功能性碳納米顆粒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種功能性熒光碳納米顆粒（Carbon?Nanoparticles，簡稱CNPs）的制備、表征及其在生物檢測技術(shù)中的應(yīng)用。特征是將1g的海藻酸鈉與0.1gNaOH混合緩慢加入到30ml的去離子水中同時(shí)充分?jǐn)嚢?，然后置于高壓釜中反?yīng)4h，溫度為160℃。反應(yīng)所得的碳納米顆粒經(jīng)酸堿中和。本發(fā)明原料來源豐富、廉價(jià)易得、制備方法簡單；合成的碳納米顆粒具有良好的熒光特性，包括熒光穩(wěn)定、無光閃爍、激發(fā)波長和發(fā)射波長可調(diào)控，生物相容性好、毒性低、分子量和粒徑均很小等優(yōu)點(diǎn)，在生物檢測、傳感、造影等諸多的應(yīng)用領(lǐng)域中得到長足的發(fā)展。
【專利說明】功能性碳納米顆粒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米熒光材料，具體地說是一種碳納米顆粒的制備、表征及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2004年，克萊蒙森大學(xué)的研究者在用電泳分離多壁碳納米管過程中偶然發(fā)現(xiàn)碳納米顆粒。其主要組成元素是碳，為自然界最豐富的元素之一，也是生命體最重要的組成元素之一。由于無毒且具備良好的熒光特性，備受青睞，在眾多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。主要用于微生物、動物細(xì)胞的標(biāo)記及活體成像?，F(xiàn)在已報(bào)道的技術(shù)及其存在的問題包括如下幾個方面:
[0003](1)發(fā)光半導(dǎo)體量子點(diǎn)(又稱量子點(diǎn))技術(shù)(文獻(xiàn)I =Warren C.ff.Chan and ShumingNie, Science, 1998，281，2016-2018)。量子點(diǎn)的發(fā)明，開創(chuàng)了納米粒子作為熒光標(biāo)記物應(yīng)用的新領(lǐng)域。但是量子點(diǎn)發(fā)光不穩(wěn)定易閃爍、具有一定毒性等缺點(diǎn)，會影響細(xì)胞或生物大分子的活性，在一定程度上限制它的使用。而熒光碳納米顆粒是環(huán)境友好型的生物標(biāo)記物克服其各種缺陷，引起人們極大的興趣。
[0004](2)無機(jī)物碳化的突光碳納米粒子技術(shù)(文獻(xiàn)2:Xiao-You Xu, Robert Ray, etal..J.Am Chem.Soc.2004，126，12736-1273;文獻(xiàn) 3:M Bottini, C Balasubramanian, MlDawson, A Bergamaschi, S Bellueei, TMustelin.J.Phys.Chem.B,2006,110,831-836.;文獻(xiàn) 4:Sun Y.P.，Zhou B.，Lin Y.，et al..J.Am.Chem.Soc, 2006，128，7756-7757.)。無機(jī)碳化所獲得的碳納米顆粒成本低廉，但發(fā)光主要集中在可見光區(qū)內(nèi)，所以限制了其在活體成像中的進(jìn)一步應(yīng)用。目前用的主要原料有單壁碳納米管、多壁碳納米管、石墨靶、商業(yè)活性炭。得到的碳納米顆?？砂l(fā)出多色可見光，具有良好的生物相容性，但分離的步驟較繁瑣。
[0005](3)有機(jī)物碳化的熒光碳納米技術(shù):有機(jī)碳化所得碳納米顆粒的粒徑較大些，但是發(fā)光量子效率較高且具有上轉(zhuǎn)換熒光和近紅外發(fā)射的特性。主要原料有蔗糖、淀粉、葡萄糖等多糖類物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以淀粉和蔗糖作為碳源合成碳納米顆粒具有特殊的熒光性質(zhì)，即在近紅外波長的激光作用下能發(fā)出近紅外光。由于近紅外能穿透組織進(jìn)行深層組織成像且自發(fā)熒光背景低，有望將其引入到腫瘤細(xì)胞體內(nèi)活體成像研究中，克服半導(dǎo)體量子點(diǎn)的高毒性與高費(fèi)用等缺陷。(文獻(xiàn) 5:Peng H, Travas-SejdicJ, ChemMater, 2009, 21 (23),5563-5 ;文獻(xiàn) 6:Zhao QL, Zhang ZL, Huang BH, Peng J, Zhang M, Pang Dff.ChemCommun,2008，41，5116-8 ;文獻(xiàn) 7:Ray S C，Saha A, Jana NR, Sarkar R.PhysChem, 2009,113(43),18546-51.)。在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的實(shí)踐與研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。碳納米顆粒的最大優(yōu)點(diǎn)是具備良好熒光特性，所以在生物檢測方面具有一定的優(yōu)勢。但目前碳納米顆粒的制備工藝比較復(fù)雜，碳源來源探索還不夠廣泛，所得碳納米顆粒較難分離等問題尚待進(jìn)一步解決。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是以廉價(jià)的碳源為原料，采用簡便的合成方法獲得具有良好突光特性的碳納米顆粒(Carbon Nanoparticles),然后對所得的碳納米顆粒進(jìn)行表征分析及應(yīng)用方面的研究。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]以海藻酸鈉為原料，采用水熱合成法得到具有良好熒光特性的碳納米顆粒。
[0009]其制備方法為:采用水熱合成法制備而成，將碳源與強(qiáng)堿置于高壓釜反應(yīng)器中，然后加入一定量的去離子水后，一步反應(yīng)得碳納米顆粒。然后用硼氫化鈉處理分析所得碳納米顆粒的量子產(chǎn)率的變化情況。
[0010]具體實(shí)驗(yàn)操作過程:稱取Ig的海藻酸鈉和0.1g的氫氧化鈉緩慢加入到30ml的去離子水中同時(shí)充分?jǐn)嚢?。然后置于密閉容器(高壓釜)中反應(yīng)4h，溫度為160°C。反應(yīng)完后，用HCl中和處理(質(zhì)量濃度I~30%)，用透析袋(截留分子量300~3000，在此為MWC0500)透析2天(隔2h換一次水)。將所得到的溶液分別用0.45 μ m，0.22 μ m微濾膜處理除去大分子雜質(zhì)。接著用高速臺式冷凍離心機(jī)(1000Orpm)離心20min,除去相對較小的雜質(zhì)，即得到熒光碳納米顆粒Alg-CNPs。
[0011]硼氫化鈉處理碳納米顆粒:每毫升的碳納米顆粒加0.1g的硼氫化鈉后，攪拌使之充分溶解，然后對其量子產(chǎn)率進(jìn)行分析。
[0012]碳納米顆粒的表征:(I)用熒光光譜儀分析碳納米顆粒的熒光特性。(2)用紫外分光光度計(jì)分析碳納米顆粒的全波長吸收情況與具體激發(fā)光作用下的吸收值。(3)用傅立葉紅外光譜儀分析碳納米顆粒的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。(4)分析經(jīng)硼氫化鈉處理后碳納米顆粒的量子產(chǎn)率(QYs)。(5)不 同pH值對碳納米顆粒熒光特性的影響(pH=3、5、7、9、ll、13)。
[0013]碳納米顆粒用于生物成像:利用碳納米顆粒為探針，與魚食進(jìn)行共混制備成熒光性魚食，對魚進(jìn)行熒光性魚食喂養(yǎng)后，利用熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行生物成像。
[0014]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0015](I)利用海藻酸鈉為碳源，只需簡單的一步反應(yīng)法即可以制備碳納米顆粒，簡化了碳納米顆粒復(fù)雜合成過程
[0016](2)擴(kuò)大了碳納米顆粒碳源的選擇范圍，不需要經(jīng)過繁瑣的合成步驟及設(shè)備進(jìn)行制備及分離純化，適合進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)
[0017](3)得到的碳納米顆粒熒光性質(zhì)穩(wěn)定，在熒光顯微鏡檢測方面的應(yīng)用具有一定的優(yōu)勢
[0018](4)得到的碳納米顆粒在水中分散性好，熒光發(fā)射光譜可調(diào)，有望作為生物標(biāo)記物應(yīng)用于生物檢測和動物活體成像
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0019]圖1是還原后Alg-CNPs的透射電子顯微鏡照片；
[0020]圖2是還原后Alg-CNPs紫外吸收光譜與熒光光譜，插入的是還原前Alg-CNPs熒光光譜；
[0021]圖3是還原后Alg-CNPs的傅立葉變換紅外光譜；
[0022]圖4是還原后Alg-CNPs的光穩(wěn)定性；
[0023]圖5是不同pH值對還原后Alg-CNPs的熒光特性的影響；[0024]圖6是還原后Alg-CNPs碳納米顆粒用于孔雀魚活體熒光成像照片，左上角是孔雀魚活體熒光成像照片，右下方為對比的魚成像照片。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0026]實(shí)施例1:碳納米顆粒制備及分離純化
[0027](I)Alg-CNPs 的制備:
[0028]稱取Ig海藻酸鈉與0.1g的NaOH置于燒杯中，加入30ml的去離子水。然后將反應(yīng)物置于高壓反應(yīng)釜中反應(yīng)4h，溫度為160攝氏度。放置室溫冷卻后，反應(yīng)產(chǎn)物用IM的HCl將pH調(diào)到7。
[0029](2) Alg-CNPs 的分離純化:
[0030]將所得的產(chǎn)品溶液分別用0.45 μ m，0.22 μ m微濾膜處理除去大分子雜質(zhì)。接著用高速臺式冷凍離心機(jī)(1000Orpm)離心20min,然后用透析袋(500Da)處理除去鹽等小分子物質(zhì)，透析時(shí)間為2天(隔2h換一次水)。
[0031]實(shí)施例2:碳納米顆粒性質(zhì)表征
[0032](I)碳納米顆粒的透射電鏡表征:
[0033]由圖1可見，海藻酸鈉碳納米顆粒的粒徑在IOOnm左右，且粒徑分布比較均勻，單分散性較好。
[0034](2)碳納米顆粒的紫外吸收光譜和熒光光譜圖
[0035]圖2為還原后alg-CNPs的紫外吸收光譜與熒光光譜圖，從圖中可以看出碳納米顆粒在260nm處有吸收峰,該峰為C=C典型峰。碳納米顆粒在不同波長(320nm-420nm)激發(fā)光作用下，發(fā)射光的波長有所不同，主要集中在可見光范圍內(nèi)。隨著激發(fā)波長的增加，發(fā)射波長發(fā)生紅移。
[0036](3)碳納米顆粒的傅立葉紅外光譜圖
[0037]圖3為alg-CNPs的紅外光譜圖，合成所得的碳納米顆粒在3391CHT1左右有0_H伸縮振動吸收峰，在2925cm—1左右有-CH2伸縮振動吸收峰，1599cm—1為C=O的伸縮振動吸收峰，1399CHT1為-CH2彎曲振動吸收峰。
[0038](4)碳納米顆粒的光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
[0039]碳納米顆粒、羅丹明B及熒光素在水溶液中的光穩(wěn)定性如圖4所示，所用的光源為30W白熾燈,樣品距離白熾燈為IOcm,分別于碳點(diǎn)的最大激發(fā)波長360nm、突光素最大激發(fā)波長319nm、羅丹明B最大激發(fā)波長552nm測其最大熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著時(shí)間的延長，熒光素和羅丹明的熒光強(qiáng)度不斷減弱。其中，熒光素在前IOmin內(nèi)及聚驟降，50min后衰減至起始強(qiáng)度熒光的27%，熒光素的強(qiáng)度衰減至起始的82%。而碳納米顆粒的熒光強(qiáng)度較穩(wěn)定，基本保持不變。
[0040]實(shí)施例3:硼氫化鈉處理提高碳納米顆粒熒光量子產(chǎn)率
[0041](I)硼氫化鈉處理
[0042]取15ml的碳納米顆粒置于燒杯中，加入1.5g的硼氫化鈉后充分混勻，然后用透析方法除去多余的硼氫化鈉(500Da)，透析時(shí)間為2天(隔2h換一次水)。
[0043](2)硼氫化鈉處理后碳納米顆粒熒光量子產(chǎn)率[0044]從表1可得出的結(jié)論是合成的碳納米顆粒經(jīng)硼氫化鈉還原后量子產(chǎn)率大大提高。
[0045](3) pH值對碳納米顆粒熒光性質(zhì)的影響
[0046]分別取0.5ml的alg-CNPs樣品，加入4.5ml的去離子水，再用5M的HCl和5MNa0H調(diào)pH至3、5、7、9、11、13做三組平行實(shí)驗(yàn)。圖5為pH值對碳納米顆粒熒光特性的影響，圖中可得出的結(jié)論是，碳納米顆粒熒光強(qiáng)度受pH影響，當(dāng)pH偏酸時(shí)碳納米顆粒熒光強(qiáng)度相應(yīng)較強(qiáng)；當(dāng)PH偏中性或者堿性時(shí)，其熒光強(qiáng)度變?nèi)酢?br> [0047]實(shí)施例4:碳納米顆粒用于生物成像
[0048]將魚食與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為1:1混合于燒杯中，加入少量的水，將其攪碎。置于小離心管中，冷凍干燥處理24h，得到粉末狀物質(zhì)即為魚食。生物成像采用市售孔雀魚，每24小時(shí)喂養(yǎng)一次，每次喂養(yǎng)將水全部倒掉，換新的自來水，然后加入魚食。喂食量為20mg/次。36小時(shí)后利用小動物活體成像儀成像，激發(fā)光源455納米，發(fā)射光譜500-720納米，曝光時(shí)間460ms。
【權(quán)利要求】
1.功能性碳納米顆粒，其特征在于:以海藻酸鈉為原料，采用水熱合成法獲得具有良好熒光特性的碳納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能性碳納米顆粒，其特征在于:將0.1~5g的海藻酸鈉與0.01~IOg NaOH混合緩慢加入到10~40ml的去離子水中同時(shí)充分?jǐn)嚢?；然后置于密閉容器或高壓釜中反應(yīng)I~40h，溫度為140~280°C ;反應(yīng)完后，用HCl (質(zhì)量濃度I~30%)中和處理至PH=5~9,裝入透析袋(截留分子量300~3000)內(nèi)于水中透析I~4天,透析過程每I~8個小時(shí)換一次水；將所得到透析袋內(nèi)的溶液用0.1~0.Sum微濾膜處理除去大分子雜質(zhì)，得上清液即熒光碳納米顆粒Alg-CNPs。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的功能性碳納米顆粒，其特征在于:取I~50ml熒光碳納米顆粒Alg-CNPs置于燒杯中，加入0.1~5g硼氫化鈉隔夜充分?jǐn)嚢柽€原，然后裝入透析袋(截留分子量300-3000)內(nèi)于水中透析I~4天，透析過程每I~8個小時(shí)換一次水；經(jīng)還原后的透析袋內(nèi)的溶液、即碳納米顆粒的量子產(chǎn)率大大提高。
4.一種權(quán)利要求1-3任一所述的碳納米顆粒在生物標(biāo)記中的應(yīng)用。
5.按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生物標(biāo)記是指碳納米顆粒用于抗體、抗原、蛋白或核酸大分子的標(biāo)記。
6.按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生物標(biāo)記是指碳納米顆粒用于動物的飲水、食物或藥物中，碳納米顆粒與動物的飲水、食物或藥物混合，用于動物成像。
7.—種權(quán)利要求1-3任一所述的碳納米顆粒用于血液及果汁中葡萄糖含量的檢測。
8.—種權(quán)利要求1-3任一所述的碳納米顆粒用于與金、銀或銅重金屬離子相結(jié)合后增強(qiáng)表面拉曼散射。`
【文檔編號】C01B31/02GK103864047SQ201210555354
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月17日
【發(fā)明者】馬小軍, 譚明乾, 顏惠平 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所