專利名稱：：對表面表達(dá)有mcsp的細(xì)胞的細(xì)胞毒性的介導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)；更特別涉及使用癌癥緩解性抗體(CDMAB)來啟動(dòng)細(xì)胞毒性反應(yīng)，可根據(jù)情況選擇與一種或多種化療劑聯(lián)合使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明CDMAB進(jìn)行結(jié)合分析。
背景技術(shù)：
：許多開發(fā)針對人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系的抗體的研究人員們各自獨(dú)立鑒定出黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白多糖(MCSP)。他們發(fā)現(xiàn)有一些抗體能與黑色素瘤細(xì)胞表面的特定抗原發(fā)生反應(yīng)。由于各自獨(dú)立開發(fā)，靶抗原出現(xiàn)多種叫法，后來統(tǒng)一確定為MCSP。因此MCSP又稱為高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)、人黑色素瘤蛋白多糖(HMP)、黑色素瘤相關(guān)蛋白多糖抗原(MPG)和黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白多糖(mel-CSPG)，現(xiàn)己鑒定出MCSP是各種特定抗體的抗原，其中一些抗體會在下文闡述。還發(fā)現(xiàn)MCSP與大鼠蛋白多糖NG2之間的同源性達(dá)80%以上，所以MCSP又稱為大鼠蛋白多糖NG2。MCSP是一種糖蛋白-蛋白多糖復(fù)合體，由一個(gè)250kDa的N連接糖蛋白和一個(gè)大于450kDa的蛋白多糖成分組成。核心糖蛋白以游離或硫酸軟骨素修飾的形式存在于黑色素瘤細(xì)胞表面。由于成功克隆到MCSP，所以它的一些結(jié)構(gòu)特征被鑒定出來，它有3個(gè)胞外域，共包含10個(gè)半胱氨酸(5個(gè)可能的二硫橋)、15個(gè)可能的N連接糖基化位點(diǎn)和11個(gè)潛在的硫酸軟骨素連接位點(diǎn)?？缒げ糠钟?個(gè)半胱氨酸，其功能還不清楚。胞質(zhì)域有3個(gè)蘇氨酸殘基，可能是蛋白激酶C進(jìn)行磷酸化的位點(diǎn)，不過至今還未發(fā)現(xiàn)MCSP被磷酸化。已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)惡性黑色素瘤中都表達(dá)有MCSP，最初認(rèn)為它在正常細(xì)胞和其它類型的腫瘤上很少見。早先得出此結(jié)論的研究曾采用免疫組化技術(shù)(IHC)，用抗MCSP抗體B5檢測經(jīng)甲醛或甲醇固定的正常組織和腫瘤組織上MCSP的分布。這一研究發(fā)現(xiàn)，所檢測的22例黑色素瘤和2例星形細(xì)胞瘤中與抗體B5發(fā)生反應(yīng)的分別為17例和2例，而檢測的23例癌癥中無一發(fā)生反應(yīng)。檢測的22例正常組織中，發(fā)現(xiàn)B5只與皮膚角化細(xì)胞、肺泡上皮、毛細(xì)血管內(nèi)皮結(jié)合。另一項(xiàng)研究是利用抗MCSP抗體9.2.27和冰凍組織切片檢測MCSP的組織分布。再次發(fā)現(xiàn)檢測的所有黑色素瘤組織和細(xì)胞系中都發(fā)生反應(yīng)，而6例不同類型的癌腫瘤中均無反應(yīng)。7例胎兒組織中只觀察到皮膚內(nèi)有反應(yīng)，主動(dòng)脈中有微弱反應(yīng)，而成人組織中，13例組織中只看到3例有反應(yīng)。后續(xù)研究是利用識別MCSP不同表位的抗MCSP抗體9.2.27、225.28S和A0122和冰凍組織來檢測MCSP分布。研究發(fā)現(xiàn)，所有抗MCSP抗體的染色圖譜近似，并且與神經(jīng)、間充質(zhì)、上皮來源的正常細(xì)胞和惡性腫瘤都發(fā)生反應(yīng)而以前認(rèn)為是MCSP陰性結(jié)果。尤其是，抗體B5與檢測的24例器官中的各種上皮、結(jié)締、神經(jīng)和肌肉組織都發(fā)生反應(yīng)，并且所檢測的34例各種類型的腫瘤中有28例發(fā)生反應(yīng)。研究者解釋說，出現(xiàn)這種差異是由于他們使用的IHC技術(shù)經(jīng)過了改進(jìn)，變得更加穩(wěn)定，他們注意到固定方法的選擇非常重要，并且猜測，MCSP抗原的一個(gè)重要特征是對IHC技術(shù)中的方法歩驟很敏感。為搞清楚MCSP在超微結(jié)構(gòu)水平的定位，研究者們又開展了進(jìn)一步研究。借助電子顯微鏡的免疫定位研究證實(shí)，MCSP幾乎專一性存在于黑色素瘤細(xì)胞表面的微區(qū)——微端絲中，而微端絲可能在細(xì)胞-細(xì)胞接觸和細(xì)胞-基質(zhì)粘連中發(fā)揮作用。1996年，MCSP被克隆出后，即以MCSPcDNA作探針，對腫瘤細(xì)胞系和正常人組織中分別表達(dá)的MCSP進(jìn)行了northern印跡分析。所檢測的8例不同腫瘤細(xì)胞系中，只在黑色素瘤細(xì)胞系中觀察到MCSP表達(dá)而在所檢測的16例正常成人和4例正常胎兒組織中未發(fā)現(xiàn)MCSP表逸MCSP在組織中定位的不同研究結(jié)果所表現(xiàn)出的這種不一致說明，可能還需要進(jìn)一步研究以闡明該抗原真正的表達(dá)圖譜，或者對報(bào)道結(jié)果之間的差異作出解釋。因?yàn)橐阎鞍锥嗵悄芙閷?dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-胞外基質(zhì)(ECM)間的相互作用，所以MCSP在這些過程中發(fā)揮的作用業(yè)已研究清楚。研究顯示，MCSP能促進(jìn)ci4卜整合素介導(dǎo)的粘連及黑色素細(xì)胞的擴(kuò)散。還有研究指出，MCSP核心蛋白發(fā)出信號，誘導(dǎo)pl3(T"募集及酪氨酸磷酸化，從而可調(diào)節(jié)細(xì)胞粘連和運(yùn)動(dòng)，幫助腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移。綜合這些研究成果可見，MCSP可通過激活整合素和激發(fā)細(xì)胞骨架重排路徑來促進(jìn)黑色素細(xì)胞粘連。研究還發(fā)現(xiàn)MCSP可能通過其硫酸軟骨素成分與膜3型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT3-MMP)建立某種聯(lián)系。有研究暗示，體內(nèi)黑色素瘤表達(dá)的MT3-MMP有可能促進(jìn)正在生長的腫瘤附近的ECM蛋白的降解，從而為腫瘤提供擴(kuò)張空間。所以，MT3-醒P與MCSP之間可能存在促進(jìn)黑色素瘤侵入的激活步驟。使用抗MCSP抗體進(jìn)行的體外分析試驗(yàn)也已陸續(xù)展開，以査明MCSP在腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移過程中所起的作用。抗體9.2.27被用來評價(jià)MCSP在不依賴錨定生長(anchorage-ind印endentgrowth)中所發(fā)揮的作用。黑色素瘤細(xì)胞在含抗體9.2.27的軟瓊脂中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示形成的細(xì)胞克隆數(shù)量特異性減少67-74%。這些研究結(jié)果暗示，MCSP可能參與細(xì)胞間相互作用，使細(xì)胞不依賴錨定生長。上述研究作者還通過測定牛主動(dòng)脈內(nèi)皮(BAE)細(xì)胞基膜上黑色素瘤細(xì)胞M14粘連的試驗(yàn)來檢測9.2.27對MCSP的抑制效果。該試驗(yàn)中，對9.2.27與單克隆抗體W6/32(針對所有I類組相容性抗原)對照的療效進(jìn)行比較。將M14對照細(xì)胞和經(jīng)抗體預(yù)先處理的M14細(xì)胞鋪在BAE細(xì)胞基膜上。結(jié)果顯示，9.2.27處理的細(xì)胞中，27%的細(xì)胞粘連受到明顯抑制，而W6/32處理的細(xì)胞中沒有觀察到顯著影響。通過掃描電子顯微術(shù)在超微結(jié)構(gòu)水平上證實(shí)用9.2.27進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理所獲得的另一更顯著作用是細(xì)胞擴(kuò)散受到抑制。針對黑色素瘤細(xì)胞開發(fā)的、經(jīng)證實(shí)能特異性識別MCSP的許多抗體己進(jìn)行了體外和體內(nèi)試驗(yàn)來確定其抗癌效果。單克隆抗體9.2.27識別MCSP的核心糖蛋白成分，是最早用于研究其腫瘤抑制特性的抗體之一。Bumol等人就9.2.27與9.2.27-白喉毒素A(DTA)結(jié)合物對裸鼠黑色素瘤的免疫治療效果開展了研究。最先進(jìn)行的是體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，該試驗(yàn)通過向蛋白中摻入[35S]蛋氨酸標(biāo)記來檢測9.2.27和9.2.27-DTA結(jié)合物對M21人黑色素瘤細(xì)胞中蛋白合成的影響。結(jié)果顯示，9.2.27-DTA結(jié)合物能顯著抑制M21黑色素瘤細(xì)胞的蛋白合成不過未結(jié)合的DTA產(chǎn)生的影響更大一些。而單使用9.2.27所產(chǎn)生的影響極小。另外，又對9.2.27和9.2.27-DTA結(jié)合物抗裸鼠中人黑色素瘤的效果進(jìn)行了研究。將M21腫瘤碎塊植入小鼠皮下，讓其生長3天，然后在第3天用9.2.27或9.2.27-DTA結(jié)合物治療小鼠，并每隔3天治療一次。比較受治小鼠和未受治對照小鼠的腫瘤體積。第18天(數(shù)據(jù)報(bào)告的最后一天)，與未治療對照相比，分別經(jīng)9.2.27治療和9.2.27-DTA結(jié)合物治療的小鼠顯示其腫瘤生長抑制率分別為64%和52%。在最初的這項(xiàng)研究中，作者得出結(jié)論說，9.2.27和9.2.27-DTA結(jié)合物對裸鼠中M21黑色素腫瘤生長的抑制效果大致相同。雖然這項(xiàng)最早的研究報(bào)告說9.2.27能抑制體內(nèi)腫瘤生長，但后續(xù)研究(包括前一研究作者開展的后續(xù)研究)卻證實(shí)裸露的9.2.27在體內(nèi)沒有任何抗腫瘤效果?？偠灾芯?.2.27對人腫瘤療效的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，雖然9.2.27能耙向癌細(xì)胞，但用裸露的9.2.27治療不產(chǎn)生抗癌活性。隨后，預(yù)期用9.2.27免疫結(jié)合物治療的研究中，嘗試在I期臨床試驗(yàn)中加大9.2.27的劑量。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和/或免疫過氧化物酶染色技術(shù)確定其腫瘤與9.2.27反應(yīng)的8例惡性黑色素瘤患者接受每周2次、劑量按1、10、50、100和200mg逐漸遞增的抗體靜脈注射。雖然患者未出現(xiàn)明顯毒性癥狀，而且9.2.27靶定在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤結(jié)上，但是并未觀察到臨床反應(yīng)。再后面的研究是將9.2.27與化療藥物阿霉素(DXR)結(jié)合，然后研究該結(jié)合物對體內(nèi)和體外黑色素瘤的生長抑制效果。利用[:iH]胸苷摻入試驗(yàn)，檢測DXR-9.2.27結(jié)合物對M21細(xì)胞的生長抑制效果。結(jié)果顯示，該結(jié)合物對靶細(xì)胞M21的生長呈現(xiàn)依賴特定劑量的抑制效果，對MCSP陰性對照細(xì)胞系沒有效果。沒有進(jìn)行體外試驗(yàn)來檢測單使用7.2.27的效果。為搞清楚DXR-9.2.27結(jié)合物在體內(nèi)的作用，給小鼠皮下注射M21細(xì)胞，讓腫瘤生長8-10天。第10天開始靜脈注射結(jié)合物，并每隔3天注射一次，持續(xù)30天。最后只在經(jīng)DXR-9.2.27結(jié)合物治療的小鼠中看到明顯的腫瘤生長抑制效果，而分別單獨(dú)使用DXR和9.2.27沒有顯示對腫瘤生長的抑制結(jié)果；9.2.27和DXR的混合物同樣顯示陰性結(jié)果。另外，還開展了一項(xiàng)有關(guān)9.2.27結(jié)合物效果的研究。Schrappe等人將化療劑4-去乙酰長春花堿-3-羧基酰肼(DAVLBHY)與9.2.27結(jié)合后檢測其對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用。向裸鼠皮下注射U87MG(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系)，然后在第2、5、7和9天進(jìn)行治療。結(jié)果顯示DAVLBHY-9.2.27結(jié)合物使腫瘤體積大大減小，而分別單獨(dú)用PBS或9.2.27治療的對照組中，腫瘤快速生長，與PBS相比，用9.2.27治療的小鼠的腫瘤體積沒有減小。據(jù)最初記載，針對人黑色素瘤細(xì)胞系M21的抗體225.28S與高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原發(fā)生反應(yīng)。該抗原分子隨后證實(shí)是MCSP。一項(xiàng)早期的研究對225.28S(IgG2a)溶解人黑色素瘤細(xì)胞系的能力進(jìn)行了檢測，并與另一個(gè)抗MCSP的抗體653.40S(IgGJ予以比較。結(jié)果確定225.28S和653.40S能識別MCSP上相同或空間上鄰近的抗原決定簇。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗體與補(bǔ)體結(jié)合后不能溶解黑色素瘤細(xì)胞。兩個(gè)抗體在抗體依賴的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中都可能介導(dǎo)黑色素瘤靶細(xì)胞溶解，其中225.28S的細(xì)胞溶解活性高于653.40S。但是，只有效應(yīng)物/耙細(xì)胞比例顯著高于其他研究報(bào)道的使用抗黑色素瘤抗原的抗體比例時(shí)才能發(fā)生黑色素瘤細(xì)胞溶解。研究作者得出的結(jié)論是，這些抗體與人補(bǔ)體結(jié)合不具有細(xì)胞溶解活性以及ADCC中發(fā)生溶解需要很高的效應(yīng)物/耙細(xì)胞比例的研究結(jié)果暗示將單克隆抗體注入黑色素瘤患者體內(nèi)可能不會破壞腫瘤細(xì)胞。作者建議，應(yīng)用這些抗體進(jìn)行免疫治療時(shí)，其作用應(yīng)只局限于做放射性同位素、化療劑或毒性劑的載體。為弄清裸露抗體225.28S在I期臨床試驗(yàn)中的治療能力，開展了向2例黑色素瘤晚期患者靜脈注射該抗體10mg的研究。雖然注射抗體并未產(chǎn)生臨床毒副作用，但亦未出現(xiàn)陽性治療反應(yīng)。研究人員將抗體225.28S與一種尤其對正在分裂的細(xì)胞產(chǎn)生毒性的低分子量多肽——嘌呤硫素結(jié)合后檢測其對人黑色素瘤細(xì)胞系Colo38的體外毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Colo38細(xì)胞與225.28S-嘌呤硫素結(jié)合物在一起培養(yǎng)24小時(shí)后，3H胞苷攝入受到抑制。另外，與結(jié)合物共培養(yǎng)7天后培養(yǎng)物中Colo38細(xì)胞的活性明顯降低。雖然觀察到體外毒性作用，但仍有一部分黑色素瘤細(xì)胞在225.28S-嘌呤硫素治療后存活。作者暗示，惡性疾病可能得依靠作為毒性劑載體的抗不同腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體雞尾酒療法來進(jìn)行免疫治療，這說明癌癥治療中僅使用225.28S結(jié)合物是不夠的。225.28S-嘌呤硫素結(jié)合物的治療效果是根據(jù)裸鼠體內(nèi)人黑色素瘤的生長情況來評定的。首先向裸鼠皮下或腹腔植入Colo38細(xì)胞。腹腔植入的小鼠在第l、3和5天接受治療，皮下植入的小鼠在第l、3、5和20天接受治療。監(jiān)控所有小鼠的生存情況。只在經(jīng)225.28S-嘌呤硫素結(jié)合物治療的腹腔植入小鼠中觀察到生存期明顯延長的統(tǒng)計(jì)學(xué)效果。僅使用225.28S^嘌呤硫素或225.28S和嘌呤硫素的混合物均沒有提高腹腔或皮下植入小鼠的生存期。記錄皮下植入小鼠的腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)只有225.28S-嘌呤硫素結(jié)合物的治療使腫瘤體積顯著減小，而單使用225.28S治療腫瘤體積沒有減小。研究人員還將225.28S與化療藥物甲氨蝶呤(MTX)結(jié)合，并研究其對體內(nèi)腫瘤生長的抑制效果。給裸鼠皮下接種人黑色素瘤細(xì)胞M21，然后第1、47、10和14天予以治療，結(jié)果顯示只有MTX-225.28S結(jié)合物能抑制腫瘤生長。而僅使用225.28s、氨甲蝶呤或225.28s和氨甲蝶吟混合物均不能抑制腫瘤生長。在一項(xiàng)研究中，225.28s被用來確定施用異種制劑是否對人有潛在毒性影響。向85例轉(zhuǎn)移性皮膚黑色素瘤患者施用經(jīng)1311、l2:'I、mIn或"Tc標(biāo)記的完整抗體225.28S或其F(ab'h片段。抗體注射量為14-750yg。各患者均未觀察到臨床副作用。該研究也未報(bào)道有臨床反應(yīng)，不過，因?yàn)檫@項(xiàng)研究主要用于毒理檢測，所以沒有必要預(yù)測該項(xiàng)結(jié)果。225.28s被用來產(chǎn)生鼠抗獨(dú)特型單克隆抗體，其包括產(chǎn)生MCSP鏡象的抗體MF11-30。研究顯示，醒Fll-30既能誘導(dǎo)同種系統(tǒng)又能誘導(dǎo)異種系統(tǒng)產(chǎn)生抗MCSP抗體。有兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)中對晚期惡性黑色素瘤患者按遞增劑量施用MMFll-30以檢測其毒性和治療反應(yīng)。該兩項(xiàng)研究中均未產(chǎn)生副作用，而且治療耐受性良好。第二項(xiàng)試驗(yàn)中，有7例患者所產(chǎn)生的抗-抗獨(dú)特型抗體的效價(jià)至少為1:8，血清中MCSP水平無顯著變化，平均生存期為55周(16-95周之間)，而其余患者(所產(chǎn)生的抗抗獨(dú)特型抗體的效價(jià)為l:4或更ffc血清中MCSP水平增加)的平均生存期為19周(8-57周之間)，前者明顯高于后者。抗體763.74也抗黑色素瘤細(xì)胞并識別MCSP。還沒有見到有關(guān)抗體763.74具有體外或體內(nèi)抗癌效果的任何報(bào)道、但使用該抗體也可產(chǎn)生鼠抗獨(dú)特型單克隆抗體。MK2-23屬于這類抗體，具有抗MCSP抗體763.74限定的決定簇的內(nèi)影像。臨床前實(shí)驗(yàn)顯示，MK2-23可免疫誘導(dǎo)同種宿主(BALB/c小鼠)和異種宿主(兔)產(chǎn)生抗MCSP抗體。MK2-23與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)載體結(jié)合并與佐劑一并施用后，14免疫原性顯著提高。臨床試驗(yàn)中用區(qū)2-23免疫黑色素瘤患者，觀察體液反應(yīng)特征。將MK2-23與KLH結(jié)合并與卡介苗(BCG)混合后免疫25例IV期黑色素瘤患者，分別于第0、7和28天皮下注射2mg。如果抗抗獨(dú)特型抗體的效價(jià)低，就再增加注射次數(shù)。在MK2-23免疫的患者中大約60%都產(chǎn)生了抗MCSP抗體，盡管抗體的親和力和效價(jià)都比較低。研究發(fā)現(xiàn)，患者經(jīng)區(qū)2-23免疫產(chǎn)生抗MCSP抗體后，生存期明顯比未經(jīng)MK2-23免疫的患者延長。產(chǎn)生抗MCSP抗體的患者的平均生存期為52周(19-93周之間)，而血清中沒有陽性抗MCSP抗體的9例患者的平均生存期為19周(9-45周之間)。3例產(chǎn)生抗MCSP抗體的患者的病情出現(xiàn)部分緩解。雖然本研究結(jié)果的前景看好，但是用區(qū)2-23免疫的患者中仍有40%沒有與陽性抗MCSP抗體發(fā)生免疫應(yīng)答。而且，3例出現(xiàn)部分緩解的患者最后又全部復(fù)發(fā)。曾嘗試用低劑量的環(huán)磷酰胺(CTX)對患者進(jìn)行預(yù)處理，以增加區(qū)2-23的免疫原性，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)磷酰胺通過選擇性抑制某些抑制性細(xì)胞活性來提高細(xì)胞和體液對腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)。但是，CTX預(yù)處理并沒有使區(qū)2-23的免疫原性發(fā)生變化。單克隆抗體48.7是針對人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系M1733產(chǎn)生的一類抗體，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它能與MCSP分子發(fā)生免疫反應(yīng)。I期臨床試驗(yàn)中聯(lián)合施用了48.7與鼠單克隆抗體96.5后一抗體能抵抗人黑色素瘤上的轉(zhuǎn)鐵蛋白樣細(xì)胞表面糖蛋白p97。5例患者接受了治療，第1、10天注射mAbs96.5和48.7各2mg，第2天各10mg，第3-10天各25mg。結(jié)果顯示，治療耐受性良好；但是所有患者對治療無臨床反應(yīng)，而且均出現(xiàn)疾病進(jìn)展。另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中對這兩個(gè)抗體也進(jìn)行了研究，其中，用帶有放射性標(biāo)記的兩個(gè)抗體中任一抗體的Fab片段治療3例黑色素瘤已轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的患者。向2例患者施以5mg標(biāo)記有'311的48.7Fab片段，并使患者血腦屏障(BBB)滲透性開放，試圖提高進(jìn)入腦腫瘤的抗體量。雖然改變血腦屏障滲透性能增加Fab向腫瘤所在腦半球和腦脊液的釋放量，但并未發(fā)現(xiàn)該抗體明顯、持久地在腫瘤部位局部釋放。研究者們猜測這可能是由于抗體劑量不足導(dǎo)致。Melimmune是兼具兩個(gè)模擬MCSP不同表位的鼠抗獨(dú)特型抗體，Melimmune-l(I-Mel-l)和Melimmune-2(I-Mel-2)牛寺點(diǎn)的制劑。I-Mel-l是針對抗MCSP抗體225.28(前面己討論)產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體MFll-30的亞克隆。研究顯示，I-Mel-1誘導(dǎo)兔發(fā)生抗MCSP免疫應(yīng)答。I-Mel-2是針對抗MCSP抗體MEM136產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體，MEM136與MCSP上作用的表位和225.28不同。I-Mel-2也誘導(dǎo)兔產(chǎn)生抗MCSP免疫應(yīng)答。包含1:1的I-Mel-1禾nI_Mel-2的Meli腿une制劑被用來對21例黑色素瘤被切除且未轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行I期試驗(yàn)。該項(xiàng)研究對一個(gè)機(jī)構(gòu)的12名患者作了詳細(xì)的免疫反應(yīng)分析。按照兩項(xiàng)治療方案中的一項(xiàng)方案，向患者施與0.2-0.4mgmelimmune(I-Mel-l和I-Mel-2各0.1-2.Omg)。所有患者均產(chǎn)生抗I-Mel-1和抗I-Mel-2的抗體，其中10例患者產(chǎn)生的抗I-Mel-2的抗體反應(yīng)峰大于I-Mel-1。但是，該研究不能證明誘導(dǎo)產(chǎn)生了MCSP特異性抗體，因?yàn)榛颊哐宀荒芤种茙в蟹派湫詷?biāo)記的225.28或MEM136與表達(dá)MCSP的Mel-21細(xì)胞結(jié)合。還進(jìn)行了一項(xiàng)直接細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)，來檢測患者血清中是否存在抗MCSP抗體；但是在基于FACS的試驗(yàn)中，免疫前血清和免疫后血清與M21細(xì)胞的結(jié)合沒有差別。又在另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中對I-Mel-2進(jìn)行了試驗(yàn)，其中向26例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者肌內(nèi)注射2mgI-Mel-2和100或250yg佐劑SAF-m，每兩周注射一次，持續(xù)4周，然后每兩月一次，直到出現(xiàn)疾病進(jìn)展。通過抑制放射免疫分析法檢測到5例患者產(chǎn)生抗MCSP抗體。在這5例產(chǎn)生陽性抗MCSP抗體的患者中，1例完全緩解，1例病情穩(wěn)定另3例病情出現(xiàn)進(jìn)鳳病情完全緩解的患者產(chǎn)生的抗MCSP抗體的效價(jià)最高(1:1500)。在先專利US5270202(及其相關(guān)專利:W09216646A1、EP0576570A1)i井授了一種針對抗人黑色素瘤相關(guān)蛋白多糖(亦稱HMW-MAA)抗體MEM136的抗獨(dú)特型抗體頂elpg2(亦稱頂32)。文中指出頂elpg2抗體特異性靶向MEM136，建議將其用于診斷和治療表達(dá)MPG抗原的相關(guān)疾病。雖然體外試驗(yàn)確定IMelpg2能抵抗腫瘤細(xì)胞侵入，但它并不是所試驗(yàn)的最有效的抗體，而且盡管出現(xiàn)Ab3應(yīng)答，也不能證明它在體內(nèi)具有抗腫瘤療效。EP0380607B1講授了一類針對Mab225.28的抗獨(dú)特型抗體，它對H麗-MAA的一個(gè)未知表位有特異性。這類抗體被用于黑色素瘤自動(dòng)免疫治療。文中報(bào)道通過動(dòng)物模型對針對225.28產(chǎn)生的MFll-30和IMelpgl以及抗獨(dú)特型多克隆抗體予以評價(jià)，其中使用MF11-30對黑色素瘤患者進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，但沒有數(shù)據(jù)支持。MFll-30能誘導(dǎo)產(chǎn)生獨(dú)特型抗體225.2&在用BM-Cycline處理MF11-30細(xì)胞系并檢測支原體污染清除效果時(shí)，獲得頂elpgl細(xì)胞系。雖然兔血清中能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IMelpgl抗體，而且該抗體能與Colo38黑色素瘤細(xì)胞結(jié)合，但并不表明它具有體內(nèi)或體外抗腫瘤活性。US4879225講授從不可溶的免疫復(fù)合物中制備抗體。該專利中，抗HMW-MAA的抗體Mab9.2.27被固定在蛋白A-瓊脂糖上用作抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Mab9.2.27的大鼠抗獨(dú)特型抗體，多種與瓊脂糖結(jié)合的細(xì)胞或細(xì)胞溶解產(chǎn)物復(fù)合物產(chǎn)生抗黑色素瘤細(xì)胞抗體。將與黑色素瘤細(xì)胞結(jié)合、但不與正常T細(xì)胞或B細(xì)胞結(jié)合的鼠單克隆抗體與9.2.27進(jìn)行比較，從中選擇與9.2.27特性類似的抗體，進(jìn)一步表示為NR-ML-02、NR-ML-03、NR-ML-04、NR-ML_05、NR-ML_06。這些抗體在用9.2.27作捕獲抗體、用可溶性SKMEL-28黑色素瘤膜作抗原的夾心ELISA試驗(yàn)中均表現(xiàn)為陽性。另外這些抗體還能識別黑色素瘤細(xì)胞并且可與平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)。另外還產(chǎn)生61種抗蛋白多糖抗體，其中10種抗體識別與NR-ML-02/NR-ML-04相同的決定簇，3種抗體識別與NR-ML-03或NR-ML-05相同的決定簇；45種抗體識別的決定簇與該5種抗體確定的決定簇不同。US5084396中，這些抗體經(jīng)放射性標(biāo)記后與9.2.27比較攜帶黑色素瘤異種移植物的裸鼠中的腫瘤攝取量。結(jié)果顯示，腫瘤對NR-ML-05和NR-ML-02產(chǎn)生的攝取量最大，9.2.27次之，NR-ML-02最小。這些發(fā)明既不能說明這些抗體能減小癌癥的腫瘤負(fù)荷，也不能說明這些抗體能延長患癌癥的哺乳動(dòng)物的生存期。US5034223講授一種通過用未結(jié)合的封閉抗體預(yù)處理來增加結(jié)合抗體向攜帶腫瘤相關(guān)抗原的組織釋放量的方法。該方法中，先施用未標(biāo)記的MabNR-2AD(僅對一例患者的B細(xì)胞淋巴瘤有特異性的抗獨(dú)特型抗體)，然后再在臨床上施用與technicium99(Tc_99)結(jié)合的抗匿W-MAA、9.2.27和NR-ML-05的抗體。由于這些研究是利用既沒有細(xì)胞毒性、也沒有放射性效果的Tc-99作報(bào)告同位素，雖然用這種方法可以提高抗HMW-MAA抗體的攝取量，但并沒有證據(jù)證明抗腫瘤效果產(chǎn)生。US5580774講授利用編碼Mab9.2.27的抗體基因構(gòu)建嵌合抗體。文中沒有公開用該嵌合抗體進(jìn)行癌癥診斷或治療的內(nèi)容。US5493009和US5780029講授針對抗HMW-MAA抗體763.74的鼠抗獨(dú)特型抗體MK2-23及其結(jié)合物。文中記載，MK2-23可以直接與763.74結(jié)合而抑制763.74與黑色素瘤細(xì)胞Colo38結(jié)合。另外，MK2-23誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ab3可以與H麗-MAA直接結(jié)合，并能競爭性抑制763.74與Colo38黑色素瘤細(xì)胞結(jié)合。在臨床試驗(yàn)中用離2_23對IV期黑色素瘤患者進(jìn)行自動(dòng)免疫治療。89%患者的免疫后血清與Colo38黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)從而抑制763.74與Colo38細(xì)胞結(jié)合，這暗示患者血清中誘導(dǎo)產(chǎn)生了Ab3抗體。文中報(bào)告15例患者中有6例患者的轉(zhuǎn)移病灶尺寸減小，但沒有提供研究細(xì)節(jié)?；颊哐逯兄挥胁糠挚贵w的特異性予以確定，仍不清楚Ab3抗體的存在是否在一定程度上與觀察到的臨床反應(yīng)有關(guān)，因?yàn)?63.74抗體原本不具有抗腫瘤效果。US5866124講授來源于匿2-23的針對抗HMW-MAA抗體763.74的抗獨(dú)特型嵌合抗體MK2-CHy1及其衍生物。說明書第12/47頁US5017693、US5707603、US5817774、US6248870、US5112954、US6238667等眾多發(fā)明講授了與抗HMW-MAA抗體結(jié)合的化合物，但沒有揭示它們在癌癥治療方面的應(yīng)用。重要地是，單獨(dú)使用這些抗體就能產(chǎn)生抗癌療效，它們并不需要通過結(jié)合來獲得細(xì)胞毒性或抑制細(xì)胞的作用。這些專利和專利申請雖然鑒定出MCSP抗原和相關(guān)抗體，但要么沒有公開本發(fā)明所分離的單克隆抗體，要么沒有講授或暗示本發(fā)明所分離的單克隆抗體的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人之前已取得名為〃患者個(gè)體特異性抗癌抗體〃的美國專利6，180，357，其涉及一種選擇癌癥治療個(gè)性化抗癌抗體的方法。本文中，術(shù)語"抗體"和"單克隆抗體〃(mAb)可以互換使用，都是指雜交瘤細(xì)胞(如老鼠或人)產(chǎn)生的完整免疫球蛋白、免疫結(jié)合物，有些情況下也指免疫球蛋白的片段和它的重組蛋白，如嵌合免疫球蛋白和人源化免疫球蛋白、F(油')和F(ab')2片段、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(qū)(Fv)s、融合蛋白等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該很清楚，多肽中某些氨基酸序列的變化不會顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能?？贵w分子重排中，一般可以容忍其骨架區(qū)核酸或氨基酸序列的修飾，這些修飾包括但不限于，取代(保守取代優(yōu)先)，缺失或添加。另外，將標(biāo)準(zhǔn)化療形式(如放射性核素)與本發(fā)明CDMAB結(jié)合起來在所述化療方面予以應(yīng)用也屬于本發(fā)明的范圍。CDMAB還能與毒素、細(xì)胞毒性組分(cytotoxicmoiety)、酶(如生物素結(jié)合酶)或血細(xì)胞結(jié)合在一起形成抗體結(jié)合物。本申請使用'357專利中講授的制備患者特定抗癌抗體的方法來分離編碼癌癥緩解性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。這些抗體能特異性針對一個(gè)腫瘤，從而使定制癌癥治療方案具備可行性。本文中，以下具有細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒性)或細(xì)胞生長抑制(細(xì)胞抑制性)特性的抗癌抗體稱為細(xì)胞毒素。它們能輔助用于癌癥分期和診斷，還能用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。個(gè)性化抗癌治療的前景有望改變患者的治療方式。臨床設(shè)想如下在腫瘤發(fā)生時(shí)采集腫瘤樣本并存到腫瘤庫中。根據(jù)現(xiàn)有的癌癥緩解性抗體組，進(jìn)行腫瘤樣本分型。先按傳統(tǒng)方法對患者分期，然后可再用相應(yīng)抗體進(jìn)一步分期。可以直接用已有抗體對患者盡速治療，或者用本文概括的方法或使用噬菌體表面呈現(xiàn)文庫并結(jié)合本文公開的篩査方法制備腫瘤特異性抗體組后進(jìn)行治療。將制備的所有抗體加到抗癌抗體庫中，因?yàn)橛锌赡芷渌[瘤也會產(chǎn)生某些與正在治療的腫瘤一樣的抗原表位。根據(jù)本方法制備的抗體可用于治療能與其結(jié)合的癌癥?；旧鲜褂脤＠鸘S6，180，357和專利申i青No.10/348，231中公開的方法，用患者乳腺癌活檢細(xì)胞免疫小鼠獲得小鼠單克隆抗體11BD-2Ell-2。人不同組織來源的一些細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)有HBD-2E11-2抗原。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和卵巢癌細(xì)胞系0VCAR-3在體外對11BD-2E11-2的細(xì)胞毒性作用比較敏感。根據(jù)11BD-2E11-2對培養(yǎng)的MCF-7和0VCAR-3細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性的研究結(jié)果，進(jìn)一步將11BD-2E11-2植入小鼠內(nèi)，以查明它對這些癌細(xì)胞是否有抗癌活性(如專利申請No.10/762，129所述)。臨床前異種移植腫瘤模型已公認(rèn)為有效的療效預(yù)測模型。在預(yù)防人乳腺癌體內(nèi)模型中，11BD-2E11-2能防止腫瘤生長并減小腫瘤負(fù)荷(據(jù)專利申請No.10/762，129記載)。第51天(最后一次治療后不久)，11BD-2E11-2治療組中腫瘤平均體積為同型對照組體積的20%。治療后持續(xù)監(jiān)測280天。11BD-2E11-2治療組中40%自移植后生存期在7.5個(gè)月以上。相反，治療后6.5個(gè)月同型對照組的死亡率達(dá)100%。所以在較為成熟的人乳腺癌模型中，與對照治療組相比，11BD-2E11-2使生存期增加、腫瘤負(fù)荷減小。為確定11BD-2E11-2在其他人乳腺癌模型中也有同樣療效，在所建立的一個(gè)乳腺癌模型中檢測它對MDA-MB-468(MB-468)細(xì)胞的抗腫瘤活性(如專利申請No.10/810，744所述)。結(jié)果顯示，與緩沖液對照相比，11BD-2Ell-2抑制腫瘤生長達(dá)250/0。所以，11BD-2E11-2在所建立的預(yù)防乳腺癌異種移植模型中能防止腫瘤生長。另外，它在至少兩種不同的乳腺癌模型中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。11BD-2E11-2治療除在人乳腺癌模型中產(chǎn)生有益效果外，還在預(yù)防卵巢癌模型中表現(xiàn)出抗0VCAR-3細(xì)胞的抗腫瘤活性(如專利申請No.10/762，129所述)。該模型中用體重作為腫瘤進(jìn)展的檢測指標(biāo)。移植后第80天(治療結(jié)束后第16天)治療組小鼠的平均體重占對照組的87.6%(p=0.015)。在一個(gè)較為成熟的人卵巢癌模型中，HBD-2E11-2與緩沖液對照治療組相比，能延緩腫瘤進(jìn)展，因此HBD-2E11-2治療具有一定療效。11BD-2E11-2因具有抗腫瘤活性而在幾個(gè)不同癌癥模型中成為備受矚目的抗癌治療劑。為確定11BD-2E11-2在其他人卵巢癌模型中也有同樣療效，在建立的一個(gè)卵巢癌模型中檢測它對ES-2+SEAP細(xì)胞(經(jīng)人胎盤分泌的堿性磷酸酶(SEAP)轉(zhuǎn)染的ES-2卵巢癌細(xì)胞)的抗腫瘤活性(如專利申請No.10/810，744所述)。與緩沖液對照相比，11BD-2E11-2使治療組中小鼠群的生存期延長。另外，11BD-2E11-2治療組內(nèi)1只小鼠在治療后SEAP循環(huán)水平大大降ffcSEAP循環(huán)水平可用作腫瘤負(fù)荷指示因子。所以，11BD-2E11-2在建立的預(yù)防卵巢癌異種移植模型中能防止腫瘤生長。另外，它在兩種不同的人卵巢癌模型中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。生化數(shù)據(jù)表明11BD-2E11-2的抗原是MCSP(如專利申請No.10/810，744所述)，先前的免疫組織化學(xué)分析及其他實(shí)驗(yàn)室開展的體外試驗(yàn)均已證實(shí)黑色素瘤細(xì)胞上表達(dá)有MCSP，并且指出MCSP與腫瘤粘連、侵入和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，11BD-2Ell-2在所建立的預(yù)防人黑色素瘤模型中被確定具有療效。在預(yù)防黑色素瘤模型中，第55天(治療結(jié)束后第5天)，11BD-2E11-2治療組中腫瘤平均體積占緩沖液對照治療組體積的58%(p=0.046)。在建立的模型中，療程結(jié)束后，抗體11BD-2E11-2與緩沖液對照治療組相比抑制腫瘤生長達(dá)491由于本次實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物數(shù)量有限實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有達(dá)到顯著水平(p二0.1272)，但趨勢卻一目了然。所以，11BD-2E11-2在建立的預(yù)防惡性黑色素瘤異種移植模型中能防止腫瘤生長，另外，11BD-2E11-2在兩種不同的人乳腺癌和卵巢癌模型以及人黑色素瘤模型中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。為確認(rèn)11BD-2E11-2表位可作為藥物耙點(diǎn)，檢測冰凍正常人組織中是否表達(dá)有11BD-2E11-2抗原(如專利申請No.10/810，744所述)。通過用11BD-2E1卜2染色的IHC技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)組織，包括肝、腎和心臟等活的器官的細(xì)胞，都不表達(dá)11BD-2E11-2抗原。雖然幾乎所有組織的血管平滑肌纖維被染色，但亦有某些組織上皮也被染了色。搞清楚乳腺癌患者體內(nèi)11BD-2E11-2抗原的定位及分布對評價(jià)11BD-2E11-2的免疫療效和設(shè)計(jì)有效的臨床試驗(yàn)至關(guān)重要。為確定癌癥患者的乳腺瘤中11BD-2E11-2抗原的表達(dá)位置，從來自8例(7份額外樣本或者完全分離，或者不代表微陣列切片上的腫瘤)乳腺癌患者的腫瘤組織樣本中篩選表達(dá)11BD-2E11-2抗原的樣本(據(jù)專利申請No.10/810，744所述)。研究結(jié)果顯示62%組織樣本染色呈陽性，說明存在11BD-2E11-2抗原?；颊邩颖緝?nèi)11BD-2E11-2的表達(dá)顯示為癌細(xì)胞特異性表逸因?yàn)橹挥袗盒约?xì)胞被染色。另外，3份(再從微陣列切片中完全分離出2份額外樣本)乳腺癌患者正常組織樣本中均沒有出現(xiàn)11BD-2E11-2染色。根據(jù)癌癥期或進(jìn)展程度分析腫瘤時(shí)，從結(jié)果中看不出11BD-2E11-2陽性表達(dá)量隨腫瘤期別增加而增加的趨勢。但由于樣本規(guī)模小，所以研究結(jié)果有一定局限性。由于11BD-2E11-2的抗原是MCSP(據(jù)專利申請No.10/810,744所述)，而且以前的免疫組織化學(xué)分析及其他實(shí)驗(yàn)室開展的體外試驗(yàn)均已證實(shí)黑色素瘤細(xì)胞上表達(dá)MCSP，所以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定惡性黑色素瘤患者群體中11BD-2E11-2抗原的定位及其分布。這有助于評價(jià)11BD-2E11-2對黑色素瘤患者的免疫療效和設(shè)計(jì)行之有效的臨床試驗(yàn)。為確定癌癥患者黑色素瘤中IIBD-2E11-2抗原表達(dá)的位置，對來自33例惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織樣本進(jìn)行IIBD-2E11-2抗原表達(dá)的評估。研究結(jié)果顯示67%組織樣本染色呈陽性，說明存在IIBD-2E11-2抗原。患者樣本內(nèi)IIBD-2E11-2的表達(dá)顯示為癌細(xì)胞特異性表達(dá)，因?yàn)橹挥袗盒约?xì)胞被染色。另外，6份惡性黑色素瘤患者正常組織樣本中均沒有出現(xiàn)11BD-2E11-2染色。生化數(shù)據(jù)表明11BD-2E11-2所識別的抗原是MCSP(據(jù)專利申請No.10/810，744所述)。研究顯示IIBD-2E11-2免疫沉淀蛋白被抗大鼠MCSP同源物的抗體識別，而抗MCSP免疫沉淀蛋白又被11BD-2Ell-2識別，從而支持了上述結(jié)論。這些IHC和生化結(jié)果均證實(shí)11BD-2E11-2與MSCP抗原結(jié)合。所以，確鑿證據(jù)顯示，11BD-2E11-2通過與MCSP上特定表位配接而介導(dǎo)抗癌作用。本文概述的其他生化數(shù)據(jù)也證實(shí)11BD-2E11-2所識別的抗原就是MCSP。這些抗體表位匹配結(jié)果表明11BD-2Ell-可能與具有兩個(gè)主要結(jié)合部位的一個(gè)不連續(xù)表位結(jié)合。總之，該數(shù)據(jù)證實(shí)IIBD-2E11-2抗原是癌癥相關(guān)性抗原，在人體內(nèi)表達(dá)，在病理上與癌癥靶點(diǎn)相關(guān)。另外，還證實(shí)IIBD-2E11-2抗體與人癌組織結(jié)合，并且適用于診斷、治療預(yù)測或預(yù)后等分析。此外，由于該抗原在大多數(shù)非惡性細(xì)胞中不表達(dá)，所以其細(xì)胞定位可指示出細(xì)胞的癌癥狀態(tài)，利用這種定位觀察方法可將該抗原及其基因或衍生物、蛋白或蛋白變體應(yīng)用于診斷、治療預(yù)測或預(yù)后等分析。目前已開發(fā)出許多不同的抗MCSP抗體，并己在許多體外和體內(nèi)系統(tǒng)中進(jìn)行了檢測。在臨床前模型中，除了一項(xiàng)研究結(jié)果不能重復(fù)外，其他結(jié)果均顯示，裸露的抗MCSP抗體在幾個(gè)不同的黑色素瘤模型和一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)模型中不能減小腫瘤或延長生存期；目前還沒有用抗MCSP抗體對其他癌癥類型展開研究。用裸露的抗MCSP抗體針對人進(jìn)行的全部試驗(yàn)均未產(chǎn)生任何臨床陽性結(jié)果。研究顯示，裸露的11BD-2E11-2在鼠人乳腺癌模型中能延長生存期和減小腫瘤負(fù)荷。11BD-2E11-2在鼠人卵巢癌模型中也能抑制腫瘤進(jìn)展和延長生存期。已將抗MCSP抗體與許多毒性或化療劑結(jié)合，這些結(jié)合物經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)在鼠黑色素瘤模型中均能取得陽性結(jié)果。還沒有關(guān)于抗MCSP結(jié)合物在人體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)的報(bào)道，所以這些結(jié)合物的安全性還不清楚。不過，僅用單克隆抗體治療沒有什么毒性，即使有一些相關(guān)毒性，其耐受性也良好。所以如果用裸露的抗MCSP抗體治療癌癥患者可獲得臨床陽性結(jié)果，這將是人類的福音，是現(xiàn)行醫(yī)療技術(shù)的一大進(jìn)步。11BD-2Ell-2不與毒性制劑結(jié)合，也有抗癌活性；所以可以避免施用抗體-毒素結(jié)合物所要考慮的特定安全問題。另外，已用許多抗MCSP抗體產(chǎn)生了抗獨(dú)特型抗體，并對動(dòng)物和人體進(jìn)行了試驗(yàn)。小規(guī)模的非盲試驗(yàn)中，用抗獨(dú)特型抗體免疫患者出現(xiàn)陽性抗MCSP免疫應(yīng)答時(shí)，與沒有產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的患者相比，患者的平均生存期延長。在所舉的實(shí)例中，通過抗獨(dú)特型抗體靶向MCSP可取得臨床陽性結(jié)果。這一方法的弊病在于并非所有經(jīng)抗獨(dú)特型抗體免疫的患者都發(fā)生抗MCSP應(yīng)答。所以如果直接施用抗MCSP抗體即可取得臨床陽性結(jié)果，就能克服這種需要依靠患者自身免疫應(yīng)答才能獲得臨床益處的問題。11BD-2E11-2正是這樣一種能直接靶向MCSP、在公認(rèn)能預(yù)測療效的臨床前異種移植腫瘤模型中表現(xiàn)出抗癌作用的抗體?？傊?，本發(fā)明講授利用11BD-2E11-2抗原作為治療劑靶點(diǎn)，向哺乳動(dòng)物施用該治療劑后能減小表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷(從而延緩疾病進(jìn)展)，還可以延長該受治哺乳動(dòng)物的生存期。本發(fā)明還講授利用C匿AB(11BD-2E11-2)及其衍生物靶向其抗原以減小哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，和延長攜帶有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的生存期。此外，本發(fā)明還講授利用癌細(xì)胞中可檢測到HBD-2E11-2抗原這一特點(diǎn)，對攜帶表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物進(jìn)行診斷、治療預(yù)測和預(yù)后。如果首次治療對患者無效或者腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)產(chǎn)生該腫瘤特異性抗體進(jìn)行再次治療。另外，可以將抗癌抗體與取自患者的血紅細(xì)胞結(jié)合后再注射機(jī)體用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。目前轉(zhuǎn)移性癌癥還無法有效治療，而且癌癥一旦轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著死亡。不過，轉(zhuǎn)移性癌癥通常伴有大量血管生成，通過血紅細(xì)胞輸送，抗癌抗體能聚集在腫瘤部位。由于大多數(shù)癌細(xì)胞需要依賴宿主血液供應(yīng)來維持生存，所以抗癌抗體與血紅細(xì)胞結(jié)合后，甚至在轉(zhuǎn)移前就能原位抑制腫瘤。另外，抗體也可以與淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞等其他血細(xì)胞結(jié)合。共有五類抗體，每一類抗體都與其重鏈功能相關(guān)。一般認(rèn)為，裸抗體殺死癌細(xì)胞是通過抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)作用或者補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)作用完成。例如，老鼠IgM和IgG2a抗體能通過結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的C-1成分激活人補(bǔ)體，從而激活補(bǔ)體活化的典型途徑，繼而溶解腫瘤。人抗體中大多數(shù)有效的補(bǔ)體活化抗體通常是IgM和IgGl。老鼠的同型抗體IgG2a和IgG3能募集具有Fc受體的毒性細(xì)胞，從而通過單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞將細(xì)胞殺死。人同型抗體IgGl和IgG3由ADCC介導(dǎo)?？贵w介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷作用的其他機(jī)理可能是抗體能將細(xì)胞膜中各種化學(xué)鍵及相關(guān)糖蛋白或糖脂水解(即催化抗體)。還有兩種普遍接受的有關(guān)抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷作用的機(jī)理。一是用抗體作疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對癌細(xì)胞表面抗原的免疫反應(yīng)。二用抗體靶向生長受體，干擾其功能或者對該受體進(jìn)行負(fù)調(diào)控使其功能喪失。癌癥藥物臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)是該藥物能在風(fēng)險(xiǎn)可接受狀況下使患者受益。生存通常是癌癥治療中追求的主要益處，但除延長生命外，還有一些其它公認(rèn)的益處。在治療不影響生存前提下，其他益處包括癥狀減輕、防止不利事件、延長復(fù)發(fā)期或無病生存期和延長腫瘤進(jìn)展時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)已被普遍接受，例如美國食品藥物管理局(FDA)等監(jiān)管機(jī)關(guān)已批準(zhǔn)能產(chǎn)生這些益處的藥物(Hirschfeld等CriticalReviewsinOncology/Hematology42:137-1432002)。除這些標(biāo)準(zhǔn)外，還有其他已得到認(rèn)同的可預(yù)示這些益處的終點(diǎn)。美國FDA出臺的加快審批程序承認(rèn)有一些可能預(yù)測患者受益的指標(biāo)。2003年底，已有16種藥物根據(jù)這一程序獲批，其中4種獲完全批準(zhǔn)，即這些替代終點(diǎn)預(yù)測的直接益處在后續(xù)研究中得到證實(shí)。確定藥物對固體腫瘤療效的一個(gè)重要終點(diǎn)是腫瘤負(fù)荷，一般通過測定治療反應(yīng)對其進(jìn)行評價(jià)(Therasse等，JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。固體腫瘤反應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)工作組(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumorsWorkingGroup)(國際癌癥專家小組)發(fā)布了進(jìn)行上述評價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)中客觀反應(yīng)所示，與適當(dāng)?shù)膶φ战M比較，經(jīng)證實(shí)對腫瘤負(fù)荷有效的藥物應(yīng)最終使患者產(chǎn)生直接益處。一般來說臨床前腫瘤負(fù)荷的評價(jià)和記錄更加直截了當(dāng)。因?yàn)榕R床前研究能轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐，所以臨床前模型中延長生存期的藥物最有可能在臨床應(yīng)用。與臨床治療產(chǎn)生的陽性反應(yīng)類似，臨床前減小腫瘤負(fù)荷的藥物也可能對疾病產(chǎn)生明顯的直接影響。雖然癌癥藥物治療中延長生存期是追求的最重要臨床結(jié)果，但其他一些益處也具有臨床利用價(jià)值，顯然，可能延緩疾病進(jìn)展的腫瘤負(fù)荷減小就能獲得直接益處，具有臨床價(jià)值(Eckhardt等，DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASC0EducationalBook,39thAnnualMeeting,2003，pages209-219)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是使用一種從特定個(gè)體細(xì)胞中產(chǎn)生對癌細(xì)胞有毒性而對非癌細(xì)胞無毒性的癌癥緩解性抗體的方法，以期分離雜交瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的單克隆抗體及所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一目的是講授CDMAB及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的再一目的是產(chǎn)生其細(xì)胞毒性通過ADCC介導(dǎo)的CDMAB。本發(fā)明的還一目的是產(chǎn)生其細(xì)胞毒性通過CDC介導(dǎo)的CDMAB。本發(fā)明的再一目的是產(chǎn)生其細(xì)胞毒性與其催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解能力成函數(shù)關(guān)系的CDMAB。本發(fā)明的又一目的是產(chǎn)生在用于癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測的結(jié)合分析法中所使用的CDMAB。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)通過以下闡述、范例和特定實(shí)施例形式的說明將會顯而易見。本專利或申請文件包含至少一幅彩色附圖。若需要本專利或?qū)＠暾埖暮噬綀D的出版文本副本，可請求美國專利商標(biāo)局提供并支付必要費(fèi)用。圖1:用11BD-2E11-2作探針與MDA-MB-231(泳道1)或0VCAR-3(泳道2)膜雜交所得的Western印跡圖譜。膜蛋白在還原條件下分離。右邊表示分子量標(biāo)記。圖2:去糖基化作用對11BD-2E11-2與MDA-MB-231膜結(jié)合的影響。11BD-2E11-2與分別置于僅有去糖基化緩沖液(泳道1)，包含PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、0-內(nèi)切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶(泳道2)，包含PNGase、O-內(nèi)切糖苷酶和唾液酸酶(泳道3)，僅含唾液酸酶(泳道4)，僅含0-內(nèi)切糖苷酶(泳道5)和僅含PNGase(泳道6)中的MDA-MB-231膜結(jié)合的情況。圖3用11BD-2E11-2免疫沉淀的膜蛋白MDA-MB-231的SDS-PAGE(A組)和Western印跡(B組)圖譜。泳道1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2表示MDA-MB-231膜蛋白，泳道3表示11BD-2E11-2免疫沉淀物，以及泳道4表示同型對照免疫沉淀物。圖4:探針分別為11BD-2E11-2(A組)、IgGl同型對照(克隆107.3，B組)、抗大鼠NG2(多克隆，C組)、正常兔IgG(D組)、抗MCSP(克隆9.2.27，E組)和IgG2a同型對照(克隆G155-228，F(xiàn)組)的蛋白Western印跡圖譜。泳道1:11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道2:IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物，泳道3:抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道4IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物，泳道5:MDA-MB-231膜和泳道6:僅樣本緩沖液(陰性對照)。圖5:11BD-2E11-2-HRP與MCSP肽陣列的結(jié)合強(qiáng)度(Boehringer燈光設(shè)備)。圖6:針對幾種癌細(xì)胞系和非癌細(xì)胞的11BD-2Ell-2、同型對照或抗EGFR抗體的典型的FACS直方圖。圖7:顯示了11BD-2E11-2(A)和同型對照抗體(B)分別與冰凍正常人組織陣列中的心臟組織切片的結(jié)合圖譜的典型顯微照片。圖中，11BD-2Ell-2沒有使心肌纖維染色。放大倍數(shù)是200X。圖8:顯示了11BD-2E11-2(A)、抗肌動(dòng)蛋白(B)和同型對照抗體(C)分別與冰凍正常人組織陣列中的骨骼肌組織切片的結(jié)合圖譜的典型顯微照片。11BD-2E1卜2沒有使骨骼肌染色，但使血管平滑肌染色(箭頭)。放大倍數(shù)是200X。圖9:11BD-2E11-2(A)和同型對照抗體(B)分別與乳腺癌腫瘤(浸潤性導(dǎo)管癌)結(jié)合的典型顯微照片。A組中黑色箭頭指向腫瘤細(xì)胞。放大倍數(shù)是200X。圖10:顯示了11BD-2E11-2(A)、陽性對照抗CD63(NKI-C3)(B)和陰性同型對照抗體(C)分別與冰凍人黑色素瘤組織陣列中的惡性黑色素瘤組織切片的結(jié)合圖譜的典型顯微照片。放大倍數(shù)是200X。圖11:顯示了11BD-2E11-2分別與冰凍黑色素瘤人組織陣列中的惡性黑色素瘤(A)和正常皮膚組織切片(A)的結(jié)合圖譜的典型顯微照片。11BD-2E11-2使惡性黑色素瘤顯著染色而未使正常皮膚染色。放大倍數(shù)是200X。圖12:預(yù)防MDA-MB-468乳腺癌模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體施用療程。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。圖13:—項(xiàng)ES-2異種移植研究模型中攜帶腫瘤的小鼠經(jīng)11BD-2E11-2或緩沖液對照抗體治療后的生存期。圖14:一項(xiàng)ES-2異種移植研究模型中攜帶腫瘤的小鼠在11BD-2E11-2或緩沖液對照治療前、中、后的SEAP水平。圖15:預(yù)防A2058惡性黑色素瘤模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體施用療程。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均十/-SEM。圖16:—項(xiàng)A2058惡性黑色素瘤模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體施用療程。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均十/-SEM。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:通過Western印跡法鑒定結(jié)合蛋白為鑒定11BD-2E11-2抗體所識別的抗原，將表達(dá)該抗原的細(xì)胞膜進(jìn)行凝膠電泳，并利用Western印跡法將其轉(zhuǎn)移到膜上以確定通過該抗體檢測到的蛋白(據(jù)專利申請No.10/810，744所述)。1、膜的制備先前的研究工作已證實(shí)11BD-2E11-2的FACS與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(MB-231)結(jié)合。并且還證實(shí)11BD-2E11-2具有抗卵巢癌細(xì)胞系0VCAR-3的功效。所以，制備這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞膜進(jìn)行抗原鑒忠另外Western印跡和免測沉淀研究也已證實(shí)11BD-2E11-2與制備的A2058細(xì)胞膜的結(jié)合圖譜類似。用MB-231乳腺癌或OVCAR-3卵巢細(xì)胞的鋪滿培養(yǎng)物制備總細(xì)胞膜。去除細(xì)胞團(tuán)中的培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞。用分離緩沖液(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)在振蕩器上37。C、振蕩20分鐘使細(xì)胞分離。收集細(xì)胞，4°C、900g離心10分鐘。離心后，細(xì)胞團(tuán)重懸在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，4°C、900g再離心10分鐘以洗滌。然后保存在-80°C。細(xì)胞團(tuán)按3ml緩沖液/克細(xì)胞的量重懸在勻漿緩沖液中，緩沖液中按1片/50ml緩沖液的量加入Complete蛋白酶抑制劑"雞尾酒"片(Roche，LavalQC)。裂解細(xì)胞前先用polytron勻漿器在冰上將細(xì)胞懸浮液勻漿粉碎。4°C、15，OOOg離心細(xì)胞勻漿液10分鐘以去除細(xì)胞核顆粒。收獲上清纟私分裝到幾管內(nèi)，然后4。C、75，600g離心90分鐘。小心棄除管內(nèi)上清液，將各膜團(tuán)重懸在大約5ml勻漿緩沖液中。然后將各管合到一個(gè)管內(nèi)，4°C、75，600g離心90分鐘。小心棄除管內(nèi)上清液，并對細(xì)胞團(tuán)稱重。將含1%TritonX-100'的溶解緩沖液按3ml緩沖液/克膜團(tuán)的量加到細(xì)胞膜團(tuán)中。300rpm冰上振蕩1小時(shí)，使膜團(tuán)溶解。75，600g離心，將不溶物質(zhì)離心成團(tuán)。小心倒出含有膜蛋白的上清液用于蛋白質(zhì)含量分析，并保存在-8(TC。2、SDS-PAGE禾nWestern印跡用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜蛋白。取20"g膜蛋白與含100mMDTT的SDS-PAGE樣本緩沖液混合，然后加到8%SDS-PAGE凝膠的點(diǎn)樣孔內(nèi)。將預(yù)先染色的分子量標(biāo)記(安大略省伯靈頓市Invitrogen公司)上樣到對照泳道內(nèi)。IOOV、電泳10分鐘，然后電壓調(diào)到150V，直到看到預(yù)先染色的分子量標(biāo)記完全分離為止。按電漬法(40V、16小時(shí))將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上。根據(jù)預(yù)先染色的標(biāo)記是否從凝膠完全轉(zhuǎn)移到膜上來估計(jì)轉(zhuǎn)移情況。轉(zhuǎn)移完后，用含50/。脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水(含O.5%Tween-20)封閉膜，2小時(shí)。之后用含O.5%Tween-20的Tris-緩沖鹽水(TBST)洗滌一次，置于經(jīng)3%脫脂奶粉TBST稀釋的5ug/ml11BD-2E11-2中2小時(shí)。再用TBST洗滌3次后，將膜置于與辣根過氧化物酶結(jié)合(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Fc)(來自JacksonImmunologicals,WestGrovePA)中，之后用TBST洗滌3次，再置于HRP底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(底物試劑盒購自安大略省伯靈頓Vector實(shí)驗(yàn)室)。圖1清楚地顯示出，11BD-2E11-2與MB-231(泳道l)和OVCAR-3(泳道2)膜蛋白的3個(gè)分子量區(qū)結(jié)合。與分子量(MW)標(biāo)準(zhǔn)比照，該抗體與分子量大約為150、240和280kDa的蛋白結(jié)合。其他所有研究都用MB-231膜進(jìn)行，因?yàn)樵摷?xì)胞系反應(yīng)更強(qiáng)一些。實(shí)施例2:確定11BD-2E11-2結(jié)合的抗原的糖基化為確定11BD-2E11-2抗體識別的抗原是否是糖蛋白，將MB-231膜置于PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、0-內(nèi)切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶的不同組合中。用SDS-PAGE電泳分離膜，然后按Western印跡法與11BD-2E11-2雜交。圖2為11BD-2E11-2與分別置于僅有去糖基化緩沖液(泳道1)，包含PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、o-內(nèi)切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶(泳道2)，包含PNGase、0-內(nèi)切糖苷酶和唾液酸酶(泳道3)，僅含唾液酸酶(泳道4)，僅含0-內(nèi)切糖苷酶(泳道5)和僅含PNGase(泳道6)中的MDA-MB-231膜結(jié)合的情況。經(jīng)糖苷酶處理的MB-231膜仍與11BD-2E11-2結(jié)合，但可以看到所有泳道中蛋白質(zhì)分子量發(fā)生了變化，這說明11BD-2Ell-2識別的抗原是糖蛋白。實(shí)施例3:11BD-2Ell-2所結(jié)合的抗原的鑒定l.免疫沉淀本例中，將用11BD-2E11-2抗體與可溶性膜糖蛋白之間的免疫沉淀反應(yīng)分離出相關(guān)配基，然后進(jìn)行11BD-2Ell-2特異性抗原鑒定。取100uLProteinG.Dynabeads(DyrmlBiotech,LakeSuccess,紐約)用lml0.1M磷酸鈉緩沖液(p朋.0)洗滌3次。將含100ug11BD-2E11-2的100ixL0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)加入洗滌后的珠子中，轉(zhuǎn)動(dòng)混合1小時(shí)。去除未結(jié)合的抗體，用0.5ml0.1M含0.l%Tween-20的磷酸鈉(pH7.4)將外面包裹11BD-2E1卜2的珠子洗滌3次。再用lml0.2M三乙醇胺(pH8.2)洗滌2次。加入lml含0.02M二甲基庚二胺鹽的0.2M三乙醇胺(pH8.2)，轉(zhuǎn)動(dòng)混合30分鐘，使11BD-2E11-2與珠子化學(xué)交聯(lián)。最后將珠子置于lml0.05MTris(pH7.5)中轉(zhuǎn)動(dòng)混合15分鐘，使反應(yīng)終止。將HBD-2Ell-2交聯(lián)珠用lml含0.l%Tween-20的lmMKH2P04、10mMNa2HP04、137mMNaCl、2.7mMKC1溶液(PBS)洗滌3次。再用0.1M、pH3.0檸檬酸鹽預(yù)洗提3分鐘，然后用0.1M含0.l%Tween-20的PBS洗漆3次。用針對三硝基苯酚(不相干分子)的小鼠IgGi抗體(克隆107.3，安大略省Oakville市BDBiosciences公司提供，)作陰性IgG,同型對照，按上述同樣方法制備另一套抗體交聯(lián)珠。將11BD-2E11-2交聯(lián)珠置于含1%BSA的0.lM磷酸鈉溶液(pH7.4)中，轉(zhuǎn)動(dòng)混合30分鐘進(jìn)行封l迅然后用0.lM磷酸鈉溶液(pH7.4)洗滌3次。將500ugMB-231細(xì)胞膜制備物置于11BD-2E11-2交聯(lián)珠中，4。C轉(zhuǎn)動(dòng)混合2.5小時(shí)。再用lml含1%TritonX-100的lmMKH2P04、10mMNa2HP04、287mMNaCl、2.7mMKC1溶液將該免疫復(fù)合物結(jié)合珠洗滌3次。將11BD-2E11-2結(jié)合珠置于30uL0.1M檸檬酸鹽(pH3.0)緩慢混合3分鐘，洗提出11BD-2Ell-2結(jié)合蛋白。加入9uL1MTris(pH9)將洗提出的蛋白pH調(diào)為中性，保存在-80°C。用3ml含0.l%Tween-20的PBS洗滌11BD-2E11-2交聯(lián)珠。將IgG,同型對照(克隆107.3)交聯(lián)珠置于MB-231膜蛋白中，按與11BD-2E11-2珠同樣的方法進(jìn)行操作。利用MB-231膜蛋白按所述方法制備兩批11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白后合在一起。IgGl(克隆107.3)同型對照珠也進(jìn)行同樣操作。將62%的免疫沉淀混合物(相當(dāng)于620tigMB-231膜蛋白經(jīng)免疫沉淀后所得蛋白量)上樣到4-20%SDS-PAGE梯度凝膠的1個(gè)泳道孔內(nèi)。將相當(dāng)于20ugMB-231膜蛋白的107.3交聯(lián)珠產(chǎn)物上樣到相鄰泳道內(nèi)。在對照泳道中加入未染色的(安大略省伯靈頓Invitrogen)或預(yù)先染色的分子量標(biāo)記。先100V電泳10分鐘，再150V、60分鐘。最后將凝膠置于SYPRORuby(安大略省米西索加市BioRad公司)中染色。在平行的Western印跡操作中，電泳分離出18%免疫沉淀混合物(相當(dāng)于180tigMB-231膜蛋白經(jīng)免疫沉淀后所得蛋白量)與等量IgGl同型對照(克隆107.3)交聯(lián)珠產(chǎn)物。通過電漬法在40V、16小時(shí)下將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上。之后用含5。/。脫脂奶粉的TBST封閉膜2小時(shí)。然后用含3%脫脂奶粉的TBST稀釋的11BD-2E11-2作探針與膜雜交2小時(shí)。用TBST洗滌3次后，將膜置于山羊抗小鼠IgG(Fc)-HRP結(jié)合物中1小時(shí)。再用TBST洗滌3次，然后置于HRP的底物TMB中。圖3為11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白的凝膠和Western印跡圖譜。凝膠上(A組)泳道1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2表示MB-231膜蛋白。在含有11BD-2E11-2免疫沉淀物的泳道中(泳道3)，有兩條不同的帶，分子量分別為240和280kDa，而含有107.3免疫沉淀物(泳道4)的泳道中沒有出現(xiàn)這兩條帶。在對應(yīng)的Western印跡圖譜(B組)上，11BD-2E11-2與240和280kDa的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白反應(yīng)明顯。11BD-2E11-2與另一條150kDa的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白帶同樣反應(yīng)明顯；而在染色的凝膠上沒有檢測到這條蛋白帶。11BD-2E11-2與11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白的反應(yīng)情況與整個(gè)MB-231細(xì)胞膜上所呈現(xiàn)的情況類似(泳道2)。11BD-2E11-2與IgGl同型對照(克隆107.3;泳道4)免疫沉淀蛋白沒有發(fā)生反應(yīng)，這說明11BD-2E11-2與免疫沉淀蛋白的結(jié)合是特異性的，而并非雜蛋白所致。2.質(zhì)譜分析用無菌解剖刀切出凝膠上相當(dāng)于240和280kDa的11BD-2EU-2免疫沉淀蛋白區(qū)域(圖3A組泳道3X然后應(yīng)用MALDI/MS和LC/MS/MS質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定凝膠塊中蛋白。在PROGEST工作站中用胰蛋白酶酶解樣本，然后取一部分酶解后上清液進(jìn)行MALDI/MS分析。用ZipTips自動(dòng)點(diǎn)樣(ProMS);用基質(zhì)(a-氰基4-羥基肉桂酸)溶液(含60%乙腈、0.2%TFA)和C18填料洗提肽段。操作VoyagerDE-STR質(zhì)譜儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCityCA)獲得MALDI/MS數(shù)據(jù)，觀察到的m/z數(shù)值提交給ProFound程序(Proteometrics程序包)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋檢索。運(yùn)用ProFound程序査詢當(dāng)?shù)乇４娴腘CBInr數(shù)據(jù)庫備份。采用nanoLC/MS/MS方法在MicromassQ-Tof2質(zhì)譜儀上使用75umC18柱以流速200nL/min對另一部分酶解上清液進(jìn)行分析。用當(dāng)?shù)氐腗ASCOT備份檢索MS/MS數(shù)據(jù)。利用MALDI/MS和LC/MS/MS鑒定的蛋白列于表1。表1.利用MDA-MB-231細(xì)胞膜的11BD-2E11-2免疫沉淀物鑒定的蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>兩份樣本均鑒定為黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白多糖(MCSP)。3、確認(rèn)通過檢測已知的抗MCSP抗體是否與11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白發(fā)生反應(yīng)來確定該抗原，反之亦然。同樣采用前述方法制備免疫沉淀物，不同的是，另外增加了小鼠抗MCSP單克隆抗體9.2.27(IgG2a)(Chemicon，TemeculaCA)，和用作陰性IgG2a同型對照的抗三硝基苯酚(不相干分子)小鼠IgG2a抗體(克隆G155-178由安大略省0akville市BDBiosciences公司提供)。用SDS-PAGE分離相同的6塊10%凝膠中的11BD-2E11-2免疫沉淀物、IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物、抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物、IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物和MB-231膜。按上述方法進(jìn)行電泳、Western印跡操作。將膜置于含3%脫脂奶粉的TBST稀釋的5ug/ml11BD-2E11-2、IgGl同型對照(克隆107.3)、抗MCSP(克隆9.2.27)、IgG2a同型對照(克隆G155-228)、兔多克隆抗大鼠NG2抗體(MCSP是大鼠NG2的人同源物；Chemicon，TemeculaCA)和正常兔IgG(Sigma,SaintLouisM0)中2.5小時(shí)。Western印跡圖譜如圖4所示。圖4(A組)顯示了11BD-2E11-2分別與11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道1)、IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物(泳道2)、抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物(泳道3)、IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物(泳道4)、MB-231膜、(泳道5)和僅樣本緩沖液(陰性對照)(泳道6)結(jié)合的情況。MB-231膜和11BD-2E11-2免疫沉淀物中，11BD-2E11-2識別同樣的3條帶，分別約為150、240和280kDa。而在抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道中僅有上面280kDa的帶被識別。同型對照免疫沉淀物泳道均無反應(yīng)，說明11BD-2E11-2與免疫沉淀物之間的反應(yīng)是由于蛋白與11BD-2E11-2和9.2.27特異性結(jié)合和免疫沉淀蛋白所致。以IgGl同型對照(克隆107.3)為探針進(jìn)行的平行雜交(B組)中，所有泳道都沒有觀察到反應(yīng)，這說明在以11BD-2E11-2為探針進(jìn)行雜交所觀察到的反應(yīng)是特異性的。C組顯示出兔多克隆抗大鼠NG2抗體在平行雜交中的結(jié)合情況。抗NG2與UBD-2Ell-2免疫沉淀物(泳道l)中大約150和240kDa的兩條帶結(jié)合，但沒有與其他泳道中相同分子量的蛋白結(jié)合。在平行雜交(D組)中，正常的兔IgG與IgG2a免疫沉淀物(泳道4)和MB-231膜(泳道5)中蛋白略微發(fā)生非特異性反應(yīng)。所以C組(以兔抗NG2為探針)泳道中出現(xiàn)的相同反應(yīng)應(yīng)視為非特異性的。在平行雜交(E組)中，抗MCSP(克隆9.2.27)僅與抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道(泳道3，箭頭所示)中的一條帶有很微弱的結(jié)合；在MB-231膜(泳道5)中沒有看到這條帶，說明9.2.27可能與該抗原的親合力低，所以只有在例如免疫沉淀樣本濃縮后才顯出反應(yīng)。以lgG2a同型對照(克隆G155-228)為探針進(jìn)行的平行雜交(F組)中，所有泳道均未觀察到反應(yīng)，這說明在以抗MCSP(克隆9.2.27)為探針進(jìn)行雜交所觀察到的反應(yīng)是特異性的。這些結(jié)果證明與HBD-2E11-2免疫沉淀蛋白被大鼠MCSP同源物識別，而抗MCSP免疫沉淀蛋白又被11BD-2E11-2識別。質(zhì)譜鑒定結(jié)果和已知商業(yè)抗體所證實(shí)的結(jié)果共同證明11BD-2E11-2特異性抗原是MCSP。這也與實(shí)施例2的去糖基化實(shí)驗(yàn)證實(shí)MCSP核心蛋白是糖蛋白的結(jié)果一致。實(shí)施例4:抗體表位測定本實(shí)施例通過抗體表位測定實(shí)驗(yàn)來確定HBD-2E11-2識別MCSP分子的區(qū)域。根據(jù)MCSP的氨基酸序列合成重疊肽陣列，將陣列與纖維素膜逐步共價(jià)結(jié)合，得到確定的排列。各肽段長18個(gè)氨基酸，有9個(gè)氨基酸相互重疊。將肽陣列置于封閉緩沖液中幾個(gè)小時(shí)。采用在Wilson和nakane方法基礎(chǔ)上改進(jìn)的高碘酸法將11BD-2E1卜2與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合。將封閉后的肽陣列置于含lug/ml11BD-2Ell-2-服P的封閉緩沖液中。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用羊抗小鼠IgG-HRP溫育的肽陣列作陰性對照。肽陣列用TBST洗滌后，與化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行作用?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)時(shí)，用電荷耦合成像系統(tǒng)(CCD成像系統(tǒng))對肽陣列上各點(diǎn)發(fā)光進(jìn)行定量分析，得到各肽的信號強(qiáng)度值(Boehringer燈光設(shè)備;BLU)。本實(shí)驗(yàn)中低于7500BLU的信號視為背景。肽陣列的結(jié)合數(shù)據(jù)列于表2。表2,11BD"2S1和HCSP肽陣列的培合驟號氣綦酸序鄉(xiāng)肚U.醫(yī),鵬夢鵬mi&L■■seeS70112804945避8袋!01,!2湖131禱,A窗TOSC腿SS紋1516微、，繊微20嫩,鵬誠jraT，M21ragMJW鼸鉱戰(zhàn)玄鼸亀遷CjtEf茲絲IWyiQ固23WETOX^膽鼸磁狩舊3378124<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>圖5表示該結(jié)合數(shù)據(jù)的示意圖。11BD-2E11-2與肽ft26(SEQIDNO.1)的結(jié)合最強(qiáng)，與tt71(SEQIDNO.2)結(jié)合較弱，僅稍高于背景，可以看到，11BD-2E11-2被肽#3(SEQIDNO.3)、恥6(SEQIDNO.4)、#170(SEQIDNO.5)、#251(SEQIDNO.6)、#252(SEQIDNO.7)柳256(SEQIDNO.8)所識別。這些結(jié)果表明11BD-2E11-可以與具有兩個(gè)主要結(jié)合位(肽#26和#71)的一個(gè)不連續(xù)表位及其他許多位點(diǎn)結(jié)合。實(shí)施例5如專利申請No.10/743,451所述，雜交瘤細(xì)胞系11BD-2E11-2已根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2003年11月11日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),地址馬納薩斯Blvd.大學(xué)10801，VA20110-2209，保藏號PTA-5643。根據(jù)CFR1.808規(guī)定，保藏人應(yīng)確保專利授權(quán)后公眾獲取保藏材料不再受限制?？贵w制備單克隆抗體11BD-2E11-2的制備在CL-1000瓶(安大略省0akville市BDBiosciences公司)中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞(PTA-5643)，收集后，按1周兩次反復(fù)接種，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的抗體純化步驟用純化柱ProteinGS印harose4FastFlow純化(AmershamBiosciences,Baied，Urfe，QC)。如專利申請10/348，231所述，在細(xì)胞毒性分析試驗(yàn)(表2)中，將11BD-2E11-2與眾多陽性對照(抗Fas(E0S9.1，IgM，ka卯a(chǎn)型，20ug/ml，eBioscience，SanDiego,CA)、抗Her2/neu(IgGl，kappa型，10iig/ml，安大略省馬克姆InterMedico公司)、抗EGFR(C225,IgGl，kappa型，5yg/ml，Cedarlane，Hornby,0N)、環(huán)己酰亞胺(IOOpM，安大略省Oakville市Sigma公司)和N認(rèn)3(0.1%，安大略省0akville市Sigma公司))和陰性對照(107,3(抗TNP，IgGl,kappa型，20ug/ml，安大略省0akville市Sigma公司BDBiosciences公司XG155-178(抗-TNP，IgG2a，kappa型，20ug/ml，安大略省Oakville市Sigma公司BDBiosciences公司XMPOll(抗原特異性未知，IgG2b，kappa型，20ug/ml)，J606(抗果聚糖，IgG3，kappa型，20ug/ml)，IgG緩沖液(2%))進(jìn)行比較。用乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，MDA-MB-468(MB-468)，MCF-7)、結(jié)腸癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR-3(0VCAR))、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD27sk，Hs888Lu)細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)(均來自弗吉尼亞州馬納薩斯市ATCC)。Live/Dead細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自MolecularProbe公司(Eugene,0R)，在操作該試劑盒時(shí)根據(jù)其產(chǎn)品說明書作了如下改動(dòng)檢測前按預(yù)定的合適密度將細(xì)胞接種到孔板內(nèi)。2天后，將純化后的抗體或?qū)φ沼门囵B(yǎng)基稀釋，然后取lOOul轉(zhuǎn)到細(xì)胞孔板內(nèi)，置5%0)2恒溫箱培養(yǎng)5天。之后將孔板倒空，并吸干液體。室溫下用多通道塑料擠瓶將含MgCl2和CaCL的DPBS分加到各孔內(nèi)，輕敲3下，再倒空并吸干液體。將含MgCh和CaCl2的DPBS稀釋的熒光鈣黃綠素染料加到各孔內(nèi)，置于37°C、50/oC(V恒溫箱內(nèi)30分鐘。用PerkinElmerHTS7000自動(dòng)熒光讀板機(jī)讀取孔板數(shù)據(jù)，然后用微軟Excel軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果列于表3。表中數(shù)據(jù)表示四個(gè)實(shí)驗(yàn)各重復(fù)三次的平均結(jié)果，并以下列方式定性表示4/4實(shí)驗(yàn)大于細(xì)胞毒性閾值(+++)，3/4實(shí)驗(yàn)大于細(xì)胞毒性閾值(++)，2/4實(shí)驗(yàn)大于細(xì)胞毒性閾值(+)。表l中未標(biāo)記的細(xì)胞表示矛盾或效果低于細(xì)胞毒性閾值。11BD-2E11-2對乳腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞有特異性細(xì)胞毒性，對正常細(xì)胞沒有影響?；瘜W(xué)細(xì)胞毒性劑能產(chǎn)生預(yù)期的細(xì)胞毒性，而這里包括的其它許多抗體在生物細(xì)胞分析試驗(yàn)的限制下也可以達(dá)到預(yù)期效果?？偠灾陨蠈?shí)驗(yàn)顯示11BD-2E11-2抗體對兩種癌細(xì)胞類型表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。該抗體的活性具有選擇性，因?yàn)椴⒎撬蓄愋偷陌┘?xì)胞都對該抗體敏感。另外，該抗體不對非癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性(治療中須考慮的一個(gè)重要因素)，說明該抗體具有功能特異性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如專利申請10/348，231和10/810，744所述，用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)評價(jià)11BD-2E11-2與上述癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系組及以下卵巢癌細(xì)胞系^2780-0&A2780-s>C-140V200&Hey、OCOl、0VCA-429和ES-2+SEAP)的結(jié)合。FACS所用細(xì)胞的制備先用DPBS(不含Ca2+和Mg"洗滌細(xì)胞單層，然后在37。C用細(xì)胞分離緩沖液(安大略省伯靈頓INVITROGEN公司)將細(xì)胞培養(yǎng)板上細(xì)胞洗脫。離心收集后，將細(xì)胞重懸在4。C含MgC12、CaC"和2。/?；?5呢胎牛血清(FBS)的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(洗滌培養(yǎng)基)中計(jì)數(shù)，并等分成適當(dāng)細(xì)胞密度，再將細(xì)胞離心成團(tuán)，重懸在4"C含有20ug/ml試驗(yàn)抗體(11BD-2E11-2)或?qū)φ湛贵w(同型對照或抗EGFR)的染色培養(yǎng)基(含MgC12、CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS)中，置于冰上30分鐘。在加入與AlexaFluor488結(jié)合的第二抗體前細(xì)胞先用洗滌培養(yǎng)基洗滌1次。然后加到含AlexaFluor488結(jié)合抗體的染色培養(yǎng)基中20或30分鐘。之后細(xì)胞再洗滌最后一次，并重懸在含14g/ml碘化丙啶或1.5%多聚甲醛的染色培養(yǎng)基中。向流式細(xì)胞儀FACScan上樣，用CellQuest軟件(安大略省Oakville市BDBiosciences公司)評價(jià)獲取的細(xì)胞。通過調(diào)節(jié)FSC和SSC檢測器電壓和振幅增益，設(shè)定細(xì)胞前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)。運(yùn)行先后以純化的同型對照抗體染色、再以AlexaFluor488結(jié)合的第二抗體染色以使細(xì)胞熒光強(qiáng)度峰相同、平均值均約為1-5單元的細(xì)胞，來調(diào)節(jié)檢測器的三個(gè)熒光通道(FL1、FL2和FL3)。結(jié)合FSC設(shè)門和碘化丙啶排除法(使用的話)，獲得活細(xì)胞。每份樣本獲得約10，000個(gè)活細(xì)胞，分析結(jié)果列于表4和5c表4和5列出了平均熒光強(qiáng)度相對同型對照增加的倍數(shù)，定性表示為小于5(-);5-50(+);50-100(++);大于100(+++)，以及括號內(nèi)為染色細(xì)胞的百分比。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>圖6所示為11BD-2E11-2抗體的典型直方圖。11BD-2E11-2與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(表4)和包括ES-2+SEAP在內(nèi)的幾個(gè)卵巢腫瘤細(xì)胞系(表5)特異性結(jié)合。11BD-2E11-2也與非癌細(xì)胞結(jié)合，但這種結(jié)合并不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這一非顯而易見的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明結(jié)合并不一定意味著抗體是與其相關(guān)抗原結(jié)合的隱含。這暗示抗體在不同細(xì)胞中的配接情況決定細(xì)胞毒性，而不是僅僅決定抗體^口口o實(shí)施例6:正常人組織染色本實(shí)施例通過IHC研究旨在査明11BD-2E11-2抗原在人體內(nèi)的分布。之前已摸索了IHC的最佳操作條件，以此確定其他實(shí)驗(yàn)條件。11BD-2E11-2單克隆抗體的制備和純化步驟如上所述。據(jù)專利申請No.10/810，744所述，采用冰凍人正常器官組織陣列(紐約Watervliet市Clinomics公司)使抗體與20個(gè)正常人組織結(jié)合。將玻片用冷丙酮(-2(TC)處理10分鐘后，置于室溫。然后用4"C冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗3次，每次2分鐘，再在3%過氧化氫中清洗10分鐘以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。接著用PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后置于Universal阻斷劑(安大略省多倫多Dako公司)中室溫5分鐘，HBD-2E11-2、抗人肌肉肌動(dòng)蛋白抗體(克隆HHF35，安大略省多倫多Dako公司)或同型對照抗體(針對黑曲霉葡萄糖氧化酶，哺乳動(dòng)物組織中不存在、也不誘導(dǎo)產(chǎn)生這種酶；安大略省多倫多Dako公司)用抗體稀釋緩沖液(安大略省多倫多Dako公司)稀釋到作用濃度(抗肌動(dòng)蛋白抗體2ug/ml，其他抗體5yg/ml)，室溫下過夜l小時(shí)。玻片用PBS清洗3次，每次2分鐘。用所提供的結(jié)合服P的第二抗體(安大略省多倫多DakoEnvisionSystem公司)檢測或觀察第一抗體的免疫反應(yīng)活性，室溫30分鐘。然后再用PBS清洗玻片3汰每次2分鐘。加入DAB(3,3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，安大略省多倫多Dako公司)色原底物溶液，讓免疫過氧化物酶室溫染色10分鐘。然后用自來水清洗玻片，使顯色反應(yīng)終止。再用Meyer蘇木精(安大略省Oakville市SigmaDiagnostics公司)復(fù)染色，然后用乙醇(95-100%)逐級脫水，并用二甲苯清除。使用封片劑(安大略省多倫多DakoFaramount公司)將玻片封住。用倒置顯微鏡Axiovert200(安大略省多倫多加拿大Zeiss公司)進(jìn)行顯微鏡檢，NorthernEclipse成像軟件數(shù)碼成像并保存。最后由病理學(xué)家對結(jié)果進(jìn)行分析、評分和解釋。表6概括出正常人組織陣列經(jīng)11BD-2E11-2染色后的結(jié)果。從表中可看到，主要有2類組織被染色。有一組組織完全為陰性，包括正常甲狀腺、支氣管和左心室心肌(圖7)。第二組組織包括組織切片中染色為陽性的組織，但限于血管平滑肌纖維和/或上皮組織(圖8)。這些結(jié)果說明11BD-2E11-2特異性抗原并未在正常組織上廣泛表達(dá)，而且該抗體也僅與人的有限幾個(gè)組織結(jié)合。11BD-2E11-2對正常人組織的染色結(jié)果與先前報(bào)道的抗MCSP抗體B5的情況類似；先前的研究顯示B5與皮膚角化細(xì)胞、肺泡上皮和毛細(xì)管內(nèi)皮結(jié)表6:冰凍人正常組織上11BD-2E11-2的IHC結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>縮寫SMF:平滑肌纖維，Bg:背景染色，PD:部分分離，F(xiàn):folded,CD:完全分離。實(shí)施例7:人乳腺癌組織染色本實(shí)施例通過工HC研究來確定11BD-2E11-2抗原與人乳腺癌之間的關(guān)系(據(jù)專利申請No.10/810，744所述)。對肌動(dòng)蛋白(陽性對照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶(一種哺乳動(dòng)物組織中不存在也不能誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶)抗體(陰性對照)進(jìn)行比較。本研究中使用源自15例乳腺癌患者和5份未長腫瘤的乳腺組織樣本的乳腺癌組織陣列(紐約Watervliet市Clinomics公司)。各患者信息包括年齡、性別和診斷結(jié)果。IHC步驟同實(shí)施例6。表7概括了乳腺癌組織陣列經(jīng)11BD-2E1卜2抗體結(jié)合后的染色情況。各陣列包含了15例患者個(gè)體的腫瘤樣本?？傮w上，進(jìn)行試驗(yàn)的8例(其中7份組織樣本或者完全分離，或者不具有代表性)患者中62%顯示為11BD-2E11-2抗原陽性。而3份(又有2份組織樣本完全分離)正常乳腺組織樣本均未呈現(xiàn)11BD-2E11-2陽性(圖9)。從結(jié)果中看不出11BD-2E1卜2陽性表達(dá)量隨腫瘤期別增加而增加的趨勢。但由于樣本規(guī)模小，所以研究結(jié)果有一定局限性。11BD-2E11-2染色具有癌細(xì)胞特異性(圖9)。從11BD-2Ell-2的染色圖譜來看，抗體對患者樣本中的惡性細(xì)胞具有高度特異性，因而成為備受矚目的藥物靶點(diǎn)。11BD-2E11-2對乳腺癌組織的染色結(jié)果與先前報(bào)道的抗MCSP抗體B5類似。先前的研究顯示B5與60%乳腺癌腫瘤組織結(jié)合。表7:冰凍人正常組織和乳腺癌組織上11BD-2E11-2的IHC結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>本實(shí)施例通過IHC研究來確定11BD-2E11-2抗原與人黑色素瘤癌之間的癌癥關(guān)系。比較抗CD63抗體(NIK-C3;MEDIC0RP，MontrealQC);陽性對照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶(一種哺乳動(dòng)物組織中不存在也不能誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶)抗體(陰性對照)。所使用的惡性黑色素瘤組織陣列源自35例惡性黑色素瘤患者，IO份樣本源自惡性黑色素瘤患者的正常皮膚組織(馬里蘭州Bethesda市TriStarTechnologyGroup有限責(zé)任公司)。IHC操作步驟除以下改動(dòng)外基本同實(shí)施例6:加入用于免疫過氧化物酶染色的AEC(安大略省多倫多Dako公司)色原底物溶液室溫下顯色10分鐘。用自來水清洗玻片，使顯色反應(yīng)終止。用Meyer蘇木精(安大略省0akville市SigmaDiagnostics公司)復(fù)染色后，玻片用蒸餾水清除。表8概括了黑色素瘤癌組織陣列經(jīng)11BD-2EU-2抗體結(jié)合后的染色情況。各陣列包含采自35例患者個(gè)體的腫瘤樣本和10例患者的正常皮膚?？傮w上，進(jìn)行試驗(yàn)的33例(其中2份組織樣本完全著色)患者中67%表現(xiàn)為11BD-2Ell-2抗原陽性(圖IO)。另外，取自惡性黑色素瘤患者的6份(4份組織樣本不具有代表性或不能用)正常皮膚組織樣本均未呈現(xiàn)陽性(圖ll)。11BD-2E11-2染色具有癌細(xì)胞特異性(圖11)。HBD-2E11-2的染色圖譜顯示，抗體對患者樣本中的惡性細(xì)胞有高度特異性，因而稱為備受矚目的藥物耙點(diǎn)，并且證實(shí)11BD-2E11-2可用作潛在藥物。表8:冰凍人正常皮膚和黑色素瘤組織上11BD-2E11-2的IHC結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>縮寫meta:轉(zhuǎn)移性，NR:沒有代表性，CD:完全分離，NA:不能用。實(shí)施例9:建立體內(nèi)MDA-MB-468腫瘤實(shí)驗(yàn)根據(jù)專利申請No.10/810，744所述并參照圖12，向6-8周的老年雌性SCID小鼠后頸部皮下注射含200萬個(gè)MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞的生理鹽水lOOul。每周用卡尺測量腫瘤生長體積。當(dāng)群體中大多數(shù)腫瘤體積達(dá)到lOOmm3，小鼠隨機(jī)分成2個(gè)治療組，每組5_6只。11BD-2E1卜2或緩沖液對照的母液在用含2.7mMKC1、ImMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后，按10mg/kg/劑腹腔注入300"1。然后按同樣方式一周注入3次、共10齊U，直到注入后第66天。大約每七天用卡尺測一次腫瘤體積，直到研究結(jié)束或動(dòng)物個(gè)體達(dá)到加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(CCAC)終點(diǎn)。研究期間記錄動(dòng)物體重。研究結(jié)束時(shí)，根據(jù)CCAC指南對所有動(dòng)物實(shí)施安樂死。隨機(jī)化時(shí)各組的腫瘤平均體積和標(biāo)準(zhǔn)偏差大致相同。各組間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明是真正的隨機(jī)化。如圖12所示，在為期3周的療程結(jié)束時(shí)，與緩沖液對照相比，抗體11BD-2E11-2抑制腫瘤生長達(dá)25%(p=0.52)。盡管非顯著性差異，但與緩沖液對照相比，研究期間可以觀察到腫瘤體積減小的趨勢。所以，研究顯示11BD-2E11-2在乳腺癌模型中有療效。實(shí)施例10:建立體內(nèi)ES-2+SEAP腫瘤實(shí)驗(yàn)據(jù)專利申請No.10/810，744所述并參照圖13和14，將1000萬經(jīng)轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)人胎盤分泌堿性磷酸酶(SEAP)的ES-2+SEAP人卵巢癌細(xì)胞腹腔注入6-8周老年雌性athymic裸鼠體內(nèi)。將1000萬卵巢癌細(xì)胞重懸在500pl無血清的a-MEM中。第7天，3只小鼠死亡，說明腫瘤生長。然后小鼠隨機(jī)分成2個(gè)治療組，每組8只。11BD-2E11-2或緩沖液對照的母液在用含2.7mMKC1、lmMKH2P04、137rnMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后，按10mg/kg/劑腹腔注入250ul。然后每天施用一次，施用5劑后，再每隔一天施用一次，施用5齊lj，前后總共施用10齊ij。研究期間或者動(dòng)物個(gè)體達(dá)到CCAC終點(diǎn)前，通過所測定的SEAP循環(huán)水平來推測腫瘤負(fù)荷，并在尸檢后對腫瘤負(fù)荷進(jìn)行目測評估。研究期間記錄動(dòng)物體重。研究結(jié)束時(shí)，根據(jù)CCAC指南對所有動(dòng)物實(shí)施安樂死。隨機(jī)化時(shí)分析血漿SEAP循環(huán)水平(用來表示腫瘤負(fù)荷)。11BD-2E11-2治療組和緩沖液對照治療組之間，SEAP平均水平?jīng)]有顯著性差異。但各組內(nèi)腫瘤攝取率發(fā)生變化。如圖13所示，抗體11BD-2E11-2使治療組群體生存期有延長的趨勢。如圖14所示，一只接受11BD-2E11-2治療的動(dòng)物的SEAP循環(huán)量已減小到可幾乎忽略不計(jì)的水平。自注入后60天左右SEAP循環(huán)一直維持在低水平。實(shí)施例11:體內(nèi)A2058人黑色素瘤的預(yù)防腫瘤實(shí)驗(yàn)參照圖15中數(shù)據(jù)，向4-8周老年雌性SCID小鼠后頸部皮下注射IOOpI含75萬A2058人黑色素瘤癌細(xì)胞的生理鹽水。小鼠隨機(jī)分成2個(gè)治療組，每組5只。注射后當(dāng)天，11BD-2E11-2試驗(yàn)抗體或緩沖液對照的母液在用含2.7mMKC1、lmMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后，按20mg/kg/劑腹腔注入300u1。然后按同樣方式每周施用抗體或緩沖液對照一次，持續(xù)施用7周。用卡尺每7天測一次腫瘤體積，直到第10周，或者動(dòng)物個(gè)體達(dá)到加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(CCAC)規(guī)定的終點(diǎn)為止。研究期間記錄動(dòng)物體重。研究結(jié)束時(shí)，根據(jù)CCAC指南對所有動(dòng)物實(shí)施安樂死。如圖15所示，與緩沖液對照相比，11BD-2E11-2治療使腫瘤生長減慢。第55天(治療結(jié)束后第5天)，11BD-2E11-2治療組的腫瘤平均體積占緩沖液對照組的58%(=.046，非配對t檢驗(yàn)法)。所以，與對照相比，11BD-2E11-2在乳腺、卵巢和黑色素瘤的人體內(nèi)癌癥模型中對癌癥有療效，并且能減小腫瘤負(fù)荷。實(shí)施例12:建立體內(nèi)A2058人黑色素瘤的腫瘤實(shí)驗(yàn)參照圖16，向老年雌性SCID小鼠的后頸部注入100iU含50萬A2058人黑色素瘤癌細(xì)胞的生理鹽水。每周用卡尺測一次腫瘤體積。當(dāng)群體中大多數(shù)腫瘤體積達(dá)到100mm3，小鼠隨機(jī)分成2個(gè)治療組每組5-6只。11BD-2E11-2或緩沖液對照的母液用含2.7mMKC1、lmMKH2P04>137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液稀釋后按20mg/kg/劑腹腔注射300ul。然后按同樣方式每周施用抗體或緩沖液對照3次，共施用10齊l」，直至注入后第44天。用卡尺大約每七天測一次腫瘤體積，直到研究結(jié)束或動(dòng)物個(gè)體達(dá)到CCAC終點(diǎn)。研究期間記錄動(dòng)物體重。研究結(jié)束時(shí)，根據(jù)CCAC指南對所有動(dòng)物實(shí)施安樂死。隨機(jī)化時(shí)各組的腫瘤平均體積和標(biāo)準(zhǔn)偏差大致相同。各組間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明是真正的隨機(jī)化。如圖13所示，在治療期結(jié)束后，與緩沖液對照相比，抗體11BD-2E11-2抑制腫瘤生長達(dá)49%(p=0.1272;非配對t檢驗(yàn)法)。盡管結(jié)果屬于非顯著性差異，但與緩沖液對照相比，研究期間可以觀察到腫瘤體積減小的趨勢。所以，11BD-2E11-2在乳腺、卵巢和惡性黑色素瘤模型中顯示出療效。總之，11BD-2E11-2在多個(gè)人癌癥模型中產(chǎn)生的益處(與對照治療相比，延長生存期和/或減小腫瘤負(fù)荷)暗示該抗體對包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的癌癥治療具有藥理和制藥方面的益處。確鑿證據(jù)顯示11BD-2E11-2是通過與MSCP上表位配接來介導(dǎo)抗癌作用。本發(fā)明中，所述表位稱為"MSCP抗原性部分(antigenicmoiety)"，其特征為能與雜交瘤細(xì)胞系11BD-2E11-2編碼的單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段或抗體結(jié)合物結(jié)合。實(shí)施例3中顯示，11BD-2E1卜2抗體可用于免疫沉淀MDA-MB-231細(xì)胞等表達(dá)的相關(guān)抗原。另外，還可能借助FACS、細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附或IHC等技術(shù)將11BD-2E11-2抗體用于檢測是否存在表達(dá)與該抗體特異性結(jié)合的MSCP抗原性部分的細(xì)胞和/或組織。因此，通過FACS、細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附或IHC檢測技術(shù)，免疫沉淀的11BD-2E11-2抗原可以抑制11BD-2E11-2與這些細(xì)胞或組織結(jié)合。另外，與11BD-2Ell-2抗體一樣，其他抗MSCP抗體也可用于免疫沉淀和分離其他形式的MSCP抗原，而且同樣利用上述檢測法，該抗原也可用于抑制這些抗體與表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織的結(jié)合。本文中提到的所有專利和出版物代表本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員的技術(shù)水平，并視同以一一具體指明的引用方式全部并入文本。應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明按一定形式予以闡述，但并不限于本文所述和所顯示的特定形式或布局。本發(fā)明可在其范圍內(nèi)做出各種變更，而且并不限于本說明書所言和所顯示的內(nèi)容，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是不言而喻的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)和取得已述及和雖未述及卻切實(shí)存在的目的、預(yù)期結(jié)果和有益效果。本文所述的寡聚核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)化合物、方法、步驟和技術(shù)均代表優(yōu)選實(shí)施例，它們只是作為典型實(shí)例而非對發(fā)明范圍作出限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會想到屬于本發(fā)明精神涵蓋范圍和所附權(quán)利要求范圍所限定的變更及其他應(yīng)用。雖然已對本發(fā)明作出說明并給出具體的優(yōu)選實(shí)施例，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于這些具體的實(shí)施例。實(shí)際上，對本發(fā)明上述實(shí)施方式做出的各種本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的改動(dòng)都包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種治療癌癥患者的方法，其包括向所述患者施用抗癌抗體或其片段，該抗體是根據(jù)癌癥治療所使用的抗癌抗體的制備方法制備所得，所述抗體或其片段的特征在于對癌組織細(xì)胞有細(xì)胞毒性，而對非癌細(xì)胞基本上為良性；其中，將所述抗體或其片段與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導(dǎo)所述癌癥的治療；所述抗體是分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，它能與所述癌組織表達(dá)的抗原性部分結(jié)合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段是人源化抗體或嵌合抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包括將所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自毒素、酶、放射性化合物和血細(xì)胞的成分結(jié)合，形成抗體結(jié)合物；向所述患者施用所述抗體結(jié)合物或結(jié)合片段；其中，將所述抗體結(jié)合物或結(jié)合片段與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導(dǎo)所述癌癥的治療。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述抗體或其片段是人源化抗體或嵌合抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性來介導(dǎo)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性來介導(dǎo)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解來介導(dǎo)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過針對腫瘤細(xì)胞上癌癥抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答來介導(dǎo)。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過靶向細(xì)胞膜蛋白以干擾其功能來介導(dǎo)。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過使細(xì)胞蛋白構(gòu)象變化從而產(chǎn)生細(xì)胞殺傷作用啟動(dòng)信號來介導(dǎo)。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述制備方法利用含有取自特定個(gè)體的癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的組織樣本進(jìn)行制備。12.—種治療癌癥患者的方法，其包括向所述患者施用抗癌抗體或其片段，該抗體是根據(jù)癌癥治療所使用的抗癌抗體的制備方法制備所得，所述抗體對癌組織細(xì)胞有細(xì)胞毒性，而對非癌細(xì)胞基本上為良性；其中，所述抗體是分離出的、由保藏于ATC(;保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，將它與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導(dǎo)所述癌癥的治療。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，所述抗體或其片段是人源化抗體或嵌合抗體。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其包括將所述抗體或其片段與選自毒素、酶、放射性化合物和血細(xì)胞的成分結(jié)合，形成抗體結(jié)合物；向所述患者施用所述抗體結(jié)合物或其片段；其中，將所述抗體結(jié)合物與藥物可接受的佐劑混合后，按有效量施用以介導(dǎo)所述癌癥的治療。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，所述抗體或其片段是人源化抗體或嵌合抗體。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性來介導(dǎo)。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性來介導(dǎo)。18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解來介導(dǎo)。19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過針對腫瘤細(xì)胞上癌癥抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答來介導(dǎo)。20.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過靶向細(xì)胞膜蛋白以干擾其功能來介導(dǎo)。21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗體或其片段的細(xì)胞毒性是通過使細(xì)胞蛋白構(gòu)象變化從而產(chǎn)生細(xì)胞殺傷作用啟動(dòng)信號來介導(dǎo)。22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述制備方法利用含有取自特定個(gè)體的癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的組織樣本進(jìn)行制備。23.—種介導(dǎo)對細(xì)胞表面上表達(dá)有MCSP抗原性部分的人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法，其包括使所述腫瘤細(xì)胞與分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，所述抗體或抗原結(jié)合片段是分離出的、能與所述表達(dá)的MCSP抗原性部分結(jié)合的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATC(;保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結(jié)合，所述結(jié)合后即產(chǎn)生對細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述分離出的抗體或其抗原結(jié)合片段是人源化抗體或嵌合抗體。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，將所述分離出的抗體或其抗原結(jié)合片段與選自細(xì)胞毒性組分、酶、放射性化合物和血細(xì)胞的成分結(jié)合，形成抗體結(jié)合物。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述分離出的抗體或其抗原結(jié)合片段是人源化抗體或嵌合抗體。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述分離出的抗體或其抗原結(jié)合片段是鼠源抗體。28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，人腫瘤組織樣本從選自乳腺、卵巢或黑色素瘤組織的組織中的瘤獲得。29.—種確定存在表達(dá)MCSP抗原性部分的細(xì)胞的結(jié)合分析法，該MCSP抗原性部分能與分離出的、由保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合，該結(jié)合分析法包括提供細(xì)胞樣本；提供分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能與所述表達(dá)的MCSP抗原性部分結(jié)合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCG保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結(jié)合；將所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣本接觸；以及確定所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣本結(jié)合；從而確定存在表達(dá)能與所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合的MCSP抗原性部分的細(xì)胞。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的結(jié)合分析法，其中，人腫瘤組織樣本從選自乳腺、卵巢或黑色素瘤組織的組織中的瘤獲得。31.—種從樣本中分離或篩選表達(dá)能與分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合的MCSP抗原性部分的細(xì)胞的方法，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結(jié)合，該方法包括提供細(xì)胞樣本；提供分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能與所述表達(dá)的MCSP抗原性部分結(jié)合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCG保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的抗體結(jié)合；將所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣本接觸；以及確定所述分離出的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣本結(jié)合；從而確認(rèn)存在表達(dá)能與所述分離出的、由保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合的MCSP抗原性部分的細(xì)胞。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，細(xì)胞樣本從選自乳腺、卵巢或黑色素瘤組織的組織中的瘤獲得。33.—種通過對哺乳動(dòng)物中的人腫瘤予以治療來延長生存期和/或延緩疾病進(jìn)展的方法，其中，所述腫瘤表達(dá)能與具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合的抗原，該方法包括向所述哺乳動(dòng)物按有效量施用所述單克隆抗體以減小所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷，從而延緩疾病進(jìn)展和/或延長生存期。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述抗體與細(xì)胞毒性組分結(jié)合。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述細(xì)胞毒性組分是放射性同位素。36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述抗體將補(bǔ)體激活。37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述抗體是鼠源抗體。39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述抗體是人源化抗體。40.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述抗體是嵌合抗體。41.一種MCSP的表位，其包括表達(dá)出的MCSP抗原性部分，該MCSP抗原性部分能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的單克隆抗體或它的能與所述表達(dá)出的MCSP抗原性部分特異性結(jié)合的抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合。42.—種抗體-抗原復(fù)合物，其包括權(quán)利要求41所述MCSP的表位，該表位能被具有保藏于ATCC、保藏號為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體鑒別特征的單克隆抗體或它的能與所述MCSP表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合片段結(jié)合。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的抗體-抗原復(fù)合物，其中，該抗體是嵌合抗體。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的抗體-抗原復(fù)合物，其中，該抗體是人源化抗體。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的抗體-抗原復(fù)合物，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自細(xì)胞毒性組分、酶、放射性化合物和血細(xì)胞的成分結(jié)合，形成抗體結(jié)合物。46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.1所示肽序列LEFTLTTQSRQAPLAFQA被特異性結(jié)合。47.根據(jù)權(quán)利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.2所示肽序列CGGPAQDLTFRVSDGLQA被特異性結(jié)合。48.根據(jù)權(quán)利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.1所示肽序列LEFTLTTQSRQAPLAFQA和SEQIDNO.2所示肽序列CGGPAQDLTFRVSDGLQA被特異性結(jié)合。49.豐^fe禾J^求48戶;M的表位，其^i^與至^^^條選自SEQIDNO.3所示肽序列TL1MARLASAASFFGEN、SEQIDNO.4所示肽序列ACEGLTFQVLGTSSGLPV、SEQIDNO.5戶標(biāo)月W^JVLRGAPGTEVRSFTQAQL、SEQIDNO.6所示肽序列KTGKHDVQVLTAKPRNGL、SEQIDNO.7所示肽序列LTAKP艦LAGDTETFRK、SEQIDNO.8戶際月游列PGGQPDPELLQFCRTPNP的月游列J口口°全文摘要本發(fā)明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)；更特別涉及使用癌癥緩解性抗體(CDMAB)來啟動(dòng)細(xì)胞毒性反應(yīng)，可根據(jù)情況選擇與一種或多種化療劑聯(lián)合使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明CDMAB進(jìn)行結(jié)合分析。文檔編號C07K16/00GK101107267SQ200580040303公開日2008年1月16日申請日期2005年3月24日優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日發(fā)明者大衛(wèi)·S·F·楊,海倫·P·芬得利,艾莉森·L·費(fèi)里,蘇姍·E·哈恩申請人:阿里烏斯研究公司