)胞；從移植3.5mon睪丸冰凍切片中隨機(jī)選取40張觀察，在每個(gè)睪丸切面中有接近60％的曲細(xì)精管管腔含有紅色熒光陽性的細(xì)胞。GC-1spg細(xì)胞移植2mon后觀察睪丸曲細(xì)精管冰凍切片，大部分紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，形成單細(xì)胞層；移植后3.5mon觀察受體小鼠睪丸冰凍切片睪丸冰凍切片，大部分紅色熒光陽性細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜分布，但是其中有部分曲細(xì)精管內(nèi)充滿陽性細(xì)胞，提示細(xì)胞已經(jīng)開始面向管腔生長。(圖5)將冰凍切片在熒光顯微鏡下詳細(xì)拍照記錄曲細(xì)精管內(nèi)紅色熒光陽性的曲細(xì)精管的位置和形態(tài)，然后將該切片固定后以Hoechst染細(xì)胞核后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。在GC-1spg細(xì)胞移植2mon后，供體細(xì)胞已經(jīng)沿著受體睪丸的曲細(xì)精管基底膜增殖，形成單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞定位的位置相當(dāng)于精原干細(xì)胞所處的niche中，部分管腔內(nèi)可觀察到紅色熒光陽性細(xì)胞面向管腔生長，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)，該細(xì)胞團(tuán)類似生精克隆。在GC-1spg細(xì)胞移植3.5mon后，供體細(xì)胞已經(jīng)在受體曲細(xì)精管內(nèi)增殖分化，形成生精旺盛的生精克隆，曲細(xì)精管生精上皮飽滿，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)，可以找到各期生精細(xì)胞，包括成熟精子(圖24C)；相差顯微鏡觀察到陽性克隆的管腔內(nèi)成熟精子尾。
為了進(jìn)一步明確GC-1spg細(xì)胞移植后3.5mon在受體睪丸曲細(xì)精管內(nèi)確實(shí)增殖分化生成成熟精子，將GC-1spg細(xì)胞移植后3.5mon受體睪丸冰凍切片固定后以Hoechst33258染細(xì)胞核，然后以FITC-conjugatedPeanut agglutinin(PNA)染精子頂體，激光共聚焦顯微鏡下觀察，在紅色熒光陽性的細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)中，觀察到精子頂體染色陽性，證明GC-1spg細(xì)胞移植后3.5mon在受體睪丸曲細(xì)精管內(nèi)已經(jīng)生成成熟精子。(圖6)4、應(yīng)用精原干細(xì)胞移植技術(shù)平臺(tái)建立了實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)RNA干擾的動(dòng)物模型，應(yīng)用該動(dòng)物模型在體驗(yàn)證了在精子發(fā)生過程中HSD-11基因可能和精原細(xì)胞自我更新和分化有關(guān)選擇HSD-11基因?yàn)檠芯磕康幕?，HSD11基因是本實(shí)驗(yàn)室從人睪丸cDNA文庫中克隆到的一個(gè)新基因，該基因定位于人15號(hào)染色體。前期研究提示，HSD11基因可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-xL的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因子的敏感性。選擇pRNAT-H1.1/Hygro載體來構(gòu)建RNAi質(zhì)粒載體。該載體以H1為啟動(dòng)子表達(dá)siRNA，同時(shí)表達(dá)GFP，便于檢測(cè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明的前期工作已經(jīng)篩選出HSD-11的RNA干擾靶點(diǎn)，根據(jù)該靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA，構(gòu)建入pRNAT-H1.1/Hygro載體。序列兩端帶有BamH I和HindIII的酶切位點(diǎn)粘端，便于克隆入質(zhì)粒載體。載體構(gòu)建成功，測(cè)序正確。
將構(gòu)建好的pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11和pRNAT-H1.1/Hygo-negtive質(zhì)粒大量提取后轉(zhuǎn)染精原細(xì)胞系GC-1spg，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，western blot檢測(cè)pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11對(duì)精原細(xì)胞系GC-1spg的內(nèi)源HSD-11的敲減作用。western blot結(jié)果顯示pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11對(duì)精原細(xì)胞系GC-1spg的內(nèi)源HSD-11有明顯的敲減作用(圖7)。
分離小鼠胚胎睪丸細(xì)胞，以PKH26熒光標(biāo)記后，以NucleofectorTM分別將pRNAT-H11/Hygro一HSD-11和pRNAT-H1.1/Hygro-negtive質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎睪丸細(xì)胞中，然后培養(yǎng)過夜，第二天在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，然后重新將細(xì)胞消化下來后移植入受體小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，移植2mon后將受體小鼠睪丸取材鑒定。Nucleofector technology是一種特殊的電轉(zhuǎn)技術(shù)，根據(jù)不同的細(xì)胞類型選擇相應(yīng)的電轉(zhuǎn)試劑和電轉(zhuǎn)程序操作，這種方法有很多優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)染效率非常高，尤其適用于以常規(guī)轉(zhuǎn)染方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；外源DNA被直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，所以從轉(zhuǎn)染到外源DNA表達(dá)所需要的時(shí)間非常短，大部分細(xì)胞只需要2～4h；操作容易，只需選擇最佳的電轉(zhuǎn)試劑和電轉(zhuǎn)程序操作；對(duì)細(xì)胞的損害非常小，最大限度降低了轉(zhuǎn)染過程對(duì)細(xì)胞的不良影響。小鼠胚胎睪丸細(xì)胞以PKH26熒光標(biāo)記、以NucleofectorTM轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)8h后熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，PKH26標(biāo)記的紅色熒光明亮均勻，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，達(dá)到60～70％(圖8.1)。試驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/Hygro-HSD-11質(zhì)粒，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/Hygro-negtive質(zhì)粒。
細(xì)胞移植2mon后取材鑒定，熒光顯微鏡下觀察睪丸冰凍切片，在陰性對(duì)照組，供體細(xì)胞大多在曲細(xì)精管內(nèi)增殖形成單細(xì)胞層，在每個(gè)睪丸切面中大約有10％的管腔含有供體細(xì)胞增殖形成的單細(xì)胞層；在實(shí)驗(yàn)組，也可以觀察到曲細(xì)精管管腔含有供體細(xì)胞增殖形成的單細(xì)胞層，平均數(shù)量高于對(duì)照組，在每個(gè)睪丸切面中大約有15～20％的管腔含有供體細(xì)胞增殖形成的單細(xì)胞層。在實(shí)驗(yàn)組睪丸切片中，觀察到某些曲細(xì)精管內(nèi)出現(xiàn)一些紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞團(tuán)，這些細(xì)胞團(tuán)所在的曲細(xì)精管管腔內(nèi)沒有供體細(xì)胞增殖形成的單細(xì)胞層，說明供體細(xì)胞的生長分化行為異常。觀察結(jié)果提示，敲減HSD-11后影響精子發(fā)生的早期階段即精原細(xì)胞的增殖，供體精原干細(xì)胞在HSD-11敲減后，在受體曲細(xì)精管內(nèi)存活，并能通過減數(shù)分裂發(fā)育成圓形精子細(xì)胞，但是，由于自我更新的能力被抑制，故曲細(xì)精管基底部細(xì)胞缺失。本研究初步提示，HSD-11可能在精子發(fā)生過程中調(diào)控細(xì)胞的增殖。(圖8.2)本發(fā)明應(yīng)用精原干細(xì)胞移植技術(shù)平臺(tái)建立了實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)RNA干擾的動(dòng)物模型，在該動(dòng)物模型中，原代供體生精細(xì)胞經(jīng)體外轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒敲減某基因?qū)⑵湟浦踩胄∈笄?xì)精管可連續(xù)進(jìn)行在體觀察。
5、建立了小鼠曲細(xì)精管顯微注射特異性抗體研究其相關(guān)基因?qū)影l(fā)生的影響的動(dòng)物模型，通過該動(dòng)物模型，進(jìn)一步確證了rtSH3p13和RSD-9基因與精子頂體形成有密切關(guān)系本發(fā)明探索了小鼠曲細(xì)精管顯微注射相關(guān)基因特異性抗體對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因功能的研究方法。選擇rtSH3p13基因和RSD-9基因作為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明二者是在精子發(fā)生晚期表達(dá)并發(fā)揮其功能的基因，很可能在頂體形成中發(fā)揮作用。
本發(fā)明通過小鼠曲細(xì)精管顯微注射的方法研究了rtSH3p13和RSD-9的兔多克隆抗體對(duì)精子發(fā)生的影響。實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸曲細(xì)精管分別注射rtSH3p13和RSD-9的兔多克隆抗體，注射劑量為10μ1。由于精子發(fā)生對(duì)睪丸微環(huán)境的變化比較敏感，所以手術(shù)操作和曲細(xì)精管顯微注射本身會(huì)影響睪丸微環(huán)境，進(jìn)而對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生非特異性的影響；此外，血清中的其他成分也可能對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生非特異性的影響；不同小鼠的生精狀況也存在個(gè)體差異性。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立3種對(duì)照1、自體對(duì)照以免疫前血清注射實(shí)驗(yàn)組小鼠的對(duì)側(cè)睪丸；2、異體對(duì)照以免疫前血清注射對(duì)照組小鼠的睪丸；3、非注射對(duì)照正常小鼠睪丸，不做曲細(xì)精管顯微注射。分別在抗體注射后5天、15天取材鑒定。
抗體注射5天后小鼠睪丸石蠟切片做HE染色后顯微鏡下觀察，在注射免疫前血清的對(duì)照組和注射抗體的實(shí)驗(yàn)組的睪丸切片中，可以觀察到三種不同的曲細(xì)精管管腔1)極度擴(kuò)張的管腔注射時(shí)液體流入管腔，壓力使管腔在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生擴(kuò)張；2)中度擴(kuò)張的管腔在注射后，注射液體由極度擴(kuò)張的管腔內(nèi)不斷流入，引起管腔中度擴(kuò)張；3)輕度擴(kuò)張或者基本未擴(kuò)張的管腔注射液體微量滲入或者未滲入。觀察發(fā)現(xiàn)，在注射免疫前血清的對(duì)照組睪丸切片中，輕度擴(kuò)張或者基本未擴(kuò)張的管腔內(nèi)精子發(fā)生是正常的；在擴(kuò)張的曲細(xì)精管內(nèi)，生精上皮的細(xì)胞層因?yàn)楣芮坏臄U(kuò)張而變薄，但是精子發(fā)生各期細(xì)胞的形態(tài)以及生精克隆的細(xì)胞排列都沒有受到影響，沒有觀察到細(xì)胞的缺失和壞死；附睪內(nèi)有數(shù)量較多的正常成熟精子。上述鑒定結(jié)果證明，注射免疫前血清的對(duì)照組除了部分曲細(xì)精管發(fā)生擴(kuò)張之外，精子發(fā)生過程沒有受到明顯的影響。與對(duì)照組有顯著差異，在注射rtSH3p13抗體的實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸切片中，在擴(kuò)張的曲細(xì)精管內(nèi)，精子發(fā)生出現(xiàn)不同程度的紊亂。生精克隆的細(xì)胞排列紊亂，圓形精子、變形期精子和成熟精子都有所減少；在很多管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死現(xiàn)象，根據(jù)壞死細(xì)胞形態(tài)可初步判斷為精子細(xì)胞；附睪內(nèi)的精子數(shù)量減少，而且可觀察到脫落的壞死圓形精子細(xì)胞。該鑒定結(jié)果初步提示，rtSH3p13抗體影響了實(shí)驗(yàn)組小鼠的精子發(fā)生過程，尤其對(duì)精子細(xì)胞有較明顯的抑制和破壞作用。(圖9)為了驗(yàn)證rtSH3p13抗體是否特異性影響精子的頂體，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的睪丸冰凍切片固定后以Hoechst33258染細(xì)胞核，然后以FITC-conjugated Peanut agglutinin(PNA)染精子頂體，激光共聚焦顯微鏡下觀察。在對(duì)照組，我們觀察到所有的曲細(xì)精管內(nèi)精子頂體染色都很強(qiáng)，頂體形態(tài)正常，附睪內(nèi)精子的頂體也是正常的；而在實(shí)驗(yàn)組，頂體的染色明顯減少減弱，很多精子頂體形態(tài)不正常，可觀察到一些點(diǎn)狀的頂體解體現(xiàn)象，附睪內(nèi)不但成熟精子數(shù)量少，而且大部分精子頂體缺失。(圖10)RSD-9抗體注射組，經(jīng)過取材鑒定，曲細(xì)精管內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比沒有非常顯著的特異性改變，但是以FITC-PNA染精子頂體后發(fā)現(xiàn)RSD-9抗體注射組的頂體染色普遍較弱，尤其是在擴(kuò)張管腔內(nèi)；在同一張睪丸切片中的未擴(kuò)張管腔內(nèi)，精子頂體染色與對(duì)照組相似，說明頂體染色強(qiáng)度與細(xì)胞接觸到的抗體劑量有一定關(guān)系。該結(jié)果提示RSD-9抗體可能影響了精子頂體的形成。(圖11)該結(jié)果證明，小鼠曲細(xì)精管顯微注射抗體可望成為研究精子發(fā)生相關(guān)基因在體功能的，尤其是在精子發(fā)生晚期所表達(dá)基因的體內(nèi)檢測(cè)方法。通過該實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確證了rtSH3p13和RSD-9與精子頂體形成有密切關(guān)系。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明以小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)為技術(shù)平臺(tái)，結(jié)合精原干細(xì)胞移植技術(shù)、RNA干擾技術(shù)和抗體注射技術(shù)，建立并完善了以小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，對(duì)闡明精子發(fā)生過程中的重要基因和蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述發(fā)明，其特征在于精原干細(xì)胞移植的基本方法就是利用小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射的方法將供體小鼠的睪丸細(xì)胞注射進(jìn)入受體小鼠的睪丸曲細(xì)精管中，從而誘導(dǎo)受體睪丸曲細(xì)精管管腔內(nèi)出現(xiàn)供體精子發(fā)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述發(fā)明，其特征在于原代胚胎小鼠或新生小鼠睪丸細(xì)胞和精原細(xì)胞系GC-1spg能夠作為精原細(xì)胞移植的供體細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述發(fā)明，其特征在于供體細(xì)胞以PKH26熒光標(biāo)記后，以NucleofectorTM分別將RNAi質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到供體細(xì)胞中，然后移植入受體小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，移植2mon后將受體小鼠睪丸取材鑒定，通過分析供體細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)的精子發(fā)生特點(diǎn)，提示RNA干擾靶基因的功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述發(fā)明，其特征在于該動(dòng)物模型適于研究精子發(fā)生早期表達(dá)并發(fā)揮其功能的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述發(fā)明，其特征在于以小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射特異性抗體的方法能夠研究精子發(fā)生過程中相關(guān)基因功能和調(diào)控機(jī)制。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述發(fā)明，其特征在于該動(dòng)物模型適于研究精子發(fā)生晚期表達(dá)并發(fā)揮其功能的基因。
全文摘要
本發(fā)明為一種以小鼠睪丸顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，涉及該動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明結(jié)合精原干細(xì)胞移植技術(shù)、RNA干擾技術(shù)和抗體注射技術(shù)，建立并完善了以小鼠睪丸顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，對(duì)闡明精子發(fā)生過程中的重要基因和蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。應(yīng)用小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)和原代精原干細(xì)胞移植技術(shù)為平臺(tái)，建立了實(shí)現(xiàn)體內(nèi)RNA干擾的動(dòng)物模型，和小鼠曲細(xì)精管顯微注射特異性抗體研究其相關(guān)基因?qū)影l(fā)生影響的動(dòng)物模型。本發(fā)明建立的上述動(dòng)物模型為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)研究基因功能的新方法奠定了牢固的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G09B23/00GK101086809SQ200610083839
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2006年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月5日
發(fā)明者狄茜, 王琳芳, 繆時(shí)英, 宗書東 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所