專利名稱：：具有抗微生物活性的多肽及編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽與編碼該多肽的分離的多核普酸。本發(fā)明還涉及包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、及宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生與使用該多肽的方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明的一個目的是提供具有抗微生物活性的多肽與編碼該多肽的多核芬酸。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至42有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)由核香酸序列編碼的多肽，該核苷酸序列在至少中度嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:l的核苷酸145至270、(ii)SEQIDNO:1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(c)變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至42的一或多個氨基酸的保守性取代、缺失、和/或插入。本發(fā)明還涉及編碼具有抗微生物活性的多肽的分離的多核苷酸，其選自下組(a)多核苷酸，其編碼具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至42有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其與SEQIDNO:l的核苷酸145至270具有至少60%同一性；以及(c)多核苷酸，其在至少中度嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:l的核苷酸145至270、(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至270所包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交。本發(fā)明還涉及包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、和重組宿主細(xì)月包。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這樣的具有抗微生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)包括核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包括編碼該多肽的多核苷酸；以及(b)回收該多肽。本發(fā)明還涉及^f吏用本發(fā)明的多肽與多核苷酸的方法。定義抗微生物活性(antimicrobialactivity):術(shù)語"抗孩史生物活性，，在此定義為能夠殺死微生物細(xì)胞或抑制微生物細(xì)胞生長的活性。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"抗微生物的"意在表達(dá)這樣的意思，即存在殺細(xì)菌的(bactericidal)和/或抑細(xì)菌的(bacteriostatic)效果，和/或殺真菌的(fiingicidal)和/或抑真菌的(fiingistatic)效果，和/或殺病毒(virucidal)的效果，其中術(shù)語"殺細(xì)菌的"應(yīng)理解為能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語"抑細(xì)菌的"應(yīng)理解為能夠抑制細(xì)菌的生長，即抑制生長中的細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語"殺真菌的"應(yīng)理解為有殺死真菌細(xì)胞的能力。術(shù)語"抑真菌的"應(yīng)理解為能夠抑制真菌生長，即抑制生長中的真菌細(xì)胞。術(shù)語"殺病毒的，，應(yīng)理解為有滅活病毒的能力。術(shù)語"微生物細(xì)胞"指細(xì)菌或真菌細(xì)胞(包括酵母)。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"抑制微生物細(xì)胞的生長"意在表達(dá)這樣的意思，即細(xì)胞處于非生長狀態(tài)，即它們無法增殖。為了本發(fā)明的目的，抗微生物的活性可根據(jù)Lehrer等人，JournalofImmunologicalmethods,Vol.137(2)pp,167-174(1991)所述的程序測定。或者，抗微生物的活性可根據(jù)來自CLSI(臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute);之前被稱為國家臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NationalCommitteeofClinicalandLaboratoryStandards))的NCCLS指南觀'J定。具有抗微生物活性的多肽可具有以下的能力在20。C于具有抗微生物活性的多肽的25。/。(w/w)水溶液中；更優(yōu)選10。/。(w/w)的水溶液中；更優(yōu)選5。/。(w/w)的水溶液中；更優(yōu)選1。/。(w/w)的水溶液中；最優(yōu)選0.5。/。(w/w)的水溶液中；尤其是于0.1。/。(w/w)的水溶液中溫育8小時后(優(yōu)選4小時后，更優(yōu)選2小時后，最優(yōu)選1小時后，尤其是30分鐘后)減少大腸桿菌(五^/zehc/z/aco/z')(DSM1576)活細(xì)胞數(shù)目至1/100。具有抗微生物活性的多肽還可具有以下的能力在25°C于微生物的生長底物中，當(dāng)以1000ppm的濃度加入；較優(yōu)選以500ppm的濃度加入；更優(yōu)選以250ppm的濃度加入；更優(yōu)選以100ppm的濃度加入；最優(yōu)選以50ppm的濃度加入；尤其是以25ppm的濃度加入時，抑制大腸桿菌(DSM1576)的生長暈(outgrowth)24小時。具有抗微生物活性的多肽可具有以下的能力；在20。C于具有抗微生物活性的多肽的25。/。(w/w)水溶液中；優(yōu)選于10。/。(w/w)的水溶液中；更優(yōu)選于5。/。(w/w)的水溶液中；甚至更優(yōu)選于1。/。(w/w)的水溶液中；最優(yōu)選于0.5。/。(w/w)的水溶液中；尤其是于0.1。/。(w/w)的水溶液中溫育8小時后(較優(yōu)選4小時后，更優(yōu)選2小時后，最優(yōu)選l小時后，尤其是30分鐘后)將枯草芽孢桿菌(Bac/〃wH"to7z》(ATCC6633)活細(xì)胞減少至1/100。具有抗微生物活性的多肽還可具有以下的能力在25。C于微生物生長底物中，當(dāng)以1000ppm的濃度加入；優(yōu)選以500ppm的濃度加入；更優(yōu)選以250ppm的濃度加入；甚至更優(yōu)選以100ppm的濃度加入；最優(yōu)選以50ppm的濃度加入；尤其是以25ppm的濃度加入時，抑制枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的生長暈(outgrowth)24小時。本發(fā)明的多肽具有由SEQIDNO:2的氨基酸l至42所示的氨基酸序列組成的多肽的至少20%，優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，或甚至最優(yōu)選至少100%的抗微生物的活性。防衛(wèi)素(Defensin):術(shù)語"防衛(wèi)素"用于此處指本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為屬于防衛(wèi)素類抗微生物多肽的多肽。為確定某種多肽是否為本發(fā)明的防衛(wèi)素，優(yōu)選使用可免費獲得的HMMER軟件包將其氨基酸序列與PFAM數(shù)據(jù)庫的隱蔽馬爾科夫模型子集(hiddenmarkovmodelprofile)(HMM子集)比較(參見實施例6)。PFAM防衛(wèi)素家族包括防衛(wèi)素—1或"哺乳類防衛(wèi)素"("Mammaliandefensin，，)(登錄號PF00323)、防衛(wèi)素—2或"節(jié)肢動物防衛(wèi)素，，(登錄號PF01097)、防衛(wèi)素—卩或"(3防衛(wèi)素，，(登錄號PF00711)、防衛(wèi)素jropep或"防衛(wèi)素前肽"(登錄號PF00879)與Y-硫堇("thionin)或"y-硫堇家族"(登錄號PF00304)。防衛(wèi)素可屬于a-防衛(wèi)素類、卩-防衛(wèi)素類、e-防衛(wèi)素類、昆蟲(節(jié)肢動物)防衛(wèi)素類、植物防衛(wèi)素類、貝類(mussel)防衛(wèi)素類、或其它防衛(wèi)素類，其中氨基酸序列包括6或8個半胱氨酸且結(jié)構(gòu)上類似于任何前述防衛(wèi)素類。防衛(wèi)素還可為與所述任何防衛(wèi)素類型有共同的特征性質(zhì)的合成性防衛(wèi)素。這樣的防衛(wèi)素的實例包括，但不限于，a-防衛(wèi)素HNP-1(人類嗜中性粒細(xì)胞肽)、HNP-2與HNP-3;卩-防衛(wèi)素-12、Drosomycin、海利霉素(Heliomicin)、yl-噪呤硫堇(yl-purothionin)、昆蟲防衛(wèi)素A、與PCT申請WO99/53053、WO02/085934與WO03/044049所公開的防衛(wèi)素。分離的多肽術(shù)語"分離的多肽"此處用來指這樣的多肽，其至少是20%純，較優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%的，且甚至最優(yōu)選至少95%純的，其純度以SDS-PAGE測定。基本上純的多肽術(shù)語"基本上純的多肽"在本文中指這樣的多肽制備物，其包含最多10%,較優(yōu)選最多8%，更優(yōu)選最多6%,更優(yōu)選最多5%，更優(yōu)選最多4%,最多3%,甚至更優(yōu)選最多2%，最優(yōu)選最多1%,且甚至最優(yōu)選最多0.5%以重量計的與該多肽天然伴隨的其它多肽物質(zhì)。因此，較優(yōu)選地，所述基本上純的多肽為至少92%純，較優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99°/。純，最優(yōu)選至少99.5%純，且甚至最優(yōu)選100%純，以存在于該制備物中的總多肽物質(zhì)的重量計。本發(fā)明的多肽優(yōu)選為基本上純的形式。特別地，優(yōu)選該多肽呈"實質(zhì)上純的形式，，，即，該多肽制備物實質(zhì)上不含其它與其天然伴隨的多肽物質(zhì)。這可以例如通過利用公知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備該多肽而實現(xiàn)。這里，術(shù)語"基本上純的多肽"與術(shù)語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。同一性兩個氨基酸序列間或兩個核苷酸序列間的相關(guān)性以參數(shù)"同一性"描述。為了本發(fā)明的目的，兩個氨基酸序列間的同一性程度可通過使用FASTA程序包2.0x版中包含的FASTA程序(參見W.R.Pearson與D.J.Lipman(1988)，"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448;以及W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA"，MedhodsinEnzymology183:63畫98)來測定。所使用的計分矩陣為BLOSUM50,缺口罰分(gappenalty)為-12，而缺口延"f申罰分(gapextensionpenalty)為-2。兩個核苷酸序列間的同一性的程度使用與上述相同的算法與軟件包測定。所使用的計分矩陣為同一性矩陣(identitymatrix),缺口罰分為-16,而缺口延伸罰分為-4?；蛘撸ㄟ^使用來自EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)2.8.0版的Needle程序來確定兩氨基酸序列的比對。Needle程序?qū)崿F(xiàn)Needleman,S.B.與Wunsch，CD.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的總體比對算法。所使用的取代矩陣為BLOSUM62，缺口開放罰分(gapopeningpenalty)為10,而缺口延伸罰分為0.5。一個本發(fā)明的氨基酸序列("發(fā)明序列"；例如SEQIDNO:2的氨基酸1至42)與一不同的氨基酸序列("外來序列")之間的同一性程度根據(jù)下述計算用兩序列的比對中完全匹配(exactmatches)的數(shù)目，除以"發(fā)明序列"的長度或"外來序列"的長度(以其長度最短者)。結(jié)果以百分比同一性表示。當(dāng)"發(fā)明序列，，與"外來序列'，在重疊的相同位置上具有一致的氨基酸殘基時，則發(fā)生完全匹配(在以下的比對實例將其以T，表示)。序列的長度是該序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQIDNO:2的氨基酸1至42的長度為42)。在下面的比對實例中，重疊為序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANL，，。在該實例中，缺口以"-"表示。比對實例序列1:ACMSHTWGER-NL序列2:HGWGEDANLAMNPS多肽片段術(shù)語"多肽片段"在此定義為從SEQIDNO:2的氨基端和/或羧基端缺失了一個或多個氨基酸的多肽或其同源序列，其中該片段具有抗微生物活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽片段保留所有的半胱氨酸殘基，以及這些半胱氨酸殘基之間的氨基酸殘基。子序列(subsequence):術(shù)語"子序列"在此定義為從SEQIDNO:l的5'和/或3'端缺失一個或多個核苦酸的核苦酸序列或其同源序列，其中該子序列編碼具有抗微生物活性的多肽片段。等位變體術(shù)語"等位變體，，在此指占據(jù)相同染色體座位的基因的兩種或多種可選形式中的任何一種。等位變異通過突變天然地發(fā)生，且可能在群體中導(dǎo)致多態(tài)性?；蛲蛔兛蔀槌聊?在其編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體所編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語"基本上純的多核苷酸"在這里指這樣的多核苷酸制備物，其不含其它無關(guān)的或不需要的核苷酸，并且呈適于在經(jīng)基因工程處理的蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸包含最多10%,優(yōu)選最多8%，更優(yōu)選最多6%,更優(yōu)選最多5%，更優(yōu)選最多4%，更優(yōu)選最多3%，甚至更優(yōu)選最多2%，最優(yōu)選最多1%，且甚至最優(yōu)選最多0.5%以重量計的其它與其天然伴隨的多核苷酸物質(zhì)。然而，基本上純的多核香酸可包括天然存在的5，和3'非翻譯區(qū)域，例如啟動子與終止子。優(yōu)選地，基本上純的多核苷酸為至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，且甚至最優(yōu)選至少99.5%純，其以重量計。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選呈基本上純的形式。特別是，優(yōu)選地，這里公開的多核苷酸為"實質(zhì)上純的形式"，即，該多核苷酸制備物實質(zhì)上不含其它與其天然相伴隨的多核苷酸物質(zhì)。這里，術(shù)語"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語"分離的多核苷酸"以及"分離形式的多核苷酸"同義。該多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源，或其任何組合。cDNA:術(shù)語"cDNA"在此定義為這樣的DNA分子，其可v^人成熟、經(jīng)剪接的mRNA分子通過反轉(zhuǎn)錄而制備，其中所述mRNA分子獲自真核細(xì)胞。cDNA缺少通常出現(xiàn)于相應(yīng)的基因組DNA中的內(nèi)含子序列。最先的初級RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其經(jīng)過一系列的步驟加工后，作為成熟的、經(jīng)剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因此，衍生自mRNA的cDNA缺少任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語"核酸構(gòu)建體"此處指這樣的核酸分子，其為單鏈或雙鏈，分離自天然存在的基因，或其經(jīng)過修飾而以原本不會天然存在的方式包含核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"同義。控制序列術(shù)語"控制序列"在此定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核香酸的表達(dá)而言必需或有利的所有組分。每個控制序列對編碼多肽的核苷酸序列而言可以是固有的或外來的。這些控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。最少，控制序列包括啟動子、以及轉(zhuǎn)錄終止信號與翻譯終止信號。控制序列可具有接頭，用來導(dǎo)入特定的限制性位點，以便于將控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)域連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語"可操作地連接，，在此指這樣的構(gòu)型，其中控制序列被置于相對多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得該控制序列指導(dǎo)多肽的編碼序列的表達(dá)。編碼序列在這里使用時，術(shù)語"編碼序列"指這樣的核苷酸序列，其直接規(guī)定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框決定，而開放閱讀框通常以ATG起始密碼子或者備選起始密碼子例如GTG與TTG開始。編碼序列可為DNA、cDNA、或重組核苷酸序列。表達(dá)術(shù)語"表達(dá)，，包括多肽的產(chǎn)生所涉及的任何步驟，其包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。表達(dá)載體術(shù)語"表達(dá)載體，，在此定義為線性或環(huán)狀DNA分子，其包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，且可操作地連接于用于其表達(dá)的額外核苷酸。宿主細(xì)胞術(shù)語"宿主細(xì)胞"，用于此處時，包括任何細(xì)胞類型，其易于被包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等等。j務(wù)飾術(shù)語"修飾"在此處意味著對由SEQIDNO:2的氨基酸1至42組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼該多肽的DNA的基因操作。修飾可為在該氨基酸序列中發(fā)生一或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及氨基酸側(cè)鏈的置換，或使用具有類似特征的非天然氨基酸。特別地，所述修飾可以是酰胺化，例如C端的酰胺化。人工變體當(dāng)用于此處時，術(shù)語"人工變體"指具有抗微生物活性的多肽，其由表達(dá)經(jīng)修飾的SEQIDNO:l的核苷酸序列的生物產(chǎn)生。該修飾核苷SH序列是通過人力介入，對SEQIDNO:l公開的核苷酸序列進(jìn)行修飾而獲得的。發(fā)明詳述具有抗^t生物活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，其具有這樣的氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至42(即成熟多肽)具有至少60%,優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,且甚至最優(yōu)選至少97%的同一性，并具有抗;微生物活性(以下稱"同源多肽，，)。在一個優(yōu)選的方面，同源多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至42有10個氨基酸，優(yōu)選有5個氨基酸，更優(yōu)選有4個氨基酸，甚至更優(yōu)選有3個氨基酸，最優(yōu)選有2個氨基酸，且甚至最優(yōu)選有1個氨基酸不同。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有抗微生物活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸1至42,或其等位變體；或其具有抗微生物活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸l至42。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有抗微生物活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至42或其等位變體；或其具有抗微生物活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至42組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離多肽，它們由這樣的多核苷酸所編碼所述多核苷酸在極低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選在低度嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選在中度嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選在中度-高度嚴(yán)緊條件下，甚至更優(yōu)選在高度嚴(yán)緊條件下，最優(yōu)選在極高嚴(yán)緊條件下與下列者雜交(i)SEQIDNO:l的核苷酸145至270,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至270中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補(bǔ)鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch,與T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALabrotoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:l的子序列包含至少100個連續(xù)的核香酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，該子序列可編碼具有抗微生物活性的多肽片段。SEQIDNO:l或其子序列的核苦酸序列，以及SEQIDNO:2或其片段的氨基酸序列，可用于設(shè)計核酸探針，以從不同的屬或種的林系中依照本領(lǐng)域熟知的技術(shù)鑒定并克隆編碼具有抗微生物活性的多肽的DNA。特別地，可依照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡法程序，用這樣的探針與目標(biāo)屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定并分離其中相應(yīng)的基因。這樣的探針可以顯著地短于完整序列，j旦長度應(yīng)該至少為14個，優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少35個，最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選該核酸探針的長度至少為100個核苷酸。例如，該核酸探針可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少為270個核苷酸。DNA與RNA探針兩者都可使用。該探針通常被標(biāo)記以用來檢測相應(yīng)的基因(例如，以32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白標(biāo)記)。這樣的探針為本發(fā)明所涵蓋。因此，對于從這樣的其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫，可以從其中篩選可與上述探針雜交并編碼具有抗微生物活性多肽的DNA。來自這樣的其它生物的基因組或其它DNA可借助瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)來分離。來自所述文庫的DNA或經(jīng)過分離的DNA可轉(zhuǎn)移至并固定于硝酸纖維素或其它適合的載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO:l或其子序列同源的克隆或DNA,將該載體材料用于Southern印跡。為了本發(fā)明的目的，"雜交"表明在極低至極高嚴(yán)緊條件下，該核苷酸序列與標(biāo)記核酸探針發(fā)生雜交，其中所述探針對應(yīng)于SEQIDNO:l中所示核苷酸序列、其互補(bǔ)鏈、或其子序列。在此條件下與所述核酸探針發(fā)生雜交的分子可使用X光膠片檢測。在一個優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其子序列。在另一個優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQIDNO:l。在另一個優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)域。對長度至少100個核苷酸的長探針而言，極低至極高嚴(yán)緊條件定義為在42。C、于5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml經(jīng)剪切并變性的鮭精DNA、及25%曱酰胺(用于極低及低嚴(yán)緊度)、35%曱酰胺(用于中及中-高嚴(yán)緊度)、或50%曱酰胺(用于高度和極高嚴(yán)緊度)中進(jìn)行預(yù)雜交與雜交，其依照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序最優(yōu)地進(jìn)行12個至24個小時。對長度至少100個核苷酸的長探針，將載體材料最終清洗三次，每次15分鐘，其中洗滌使用2XSSC、0.2%SDS，優(yōu)選在至少45°C(極低嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少50。C(低嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少55。C(中度嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少60。C(中-高嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少65。C(高嚴(yán)緊度)，最優(yōu)選于至少70。C(極高嚴(yán)緊度)進(jìn)行。對長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴(yán)緊條件定義為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，在比使用根據(jù)Bolton與McCarthy(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)的計算法算得的Tm低大約5。C至大約10。C的溫度，于0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、IXDenhardt溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉(Sodiummonobasicphosphate)、0.1mMATP、與0.2mg/ml酵母RNA中進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后清洗。對長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，在低于計算所得之Tm大約5。C至大約10。C條件下，在6XSCC加0.1%SDS中清洗載體材料一次15分鐘，并使用6XSSC清洗兩次各15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及人工變體，其包括SEQIDNO:2或其成熟多肽的一個或多個氨基酸的保守性取代、缺失和/或插入。優(yōu)選地，氨基酸改變從性質(zhì)而言是次要的，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸置換或插入；小的缺失，通常為l到大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的曱硫氨酸殘基；長達(dá)大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能從而促進(jìn)純化的小段延伸，諸如多組氨酸序列段(poly-histidinetract)、抗原性表位、或結(jié)合域。保守性取代的例子在下面各組之內(nèi)堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。一般不改變具體活性的氨基酸置換是本領(lǐng)域已知的，例如H.Neurath和R丄.Hill在772eiVo的'ra中所述(1979，AcademicPress，NewYork)。最常發(fā)生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、AWThr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。除了20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外，可使用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如4-羥基脯氨酸、6-N-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、與a-甲基絲氨酸)來取代野生型多肽的氨基酸殘基?？梢允褂糜邢迶?shù)目的非保守性氨基酸(不由基因密碼編碼的氨基酸)及非天然氨基酸來取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"已在蛋白質(zhì)合成后被修飾，并且/或者在其側(cè)鏈中具有與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可被化學(xué)地合成，且優(yōu)選是可以商購的，其包括2-哌啶酸(pipecolicacid)、蓬唑啉羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸、以及3,3-二甲基脯氨酸?；蛘撸霭被岣淖兙哂羞@樣的性質(zhì)，使得多肽的物理-化學(xué)特性被改變。例如，氨基酸改變可改善多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH、等等。親本多肽中的關(guān)鍵氨基酸可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham與Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定。在后一種技術(shù)中，將在分子中的每個殘基中導(dǎo)入單個丙氨酸突變，并測試所得突變分子的生物活性(即抗微生物活性)，以鑒定對該分子的活性來說至關(guān)重要的氨基酸殘基。另見Hilton等，1996，《/說o/.C/zem.271:4699-4708。酶的活性位點或其它生物相互作用還可通過分析物理結(jié)構(gòu)(通過例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親合標(biāo)記來確定)，結(jié)合對推定的接觸位置氨基酸的突變來測定。參見，例如，deVos等，1992,5We"ce255:306-312;Smith等，1992，Mo/.Ao/.224:899-904;Wlodaver等，1992,/^^SLe".309:59-64。還可從分析與本發(fā)明多肽相關(guān)的多肽的特征出發(fā)來推定關(guān)鍵氨基酸的特征?？墒褂靡阎恼T變、重組、或改組(shuffling)方法，隨后進(jìn)行相關(guān)的篩選程序，例如Reidhaar-Olson與Sauer，1988,5We"ce241:53-57;Bowie與Sauer,1989,Ato/.JcadSc/.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625所公開的那些，來產(chǎn)生并測試單個或多個氨基酸取代?？墒褂玫钠渌椒òㄒ族e(error-prone)PCR、噬菌體展示(例如Lowman等，1991,所oc/ze附.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)、以及區(qū)域針對性(region-directed)誘變(Derbyshire等，1986,46:145;Ner等,1988，DNA7:127)。可以將誘變/改組方法和高通量、自動化篩選方法結(jié)合起來，檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的經(jīng)過克隆、誘變的多肽的活性?？梢詮乃拗骷?xì)胞中回收編碼活性多肽的經(jīng)誘變的DNA分子，并使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對其快速測序。這些方法使人們能夠快速確定目標(biāo)多肽中個別氨基酸殘基的重要性，且可適用于結(jié)構(gòu)未知的多肽。SEQIDNO:2的氨基酸1至42的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)為10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選最多6，更優(yōu)選最多5,更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，且甚至最優(yōu)選l。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽是防衛(wèi)素多肽。在另一個實施方式中，本發(fā)明的多肽包括三個雙-半胱氨酸鍵。N-端延伸本發(fā)明的多肽的N-端延伸可適合地由1至50個氨基酸，優(yōu)選2-20個氨基酸，尤其是3-15個氨基酸組成。在一個實施方式中，N-末端多肽延伸不包含Arg(R)。在另一個實施方式中，該N-末端延伸包括kex2或類-kex2切割位點(下面將對其進(jìn)一步定義)。在一個優(yōu)選實施方式中，該N-末端延伸是包括至少兩個Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸殘基的肽，例如包括下列序列中之一的N一末端延伸EAE、EE、DE與DD。Kex2位點Kex24立點(參見，例3口，MethodsinEnzymologyVol185,ed.D.Goeddel，AcademicPressInc.(1990)，SanDiego,CA,"GeneExpressionTechnology，，)與類-Kex2位點是在某些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)域與成熟區(qū)域之間存在的二元(di-basic)識別位點(即切割位點)。已經(jīng)證明，在某些情況下，插入Kex2位點或類-Kex2位點可促進(jìn)前肽切割位點處的正確內(nèi)肽酶加工，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌水平增加。在本發(fā)明的背景中，插入kex2或類-Kex2位點使得在N-末端延伸中的某個位置獲得切割成為可能，結(jié)果產(chǎn)生與SEQIDNO:2的氨基酸1至42所示的成熟多肽相比得以延伸的抗微生物多肽。融合多肽本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽被融合到本發(fā)明的多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括將編碼多肽的多個編碼序列連接起來，使得它們處于同一閱讀框中，并且融合多肽的表達(dá)在相同的啟動子與終止子的控制下。具有抗孩t生物活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可獲自任何屬的微生物，為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"獲自"與所給定的來源聯(lián)用時，應(yīng)意指核苷酸序列所編碼的多肽是由該來源產(chǎn)生的，或者是由這樣的抹系產(chǎn)生的該抹系中插入了來自該來源的所述核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，獲自給定來源的多肽被分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明的多肽可為細(xì)菌多肽。例如，該多肽可為革蘭氏陽性細(xì)菌的多肽，例如芽孢桿菌(5a"7/w"的多肽，例如，嗜堿芽孢桿菌(^^///m"/Aa/o//n7—、解淀粉芽孑包桿菌(5ac〃/w51"附;;/o/z々w^c/e""、短芽孑包軒菌C6(3c77/wsfereW力、環(huán)^j犬芽孑包才干菌C6"c〃/wsc/rcw/a"s)、凝結(jié)芽孑包4干菌(5flcz7/wscoagw/"w)、)t山;fc蘭芽孑包才干菌(5ac〃/w/a"^s)、遲緩孑包芽4干菌(5acz7/ws/e"fw力、i也衣芽孑包4干菌(Bac/〃w/,c/2e"i/brm/"、巨大芽孑包4干菌(Sac/〃wmega^r/ww)、脂肪嗜熱芽孢桿菌CSacz7/w1s^ZTOAermo//2//us)、枯草芽孢桿菌、或蘇云金孢芽桿菌CBa"'〃wAwn'"g/era&)的多肽；或鏈霉菌OS&epfowycas)的多肽，例如,淺青紫鏈霉菌(iSV/^pto"ces//vzV/am)或鼠灰鏈霉菌(5y^pom3;ces的多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌的多肽，例如，大腸桿菌或假單胞菌某個種(尸sewcfomowossp,)的多狀。本發(fā)明的多肽還可為真菌多肽，更優(yōu)選為酵母多肽，例如假絲酵母屬(Cam//^)、克魯維酵母屬CS:/zon^ram^es)、畢赤酵母屬(戶/<^&)、酵母屬(iSacc/wtro，cas)、裂殖酵母屬(Sc/7/zosacc/zaramyces)、或IWrcw/a屬的多狀；或更優(yōu)選絲狀真菌的多肽，例如枝頂孢屬(y^rewom'wm)、曲霉屬(j，rg7'〃—、短梗霉屬(Jweo6asW,)、隱球菌屬(CV7/7tococcws)、f7"6ow/Wwm屬、鐮孑包屬(Fwsan'w/w)、腐質(zhì)霉屬(7/w附/co/a)、Afog"fl/0W/2e屬、毛霉屬(Mwcor)、毀絲霉屬(Afyce/—她ora)、A^oc滿腿逾屬、脈孑包菌屬(A^ewrcwpora)、擬青霉屬(尸aec〃ow少ce力、青霉屬(戶e"/cz'〃z'wm)、尸zVowjces屬、裂褶菌屬OSb/zfeop/^/wm)、踝節(jié)菌屬(7b/aram_yc")、嗜熱子嚢菌屬(77zerwooycM力、才炎孑包殼屬(72/e/(3Wa)、7b/j^oc/o^"w屬、或木霉屬(7Wc/20cferwa)的多肽。在一個優(yōu)選的方面，該多肽是卡爾酵母(5"acc/wromycescaWAergem^)、酉良酒酵母(5^cc/2a7-om^cascerev&z'ae)、jf唐4b酵母(!Sacc/zaT-ow少c&sc/astoricw力、iSacc/z"romyc^sGfowg/as"、克魯弗酵母(5"acc/zaro附;;c&sA:/i(yver0、諾地酵母(Sacc/zaromyceswor6ms&)、或卵形酵母(iSacc/zara，cesovzybnm'"的具有抗微生物活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是棘孢曲霉(As/ergz7/wsacw/eaft^)、泡盛曲霉(y4s/7ergz7/wsowamon')、^因曲霉(/^/ergz7/ws/^m/ga&"、臭曲霉(y4s/ergz'〃"51yb幼V/—、日本曲霉(A/^-gz7/w乂qpo"/c—、構(gòu)巢曲霉(/^^77/i^"油/am1)、黑曲霉(A/^g77/wsm'ger)、米曲霉(/^/erg/〃ws07z"e)、軒孑包狀嫌孑包(i^san',6acfnWo/cfes)、7^(3n',cem3f/z's、/^a"'Mmcrao^w〃mse、大刀嫌孑包(Fws(3r/wmcw/mor,)、禾本科嫌孑包(Fusar/Mmgrawz'"ear,)、禾赤嫌孑包(i^"n'wmgrow/www)、異孑包嫌孑包(Fwan'M附/2eferos/on'w附)、合？欠木嫌孑包(尸Msar/w附"egw力')、尖鐮孑包(Fwi^n'wwo;qyj:/orMm)、多^支鐮孑包(Fwsan.wmref/cw/a/ww)、4分鄉(xiāng)工嫌孑包(FiAS"n'wwrosew附)、接骨木嫌孑包(Fwsan'w/ws"附6wc/ww附)、月夫色嫌孑包(■Fwsan'wmsarcoc/zrowm)、4以分斗支孑包鐮孑包(Fwsan'wm57oro^7'c/z/o/des)、Fwsbn'wwvewewafw附、//w附/co/az7wo/ews、//wm/co/a/awwg/wosa、曼3赤毛審(Afwco廠w/e/zez')、Afyce/z'op她oraf/7ermqp/7a、粗鏈脈孑包菌(A^ewmsporacmssa)、產(chǎn)紫青霉(Pem'",〃/w附/w戸rage",)、哈茨木霉(7h'c/ocfema/2ar^'a肌附)、康寧木或綠色木霉(7Wc/zoofermaWnVfe)的多肽。在另一個較優(yōu)選的方面，該多肽是阿姆斯特丹散嚢菌(^^o^/wamWe/odam/)、阿姆#々4爭丹曲霉04^sperg/〃wawMfe/oobw/)、蒙；也曲霉(J^spe7-gz7/itf附o"fevz.t/em^)或^4s/e/^77/wsWfe的多肽。在一個優(yōu)選的方面，該多肽系個阿姆斯特丹散嚢菌的多肽，例如，SEQIDNO:2的多肽。應(yīng)當(dāng)理解，對于以上所提及的種，本發(fā)明涵蓋完全的與不完全的狀態(tài)(state)兩者，以及其它分類上的等同物，例如無性型(anamorphs),而不論其以什么種名為人所知。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識別合適的等同物的特征。公眾可以容易地從許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)獲得這些物種的抹系，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)、德意志微生物和纟田胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSM)、真菌菌種保藏中心(CentmalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)、與農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏中心，北方區(qū)域研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,NRRL》此外，這樣的多肽還可以從其它來源鑒定和獲得，包括通過使用上述的探針從自然(例如，土壤、堆肥、水；等等)分離的微生物。用于從天然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。然后可通過類似地篩選其它微生物的基因組或cDNA文庫而獲得所述多核香酸。一旦已用探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，則可使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的技術(shù)來分離或克隆該多核苷酸(參見，例如，Sambrook等，1989，如上述)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽被融合至該多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通過融合編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)至本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括將編碼所述多肽的編碼序列連接，使它們處于同一閱讀框中，并使得融合多肽的表達(dá)在相同的啟動子與終止子的控制下。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，該核苷S吏序列在SEQIDNO:l中列出。在另一個優(yōu)選的方面，該核苷酸序列為SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)域。本發(fā)明還涵蓋這樣的核苷酸序列，其編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，這些序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:l。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:l的子序列，其編碼SEQIDNO:2的具有抗微生物活性的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包括至少一個突變，其中該突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至42組成的多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或者兩者的組合。例如，通過利用眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),或抗體篩選表達(dá)文庫以檢測出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，可以實現(xiàn)從這些基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苦酸序列。例如參見Innis等人，1990,《PCR:AGuidetoMethodsandApplication》，AcademicPress,NewYork。還可以使用其它核酸擴(kuò)增程序，諸如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)、和基于核香酸序列的擴(kuò)增(nucleotidesequence-basedamplification,NASBA)?？蓮纳熬鷮?五wrari,)菌林或者另外的或相關(guān)的生物體克隆多核苷酸，因此，例如，它可以是核苷酸序列中多肽編碼區(qū)的等位變體或種間變體。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其具有與SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列(即核苷酸145至270)有至少60%,優(yōu)選至少65°/。，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少卯％，更優(yōu)選至少95%,最優(yōu)選至少97%的同一性的核苷酸序列，并編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，對于合成與本發(fā)明多肽基本上類似的多肽可能是必需的。術(shù)語與多肽"基本上類似"是指所述多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能在某些經(jīng)過工程改造的方面區(qū)別于從其天然來源分離的多肽，例如在比活、熱穩(wěn)定性、最佳pH等方面不同的人工變體。變體序列可以在SEQIDNO:l的多肽編碼區(qū)所示核苷酸序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建，例如其子序列，和/或通過引入不會導(dǎo)致由該核苦酸序列編碼的多肽具有另一種氨基酸序列、而是使之符合要用來生產(chǎn)酶的宿主生物體的密碼子使用方式的核苦酸取代，或通過引入可導(dǎo)致不同氨基酸序列的核苷酸取代來構(gòu)建。對于核苷酸取代的一般性描述可參見例如Ford等，1991，尸roto'wEgressz.o"a打fifPwnyc加,o"2:95-107。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，這樣的取代可發(fā)生在對分子功能而言關(guān)鍵的區(qū)域之外，且仍然得到活性多肽。對于由本發(fā)明的分離多核普酸所編碼的多肽的活性來說至關(guān)重要的、因此優(yōu)選不被取代的氨基酸殘基，可根據(jù)本領(lǐng)域的已知程序諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如參見Cunningham和Wells，1989，Science244:1081-1085)來鑒定。在后一種技術(shù)中，在分子中每一帶正電荷殘基處引入突變，然后測試由此得到的突變分子的抗微生物活性以鑒定對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可通過三維結(jié)構(gòu)分析來確定，其中三維結(jié)構(gòu)由核磁共振分析、晶體學(xué)、或光親和標(biāo)記等技術(shù)來測定(例如參見deVos等，1992，5We"ce255:306-312;Smith等，1992,J0w77a/0/M0/ecw/w所0/0gy224:899-904;Wlodaver等，1992，F(xiàn)五5S丄e股ra309:59-64)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，其在低度嚴(yán)緊條件，優(yōu)選中度嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中度-高度嚴(yán)緊條件，甚至更優(yōu)選高度嚴(yán)緊條件，最優(yōu)選極高嚴(yán)緊條件下與以下者雜交(i)SEQIDNO:l的核苷酸145至270、(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至270所包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；或其等位變體及其子序列(Sambrook等，1989，同上)，如此處所定義的。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其通過以下方法獲得(a)在低度、中度、中度-高度、高度、或極高嚴(yán)緊條件下將DNA群體與(i)SEQIDNO:l的核苷酸145至270、(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(b)分離該雜交多核苷酸，其編碼具有抗-微生物活性的多肽。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含與一種或多種控制序列可操作連接的本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述控制序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞中于與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢远喾N方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離多核苦酸，以便于多肽的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體的不同，可能希望或必須在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進(jìn)行操作。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？刂菩蛄锌梢允沁m當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，即受到宿主?xì)胞識別來表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列包含調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，而且可獲自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄(尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄)的適當(dāng)啟動子的實例，是從大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌OS&印/ow;/c"co^co/oO瓊脂酶基因(^g^)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因O"c萬)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am^丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(aw^M)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因Owj;g)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pew尸)、枯草芽孢桿菌x_yL4和x_y/5基因和原核生物的(3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,/VoceWwgso/A^加'owor/爿ca6fe附少o/5We"ces75:3727-3731)中獲得的啟動子，以及toe啟動子(DeBoer等，1983,尸raceW/^tV加'o""/^c"demyq/\SWe"casC/S^80:21-25)。還有"Usefolproteinsfromrecombinantbacteria",5We油ycjwerz'ca"，1980，242:74-94及Sambrook等，1989,同上中描述的其它啟動子。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的實例是從米曲霉TAKA淀粉酶、及Wzomwcw脂W7"天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/a^)、//2/zowwcwm/e/2e/脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、Fwsan'i/wve"e""mw淀粉葡糖苦酶(WO00/56900)、vewewart/w2Daria("WO00/56900)、^Fwsan'wmvewewoffwwQuinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、7Wc/zoa^mare^sez'(3-葡沖唐苦酵、7WcAoafer附flrease/纟f維二糖t]C解酵I、7Wc/zocferwarease/內(nèi)切葡聚糖酶I、7Wc/zoc/ermareese/內(nèi)切葡聚糖酶II、TWc/zocferware^se/內(nèi)切葡聚糖酶III、7h'c/zocfenw(3rease/內(nèi)切葡聚糖酶IV、TWc/wArmareese/內(nèi)切葡聚糖酶V、7Wc/zocfenware^e/木聚糖酶I、7Wc/zocfermarease/木聚糖酶II、7Wc/wAnwap-木糖苦酶基因中獲得的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的雜合啟動子)；及其突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADHl、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等，1992，8:423-488中描述了用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用啟動子?？刂菩蛄幸部梢允沁m當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，即由宿主細(xì)胞識別來終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的3'端。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子獲自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。對于酵母宿主細(xì)^^優(yōu)選的終止子獲自釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。還有Romanos等，1992,同上中描述的用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用終止子?？刂菩蛄羞€可以是適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列(leaders叫uence),即對宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5'端。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列獲自米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH2/GAP)的基因。控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即可操作連接于核苷酸序列3'端，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時可由宿主細(xì)胞識別，作為將聚腺苷殘基添加到轉(zhuǎn)錄的mRNA上的信號的序列。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺香酸化序列獲自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉a-葡糖苦酶的基因。Guo和Sherman等，1995,Mo/ecw/wCe//w/ar所o/ogv15:5983-5990中描述了對酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺香酸化序列?？刂菩蛄羞€可以是信號肽編碼區(qū)，它編碼連接于多肽的氨基末端并指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的氨基酸序列。核苷酸序列的編碼序列的5'端可天然地包含信號肽編碼區(qū)，它天然地以符合翻譯閱讀框的方式與編碼分泌多肽的編碼區(qū)段連接?；蛘?，編碼序列的5'端可以包含對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。如果編碼序列天然不含信號肽編碼區(qū)，則可能需要外來的信號肽編碼區(qū)?；蛘?，外來的信號肽編碼區(qū)可僅僅替換天然信號肽編碼區(qū)以便增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選擇宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。對細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是獲自芽孢桿菌NCIB11837生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌j3-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶類(";^:r、"/w、"/WW)、和枯草芽孢桿菌的/r^4基因的信號肽編碼區(qū)。Simonen和Palva,1993，M/cro6/o/ogZca/iev/evw57:109-137中描述了更多的信號肽。對絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是獲自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、及/^o/m/corwzWze/天冬氨酸蛋白酶、//ww/co/a/rao/e;w纖維素酶、/fwm/co/aZrao/e"s內(nèi)切葡聚糖酶V和/7wm/co/fl/awwg/wwa脂肪酶的基因的信號肽編碼區(qū)。在一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)域是SEQIDNO:1的核苷酸1至60,其編碼SEQIDNO:2的氨基酸-48至-29。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽獲自釀酒酵母a-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。Romanos等，1992，同上中描述了其它有用的信號肽編碼區(qū)?？刂菩蛄羞€可以是前肽(propeptide)編碼區(qū)，它編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有時候稱作酶原(zymogen))。多肽原一般是沒有活性的，且可通過前肽的催化或自催化切割從多肽原轉(zhuǎn)變成成熟有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母a-因子、i/n'zomwcorm/e/zez'天冬氨酸蛋白酶、牙口Afyce//o//2//zoraf/zer附cip/zz7a漆酶(WO95/33836)的基因獲得。在一個優(yōu)選的方面，前肽編碼區(qū)域是SEQIDNO:l的核苷酸61至144,其編碼SEQIDNO:2的氨基酸-28至-1。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)位于與多肽氨基末端相鄰的位置，而信號肽區(qū)位于與前肽區(qū)的氨基末端相鄰的位置。還可能需要加上調(diào)節(jié)序列以使多肽的表達(dá)可以相對于宿主細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是能響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而引起基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉。在原核系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/ac、toc、和&p操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是用于基因擴(kuò)增的那些序列。在真核系統(tǒng)中，這些包括在氨曱喋呤(methotrexate)存在時擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，以及有重金屬存在時擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。可以將本文所述的各種核酸和控制序列連接起來以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，此重組表達(dá)載體可包括一個或多個適宜的限制性位點使得在這些位點可插入或替換編碼多肽的核苷酸序列?；蛘?，本發(fā)明的核苷酸序列可通過將核苦酸序列或含有該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)載體時，將編碼序列置于載體中以使編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是能方便地接受重組DNA操作并能引起核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇一般取決于載體與要引入此載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即可以染色體外實體的形式存在，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復(fù)制的手段?；蛘撸d體可以是這樣的載體，它在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，整合到基因組中并與其整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制。此外，可使用單一載體或質(zhì)粒，或是一起含有待引入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩種或多種載體或質(zhì)粒，或者轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明載體優(yōu)選包含一種或多種選擇標(biāo)記，所述選擇標(biāo)記允許人們?nèi)菀椎剡x擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇標(biāo)記是這樣的基因，它的產(chǎn)物有助于產(chǎn)生殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型變成營養(yǎng)缺陷型等等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da/基因，或者賦予抗生素抗性諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記有ADE2、fflS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇標(biāo)記包括但不限于am必(乙酰胺酶)、fl^萬(鳥氨酸氨曱?；D(zhuǎn)移酶)、6ar(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)、(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、(硝酸還原酶)、(乳清苷-5'-磷酸脫羧酶)、(疏酸腺苦酰轉(zhuǎn)移酶(sulfateadenyltransferase))、和^pC(鄰氨基苯曱酸合酶)及其等價物。優(yōu)選用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的am^S和基因以及吸水鏈霉菌(Sfre/fomyces/^groscop/cus)的基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者允許載體在細(xì)胞中不依賴于基因組自主復(fù)制的元件。為了整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸序列或任何其它載體元件通過同源或非同源重組整合到基因組中?；蛘撸d體可包含附加的核苦酸序列用于指導(dǎo)通過同源重組在染色體中的特定位置整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。為了提高在特定位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的與相應(yīng)目標(biāo)序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10,000個石咸基對、優(yōu)選400-10,000個石威基對、且最優(yōu)選800-10,000個堿基對，從而提高同源重組的幾率。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，載體可通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體還可包含能使載體在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細(xì)胞中起作用的調(diào)節(jié)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator)。術(shù)語"復(fù)制起點"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在本文中定義為能使質(zhì)?；蜉d體在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAM卩l(xiāng)的復(fù)制起點。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點的實例是2iim復(fù)制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、及ARS4和CEN6的組合?？捎糜诮z狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點的實例有AMA1和ANSI(Gems等，1991，98:61-67;Cullen等，1987,池c/efd/(is及e，"/215:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可根據(jù)WO00/24883中所公開的方法來完成?？蓪⒈景l(fā)明多核苷酸的一個以上的拷貝插入宿主細(xì)胞中以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。提高多核苷酸拷貝數(shù)可通過下面的手段實現(xiàn)將序列的至少一個附加拷貝整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中；或使多核苷酸中包含可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因，并在合適的選擇劑存在下培養(yǎng)此細(xì)胞，以篩選出包含所述選擇標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝一因此也包含所述多核苷酸的更多拷貝一的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(例如參見Sambrook等，l989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，它們可有利地用于多肽的重組生產(chǎn)?？蓪景l(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞以-使載體保持為染色體的整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如前所述。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括所有那些由于在復(fù)制期間發(fā)生的突變而相異于親本細(xì)胞的親本細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)^0諸如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、5"cz7/mc/mw/z'、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細(xì)胞，例如淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如大腸桿菌和某種假單胞菌。在一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草桿菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿的芽孢桿菌。將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Chang和Cohen,1979,Mo/ec"/arGewera/Ge"幼'cs168:111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參見例如Young和Spizizen，1961，Jow薩/。/5ac敏油gv81:823-829;或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Jbwr"a/o/Mo/ecw/ar56:209-221)、電穿孑L(參見侈'W口Shigekawa牙口Dower，1988，B/otec/zm々wes6:742-751)、或接合(參見例如Koehler和Thorne，1987，w"a/。/5a"en'o/og);169:5771-5278)來實現(xiàn)。宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動物、昆蟲、才直物或真菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。"真菌"在用于本文時包括子嚢菌門(Acomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等,在《AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi》，第八版，1995，CABInternational，UniversityPress,Cambridge，UK中所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上第171頁中所引用的)和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfUngi)(Hawksworth等，1995，同上)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。"酵母"在用于本文時包括產(chǎn)子嚢酵母(內(nèi)孢霉目Endomycetales)、產(chǎn)擔(dān)孢子酵母、和屬于半知菌類的酵母(芽孢綱Blastomycetes)。由于酵母的分類今后還會變化，對于本發(fā)明來說，酵母應(yīng)該是如在《BiologyandActivitiesofYeast》(Skinner,F.A.、Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所定義的。在一個更優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(/fo"^"w/a)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或y"mrow/a屬細(xì)胞。在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Sacc/wramyces<iowg/as//、克魯弗酵母、諾地酵母、或卵形酵母細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳克魯維酵母(A7w;/verom;;c^/oc&)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是yi^TOwz'a/*o/>^'ca細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞門的所有絲狀體(如Hawksworth等人，1995，同上中所定義的)。絲狀真菌通常是以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、及其他復(fù)合多糖組成的菌絲壁為特征。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長，碳代謝是專性需氧的。相反，酵母諸如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽，而碳代謝可以是發(fā)酵性的。在一個更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢屬、曲霉屬、短柄霉屬、煙管菌屬(5，toafera)、Cen》o",o;^屬、鬼傘屬(Cop"'"iw)、革蓋菌屬(Con'o/w)、隱3求酵母屬、尸/"Zos/fi^m屬、鐮孑包屬、腐質(zhì)霉屬、^W"gwapoW/2e屬、毛霉屬、毀絲霉屬、^^///附0^/;(:屬、脈孢霉屬、擬青霉屬、青霉屬、尸/w"erac/2"efe屬、射月永菌屬(尸/z/e6z'a)、Pz'ramyces屬、側(cè)耳屬(尸/ewoftw)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、7bfypoc/a&wm屬、栓菌屬(rrametes)、或木霉屬的細(xì)月包。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲卄犬真菌宿主纟田月包是4干孑包狀鐮孑包、Fw^n'wwcerea/^、尸wsan'w/wCTOoAwe〃mse、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、i^an.訓(xùn)sw/p/2wreMw、尸"5^".wwtora/os膽、Fusan.畫Wc/zc^/ze"'o/cfes、或Fw^Ww附vewewa^w細(xì)月包。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是無煙管菌We/^aw(iera、Cen)o".o戸z'sa"ezW"a、Ce—on.op^c<areg/ea、Cmjrorz.op^sw6n^、Cm》or/o/w/sswM^wXpora、灰色鬼傘、毛革蓋菌(CoWo/ws/zz7^m加)、//,/co/(3/rao/ms、i/wm/co/a/朋wg/"osa、曼赫毛霉、Afyce/—腸oraAevwo//zz7(3、粗輕脈孑包菌、產(chǎn)紫青霉、/Vz"weroc/zWec/2，cwpo〃.w附、輻射射脈菌(尸/2/e6/ara&加)、尸/ewo加e/^"g"、土生梭孑包殼(7Tz/e/av/a/^ras/r&)、長纟戎毛^全菌(7Va/wefasv///o<sa()、Jhamefesv6rs/co/or、哈茨木霉、康寧木霉、7Wc/2o<5fenwa/o"g/6rac/z/a/1,、7Wc/20fifermare^se/、或綠色木霉細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以本身已知的方式，通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、和細(xì)胞壁再生的過程進(jìn)行轉(zhuǎn)化。EP238,023和Yelton等，1984,iVocee&,"gso/&eiVa"ow(3/Academyo/Sc/e"cesUSA81:1470-1474中描述了適合曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法。Malardier等，1989,(7e"e78:147-159和WO96/00787中描述了適合轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的方法。可利用Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon，M.I.編的GWcfeto7"eosfC7e"W/csawdMo/ecw/ar5/o/ogy，Mef/zcxis五"z戸o/ogy,Vol.194，pp182-187,AcademicPress.Inc,,NewYork;Ito等,1983，Jow/7a/o/5acfeWo/ogy153:163;及Hinnen等,1978,/VoceW"gso/f/zeiVa"'o"a/Jcmfemy。/5Wewc&st/SJ75:1920中所描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞的野生型形式能夠產(chǎn)生多肽；并(b)回收所述多肽。優(yōu)選地，該細(xì)胞為散嚢菌屬，且更優(yōu)選為阿姆斯特丹散嚢菌。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包括突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)域中至少具有一個突變，其中該突變核苷3吏序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至42組成的多肽，以及(b)回收該多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，利用本領(lǐng)域眾所周知的方法在適于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，細(xì)胞培養(yǎng)可在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中和允許所述多肽被表達(dá)和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批的、補(bǔ)料-分批、或固態(tài)發(fā)酵)來進(jìn)行。培養(yǎng)可使用本領(lǐng)域已知的程序在含有碳源、氮源以及無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。適宜的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或者可根據(jù)已公開的配方來制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中公開的)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基回收多肽。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其可從細(xì)胞裂解物回收。.所述多肽可以通過本領(lǐng)域已知的對多肽特異性的方法來檢測。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用。例如，可使用如本文所述的抗微生物活性測定來確定所述多肽的活性。所得多肽可通過本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，所述多肽可通過常規(guī)程序從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述程序包括但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域已知的多種程序純化，包括但不限于下述程序?qū)游?例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳(例如制備性等電聚焦)、差異溶解度(例如辟b酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例如參見《ProteinPurification》，J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)，以獲得基本上純的多肽。植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、或植物細(xì)胞，其已被編碼本發(fā)明的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化，從而表達(dá)與產(chǎn)生可回收的量的該多肽。所述多肽可從植物或植物部分回收?；蛘撸瑢⒑兄亟M多肽的植物或植物部分本身用于改善食物或飼料的質(zhì)量，例如提高營養(yǎng)價值、可口性(palatability)和流變性質(zhì)、或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子(antinutritivefactor)。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉才直物的實例有禾草(grasses)，例如草地草(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass),早熟禾屬(Poa));草料草(foragegrass),諸如羊矛屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);5顯帶草(temperategrass),例^口剪月殳孝貞屬(Agrostis);禾口谷類(cereals),例如小麥(wheat)、燕麥(oat)、黑麥(rye)、大麥(barley)、稻(rice)、高粱(sorghum)、和玉蜀黍(maize)(玉米(corn))。雙子葉植物的例子有煙草；豆類(legumes)，例如羽扇豆(lupins);馬鈴薯；甜菜；豌豆；菜豆(bean)和大豆，和十字花科(Smw/caceae)植物，例如花椰菜(cauliflower)、油菜籽(rapeseed)和與之親緣關(guān)系緊密的模式生物擬植物部分的實例有莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、和塊莖，以及構(gòu)成這些部分的單獨組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。特殊的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments),諸如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也認(rèn)為是植物部分。此外，^壬何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，也認(rèn)為是植物部分。類似的，植物部分，諸如被分離用來幫助本發(fā)明的應(yīng)用的特定組織和細(xì)胞也認(rèn)為是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和種皮。這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡而言之，植物或植物細(xì)胞的構(gòu)建可通過將一種或多種編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)構(gòu)建體整合到植物宿主基因組或葉綠體基因組中，并使所得的修飾植物或植物細(xì)胞增殖形成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。所述表達(dá)構(gòu)建體合適地為核酸構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明多肽、且可連接的多核苷酸。另外，該表達(dá)構(gòu)建體還可以包括可用于鑒定已整合所述表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記；以及將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物所需的DNA序列(后者取決于使用的DNA導(dǎo)入方法)。調(diào)節(jié)序列(例如啟動子和終止子序列，以及可選的信號或轉(zhuǎn)運(yùn)(tmnsit)序列)的選擇，是根據(jù)例如想要在何時、何處、怎樣表達(dá)該多肽而決定的。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型或誘導(dǎo)型的，或者可為發(fā)育特異性、階段特異性或組織特異性的，而且基因產(chǎn)物可以被靶向于具體的組織或者植物部分例如種子或葉。對調(diào)節(jié)序列的描述有例如Tague等，1988，尸/滅P—.o/ogy86:506。為了組成性表達(dá)，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和水稻肌動蛋白啟動子(Franck等.，1980.Ce〃21:285-294,ChristensenAH,SharrockRA和QuaiL1992,戶/a"fMo.S/o/.18:675-689;ZhangW，McElroyD,和WuR.，1991,尸/a"fCW/3:1155-1165)。器官特異性的啟動子可以是，例如，來自存儲性貯藏組織(storagesinktissues)例如種子、馬鈴薯的塊莖及果實的啟動子(Edwards和Coruzzi,1990,j朋.Aev.24:275-303)，或者來自代謝性P&藏組織(metabolicsinktissues),例如分生組織的啟動子(Ito等，1994,尸/awfMo/.所o/.24:863-878);或者是種子特異性的啟動子，例如來自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等，1998,尸/a"fCe//尸/^/o/ogy39:885-889)，來自蠶豆(Wc/a/Wa)的豆球蛋白B4和未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998,Jbw"a/o/TVa"尸/^w'o/ogy152:708-711),來自一種種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動子(Chen等，1998，P/"WCW/尸/z"/o/ogy39:935-941)，來自歐洲油菜(5msw'ca"apw力的貯存蛋白napA啟動子，或任何其他本領(lǐng)域已知的種子特異性的啟動子，例如WO91/14772所描述的。另外，該啟動子可以是葉特異性的啟動子，例如來自稻或西紅柿的啟動子(Kyozuka等，1993,尸/a"f尸/^w'o/ogy102:991-1000);小球藻病毒腺嘌呤曱基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra和Higgins,1994,尸/a"fMo/ecw/w說o/ogy26:85-93)，或來自稻的"W尸基因啟動子(Kagaya等，1995,Mo/ecw/arGenera/Gewe"cs248:668-674);或為創(chuàng)傷i秀導(dǎo)性(woundinducible)的啟動子，例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1903,戶/a"fMo/ec"/ar22:573-588)。類似地，該啟動子也可以被非生物性的處理例如溫度、干旱或鹽度變化所誘導(dǎo)，或者被外加的活化啟動子的物質(zhì)，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脫落酸和赤霉酸、及重金屬所誘導(dǎo)。還可使用啟動子增強(qiáng)子元件以實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的更高表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子元件可以是位于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如Xu等人，1993,同上中公開了利用水稻肌動蛋白1基因的第一個內(nèi)含子來增強(qiáng)表達(dá)。選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分都可以從本領(lǐng)域可用的那些進(jìn)行選擇。根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體整合到植物基因組中，包括土壤桿菌C^raZ^c^^m)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化(biolistictransformation),和電穿孑L(Gasser等人，1990，5W露e244:1293;Potrykus，1990，5/o/rec/z"o/ogy8:535;Shimamoto等人，1989，A^we338:274)。目前，根瘤土壤桿菌(Jgra6acfeWwm加we/a"'era)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的首選方法(其綜述可參見Hooykas和Schilperoort,1992，尸/a"fMo/ecw/w所o/ogy19:15-38)，而且也可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管這些植物常使用其它轉(zhuǎn)化方法。目前，優(yōu)選用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是粒子轟擊(極小金或鎢粒子，被用于轉(zhuǎn)化的DNA所包被)胚愈傷組織或發(fā)育中的胚(Christou，1992，尸/a"fJow"a/2:275-281;Shimamoto,1994,Cw^rewfQp/m'ow所0敏/2"0/0gv5:158-162;Vasil等人，1992，B/o/rec/wo/ogy10:667-674)。另外一種可選的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如Omirulleh等，1993,PlantMolecularBiology21:415-428所述。在轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選出已整合入表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并使其再生成為完整植物。通常設(shè)計轉(zhuǎn)化方法以在再生過程或后續(xù)的世代中選擇性地除去選擇基因，例如通過用兩個單獨的T-DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化，或通過特異性的重組酶位點特異性地切下選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述植物或植物細(xì)胞包括編碼本發(fā)明具有抗微生物活性的多肽的多核苷酸；以及(b)回收該多肽。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽的組合物，例如藥物組合物。優(yōu)選地，該組合物添加了這樣的多肽。術(shù)語"富集"意指該組合物的抗微生物活性已被增力cr,例如，以富集系數(shù)(enrichmentfactor)1.1增加。所述組合物還可以包含另一藥學(xué)活性劑，例如附加的殺生物劑(biocidalagent),例如另一種顯示如上述定義的抗」敞生物活性的抗卩微生物多肽。所述殺生物劑可以是本領(lǐng)域所知的抗生素?？股氐姆N類包括青霉素類(penicillins),例如青霉素G,青霉素V，曱氧苯青霉素(methicillin)，苯唑青霉素(oxacillin),羧千青霉素(carbenicillin)，乙氧萘青霉素(nafcillin)，氨芐青霉素，等等；青霉素類結(jié)合(3-內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭孢菌素(cephalosporins),例如頭孢克洛，頭孢唑啉，頭孢呋辛，拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素(monobactams);氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；會諾酮類；氯霉素(cloramphenical);曱硝噠唑；壯觀霉素；trimethoprim;萬古霉素等。所述殺生物劑還可以是抗真菌劑(anti-mycoticagent),包括多烯類化合物，例如兩性霉素B,制霉菌素；5-flucosyn;以及峻類，例長口口米康峻(miconazol)，酉同康口坐(ketoconazo1)，4尹曲康唑和氟康唑(fluconazol)。在一個實施方式中，殺生物劑是非酶性化學(xué)劑。在另一個實施方式中，殺生物劑是非多肽化學(xué)劑。組合物可包括合適的載體材料。組合物還可包括適合的遞送々某介物(vehicle),當(dāng)該組合物用作藥品時，該遞送媒介物能夠?qū)⒈景l(fā)明的抗微生物多肽遞送至所需的位置。多肽組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，并可為液體或干燥組合物的形式。例如，多肽組合物可為顆粒(granulate)或微顆粒的形式。要包含在組合物中的多肽可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法穩(wěn)定化。下面給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實例。本發(fā)明組合物的劑量與使用該組合物的其它條件可基于本領(lǐng)域已知的方法確定。方法與用途本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽通?？梢杂糜谌魏问艿郊?xì)菌、真菌、酵母或藻類污染的地方。通常，在水系統(tǒng)例如冷卻水系統(tǒng)、洗衣漂洗用水，油系統(tǒng)例如切削油(cuttingoils)，潤滑劑，油田(oilfield)等中有需要殺死微生物或控制微生物生長的地方。但是，本發(fā)明還可以用于已知的抗微生物組合物有用的所有用途，例如木材、膠乳(latex)、膠粘劑(adhesive)、膠水類(glue)、紙、紙板、紡織品、皮革、塑料、斂縫材料(caulking)和祠料的保護(hù)。其他的應(yīng)用包括食品，飲料，化妝品如洗液(lotions),乳膏，凝膠(gels)，油膏，月巴急，香波，護(hù)發(fā)劑(conditiners)，止汗劑(antiperspirants),除臭劑(deodorants),漱口劑(mouthwash),隱形眼鏡(contactlens)產(chǎn)品，酶制劑，或食品成分的保存。因此，本發(fā)明的抗微生物多肽可以用作消毒劑(disinfectant),例如用于治療眼或口腔中的感染及皮膚感染；用于止汗劑或除臭劑中；用于足浴鹽(footbathsalts)中；及用于隱形眼鏡和牙齒(口腔護(hù)理)的清潔和消毒。一般認(rèn)為本發(fā)明的抗微生物多肽可用于在任何表面上進(jìn)行清潔、消毒和抑制微生物生長。可有利地與本發(fā)明的抗微生物多肽相接觸的表面的實例有例如乳制品廠、化學(xué)或藥品加工廠、水凈化系統(tǒng)、油加工廠、紙漿加工廠、水處理廠和冷卻塔中所用的加工設(shè)備的表面。本發(fā)明的抗微生物多肽的使用量應(yīng)該能夠有效地在所述的表面上進(jìn)行清潔、消毒或抑制微生物生長。本發(fā)明的抗;微生物多肽還用于食品加工廠和任何制備或有食品供應(yīng)的地方，例如醫(yī)院，療養(yǎng)院(nursinghome)及餐館，用來清潔表面和烹飪器皿。本發(fā)明的抗微生物多肽還可在水基涂料中用作防腐劑(preservationagent)或消毒劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物作為藥物的用途。另外本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物還可以用來制造藥物，用于控制或抗(combating)微生物，例如真菌類生物或細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性細(xì)菌。本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物還可以用作人用或獸醫(yī)用的抗微生物治療劑或預(yù)防劑。因此，本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物可以用于制備人用或獸醫(yī)用的抗微生物治療劑或預(yù)防劑，用于治療微生物感染，例如細(xì)菌或真菌感染，優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌感染。具體地，所述微生物感染可以與肺病相關(guān)，所述肺病包括但不限于結(jié)核，肺炎和嚢性纖維化病；還可與性轉(zhuǎn)播疾病相關(guān)，所述性轉(zhuǎn)播疾病包括但不限于淋病(gonorrhea)和衣原體感染(chlamydia)。本發(fā)明的組合物包括有效量的本發(fā)明的抗微生物多肽。術(shù)語"有效量"用于本文中時意在指足以抑制所述微生物生長的本發(fā)明抗微生物多肽的量。本發(fā)明還涉及愈合傷口的組合物或產(chǎn)品，例如繃帶(bandages),醫(yī)療設(shè)備例如導(dǎo)管，還涉及抗頭屑(anti-dandruff)的頭發(fā)用品，例如香波。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑被施用給受到或易受微生物感染的宿主。施用可以是表面、局部或全身性的，這取決于具體的微生物，優(yōu)選局部施用(localized)。一般而言，本發(fā)明的抗微生物多肽的劑量足以使微生物群體減少至少約50%,通常為至少1個對數(shù)級，還可能是2個或更多對數(shù)級的殺滅。本發(fā)明的化合物的施用量可減小微生物群體而同時使任何副作用最小化。本發(fā)明人認(rèn)為，該組合物將在內(nèi)科醫(yī)生的指導(dǎo)下獲得并用于體內(nèi)用途。本發(fā)明的抗微生物多肽特別有用于殺死革蘭氏陰性細(xì)菌，包括銅纟錄W支單月包菌(尸sew(icwowasaerMg/woM)，和沙目艮衣原體(C7z/aw>^/zV3frac/zoma^);及革蘭氏陽性細(xì)菌，包括鏈球菌例如肺炎鏈球菌p"ewmom'a),乳房鏈5求菌(51.Wen》，豬腸鏈J求菌(S./^oz'"fes""afc),釀膿鏈球菌(51.;^oge"e"或無乳鏈球菌CS.aga/ac"'ae);和葡萄球菌例如金黃色葡萄球菌(5".，表皮葡萄球菌OS,ep/c/e/7MW力，模仿葡萄球菌(51.57'mw/ara)，木糖葡萄球菌(S,j(y/as^)和肉葡萄球菌(iS.car"cwM力。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑可以施用給受到或易受微生物性肺感染，例如肺炎的宿主，或受到或易受微生物性傷口感染，例如傷口細(xì)菌感染的宿主。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑還可以施用給受到或易受皮膚感染例如痤掩、特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)或脂溢性(seborrheic)皮炎的宿主；優(yōu)選地，該皮膚感染是細(xì)菌性皮膚感染，例如由表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、痤瘠丙酸4干菌(尸rop/om'Zwc/e〃'wwacwes),卵圓步泉糸匕馬拉色菌(尸z'tvras;orwmova/e)或凈泉糸匕馬4立色氏菌(Afo/os"z/a/wr)引起的感染。本發(fā)明的抗微生物多肽還可以用于體外制劑來殺死微生物，特別是當(dāng)人們不希望引入大量的常規(guī)抗生素的時候。例如，本發(fā)明的抗微生物多肽可以添加到動物和/或人的食物制品中；或者它們可以作為體外細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑加入，用來防止和抑制組織培養(yǎng)物中微生物的過度生長(overgrowth)。特定微生物對于本發(fā)明抗微生物多肽的殺滅作用的敏感性可以通過本文實驗部分要詳述的體外測試來確定。通常，使微生物培養(yǎng)物和不同濃度的抗微生物多肽結(jié)合經(jīng)過足以使該蛋白起作用的時間，通常為大約1小時到1天。然后計算活微生物的數(shù)目并確定殺滅水平。目標(biāo)微生物包括但不限于，革蘭氏陰性細(xì)菌，例如檸檬酸桿菌屬菌種(CVYra6acfer5p.);腸桿菌屬菌種(￡"&ra6""ww.);埃希氏菌屬菌種(&c/zeWc/2/a平),例如大腸桿菌；克雷白氏桿菌屬菌種(尺/AwW/a摩根氏菌屬菌種(^/^^"^/"平)；變形菌屬菌種(/Vofeww.);普羅威登斯菌屬菌種(/VoW^"cz'a);沙門氏菌屬菌種w.),例如傷寒沙門氏菌/>7/7/),鼠傷寒沙門氏菌(iS.^;/n'mwn'wm);沙雷氏菌屬菌種(&rra"a志賀氏菌屬菌種(幼/geZ/"假單胞菌屬菌種，例如銅綠假單胞菌；耶爾森氏菌屬菌種(7eraz'm'a例如鼠疫耶爾森氏菌(7假結(jié)核耶爾森氏菌(K戸ewcfo^^ercw/c^&)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(7！e"feraco/Wca);弗朗西斯氏菌屬菌種(/^3"<^"http://0！巴斯德氏菌屬菌種(尸o^we〃as;.);弧菌屬菌種(K&n'osp.)，例^口霍^L瓜菌(Kc/zo/erae)，副溶血斗生孓瓜菌(K./ara/2ewo/yricw);彎曲桿菌屬菌種(Cam;^/o6acferw.)，例如空腸彎曲桿菌(C.^wm');嗜血桿菌屬菌種(i/aemop/zz7w^.),例如流感嗜血菌(//./"y7wewzae),杜克氏嗜血桿菌(7/:血cre力)；博德特氏菌屬菌種CSorde^//a例如百曰咳博德特氏菌(及;emm/"，支氣管炎博德特氏菌CS.&o"c/\sep"ca),副百日咳博德特氏桿菌(及para/er加^);布魯氏菌屬菌種CBrwce〃"5p.)，奈瑟氏球菌屬菌種(7Ve/^e/^w.)，例如淋病奈瑟氏球菌(7V.goworr/zoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(7V:mem'"gzYfcfo)，等等。其4也目才示細(xì)菌包4舌Z^g7'owe//a，例i口_Lp"eMmo;/2//a;利斯特氏菌屬菌神CLWen'a例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(丄.附o"oc;^oge"es);斗支原、體屬菌種(Afyco//os附asp.),<列^口人型4支原、體(A/./zom/"/s),肺炎斗支/^、體(M/7"eM附o"z.ag);分4支4干菌屬菌種(Afyco6ac&n'w附s/.)，例如結(jié)核分枝桿菌(Mfz^wcw/ow》，麻瘋分枝桿菌(M/e戶rae);密螺旋體屬菌種(rre/owewa5p.),例如蒼白密螺"走體(r.pa〃/dwm);疏螺》走體屬C6cwe〃asp.)J列^口布氏Jlt蟲累4^體(及6wgctor/en');丄epto5p/rafe立克,欠氏體屬菌種(Wcfeto/as/.)，例如立氏立克次氏體(兄n'cfeto"),傷寒型立克次氏體0^/n');衣原體屬菌種(C/z/am;^/as;.)，例如沙眼衣原體，肺炎衣原體(C.p"ewmow'ae),鸚鵡熱衣原體(C.戸"toc!〕；螺桿菌屬菌種(/Ze/fco6acter例如幽門螺桿菌(Hw/on')，等等。非細(xì)菌類的目標(biāo)病原體包括真菌和原生動物病原體，例如癡原蟲屬的種(尸/aswo(^a■;.)，例如惡'f生癡原蟲(尸.々/";pan^w);4偉蟲屬的種(7Vy/^mwoAna>sp.)，例如布氏錐蟲(7:6race/);血吸蟲(shistosomes);內(nèi)阿米巴屬的種(五"toemoe6a平)，隱球菌屬的種，假絲酵母屬的種，例如白色假絲酵母(C.a/Zj/oms);等等?？梢圆扇《喾N施用方法。所述多肽制劑可以口服給予，或者可以血管內(nèi)、皮下和腹膜注射，通過氣霧劑施用，眼施用，膀胱內(nèi)施用，表面施用(topically)等等。例如，通過吸入施用的方法是本領(lǐng)域熟知的。所述治療性制劑的劑量可以在寬的范圍內(nèi)變化，這取決于要施用的具體的抗微生物多肽、疾病的性質(zhì)、施用頻率、施用方式、宿主對該試劑的清除，等等。開始的劑量可以較大，然后以維持較小的劑量。劑量使用的頻率可以低到每周或每兩周，也可以分成較小的劑量，每天或每半周使用一次或數(shù)次等等，來維持有效的劑量水平。在很多情況下，口服施用比靜脈內(nèi)施用要求更高的劑量。可以修飾酰胺鍵以及氨基和羧基末端以增加口服時的穩(wěn)定性。例如，可以將羧基末端酰胺化。制劑本發(fā)明的化合物可以摻入多種用于治療性施用的制劑中。更具體地，本發(fā)明的化合物可通過與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合配制成藥物組合物，還可以制成固體、半固體、液體或氣體形式的制品，例如片劑、膠嚢劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、乳膏、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、洗劑和氣霧劑(aerosols)。這些化合物本身可以通過多種途徑施用，包括口服、含服(buccal)、直腸、胃腸外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、氣管內(nèi)施用等等。本發(fā)明的抗微生物多肽可以在施用后作用于全身，也可以通過使用能在植入部位維持活性劑量的植入物(implant)或其他制劑而作用于局部。在一個實施方式中，表面使用的制劑包含螯合劑，其可降低二價陽離子(特別是鈣和鎂)的有效濃度。例如，可以包含檸檬酸鹽，EGTA或EDTA,其中優(yōu)選檸檬酸鹽。通常檸檬酸鹽的濃度為大約1-10mM。本發(fā)明的化合物可以單獨施用，相互組合施用，或者與其它已知的化合物(例如穿孔蛋白，抗炎劑，抗生素等等)組合施用。在藥物劑型中，這些化合物可以作為它們的藥學(xué)上可接受的鹽的形式施用。下面所述的方法和賦形劑都僅僅是示例性的而不是限制性的。對于口服制劑，這些化合物可以單獨使用或者與合適的添加劑組合制造片劑、粉劑、顆粒劑或膠嚢劑，例如與常規(guī)的添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉組合；與粘合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠(acacia)、玉米淀粉或明膠組合；與崩解劑(disintegrators)例如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉或羧曱基纖維素鈉組合；與潤滑劑如云母或硬脂酸鎂組合；需要的話，還可以與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調(diào)味劑組合。所述化合物可以通過下列手段制成注射制劑將所述化合物溶解、懸浮或乳化在水性或非水性的溶劑中，例如植物油或其它類似的油，合成的脂肪族酸甘油酯，高碳脂肪酸(higheraliphaticacids)或丙二醇的酯中；希望的話，可加入常規(guī)的添加劑例如增溶劑、等滲劑(isotonicagents)、助懸劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。所述化合物可以在供吸入給藥的氣霧制劑中使用。本發(fā)明的化合物可以配制到加壓的可接受的推進(jìn)劑(propellant)中，這些推進(jìn)劑例如二氯二氟曱烷，丙烷，氮氣，等等。所述化合物通過與常規(guī)添加劑例如增溶劑、等滲劑、助懸劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑配制，可用作洗液，例如用于防止燒傷感染的洗液。另外，所述化合物可以通過與多種基質(zhì)(bases)例如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合而制成栓劑。本發(fā)明的化合物可以通過栓劑直腸施用。所述栓劑可包含媒介物例如可可脂(cocoabutter)，碳蠟(carbowaxes)和聚乙二醇，它們在體溫熔解，在室溫固化?？梢蕴峁┨菨{、酏劑和混懸劑等口服或直腸施用的單位劑型，其中每個劑量單位(例如每茶匙量、每湯匙量、每片或每栓)含有預(yù)定量的組合物，其包含一種或多種本發(fā)明化合物。類似地，注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可以包含組合物中的本發(fā)明化合物，其作為無菌水、生理鹽水或另一藥學(xué)上可接受的載體中的溶液。用于緩釋劑型的植入物是本領(lǐng)域熟知的。植入物與生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成易蝕的、被宿主良好耐受的聚合物。含有本發(fā)明的抗微生物多肽的植入物被置于感染部位附近，使得活性劑的局部濃度相對于身體的其它部分升高。本文中使用的術(shù)語"單位劑型"是指適合作用單位劑量用于人和動物受試者的物理上離散的單位，每個單位包含預(yù)定量的本發(fā)明的化合物，該化合物的量根據(jù)計算足以產(chǎn)生所希望的作用；還包含與該化合物結(jié)合的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體和媒介物。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格取決于所用的具體化合物和要實現(xiàn)的作用，及該化合物在宿主中的相關(guān)藥物動力學(xué)。所述藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑，是公眾容易獲得的。另外，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑等等，是公眾容易獲得的。用于全身施用的通常劑量為每次施用0.1pg到100毫克每千克受試者體重。典型的劑量可以是每天2至6次，每次一片，或者每天一次，每次一顆/片緩釋(timerelease)膠囊或片，其中該緩釋膠嚢或片含有按比例提高的活性成分。該緩釋作用可以通過下列手段實現(xiàn)在不同的pH值下溶解的膠嚢材料，通過滲透壓緩慢釋放的膠嚢，或者其他任何已知的控釋手段。技術(shù)人員容易理解，劑量水平可能作為特定化合物、癥狀的嚴(yán)重性、以及受試者對副作用的敏感性的函數(shù)而變化。一些特定的化合物比其他化合物效力更強(qiáng)。對于給定的化合物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地使用多種手段確定其優(yōu)選劑量。一種優(yōu)選的手段是測量給定的化合物的生理效能。一種感興趣的方法是用脂質(zhì)體作遞送媒介物。脂質(zhì)體與目標(biāo)部位的細(xì)胞融合并將內(nèi)腔中的內(nèi)容物遞送到胞內(nèi)。使用多種保持接觸的手段，如分離，結(jié)合劑等等，使脂質(zhì)體與細(xì)胞維持足以融合的時間的接觸。在本發(fā)明的一個方面中，脂質(zhì)體設(shè)計為供霧化(aerosolized)以便肺部施用。脂質(zhì)體可以使用純化的、可介導(dǎo)膜融合的蛋白或肽，例如仙臺病毒(Sendaivirus)或流感病毒(influenza)等來制備。所述脂類可以是已知形成脂質(zhì)體的脂類(包括陽離子或兩性離子脂類例如磷脂酰膽堿)的任何有用的組合。其余的脂類通常是中性或酸性的脂類，例如膽固醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，等等?？梢杂肒ato等人，(1991)/所o/.C/2em:266:3361所述的方法來制備脂質(zhì)體。簡單地說，將脂類和含有肽的內(nèi)腔(lumen)組合物在合適的水性介質(zhì)(方便地為鹽水介質(zhì))中合并，其中總固形物為大約1-10重量％。短時間(約5-60秒)劇烈攪拌后，將管置于約25-40。C的溫水浴中，如此循環(huán)約5-10次。然后將該組合物超聲處理適當(dāng)?shù)臅r間，一般為約1-10秒，還可以通過渦旋混合來進(jìn)一步攪拌。然后加入水性介質(zhì)來擴(kuò)大體積，一般將體積增加至約1-2倍，再進(jìn)行振蕩和冷卻。該方法使得高分子量的分子得以摻入到內(nèi)腔中。與其他活性劑的制劑為了用于本發(fā)明主題的方法，本發(fā)明的抗微生物多肽可以與其它藥學(xué)活性劑，特別是其他的抗微生物劑一起配制。其它感興趣的作用劑包括如本領(lǐng)域已知的多種抗生素。抗生物的類別包括青霉素類(penicillins),例如青霉素G，青霉素V,甲氧苯青霉素，苯唑青霉素，羧芐青霉素，乙氧萘青霉素，氨芐青霉素，等等；青霉素類與p-內(nèi)酰胺酶抑制劑的組合，頭孢菌素，例如頭孢克洛，頭孢唑啉，頭孢吹辛，拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類；氯霉素；曱硝峻唑；壯觀霉素；trimethoprim;萬古霉素等?？拐婢鷦┮彩怯杏玫模ǘ嘞╊惢衔?，例如兩性霉素B,制霉菌素；5-flucosyn;以及唑類，例如咪康峻，酮康唑，伊曲康唑和氟康唑?？菇Y(jié)核藥包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和利福平。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑中還可包含細(xì)胞因子，例如干擾素y、腫瘤壞死因子a、白介素12等。體外合成本發(fā)明的抗微生物肽可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)通過體外合成來制備?？梢陨藤彽暮铣稍O(shè)備有4艮多，例如AppliedBiosystemsInc.,Beckman提供的自動合成儀等等。使用合成儀可以將天然氨基酸置換為非天然氨基酸，尤其是D-異構(gòu)體(或D-型)例如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對映異構(gòu)體、具有不同長度或官能性(fimctionalities)的側(cè)鏈等等。具體的序列和制備方式將根據(jù)方便性、經(jīng)濟(jì)性、所需的純度等等而定?？梢詾榘线m官能性的多種肽或蛋白質(zhì)提供化學(xué)連接，所述成鍵官能團(tuán)的例子有氨基，用于酰胺或取代的胺的形成，例如還原性氨化；疏醇基，用于硫醚或二硫鍵的形成；羧基，用于酰胺的形成，等等。需要的話，在合成或者表達(dá)過程中可以向肽中引入多種可供連接于其他分子或表面的基團(tuán)。這樣，半胱氨酸可用來形成硫醚，組氨酸用來與金屬離子絡(luò)合物(complex)連接，羧基用來形成酰胺或酯，氨基用來形成酰胺，等等。還可以依照常規(guī)的重組合成方法來分離和純化所述多肽?？梢灾苽浔磉_(dá)宿主的裂解物，再利用HPLC、排阻色譜、凝膠電泳、親和色譜(affinitychromatography)或其它純合技術(shù)來純化該裂解物。大多數(shù)情況下，所使用的組合物可包括至少20重量％的所希望的產(chǎn)物，更通常為至少約75重量％,優(yōu)選至少約95重量％，對于治療目的，通常至少約99.5重量％，相對于與該產(chǎn)物的制備和純化方法相關(guān)的污染物。上述百分?jǐn)?shù)通?；诳偟鞍住游镲暳戏?，以及包含本發(fā)明抗微生物多肽的飼料組合物和飼料添加劑。術(shù)語"動物，，包含所有的動物，包括人類。動物的例子有非反芻類動物，和反芻類動物如牛、綿羊和馬。在一個具體的實施方案中，所述動物是非反芻類動物。非反芻類動物包括單胃動物，例如豬(pigs)或豬(swine)(包括但不限于仔豬、生長期豬和大母豬(sow));禽類例如火雞和雞(包括但不限于肉仔雞(broilerchick),產(chǎn)蛋雞(layers));年幼的小牛；和魚類(包括但不限于鮭魚)術(shù)語"飼料，，或"飼料組合物"指適于被動物攝取或意欲供動物攝取的任何化合物、制備物、混合物或組合物。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，所述抗微生物多肽可以在進(jìn)食之前、之后或同時飼喂給動物。優(yōu)選后者。在一個特定的實施方案中，當(dāng)所述抗微生物多肽被添加到飼料中或被包含在飼料添加劑中時，它是明確定義的。"明確定義，，(well-defined)是指該抗」微生物多肽制備物由大小排阻層析(sizeexclusionchromatography)測得為至少50%純(參考WO01/58275的實施例12)。在其他的具體實施方案中，如該方法所測定的，微生物多肽制備物為至少60，70，80，85，88,90,92,94，或至少95%純。明確定義的抗微生物多肽制備物是有利的。例如，對于基本上不含其他干擾性或污染性的抗微生物多肽的抗微生物多肽，將其正確地按劑量施用于飼料要容易得多。術(shù)語"正確地按劑量施用"(dosecorrectly)具體是指獲得一致和恒定結(jié)果的目標(biāo)，和根據(jù)所需效果來最優(yōu)化劑量的能力。但是用于動物飼料時，該抗微生物多肽并不需要那么純；它可以，例如，包含其他的酶，在這種情況下它可以稱為抗;微生物多肽制備物。該抗微生物多肽制備物可以(a)直接加入祠料中(或直接用于植物蛋白的處理工藝中)，或(b)用于生產(chǎn)一種或多種中間性組合物，例如隨后被加入飼料(或用于處理工藝中)的飼料添加劑或預(yù)混物。上面所述的純度是指原來的抗微生物多肽制備物的純度，無論其是按照以上(a)或(b)使用。具有該數(shù)量級的純度的抗微生物多肽制備物尤其可以使用重組生產(chǎn)方法得到，但當(dāng)使用常規(guī)的發(fā)酵方法來生產(chǎn)所述抗微生物多肽時，它們不那么容易獲得，并且批次間的變差要高得多。當(dāng)然，這樣的抗微生物多肽制備物可與其他的酶混合。術(shù)語"才直物蛋白"(vegetableproteins)在本文中用于指包含至少一種書亍生自或源自植物的蛋白，包括修飾蛋白和蛋白衍生物的任何化合物、組合物、制備物或混合物。在具體的實施方案中，植物蛋白的蛋白含量為至少10,20,30,40，50,或600/o(w/w)。植物蛋白可以來自植物蛋白源，例如豆類和谷物，如來自豆科CPa6aceae(丄eg畫/mw—)、十字花科(Craci/^raceae)、藜科(C7ze"o/o血ce—和禾本科(尸oaceae)等科的才直物的材料，如大豆粕(soybeanmeal)、羽扇豆粕(lupinmeal)和油菜軒粕(rapeseedmeal)。在一個具體的實施方案中，植物蛋白源是來自豆科的一種或多種植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆(bean)的材料。在另一個具體的實施方案中，植物蛋白源是來自藜科的一種或多種植物例如甜菜(beet)、糖用甜菜(sugarbeet)、菠菜或昆諾阿藜(quinoa)的材料。植物蛋白源的其他例子有油菜籽和甘藍(lán)。大豆是優(yōu)選的植物蛋白源。植物蛋白源的其他例子有谷物，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍/玉米(maize/corn)、水稻和高粱?？刮⑸锒嚯目梢宰鳛槿魏涡问郊尤腼暳?，或者作為相對純的抗微生物多肽，或者與其他供加入該動物伺料的組分摻合，即以動物伺料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料用預(yù)混物(pre-mix)。在進(jìn)一步的一個方面，本發(fā)明涉及組合物，其用于動物飼料，例如動物飼料，和動物飼料添加劑，例如預(yù)混物。除了本發(fā)明的抗微生物多肽，本發(fā)明的動物飼料添加劑含有至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或至少一種大量礦物質(zhì)(macromineral)。另外，任選的伺料添加劑成分包括著色劑(coloringagents)、香味化合物(aromacompounds),穩(wěn)定劑，和/或至少一種選自下列的其它酶肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2.1,89;和/或P-葡聚糖酶EC3.2.1.4。在一個具體的實施方式中，所述其他酶是明確定義的(如上述用于抗微生物多肽制備物的定義)。其他抗孩i生物肽(AMP，s)的例子有CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、Defensin、Ovispirin例^口Novispirin(RobertLehrer，2000)、及它們的保留抗微生物活性的變體或片段。其他抗真菌多肽(AFP，s)的例子有巨大曲霉(A;e/^7/wg/gawfew力和黑曲霉的肽，及它們的保留抗真菌活性的變體和片段，如WO94/01459和WO02/090384所公開的。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質(zhì)構(gòu)成要加入飼料的所謂"預(yù)混物，，的一部分，而通常將大量礦物質(zhì)單獨加入該飼料。這些組合類型中的任一種當(dāng)添加了本發(fā)明的抗微生物多肽時，就是本發(fā)明的動物飼料添力口劑。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑要以0.01-10.0%,更具體為0.05-5.0%,或0.2-1.0%(%表示g添加劑每100g飼料)的水平被包含在(或者根據(jù)配方必須包含在)動物飲食或飼料中。對于預(yù)混物尤其如此。下面列出了這樣的組分的非排他性示例脂溶性維生素的例子有維生素A、維生素D3、維生素E、和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12、生物素和膽^5咸、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸鹽(或酯)(panthothenate)，例如D-泛痕量礦物質(zhì)的例子有錳、鋅、鐵、銅、硪、硒和鈷。大量礦物質(zhì)的例子有鈣、磷和鈉。WO01/58275的表A列出了這些組分的營養(yǎng)需求(以家禽和豬/仔豬為例)。營養(yǎng)需求(nutritionalrequirement)是指這些組分必須以所指明的濃度在飲食中提供?；蛘?，本發(fā)明的動物飼料添加劑包含WO01/58275的表A所列的單個組分中的至少一種。"至少一種"指組分中的任一種，一種或多種，一種，或兩種，或三種，或四種，如此往上直至全部13種，或全部15種單個組分。更具體地，該至少一種單個組分以這樣的量被包含在本發(fā)明的添加劑中，以提供表A的第4列，或第5列，或第6列所示的范圍之內(nèi)的飼料中濃度(in-feedconcentration)。本發(fā)明還涉及動物飼料組合物，動物飼料組合物或飲食具有較高的蛋白質(zhì)含量。家禽和豬的々大食可以如WO01/58275的表B、列2-3來描述。魚類的々允食可以如表B的第4列來描述。另外該魚類飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據(jù)本發(fā)明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，還包含至少一種如本申請所要求保護(hù)的抗微生物多肽。并且，或者作為(上述粗蛋白含量的)替代，本發(fā)明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量(metabolizableenergy)含量；和/或O.UOOg/kg的4丐含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷(availablephosphorus)含量；和/或0.1-100g/kg的曱硫氨酸含量，和/或0.1-150g/kg的曱石危氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體的實施方案中，所述可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、曱疏氨酸、曱硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸含量在WO01/58275的表B的范圍2、3、4或5(2-5行)的任一范圍內(nèi)。粗蛋白是用氮(N)乘以因數(shù)6.25來計算的，即，粗蛋白(g/kg"N(g/kg)x6.25。氮含量是用凱氏(Kjeldahl)定氮法(A.O.A.C.,1984，OfficialMethodsofAnalysisl她ed.,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)測定的?？纱x能量可以根據(jù)下列文獻(xiàn)來計算國家研究委員會(NRC)的出版物Nutrientrequirementsinswine,第九次修訂版,1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.，pp.2-6;和EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5。4丐、有效磷和氨基酸在完全動物飲食中氨基酸的飲食含量根據(jù)例如Veevoedertabel1997,gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN卯-72839-13-7等飼料表來計算。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物含有至少一種如上面定義的植物蛋白或蛋白源。在進(jìn)一步的具體實施方案中，本發(fā)明的動物詞料組合物含有0-80%的玉米；和/或0-80%的高粱；和/或0-70%的小麥；和/或0-70%的大麥；和/或0-30%的燕麥；和/或0-40。/。的大豆粕(soybeanmeal);和/或0-10%的魚粉；和/或0-20%的乳清。動物飲食可以例如制成粉狀(mash)飼料(非顆粒的)或顆粒飼料。通常，將粉碎的飼料原料混合，并根據(jù)所述物種所用的規(guī)格加入足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。酶可以作為固體或液體酶制劑加入。例如，固體酶制劑通常在混合步驟前或期間加入；而液體酶制備物通常在造粒步驟之后加入。酶還可以摻入飼料添加劑或預(yù)混物。飲食中的酶終濃度為0.01-200mg酶蛋白每kg飲食，例如為5-30mg酶蛋白每kg動物飲食。所述抗;敞生物多肽可以以下列量施用(劑量范圍)0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10-上述范圍都是指mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料(ppm)。如下測定mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料從飼料組合物中純化出抗微生物多肽，再使用相關(guān)的測定方法(見抗微生物活性、底物和測定方法條目下)確定純化的抗微生物多肽的比活性(specificactivity)。使用同樣的測定方法確定所述飼料組合物的抗微生物活性，根據(jù)這兩個測定，計算以mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料表示的劑量。同樣的原則也可以用于確定飼料添加劑中的mg抗微生物多肽蛋白質(zhì)。當(dāng)然，如果可以獲得制備所述伺料添加劑或飼料所用的抗微生物多肽的樣品，就由此樣品確定比活性(不需要從飼料組合物或添加劑中純化該抗微生物多肽)。信號肽與前肽本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其包括編碼蛋白質(zhì)的基因，該基因可操作地連接至以下兩者之一或兩者由SEQIDNO:l的核苷酸1至60組成的第一核苦酸序列，其編碼由SEQIDNO:2的氨基酸-48至-29組成的信號肽；以及由SEQIDNO:l的核苷酸61至144組成的第二核苷酸序列，其編碼由SEQIDNO:2的氨基酸-28至-1組成的前肽，其中該基因?qū)Φ谝慌c第二核苷酸序列是外來的。本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體與重組宿主細(xì)胞，其包括這樣的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在適合產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收該蛋白質(zhì)。所述第一與第二核苷酸序列和其它控制序列可以單獨地或組合地與外來基因可操作連接。這樣的其它控制序列系如上述。如之前所述，當(dāng)信號肽與前肽區(qū)域兩者均存在于蛋白質(zhì)的氨基末端時，前肽區(qū)域與蛋白質(zhì)氨基末端相鄰，而信號肽區(qū)域與前肽區(qū)域氨基末端相鄰。蛋白質(zhì)對宿主細(xì)胞而言可為固有的或異源的。術(shù)語"蛋白質(zhì)"于此并非意指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語"蛋白質(zhì)，，還涵蓋結(jié)合形成編碼產(chǎn)物的兩條或多條多肽。蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包括從至少兩種不同蛋白質(zhì)獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中一種或多種蛋白質(zhì)對宿主細(xì)胞可為異源的或固有的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括以上提及的蛋白質(zhì)與雜合蛋白質(zhì)的天然存在的等位變體與工程化變化形式。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道分子。在一個更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在一個更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、卩-半乳糖苦酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶(pectinolyticenzyme)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶(polyphenoloxidase)、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tmnsglutaminase)或木聚糖酶。基因可獲得自任何原核的、真核的、或其它來源。通過以下實施例描述進(jìn)一步本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例用作緩沖劑和底物的化學(xué)品為至少試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。在以下實施例中，由SEQIDNO:2的氨基酸1至42表示的抗微生物多肽稱作"Eurocin"。實施例1阿姆斯特丹散嚢菌的cDNA文庫從已經(jīng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potatodextroseagar,PDA)培育5天的阿姆斯特丹散嚢菌制備cDNA文庫。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)程序來純化富含PolyA的RNA、合成cDNA并制備文庫。關(guān)于該一般方法的詳細(xì)關(guān)見程可在國際專利申請WO01/12794的實施例中找到。用于克隆的載體是pMhas5，其由SEQIDNO:8所示，且具有以下特征<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表l.載體pMhas5的特征實施例2用于Eurocin的曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建從該cDNA文庫(見實施例l)以下述方式擴(kuò)增編碼Eurocin的核苷酸序列使用1微升cDNA(大約10納克DNA)作為模板，使用引物A與引物B進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物A:TCTTGGATCCACCATGCACTTCACCAAGGTCTCC(SEQIDNO:4)引物B:TCTTCTCGAGTTAGAAAGAACAGGTGCAGGTAGG(SEQIDNO:5)在50微升反應(yīng)體積中使用10pmole的每種引物。退火溫度為攝氏55度，并于攝氏72度延伸1分鐘?？偣策M(jìn)行35個循環(huán)。使用ExpandHighFidelityPCRSystem(Roche)。利用4%瓊脂糖凝膠分離等份的PCR反應(yīng)物。在大約300bp的大小處見到一清楚的條帶。用BamHl與Xhol消化該P(yáng)CR片段，其在PCR引物所導(dǎo)入的突出(overhang)處切割。分離經(jīng)消化的片段并將其克隆入經(jīng)BamHl-Xhol消化的pMT2786，pMT2786是基于質(zhì)粒pMT2188的曲霉表達(dá)質(zhì)粒，而質(zhì)粒pMT2188基于pCaHj527(參見國際專利申請WO02/12472的實施例7;以及WO00/70064)。所插入的序列凈皮證明編碼如上述鑒定的Eurocin序列。PCR片段的序列示為SEQIDNO:6。將具有PCR產(chǎn)物插入序列的曲霉表達(dá)質(zhì)粒命名為pMT2935且示為SEQIDNO:7。實施例3Eurocin在曲霉中的表達(dá)將pMT2935(參見SEQIDNO:7)轉(zhuǎn)化到米曲霉菌種BECh2(參見國際專利申請WO00/39322)中。將30個轉(zhuǎn)化體于選擇性且非誘導(dǎo)性的條件下在具有蔗糖與乙酰胺的Cove基本培養(yǎng)平板(Coveminimalplate)上再分離(re-isolate)兩次。為了測試Eurocin表達(dá)，將轉(zhuǎn)化體于攝氏30度在具有10毫升YPM(2%蛋白胨1%、酵母提取物、2%麥芽糖)的試管中培育6天。將上清液在NuPage10%Bis-TrisSDS凝膠(Invitrogen)上泳動，如生產(chǎn)商所建議，使用MES電泳緩沖液，以允許在低分子量范圍內(nèi)分離。米曲霉轉(zhuǎn)化體即使在被誘導(dǎo)表達(dá)Eurocin時仍生長良好。在大多數(shù)的轉(zhuǎn)化體中均見到了具有Eurocin預(yù)期大小的清楚條帶，而在未轉(zhuǎn)化的宿主菌抹米曲霉BECh2中未見到此條帶。實施例4Eurocin的純化將發(fā)酵液以0.22pmCorning431118濾器過濾并^f吏用曱酸將pH調(diào)整為4.0。在調(diào)整pH之后再次通過0.22pm過濾器過濾以去除額外的沉淀物。測量電導(dǎo)，通過加入MQ-水(Mmipore)調(diào)整至大約10mScm"。然后使用AKTAexplorerHPLC4義將濾液力口載到12毫升Source30S(AmershamBiosciences17-lZ73-01)柱上。上樣緩沖液為50mM曱酸，pH4(緩沖液A)。使用20個柱體積的0-100%緩沖液B的梯度洗脫Eurocin。緩沖液B為50mM曱酸、2M氯化鈉，pH4.0。通過MALDI誦TOFMS(VoyagerDEProinstrument,AppliedBiosystems)檢查純化級分的特征(identity),并利用SDS畫PAGE(Invitrogen，NuPage12%Bis-Tris艦S，用GelcodeBlueStainReagent,Pierce24592染色)大略地4企查純度。將包含相關(guān)化合物(根據(jù)MALDI-TOFMS)的級分合并，并在Amicon大約30分鐘。接著通過使用相同的過濾與離心條件，用0.01。/。乙酸(acidicacid)洗滌3次，4吏溶液脫鹽。通過氨基酸分析與MALDI-TOFMS分析產(chǎn)物的正確序列及純度。所測得的Eurocin質(zhì)量為4339Da。其基于SEQIDNO:2的氨基酸1至42的理論分子量為4338.8Da(平均)。儲備溶液保存于-2(TC。實施例5抗微生物活性的評價在微稀釋(microdillution)測定中評價純化的Eurocin的抗微生物活性。依照來自CLSI(臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)的NCCLS/CLSI指南來測定最小抑制濃度(MininalInhibitoryConcentration,MIC)。測試以下濃度的Eurocin:32;16;8;4;2;1;0.50;0.25;0.13;以'及0.06pg/ml。如表2所示，Eurocin對多種ATCC菌抹顯示強(qiáng)的抗樣i生物活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表2.Eurocin的抗微生物活性實施例6使用來自PFAM數(shù)據(jù)庫的HMM文件鑒定防衛(wèi)素使用隱蔽馬爾科夫模型子集(HMMprofiles)的序列分析，可以使用廣為人知的HMMER免費軟件包在互聯(lián)網(wǎng)在線進(jìn)行或在本地計算機(jī)上進(jìn)行。目前的版本是HMMER2.3.2，自2003年10月起。HMM子集可從廣為人知的PFAMlt據(jù)庫獲得。目前的版本是PFAM16.0,從2004年11月起。用于所有計算機(jī)平臺的HMMER與PFAM均可從例如美國華盛頓大學(xué)圣路易斯分校醫(yī)學(xué)院(WashingtonUniversityinSt.Louis(USA),SchoolofMedicine)獲4尋(http:〃pfam.wustl.edu與http://hmmer.wustl.edu)。若查詢的氨基酸序列或其片段屬于以下五個PFAM家族之一，則該氨基酸序列是根據(jù)本發(fā)明的防衛(wèi)素防衛(wèi)素—卩或"p防衛(wèi)素，，登錄號PF00711;'防衛(wèi)素jDropep或"防衛(wèi)素前肽，，登錄號PF00879;防衛(wèi)素_1或"哺乳類防衛(wèi)素，，登錄號PF00323;防衛(wèi)素—2或"節(jié)肢動物防衛(wèi)素，，登錄號PF01097;'，碌u堇或"，碌u堇家族"登錄號PF00304。當(dāng)在線使用PFAM數(shù)據(jù)庫時，或當(dāng)本地使用hmmpfam程序(來自HMMER軟件包)時，若氨基酸序列產(chǎn)生大于0.1的E值及大于或等于零的分?jǐn)?shù)，根據(jù)本發(fā)明，其屬于PFAM家族。當(dāng)使用hmmpfam程序在本地進(jìn)行序列分析時，需要從PFAM數(shù)據(jù)庫獲得(下載)HMM子集。每個家族存在兩個子集用于全局搜索的xxx一ls.hmm,以及用于本地搜索的xxx_fs.hmm("xxx"為家族的名稱)。這使得上述5個家族共有10個子集。這10個子集可獨立地使用，或可連結(jié)(添加)成單一檔案(使用文本編輯軟件-所述子集為ASCII文件)，其可被命名為例如defensin.hmm。然后可使用以下指令行評估查詢氨基酸序列hmmpfam-E0.1defensin.hmmsequence—file-其中"sequence—file"是帶有查詢氨基酸序列的文件，所述序列為任何可被HMMER軟件包識別的格式。若所述分?jǐn)?shù)大于或等于零(O.O),且E值大于O.l,該查詢氨基酸序列是根據(jù)本發(fā)明的防衛(wèi)素。PFAMH據(jù)庫在Bateman等人(2004)"ThePfamProteinFamiliesDatabase",NucleicAcidsResearch,Vol,32(DatabaseIssue)pp.D138-D141中有更多描述。權(quán)利要求1.具有抗微生物活性的多肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO2的氨基酸1至42有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少中度嚴(yán)緊條件下與以下者雜交的多核苷酸所編碼的多肽(i)SEQIDNO1的核苷酸145至270、(ii)SEQIDNO1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；以及(c)包含SEQIDNO2的氨基酸1至42的一或多個氨基酸的保守性取代、缺失、和/或插入的變體。151015AlaLeuGlyGlyGlyArgThrGlyGlyTyrCysAlaGlyProTrpTyr202530LeuGlyHisProThrCysThrCysSerPhe3540<210><211><212><213><220><221><222><220><221><222〉<220><221><222><400>:MetHis390PUT阿姆斯特丹散嚢菌信號(20)PROPEP(21)..(48)成熟肽(49)..(90)GlyGlyGly1lieGin-15PheAlaLeuPheThrLys-45MetAUAla-30GluValTyrGlyCysPro5GlyGlyGly20LeuGlyHisProThr35<210>4<211>34<212>■<213>人工<220><223〉引物A<楊>4tcttggatccaccatgcact<210>5<211>34<212>隨<213>人工<220><223>引物B<400〉5tcUctcgagttagaaagaa<210>6<211>296<212>醒ValSerThrlieLeuPheThrliePheAlaAla-40-35ProThrGluGlyValArgGluGluAlaAlaPro-25-20ProAspGluProProAlaSerLeuThrLysArg-10-5-lGlyAspAlaTyrGinCysSerGluHisCysArg1015ArgThrGlyGlyTyrCysAlaGlyProTrpTyr2530CysThrCysSerPhe403434<213〉阿姆斯特丹散嚢菌<220><221〉raise—feature<222>(296)<223>PCR片段<400>6tcttggatccaccatgcacttcaccaaggtctccaccattcttUUccatcttcgccgc60cggcatcatggctgctcccaccgaaggagtccgtgaggaagccgcccctggecaggaggt120ttaccccgacgaacctcctgcttctctgaccaagcgtggcttcggatgtcctggtgatgc180ctaccagtgcagtgaacactgcagggccctgggcggtggacgcactggaggsUctgtgc240tggaccttggt"ttgggtcacccUcctgcacctgttctttctaactcgagaaga296<210>7<211>7218<212>陽<213>質(zhì)粒pMT2935<400>7tgtataagctaactcgcttgagctUtggtcgcgggcaacgttttgatcatcgctUccgtttUa"UattacgttagttatatggcgggctgatattggtggtgggcUcgtaaaaa60120tcgtcaaggggtccttcacgatgcaagaccgagaaaccccaaaccgttaaagcgtccacaatttceggagteacgagegatcaacagcataggaccacctccaagcccaacUggcatcg180240gacgcaccatccaattagaagcagcaaagcgaaacagcccaagaaaaaggtcggcccgtc300ggccttttctgcaacgctgatcacgggcagcgatccaaccaacaccctccagagtgacU360ggggcggaaattutcgggattaatttccactcaacc8C3aatcacagtcgtccccggta420atttaacggctgcagacggcaatttaacggettctgegaatcgcttggattccccgcccc480tggccgUgagcttaaagtatgtcccttgtegatgegatgtatgaattcatggtgtutg540atcamuaattUtatatggcgggtggtgggcaactcgcttgcgcgggcaactcgctt600accgattacgttagggctgaUtttacgtaaaaategteaagggatgeaagaccaaaccg660tU33tttCCggagtcaacagcatccaagcccaagtccttcaeggagaaaccccagcgtc720cacatcacgagcgaaggaccacctctaggcateggacgeaccatccaattagaagcagca780aagcgaaacagcccaagaaaaaggtcggcccgtcggccttttctgcaacgctgatcaegg840gcagcgatccaaccaacaccctccagagtgactaggggcggaaatttatcgggatUatt兩tccactcaaccacaaatcacagtcgtccccggtaatttaaeggctgeagaeggcaattta960acggcttctgcgaatcgcttggattccccgcccctggccgUgagctUaagtatgtccc1020Ugtcgatgcgatgtatcacaacatataaatactggcaagggatgccatgcttggagttt1080ccaactcaattUcctcUtccacacttctcUccttcctcaatcctctatatacacaac1140tggggatccaccatgcacttcaccaaggtctccaccattctttmccatcUcgccgcc1200ggcatcatggctgctcccaccgaaggagtccgtgaggaagccgcccctggccaggaggtt1260taccccgacgaacctcctgcttctctgaccaagcgtggctteggatgtectggtgatgcc1320uccagtgcagtgaacactgcagggccctgggcggtggacgcactggaggaUctgtgctl勤ggaccttggtatttgggtcaccctaxctgcacctgttctttctaactcgagatcUgagg1440cctggcggtagacaatcaatccatUcgctatagtUa_aggatggggatg1500agggcaattggttaUtgatcatgtatgtagtgggtgtgcataatagtagtgaaatggaa1560gccaagtcatgtg"tgtaatcgaccgacggamgaggatatceggaaatacagacacc1620gtgasagccatggtctttccttcgtgtagaagaccagacagacagtccctgattUccct1680tgcacaaagcactagaaaatUgcattccatccttctctgcttgctctgctgatatcact1740gtcattcaatgcatagccatgagctcatcttagatccaagcaegtaattecatagccgag1800gtccacagtggagcagcaacattccccatcattgetttecccaggggcctcccaacgact1860aaatcsagagtatatctcUccgtccaatagategtettcgcttcaaaatctttgacaat1920tccaagagggtccccatccatcaaacccagttcaaUatagccgagatgcatggtggagt1980caattaggcagtattgctggaatgtcggggcc汪gttggccgggtggtcattggccgcctg2040tgatgccatctgccactaaatccgatcattgatccaccgcccacgaggcgcgtctttgct2100ttttgcgcggcgtccaggttcaactctctcctcUgactggaaaegcaaccctgaaggga2160ttcttcctttgagagatggaagcgtgtcatatetctteggttctaeggeaggtumtc2220tgctctttegtagcatggcatggtcacttcagegcttattUcagttgctggtattgatt2280tcttgtgcaaattgetatetgacacttattagcutggagtcaccacatttcccagcaac2340ttCCCC8Cttcctctgcaatcgccaacgtcctctcttcactgagtctccgtccgataacc2400tgcactgcaaccggtgccccatggtacgccteeggatcatactcttcctgcacgagggca2460tcaagctcactaaccgccttgaaactctcattcttcttatcgatgttcttateegcaaag2520gUaccggaacaaccacgctcgtgaaatccagcaggttgatcacagaggcatacccatag2580uceggaactggtcatgccgtaccgcagcggtaggcgtaateggegegatgatggegtec2640agttccttcccggcctmcttcagcctcccgccatttctcaaggtactccatctggt332700ttccacttctggagatgcgtgtcccagagctcgttcatgtU8cagctttgatgttcggg2760ttcagUggtctttgatatttggaatcgeeggctcgccggatgeactgatategegcatt2820acgtcggcgctgccgtcagccgegtagatatgggagatgagatcgtggccgaaatcgtgc2880ttgtatggcgtecaeggggtCaCggtgtg3ccggctttggcgagtgcggcgacggtggtt2940tccaxgccgcgcaggataggagggtgtgg3aggacattgccgtcgaagttgUgtagccg3000atattgagcccgccgttcttgatcttggaggcaauatgtccgactcggactggcgccag3060ggcatggggatgaccttggagtegtatttecatggctcctgaccgaggacgg"ttggtg3120aagaggcggaggtctaacatacttcatcagtgactgccggtctcgtaUtagtataaaaa3180gcaagaaaggaggacagtggaggcctggUUgagcaggaaaagaaggaagaggegaagg3240actcaccctcaacagagtgcgUatcggcccgacaBCgctgtgcaccgtctcctgaccct3300ccatgct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