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      肝癌中上調(diào)表達的兩種新的人蛋白及其編碼序列和另外二十種人蛋白在肝癌診斷中的新用途的制作方法

      文檔序號:3583140閱讀:199來源:國知局
      專利名稱:肝癌中上調(diào)表達的兩種新的人蛋白及其編碼序列和另外二十種人蛋白在肝癌診斷中的新用途的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地說,本發(fā)明涉及兩種新的編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的多核苷酸,以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發(fā)明還涉及在肝癌組織中上調(diào)表達的另外二十種人蛋白及其編碼序列在診斷肝癌方面的新用途(以前沒有人報道過其在肝癌診斷方面的用途)。
      背景技術(shù)
      人基因組學(xué)研究目前是國際上的熱點,除人染色體DNA大規(guī)模測序,表達序列測序(EST)的方法外,還缺少從功能開始的篩選具有功能基因組的高通量的方法。
      癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤,目前人們已越來越關(guān)注腫瘤的治療和檢測。因此,本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)研究在肝癌組織中具有表達差異的人蛋白及其激動物/抑制劑。

      發(fā)明內(nèi)容
      本實驗將cDNA芯片等方法應(yīng)用于肝癌表達譜的研究。在特定病人群體中基因表達呈現(xiàn)出高度一致性規(guī)律的一組基因往往反映了疾病起源和所處階段的不同,往往預(yù)示著患病個體不同的預(yù)后效果。肝細胞肝癌(HCC)是全球最常發(fā)生的癌癥之一,肝癌的發(fā)生和發(fā)展與許多已知的和未知的基因相關(guān),用基因芯片的方法尋找一些在肝癌組織中特異性表達差異的基因,對肝癌的研究、診斷、防治將起積極的指導(dǎo)作用。本實驗計劃通過對肝癌基因表達譜的分析以及對其和正常肝組織的比較,發(fā)現(xiàn)差異表達基因,通過聚類分析將這些差異表達基因分成特定的基因簇,發(fā)現(xiàn)它們功能上的相關(guān)性,并對新基因進行了功能推測。這樣的研究不僅可以推動肝癌發(fā)生的分子機理研究,還可以為進一步改進肝癌診斷和治療預(yù)后方法提供新的標記基因。
      實驗結(jié)果表明,本發(fā)明的基因都是在至少50%以上的肝癌樣本中發(fā)生顯著上調(diào)表達的基因,其中包括兩種新的人蛋白基因及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白基因,這些基因及其編碼的蛋白多肽可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途,見下表所示



      本發(fā)明的一個目的是提供一類在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。
      本發(fā)明的另一個目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
      本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
      本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼這些多肽的多核苷酸的重組載體。
      本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼這些多肽的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
      本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的這些多肽的抗體。
      本發(fā)明的另一個目的是提供了針對本發(fā)明的這些多肽的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
      本發(fā)明的另一個目的是提供診斷治療與這些多肽異常相關(guān)的疾病的方法。
      本發(fā)明的另一個目的是提供在肝癌組織中上調(diào)表達的另外二十種人蛋白及其編碼序列在診斷肝癌方面的新用途。
      在本發(fā)明的第一方面,提供新穎的分離出的肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽,它包含具有選自下組的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4;或其保守性變異多肽、或其生物活性片段、或其活性衍生物。較佳地,該多肽是具有選自下組的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4。
      在本發(fā)明的第二方面,提供了一種分離的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,該核苷酸序列與選自下組中的一種核苷酸序列有至少85%相同性(a)編碼上述的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽的多核苷酸;(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地,該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4。更佳地,該多核苷酸的序列選自下組SEQ ID NO1、SEQ ID NO3的編碼區(qū)序列或全長序列。
      在本發(fā)明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的載體,特別是表達載體,以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
      本發(fā)明的第四方面,提供了制備在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽的制備方法,該方法包括(a)在適合表達在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的條件下,培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞;(b)從培養(yǎng)物中分離出在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽。
      在本發(fā)明的第五方面,提供了與上述的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子,它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-800個核苷酸。
      在本發(fā)明的第六方面,提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的針對本發(fā)明的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌癥以及細胞異常增殖等病癥。
      在本發(fā)明的第七方面,提供了一種篩選的模擬、激活、拮抗或抑制在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白活性的化合物的方法,其包括利用本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及用該方法獲得的化合物。
      在本發(fā)明的第八方面,提供了一種體外檢測與在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白異常表達相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法,包括檢測生物樣品中所述多肽或其編碼多核苷酸序列中的突變,或者檢測生物樣品中本發(fā)明多肽的量或生物活性。
      在本發(fā)明的第九方面,提供了本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸在制備用于治療癌癥、發(fā)育性疾病或免疫性疾病或其它由于在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白表達異常所引起疾病的藥物的用途。
      在本發(fā)明的第十方面,提供了在肝癌組織中上調(diào)表達的另外二十種人蛋白及其編碼序列用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等的新用途(以前沒有人報道過其在肝癌診斷方面的用途)。
      本發(fā)明的其它方面由于本文技術(shù)的公開,對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
      本說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語除非特別說明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分,也可以指基因組或合成的DNA或RNA,它們可以是單鏈或雙鏈的,代表有義鏈或反義鏈。類似地,術(shù)語“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。當本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時,這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸。
      蛋白質(zhì)或多核苷酸“變異體”是指一種具有一個或多個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變異體可具有“保守性”改變,其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì),如用亮氨酸替換異亮氨酸。變異體也可具有非保守性改變,如用色氨酸替換甘氨酸。
      “缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個或多個氨基酸或核苷酸的缺失。
      “插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改變導(dǎo)致與天然存在的分子相比,一個或多個氨基酸或核苷酸的增加?!疤鎿Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個或多個氨基酸或核苷酸。
      “生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生物化學(xué)功能的蛋白質(zhì)。類似地,術(shù)語“免疫學(xué)活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動物或細胞中誘導(dǎo)特定免疫反應(yīng)以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
      “激動劑”是指當與在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白結(jié)合時,一種可引起該蛋白質(zhì)改變從而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)活性的分子。激動劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的分子。
      “拮抗劑”或“抑制物”是指當與在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白結(jié)合時,一種可封閉或調(diào)節(jié)在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的分子。
      “調(diào)節(jié)”是指在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的功能發(fā)生改變,包括蛋白質(zhì)活性的升高或降低、結(jié)合特性的改變及在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的任何其它生物學(xué)性質(zhì)、功能或免疫性質(zhì)的改變。
      “互補的”或“互補”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過堿基配對的多核苷酸天然結(jié)合。例如,序列“C-T-G-A”可與互補的序列“G-A-C-T”結(jié)合。兩個單鏈分子之間的互補可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間雜交的效率及強度有明顯影響。
      “同源性”是指互補的程度,可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一種部分互補的序列,其至少可部分抑制完全互補的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴格性程度降低的條件下進行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測。基本上同源的序列或雜交探針可競爭和抑制完全同源的序列與靶序列在嚴格性程度降低的條件下的結(jié)合。這并不意味嚴格性程度降低的條件允許非特異性結(jié)合,因為嚴格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結(jié)合為特異性或選擇性相互作用。
      “相同性百分率”是指在兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同或相似的百分率??捎秒娮臃椒y定相同性百分率,如通過MEGALIGN程序(Lasergene softwarepackage,DNASTAR,Inc.,Madison Wis.)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244)。Cluster法通過檢查所有配對之間的距離將各組序列排列成簇。然后將各簇以成對或成組分配。兩個氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過下式計算 也可以通過Cluster法或用本領(lǐng)域周知的方法如Jotun Hein測定核酸序列之間的相同性百分率(Hein J.,(1990)Methods in emzumology 183625-645)。
      “相似性”是指氨基酸序列之間排列對比時相應(yīng)位置氨基酸殘基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如,帶負電荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸;帶正電荷的氨基酸可包括賴氨酸和精氨酸;具有不帶電荷的頭部基團有相似親水性的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸;甘氨酸和丙氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;絲氨酸和蘇氨酸;苯丙氨酸和酪氨酸。
      “反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補的核苷酸序列?!胺戳x鏈”是指與“有義鏈”互補的核酸鏈。
      “衍生物”是指HFP或編碼其的核酸的化學(xué)修飾物。這種化學(xué)修飾物可以是用烷基、?;虬被鎿Q氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學(xué)特性的多肽。
      “抗體”是指完整的抗體分子及其片段,如Fa、F(ab’)2及Fv,其能特異性結(jié)合在肝癌組織中具有表達差異的蛋白的抗原決定簇。
      “人源化抗體”是指非抗原結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列被替換變得與人抗體更為相似,但仍保留原始結(jié)合活性的抗體。
      如本文所用,“分離的”是指物質(zhì)從原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì),原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的,但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開,則為分離純化的。
      如本文所用,“分離的在肝癌組織中具有表達差異的蛋白或多肽”是指在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙稀酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽的純度能用氨基酸序列分析。
      本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽,優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物,或是化學(xué)合成的產(chǎn)物,或是有重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如,細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主,本發(fā)明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
      本發(fā)明還包括在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用,術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)有一個或多個保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)被取代的多肽,而這樣的取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的;或者(II)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽;或者(III)成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽;或者(IV)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。通過本文的闡述,這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
      本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。以PP0174B04蛋白(在本申請中,蛋白質(zhì)的命名采用其克隆編號)為例,編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用,“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)或多肽,但與SEQ IDNO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。以PP1277E03蛋白(在本申請中,蛋白質(zhì)的命名采用其克隆編號)為例,編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用,“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO4的蛋白質(zhì)或多肽,但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
      編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列;成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列;成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
      術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸,也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
      本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體,其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的,等位變異體是一個多核苷酸的替換形式,它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入,但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
      本發(fā)明還涉及與以上述的序列雜交且兩序列之間具有至少50%,較佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中,“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)雜交時加用變性劑,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95%以上,更好是97%以上時才發(fā)生雜交。并且,可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ IDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
      本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸,較好是至少30個核苷酸,更好是至少50個核苷酸,最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的多聚核苷酸。
      本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供,更佳地被純化至均質(zhì)。
      本發(fā)明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如,用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性核苷酸序列,和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。
      編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的特異DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列;2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
      上述提到的方法中,分離基因組DNA最不常用。當需要的多肽產(chǎn)物的整個氨基酸序列已知時,DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。如果所需的氨基酸的整個序列不清楚時,DNA序列的直接化學(xué)合成是不可能的,選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄,形成質(zhì)?;蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù),試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫,如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時,即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
      可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交;(2)標志基因功能的出現(xiàn)或喪失;(3)測定在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的轉(zhuǎn)錄本的水平;(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測定生物學(xué)活性,來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用,也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
      在第(1)種方法中,雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源,其長度至少15個核苷酸,較好是至少30個核苷酸,更好是至少50個核苷酸,最好是至少100個核苷酸。此外,探針的長度通常在2kb之內(nèi),較佳的為1kb之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因DNA序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素,熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
      在第(4)種方法中,檢測在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法,放射免疫沉淀法,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
      應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時,可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法),用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇,并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
      如上所述得到的本發(fā)明的基因,或者各種DNA片段等的核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS,1977,745463-5467)測定。這類核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列,測序需反復(fù)進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列,才能拼接成全長的cDNA序列。
      本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體,以及用本發(fā)明的載體或本發(fā)明蛋白的編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞,以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
      通過常規(guī)的重組DNA技術(shù),利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白多肽(Science,1984;2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的多核苷酸(或變異體),或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞;(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞;(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
      本發(fā)明中,編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬茵體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56125);在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.2633521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體??傊?,只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定,任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調(diào)控元件。
      本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法,能用于構(gòu)建含在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a LaboratoryManual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上,以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子;λ噬菌體的PL啟動子;真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。此外,表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因,以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀,如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP),或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
      包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體,可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
      宿主細胞可以是原核細胞,如細菌細胞;或是低等真核細胞,如酵母細胞;或是高等真核細胞,如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌,鏈霉菌屬;細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌;真菌細胞如酵母;植物細胞;昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9;動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
      本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時,如果在載體中插入增強子序列時將會使其轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子,通常大約有10到300個堿基對,作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄??膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
      本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子、選擇性標記基因和宿主細胞。
      用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時,能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲,用CaCl2法處理,所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要,轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物,可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法,或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
      獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng),表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞,培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子,將細胞再培養(yǎng)一段時間。
      在上面的方法中的重組多肽可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要,可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
      本發(fā)明的基因都是在至少50%以上的肝癌樣本中發(fā)生顯著上調(diào)表達的基因,其中包括兩種新的人蛋白基因及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白基因,這些基因及其編碼的蛋白多肽可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途。
      重組的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物和用于篩選針對在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。由于本發(fā)明的兩種新的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白即PP0174B04,PP1277E03蛋白,以及另外二十種在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白,在肝癌組織中的表達遠高于其正常肝組織中的表達,因此本發(fā)明蛋白可作為肝癌檢測中待檢測對象。以PP0174B04蛋白為例,當抗PP0174B04的抗體檢測樣品時,如果發(fā)現(xiàn)PP0174B04蛋白的表達量高于陰性對照(正常肝組織樣品),那麼就表明受檢測的樣品中存在癌變。
      本發(fā)明還提供了一種檢測肝組織樣品是否發(fā)生癌變的方法,它包括步驟(1)用抗本發(fā)明蛋白(兩種新的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白即PP0174B04,PP1277E03蛋白,以及另外二十種在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白)的抗體與待檢測樣品接觸,以形成抗原-抗體復(fù)合物;(2)檢測該抗原-抗體復(fù)合物的存在與否,該復(fù)合物的存在表示該受檢測的肝組織發(fā)生了癌變。將本發(fā)明方法與其他檢測肝癌的方法相結(jié)合,可以更準確地檢測肝癌。
      本發(fā)明也提供了篩選藥物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的藥劑的方法。激動劑提高在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白刺激細胞增殖等生物功能,而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關(guān)的紊亂如各種癌癥。例如,能在藥物的存在下,將哺乳動物細胞或表達在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的膜制劑與標記的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白一起培養(yǎng),然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
      在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的拮抗劑可以與在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白結(jié)合并消除其功能,或是抑制在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的產(chǎn)生,或是與多肽的活性位點結(jié)合使多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的拮抗劑可用于治療用途。
      在篩選作為拮抗劑的化合物時,可以將在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白加入生物分析測定中,通過測定化合物影響在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法,可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。
      本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療,例如,各種惡性腫瘤和細胞異常增殖等。
      本發(fā)明的多肽,及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產(chǎn)抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過將此多肽直接注射免疫動物的方法得到。制備單克隆抗體的技術(shù)包括雜交瘤技術(shù),三瘤技術(shù),人B-細胞雜交瘤技術(shù),EBV-雜交瘤技術(shù)等。
      可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
      本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒,容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起,可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構(gòu)所給出的指示性提示,該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機構(gòu)許可其在人體上施用。此外,本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物如TNF等結(jié)合使用。
      藥物組合物可以以方便的方式給藥,如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。針對本發(fā)明蛋白的拮抗劑以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來給藥。施用于患者的有效成分的量和劑量范圍將取決于許多因素,如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
      編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計用于表達變異的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白,以抑制內(nèi)源性的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白活性。例如,一種變異的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白可以是縮短的、缺失了信號傳導(dǎo)功能域的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白,雖可與下游的底物結(jié)合,但缺乏信號傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白基因轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶所需蛋白基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et al.)。另外重組的本發(fā)明蛋白基因可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
      抑制在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子,其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得,如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性,可用多種方法對其進行修飾,如增加兩側(cè)的序列長度,核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
      多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中;或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導(dǎo)入細胞中,再將細胞移植到體內(nèi)等。
      本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析,例如,多肽可用物理的、化學(xué)或酶進行特異性切割,并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析,更好的是進行質(zhì)譜分析。
      本發(fā)明還提供了針對在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
      多克隆抗體可以通過將此多肽直接注射免疫動物(如家兔,小鼠,大鼠等)的方法得到,多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng),包括但不限于弗氏佐劑等。
      制備單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein.Nature,1975,256495-497),三瘤技術(shù),人B-細胞雜交瘤技術(shù),EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison etal,PNAS,1985,816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的單鏈抗體。
      抗在肝癌組織中上調(diào)表達的入蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中,檢測活檢標本中的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白。
      與在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記,注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
      抗體還可用于設(shè)計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP,攻擊抗體的氨基,通過二硫鍵的交換,將毒素結(jié)合于抗體上,這種雜交抗體可用于殺滅在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白陽性的細胞(如肝癌細胞)。
      本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白相關(guān)的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的產(chǎn)生或活性。
      能與在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時,一般應(yīng)對在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白分子進行標記。
      本發(fā)明還涉及定量和定位檢測在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的,且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白水平,可以用作解釋在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白起作用的疾病。
      編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的多聚核苷酸可用于與在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白相關(guān)疾病如肝癌的診斷和治療。在診斷方面,編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的多聚核苷酸可用于檢測在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的異常表達。如編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的DNA序列可用于對活檢標本進行雜交以判斷在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法,Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù),相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上,用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
      檢測在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白基因的突變也可用于診斷在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白相關(guān)的疾病。在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白突變的形式包括與正常野生型相比在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白DNA序列的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外,突變有可能影響蛋白的表達,因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
      本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前,需要鑒定染色體上的各基因的具體位點?,F(xiàn)在,只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明,為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián),其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
      簡而言之,根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp),可以將序列定位于染色體上。然后,將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
      體細胞雜合細胞的PCR定位法,是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物,通過類似方法,可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位。可用于染色體定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選,從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
      將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH),可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術(shù)的綜述,參見Verma等,Human Chromosomesa Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
      一旦序列被定位到準確的染色體位置,此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析,確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
      接著,需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變,而該突變在任何正常個體中未觀察到,則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體,通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化,如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力,被精確定位至與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA,可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應(yīng)于一個基因)。
      本發(fā)明的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白核苷酸全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列,尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物,并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法所制備的cDNA庫作為模板,擴增而得相關(guān)序列。當序列較長時,常常需要進行兩次或多次PCR擴增,然后再將各次擴增出得片段按正確次序拼接在一起。
      一旦獲得了相關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得相關(guān)序列。這通常是將其克隆如載體,再轉(zhuǎn)入細胞,然后通過常規(guī)方法從擴增后地宿主細胞中分離得到相關(guān)序列。
      此外,還可用人工合成地方法來合成相關(guān)序列,尤其是片段長度較短時。通常,通過先合成多個小片段,然后再進行連接可獲得序列很長地片段。
      目前,已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段,或其衍生物)地DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外,還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
      此外,由于本發(fā)明的在肝癌組織中上調(diào)表達的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,與來源于其他物種的同族蛋白相比,預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
      下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
      實施例1在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiagene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上,轉(zhuǎn)化DH5α,細菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reaction sequencingkit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩個克隆PP0174B04,PP1277E03的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結(jié)果表明,PP0174B04克隆所含的全長cDNA為2309bp(如Seq ID NO1所示),從第57bp至545bp有一個488bp的開放閱讀框架(ORF),編碼一個新的蛋白質(zhì)(如Seq ID NO2所示),我們將此克隆命名為PP0174B04,編碼的蛋白質(zhì)命名為PP0174B04蛋白;PP1277E03克隆所含的全長cDNA為1396bp(如Seq ID NO3所示),從第140bp至514bp有一個374bp的開放閱讀框架(ORF),編碼一個新的蛋白質(zhì)(如Seq ID NO4所示),我們將此克隆命名為PP1277E03,編碼的蛋白質(zhì)命名為PP1277E03蛋白。
      實施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的在肝癌組織中上調(diào)表達的兩種新的人蛋白及其編碼序列,用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul,SF et al.J.Mol.Biol.1990;215403-10],在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索。其蛋白質(zhì)同源結(jié)果如下所示1.PP0174B04蛋白BlastpQuery=PP0174B04(162個氨基酸)>gi|34532417|dbj|BAC86421.1|unnamed protein product[Homo sapiens]gi|46409598|ref|NP_997369.1|FLJ44076 protein[Homo sapiens]長度=181分值=53.5bits(127),預(yù)計值=2e-06相同性=31/72(43%),相似性=34/72(47%),缺口=1/72(1%)
      Query65 TFHCKHLLATPAVAQAGPGVAHDTILEVTNCKLWWHLHGTNSAGTQNVRTVETCLPSPRP 124T C + PAVAQ GPG A T E N K WW H G Q+ R VE P PSbjct111 TAPCIPAILAPAVAQRGPGTAWATASEGANHKPWWFPHAVKPVGMQSAR-VEAWEPPPGF 169Query125 QRKAWTAWVPRQ 136QRAW+ RQSbjct170 QRMCGKAWMSRQ 181>gi|1169123|sp|P42679|MATK_HUMAN Megakaryocyte-associated tyrosine-proteinkinase(Tyrosine-protein kinase CTK)(Protein kinase HYL)(Hematopoietic consensustyrosine-lacking kinase)長度=507分值=31.2bits(69),預(yù)計值=1.1相同性=18/57(31%),相似性=24/57(42%),缺口=3/57(5%)Query98 WWHLHGTNSAGTQ---NVRTVETCLPSPRPQRKAWTAWVPRQRCITRVEPLRGSPGQ 151W HG +SA + R +P P R W P +CIT+ E R PG+Sbjct10 WRAFHGCDSAEELPRVSPRFLRAWHPPPVSARMPTRRWAPGTQCITKCEHTRPKPGE 662.PP1277E03蛋白BlastpQuery=PP1277E03(124個氨基酸)>gi|29247279|gb|EAA38847.1|GLP_577_38920_45159[Giardia lamblia ATCC 50803]長度=2079分值=33.1bits(74),預(yù)計值=1.9相同性=15/31(48%),相似性=20/31(64%)Que ry48 VYCRVLHKVRKLFFLYGSLPSSGVTLDVLKL 78+Y R+ +L +LY S SSGVT DVL+LSbjct1790 IYVRITTNTERLRYLYSSARSSGVTTDVLRL 1820>gi|46396887|sp|Q89AM9|SSRP_BUCBP SsrA-binding protein長度=158分值=27.3bits(59),預(yù)計值=8.5相同性=18/59(30%),相似性=31/59(52%),缺口=1/59(1%)Query20 KNTQMYLPSFPQIDAFVVAFNVRYFECFVYCRVLHKVRKLFFLYGSLPSSGVTLDVLKL 78KN +MYL + Q D+ +EC++L + R++ +LY L S +T+ VL +Sbjct57 KNGEMYLVN-SQFDPISKSNLYITYECNRIKKILLRKREITYLYSKLYKSHLTIIVLSI 114
      實施例3用cDNA芯片進行肝細胞癌(HCC)表達譜研究基因芯片或基因微矩陣(DNA Microarray)是目前許多國家實驗室和大制藥公司都在著手研制和開發(fā)的新技術(shù),它是指將大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等載體上,然后用熒光檢測和計算機軟件進行數(shù)據(jù)的比較和分析,以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。本發(fā)明的多核苷酸可作為靶DNA用于基因芯片技術(shù)用于高通量研究新基因功能;尋找和篩選組織特異性新基因特別是腫瘤等疾病相關(guān)新基因;疾病的診斷,如遺傳性疾病。其具體方法步驟在文獻中已有多種報道,如可參閱文獻DeRisi,J.L.,Lyer,V.&amp;Brown,P.O.(1997)Science 278680-686.
      及文獻Helle,R.A.,Schema,M.,Chai,A.,Shalom,D.(1997)PNAS 942150-2155.
      本實驗將cDNA芯片應(yīng)用于肝癌表達譜的研究,檢測分析了70例肝癌和正常肝組織的差異表達。發(fā)現(xiàn)表達有差異的基因涉及細胞周期,解毒,凋亡,細胞骨架,代謝等多種功能的基因。我們的結(jié)果對肝癌的發(fā)生發(fā)展機制提供了大量的信息。其中,本發(fā)明的兩種新的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白及其編碼序列以及另外二十種在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白及其編碼序列在診斷肝癌方面有新用途,可以作為藥物治療的靶點和臨床檢測的重要標志。
      (一)cDNA芯片制備我們利用了博星公司提供的12800個點的cDNA芯片檢測分析了70例肝癌和正常肝組織的差異表達。也就是說各種不同的cDNA共計12800條多核苷酸序列作為靶DNA,其中包括本發(fā)明的多核苷酸。所有基因克隆于pBluescript II質(zhì)粒,用通用引物進行PCR擴增,純化所得擴增產(chǎn)物后將其濃度調(diào)到500ng/ul左右,用Cartesian 7500點樣儀(購自美國Cartesian公司)點于玻璃介質(zhì)上,點與點之間的距離為280μm。將點樣后的玻片進行玻片經(jīng)水合(2h)、室溫干燥(0.5h)、置于紫外交聯(lián)儀中交聯(lián),洗脫后干燥使DNA固定在玻璃片上制備成芯片。其具體方法步驟在文獻中已有多種報道,本實施例的點樣后處理步驟是1.潮濕環(huán)境中水合4小時;2.0.2%SDS洗滌1分鐘;3.ddH2O洗滌兩次,每次1分鐘;4.NaBH4封閉5分鐘;5.95℃水中2分鐘;6.0.2%SDS洗滌1分鐘;7.ddH2O沖洗兩次;8.涼干,25℃儲存于暗處備用。
      (二)探針制備用一步法分別從正常肝與肝癌中抽提總mRNA,并用Oligotex mRNA Midi Kit(購自Qiagene公司)純化mRNA,通過反轉(zhuǎn)錄分別將熒光試劑Cy3-dUTP(5-Amino-propargyl-2-deoxyuridine 5-triphate coupled to Cy3 fluorescentdye,購自Amersham Phamacia Biotech公司)標記正常肝組織的mRNA,用熒光試劑Cy5-dUTP(5-Amino-propargyl-2-deoxyuridine 5-triphate coupled to Cy5 fluorescentdye,購自Amersham Phamacia Biotech公司)標記肝癌組織mRNA,經(jīng)純化后制備出探針。
      具體步驟參照及方法見Schena,M.,Shalon,D.,Heller,R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9310614-10619.
      及文獻Schena,M.,Shalon,Dari.,Dayis,R.W.(1995)Science.270.(20)467-480.
      (三)雜交及洗滌分別將來自以上兩種組織的探針與芯片一起在UniHybTMHybridization Solution(購自TeleChem公司)雜交液中進行雜交16小時,室溫用洗滌液(1×SSC,0.2%SDS)洗滌。
      a)預(yù)雜交將含有0.5mg/ml魚精DNA的雜交液在95℃水浴鍋內(nèi)變性2min,已點樣的芯片也放入95℃水浴鍋內(nèi)變性30sec,然后將已變性的雜交液加到玻片的點樣區(qū)域內(nèi),蓋上蓋玻片,放入在雜交箱內(nèi)42℃預(yù)雜交6h。
      b)雜交將預(yù)雜交的玻片取出,置于95℃水浴中變性30sec。將加有雜交液的靶序列在95℃水浴中變性5min,取出后迅速置于冰上,然后加在芯片的點樣區(qū)域上,用蓋玻片Parafilm密封,置于雜交艙中,放入42℃雜交箱內(nèi)雜交16~18h。
      c)洗片準備兩個染色缸,分別裝有0.1×SSC+0.2%SDS和0.1×SSC+0.2%TWEEN20,放入50℃水浴鍋中。將雜交后的芯片依次浸入以上兩個染色缸中洗滌10min,用0.1×SSC沖洗玻片,室溫晾干。
      (四)芯片掃描及數(shù)據(jù)分析芯片洗滌后用ScanArray 4000掃描儀(購自美國General Scanning公司)在相應(yīng)波長進行掃描,掃描的圖象用Genepix3.01軟件分析熒光信號強度,進行數(shù)據(jù)分析處理,算出每個點的Ratio值,也就是Cy5/Cy3比值,該比值小于0.5大于2的點被認為是表達有差異的基因。Ratio值大于2的基因就是上調(diào)表達的基因,而Ratio值小于0.5的基因就是下調(diào)表達的基因。
      結(jié)果表明,本發(fā)明的基因都是在至少50%以上的肝癌樣本中發(fā)生顯著上調(diào)表達的基因,其中包括兩種新的人蛋白基因及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白基因,這些基因及其編碼的蛋白多肽可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途,見下表所示


      說實施例4用RT-PCR方法分析編碼在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的基因的表達用一步法分別從肝癌組織與正常肝組織中抽提總mRNA,用總RNA為模板,以oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,具體方法是用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL),反轉(zhuǎn)錄酶在42℃進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得cDNA,用Qiagene的試劑盒純化后,用本發(fā)明的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白基因的相應(yīng)引物進行PCR擴增。
      以本發(fā)明的兩種新的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白基因為例,進行PCR擴增的引物如下表所示

      特異引物1分別為位于SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的5’端的第1bp開始的正向序列;特異引物2分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的中的3’端反向序列。
      擴增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl,10mmol/LTris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,10pmol引物,1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個循環(huán)94℃30sec;55℃30sec;72℃2min。在RT-PCR時同時設(shè)β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產(chǎn)物用Qiagene公司的試劑盒純化,用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1和SEQ IDNO3所示的序列完全相同。
      結(jié)果表明,與cDNA芯片的實驗結(jié)果一致,與正常肝組織相比較,本發(fā)明的兩種新的人蛋白基因及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白基因在肝癌組織中都發(fā)生了上調(diào)表達,這些基因及其編碼的蛋白多肽可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途。
      實施例5Northern印跡法分析在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉,0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿,加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1),混合后離心。吸出水相層,加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70%乙醇洗滌,干燥并溶于水中。用20μg RNA,在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法制備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針分別為PCR擴增的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白編碼區(qū)序列(PP0174B04為第57bp至545bp,PP1277E03為第140bp至514bp)。將32P--標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜,該溶液包含50%甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后,將濾膜在1×SSC-0.1%SDS中于55℃洗30min。然后,用Phosphor Imager進行分析和定量。
      結(jié)果表明,與cDNA芯片和RT-PCR的實驗結(jié)果一致,與正常肝組織相比較,本發(fā)明的兩種新的人蛋白基因及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白基因在肝癌組織中都發(fā)生了上調(diào)表達,這些基因及其編碼的蛋白多肽可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途。
      實施例6重組在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的體外表達、分離和純化分別根據(jù)SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的編碼區(qū)序列,各設(shè)計出一對特異性擴增引物,序列如下表所示

      此兩段引物的5’端分別含有NdeI和EcoRI酶切位點,其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列,NdeI和EcoRI酶切位點相應(yīng)于表達載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品,Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。分別以含有全長目的基因的pBS-PP0174B04和pBS-PP1277E03質(zhì)粒為模板,進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為總體積50μl中含pBS-PP0174B04和pBS-PP1277E03質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymeraseMix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃20s,60℃30s,68℃2min,共25個循環(huán)。用NdeI和EcoRI分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進行雙酶切,分別回收大片段,并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α,在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后,用菌落PCR方法篩選陽性克隆,并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0063g07)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中,宿主菌BL21(pET-0063g07)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期,加入IPTG至終濃度1mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體,經(jīng)超聲波破菌,離心收集上清,用能與6個組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind QuickCartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進行層析,得到了純化的目的蛋白在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳,分別在17820Da和13640Da處得到一單一的條帶。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析,結(jié)果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2和SEQID NO4所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
      實施例7抗在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)分別合成下述在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白特異性的多肽PP0174B04蛋白多肽NH2-Met-Thr-Ala-Ile-Arg-Glu-Pro-Asp-Ile-His-Gln-Asp-His-Gly-Gly-COOH(SEQ ID NO13)PP1277E03蛋白多肽NH2-Met-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys-Ile-Leu-Cys-Ile-Ile-Ile-Ile-Ile-His-COOH(SEQ ID NO14)將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合,方法參見Avrameas,et al.Immunochemistry,1969;643。用4mg上述血藍蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔,15天后再用血藍蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上,用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白結(jié)合。
      實施例8免疫組化免疫組化試劑盒購自博士德生物工程有限公司,標本均經(jīng)3.33mol/L(10%)中性福爾馬林固定,石蠟包埋。連續(xù)組織切片厚4μm,分別進行免疫組化染色。免疫組化步驟脫蠟至水后加枸櫞酸緩沖液10mmol/L(pH6.0)95℃10min,正常羊血清封閉15min,加入一抗(濃度均為1∶100),室溫孵育4h,加生物素-SP標記二抗,室溫孵育30min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染封片。上述各步驟間均用PBS洗滌3次,每次5min。用已知陽性切片作陽性對照,以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷采用雙盲法判讀,陽性反應(yīng)為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。統(tǒng)計學(xué)計數(shù)資料用x2檢驗,計量資料用t檢驗。
      結(jié)果表明,與正常肝組織相比較,本發(fā)明的兩種新的人蛋白及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白在肝癌組織中都發(fā)生了上調(diào)表達,這些蛋白及其編碼序列可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途。
      實施例9組織芯片組織芯片又稱組織微陣列(tissuemicroarray,TMA),系將大量組織高密度地固定于載玻片上,然后用其進行免疫組化、原位雜交或其它分子病理檢測技術(shù)操作,以研究、比較靶標成分(如待測基因或其表達產(chǎn)物,或其它病理學(xué)改變)在不同標本之間的差異情況,它可在一張切片上高通量獲取組織學(xué)、基因和蛋白的表達信息。其制備步驟如下將目標蠟塊放在39~42℃水浴中軟化3min,然后從組織塊選定部位逐個取出0.6mm組織柱,隨即推入空白陣列模塊中,排布成組織芯片;最后將制成的組織芯片面向下放在玻片上,37℃放置30min。取出輕壓玻片,使組織柱在模塊中排平。一般一張TMA可排列600個0.6mm組織柱,切片厚度2~3μm,一般可切片50~100張。同大體組織標本一樣,TMA可應(yīng)用于HE染色、免疫組化、原位雜交,甚至組織顯微切割分析。由于具有高通量及規(guī)則排列易于自動化分析等特點,同一套TMA可迅速對上百種生物分子標記物(抗原、DNA、RNA等)進行分析。因此TMA在分子標記物預(yù)后價值的判斷及分子蛋白信息向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)換研究中具有重大意義。
      TMA和DNA芯片聯(lián)合應(yīng)用,組織芯片與基因芯片聯(lián)合使用在尋找和確定致病基因方面有很好的互補作用?;蛐酒蓪Τ汕先f的基因進行高通量檢測,但無法將已篩選出的相關(guān)基因中的原發(fā)和繼發(fā)改變基因區(qū)分開來。因此,基因芯片篩選的候補腫瘤基因必須通過大量的實際病例來檢驗,而這正是組織芯片的優(yōu)勢所在。首先,將基因芯片篩選的基因做成探針,用探針與組織芯片中眾多腫瘤組織進行熒光原位雜交,然后找出與腫瘤相關(guān)的基因。
      我們的實驗方法是采集同一肝癌患者的肝臟病理組織,按照肝癌腫瘤組織/正常肝組織的順序排列成兩個一組,70例患者共140個組織標本依點陣方式制成組織芯片,其詳細制作方法見上面所述。用于檢測在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的免疫組織化學(xué)技術(shù)為鏈霉親和素-生物素過氧化物酶復(fù)合物(SP)法,單克隆抗體工作濃度為1∶10,抗原修復(fù)方法為高壓蒸汽法(121℃、1.2個大氣壓10min),SP試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品。以已知在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白陽性切片作為陽性對照,以PBS液、小鼠陰性血清代替一抗作為空白及陰性對照。結(jié)果判定在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白陽性染色呈棕黃色,每個組織點位隨機選擇5個高倍視野(×400)觀測組織細胞蛋白表達,細胞中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)判為陽性,未見陽性著色細胞為陰性,陽性著色細胞數(shù)<30%為(+),30%~60%為(++),彌漫著色為(+++)。統(tǒng)計學(xué)處理SPSS(Ver10.0)統(tǒng)計軟件包,x2檢驗。
      結(jié)果表明,與正常肝組織相比較,本發(fā)明的兩種新的人蛋白及另外二十種在診斷肝癌方面有新用途的人蛋白在肝癌組織中都發(fā)生了上調(diào)表達,這些蛋白及其編碼序列可以用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物等用途。
      SEQUENCE LISTING&lt;110&gt;上海博星基因芯片有限責任公司&lt;120&gt;肝癌中上調(diào)表達的兩種新的人蛋白及其編碼序列和另外二十種人蛋白在肝癌診斷中的新用途&lt;130&gt;1&lt;160&gt;14&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;2309&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;1ggaaaacttt gggagagatt actaagcgtg tgggccaagt gctgtttgct aaagagatga 60ctgctataag ggagccagat attcatcaag atcatggggg aaaagactca aaggtatttc 120agagatcttt gaggcttccc cttctaccac agtcccagag ctctaggagg gaaggatgtt 180tctggaggca gacctgggac atcttccaca ggctcactct tcagagctgc cttgggcccc 240tgctccccac atttcattgc aagcacctct tggccacccc agctgtggct caagcaggcc 300caggtgtggc tcatgatacc attctggagg ttacaaactg taaactttgg tggcatctac 360atggtactaa ttctgcaggt acacagaatg taagaactgt ggagacatgt cttccttcac 420caagacctca aaggaaggca tggacagcct gggtgcccag gcagagatgt atcaccaggg 480tggagccact cagaggctca ccagggcagt gcctagtgga gctgtggaag tggggccacc 540cctaagatcc tggaacttta gggacaccag tctgcaactc cagcccaaga gaactgaagc 600atggactgag ccctgcaaag ccataggaac agacctgccc aaggttttgg gggcccaacc 660cctcaccccc aacaagttat aagctgtgtc cagcatacag gacatggagt caaaggagat 720tattctctgg ttttaagatt taatgctgtt tttactgttg agttttgaac ttaggaccag 780ttaccccttt ctttttgctt atatctctat tttggaatgg gaatgtctat cctgtgtctg 840tcccactatt gtgttttgga agtagataac ttgttttgat ttcacaaact tagagctgga 900gggagtttgc cccaggtgaa tcaggccttg agtctcaacc atatctgatt tagatgagac 960ttcagacttt tgagttgatg ctggaacaag ttaagactct gaggctattg ggatgtaatc1020actgtatttt acattgtgaa gacataaatt ttgggggttg gggaaaaatg ctacagtttg1080tatgtatgcc ccagaagttc atatgttgaa aacaattaat cttcgatgta acagtattag1140gaatggggct tttaagaggt gattaagaca tgagggctct tcccttatga atggatgaat1200gcttttatca tggaagtggg ttagttacag tgagagtgtg caaaatacat tgaaatacat1260
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      Leu Trp Trp His Leu His Gly Thr Asn Ser Ala Gly Thr Gln Asn Val100 105 110Arg Thr Val Glu Thr Cys Leu Pro Ser Pro Arg Pro Gln Arg Lys Ala115 120 125Trp Thr Ala Trp Val Pro Arg Gln Arg Cys Ile Thr Arg Val Glu Pro130 135 140Leu Arg Gly Ser Pro Gly Gln Cys Leu Val Glu Leu Trp Lys Trp Gly145 150 155 160His pro&lt;210&gt;3&lt;211&gt;1396&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;3gtagagatgg ggtttcaccg tgttggccag gctggtctcg aactcctgac ctcgtgatcc 60acctgcctcg gcctcctaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccactgtg cctggcttaa 120atctgaaact tttctaaaca tgaaatctac tttaaaaata ctgtgcatca tcatcatcat 180ccacttgctg tggtctaaaa atactcagat gtatctacct tctttccccc aaatcgatgc 240ctttgttgtt gctttcaatg tacgttattt tgaatgcttt gtatactgta gagtgctcca 300caaagtcagg aagctctttt tcttgtatgg ctcactgccc tcttcaggtg ttacgctgga 360tgttctcaag ttatctctgg tcttgtcagg ctttactcct ccttcctgtc ctgaggcaca 420ggcttgcact ccctctttct ctacctctgt gtttgctcac actcttgctc tctatcctgc 480tgctctacct tctctttctg ttcttgtggg ataactatgg gaataaaatt cagatttatt 540ttcctaattc tcttctgaaa attttgaact ggggaatatt gatgtcttct atttctatct 600tctaacttta caaaataagg atattctcca gattcacaag gaatgtgtat gagcactaag 660agaatgcatt tggaaccctt taggcaatgg aagaggaagg accagaaatt cagcaaaatc 720aatagctgag ttcttacaga gaaagagagg cagggaacat tatgtctcta tctatgatga 780gaggcatgtt tttctactct ctaggaaatg acttcctgca aatgatggcc agataaatca 840gaggtcatgg tccgtggaat tgctattttt ctcagttgac aatgtgtaga cgacagggtt 900tataaccagt actacttctc atgccatttg ctctgatttt ataacagcga cttcagctcc 960aattgtggac ctgattgcaa gatagtctta aattctcaaa aggagctaga accctggaat1020gtatgtaaat tttttaaatt tatttttaaa acctgaatgc caaaaagtat ttgaatgaaa1080gagtcaatca gtccaaaaac aattgcgtac ctctctggaa ggtctagtga aagggaaagg1140gaagagagaa ggaagaaagg agaatgggga aaaaaaactt ttcttccttt tacatatcca1200gctgtaatga gttcagaatg caatattgtg ccagtgggtt acagtgtgtt tcataaaagg1260
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      &lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;6gatttaagca tttattaata ccag 24&lt;210&gt;7&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sAPiens&lt;400&gt;7gtagagatgg ggtttcaccg tgtt 24&lt;210&gt;8&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;8aacataggcc gagcggcccg acat 24&lt;210&gt;9&lt;211&gt;28&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;9ccccatatga ctgctataag ggagccag 28&lt;210&gt;10&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;10gtcccttaag ttccaggatc ttag 24&lt;210&gt;11&lt;211&gt;31&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens
      &lt;400&gt;11tccccatatg aaatctactt taaaaatact g 31&lt;210&gt;12&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;12cccgaattcc catagttatc ccacaagaac 30&lt;210&gt;13&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;13Met Thr Ala Ile Arg Glu Pro Asp Ile His Gln Asp His Gly Gly1 5 10 15&lt;210&gt;14&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;14Met Lys Ser Thr Leu Lys Ile Leu Cys Ile Ile Ile Ile Ile His1 5 10 1權(quán)利要求
      1.一種分離的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白,其特征在于,它包含具有選自下組的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4,或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
      2.如權(quán)利要求1所述的多肽,其特征在于,該多肽是具有選自下組的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4。
      3.一種分離的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,該核苷酸序列與選自下組中的一種核苷酸序列有至少85%相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述的多肽的多核苷酸;(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
      4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4。
      5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,該多核苷酸的序列選自下組SEQID NO1、SEQ ID NO3的編碼區(qū)序列或全長序列,也就是SEQ ID NO1中57-545位的序列或1-2309位的序列,以及SEQ ID NO3中140-514位的序列或1-1396位的序列。
      6.一種含有外源多核苷酸的重組載體,其特征在于,它是由權(quán)利要求3-5中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運載體表達載體構(gòu)建而成的重組載體。
      7.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞,其特征在于,它是選自于下列一種宿主細胞(a)用權(quán)利要求6所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞;(b)用權(quán)利要求3-5中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
      8.一種在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白多肽的制備方法,其特征在于,該方法包含(a)在適合表達在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的條件下,培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的工程化宿主細胞;(b)從培養(yǎng)物中分離出在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白多肽。
      9.一種能與權(quán)利要求1所述的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白特異性結(jié)合的抗體。
      10.一種核酸分子,它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-800個核苷酸。
      11.如權(quán)利要求1-2中的任一權(quán)利要求所述多肽的應(yīng)用,其特征在于,它應(yīng)用于篩選在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的模擬物、激動劑,拮抗劑或抑制劑;或者用于肽指紋圖譜鑒定;或者用于作為肝癌診斷的腫瘤標志物。
      12.如權(quán)利要求3-5中的任一權(quán)利要求所述的核酸分子的應(yīng)用,其特征在于,它作為引物用于核酸擴增反應(yīng),或者用于制造基因芯片或微陣列;或者用于作為肝癌診斷的腫瘤標志物。
      13.在肝癌組織中上調(diào)表達的另外二十種人蛋白及其編碼序列在診斷肝癌方面的新用途,其特征在于,它用于肝癌的檢測,作為肝癌診斷的腫瘤標志物。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了兩種新的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于診斷和治療癌癥等疾病如肝癌的方法。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其用于疾病診斷和治療等多種用途。本發(fā)明還公開了編碼這兩種新的在肝癌組織中上調(diào)表達的人蛋白的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了另外二十種在肝癌組織中上調(diào)表達的入蛋白及其編碼序列在診斷肝癌方面的新用途(以前沒有人報道過其在肝癌診斷方面的用途)。
      文檔編號C07K14/47GK1765925SQ20041006765
      公開日2006年5月3日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
      發(fā)明者孫美倩, 李瑤, 裘敏燕, 謝毅, 毛裕民 申請人:上海博星基因芯片有限責任公司
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