專(zhuān)利名稱(chēng)：：體內(nèi)半衰期改變的生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總地涉及生物活性蛋白質(zhì)，更具體涉及改變生物活性蛋白質(zhì)的半衰期。
背景技術(shù)：
：作為人類(lèi)治療藥物給予時(shí)，生物活性蛋白質(zhì)的半衰期常常不理想。它們的固有半衰期使得給藥方案和劑量方案常常達(dá)不到最優(yōu)治療效果，產(chǎn)生順從性問(wèn)題和使患者不方便。在用于人類(lèi)治療的生物活性蛋白質(zhì)生產(chǎn)中，曾嘗試通過(guò)物理方法(如改變給藥途徑、納米顆粒包裝和脂質(zhì)體包裹)、化學(xué)修飾(如乳化、PEG化和超糖基化)和遺傳修飾(如修飾蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，聚合物標(biāo)記、人血清白蛋白融合、慘入翻譯后修飾)延長(zhǎng)生物活性蛋白質(zhì)的半衰期。參見(jiàn)例如，Lord等，C7/w.Omceri^.7:2085-2090(2001)和vanDerAuwera等，Hemafo/.66:245-251(2001)。然而，這些方法會(huì)產(chǎn)生其它問(wèn)題。通過(guò)物理方法延長(zhǎng)生物活性蛋白質(zhì)半衰期常常使藥物復(fù)雜性增加，在制造過(guò)程中增加了成本高和耗時(shí)的下游加工?；瘜W(xué)修飾可能改變生物活性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或安全性。通過(guò)重組DNA合成法制備生物活性蛋白質(zhì)時(shí)，需要根據(jù)具體應(yīng)用在特定的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中評(píng)估遺傳修飾對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)率和純度的影響。因此，需要改變生物活性蛋白質(zhì)的固有半衰期的其它方法。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及包含生物活性多肽的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)重復(fù)單元肽基序的多肽(氨基酸延伸物)。該基序包含主要組件和次要組件，其中主要組件是選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基，次要組件是選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基，限制條件是沒(méi)有一種氨基酸同時(shí)存在于主要組件和次要組件中，與未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期相比，該偶聯(lián)物的血漿半衰期有所改變。本文所用術(shù)語(yǔ)"改變"指與未偶聯(lián)的生物活性多肽或蛋白質(zhì)本身的血漿半衰期(即固有半衰期)相比半衰期延長(zhǎng)或縮短。術(shù)語(yǔ)"固有半衰期"指天然生物活性多肽的半衰期或未偶聯(lián)形式(因此包括重組形式的天然多肽)多肽的半衰期。在一些實(shí)施方式中，所述肽基序包含3-6個(gè)氨基酸殘基(即3、4、5或6個(gè))。在一些實(shí)施方式中，所述肽基序含有5或6個(gè)氨基酸殘基，次要組件包含所述肽的1個(gè)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，所述肽基序的序列由N和T氨基酸殘基、N和E氨基酸殘基、Q和S氨基酸殘基或N和Q氨基酸殘基組成。在一些實(shí)施方式中，所述氨基酸延伸是在所述生物活性多肽的N-末端；在一些實(shí)施方式中，是在所述生物活性多肽的C末端；在其它實(shí)施方式中，延伸位于所述生物活性多肽的N和C-末端。在一些實(shí)施方式中，所述生物活性多肽是細(xì)胞因子(如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長(zhǎng)激素或干擾素、如|3-干擾素或Y-干擾素)、抗體、抗體片段、蛋白水解抗體片段或結(jié)構(gòu)域、單鏈抗體、遺傳或化學(xué)優(yōu)化的抗體或其片段、可溶性gpl20或gpl60糖蛋白、凝血因子、可溶性受體如腫瘤壞死因子(TNF)-aII型受體、治療酶或紅細(xì)胞生成素(EPO)。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的半衰期經(jīng)改變比未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期縮短，例如所述生物活性多肽包括重組的活化蛋白C或重組因子VII。本發(fā)明另一方面涉及含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物和載體的組合物。在一些實(shí)施方式中，所述組合物是藥物組合物，所述載體是藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明另一方面涉及編碼上述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的嵌合DNA分子和含該嵌合DNA分子的載體，以及用該嵌合DNA分子或含有該嵌合DNA分子的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述載體是質(zhì)粒，如pCE2。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或者是細(xì)菌如大腸桿菌(五.co//)，或酵母。本發(fā)明另一方面涉及制備包含生物活性多肽的生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的方法，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)含主要組件和次要組件的肽單元的多肽，所述主要組件是選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基，次要組件是選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基，限制條件是沒(méi)有一種氨基酸同時(shí)存在于所述主要組件和所述次要組件中，因而與未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期相比，所述生物活性蛋白質(zhì)的血漿半衰期有所改變，所述方法包括在表達(dá)編碼所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的嵌合DNA分子的條件下培養(yǎng)用所述DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；和從所述細(xì)胞中提取所述嵌合DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明另一方面涉及測(cè)定某給定蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的血槳半衰期相對(duì)于未偶聯(lián)生物活性多肽的固有半衰期發(fā)是否變的方法，所述方法包括a)制備包含生物活性多肽的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)重復(fù)單元肽基序的多肽，所述基序包含主要組件和次要組件，其中主要組件包含選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基或由其組成，次要組件包含選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基或由其組成，沒(méi)有一種氨基酸同時(shí)存在于所述主要組件和所述次要組件中，和b)檢測(cè)該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物以確定該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的血漿半衰期相對(duì)于未偶聯(lián)生物活性多肽的固有半衰期是否改變。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1是PHOxpBSK載體的示意圖。-圖2是PH0-G-CSF-NNxpBSK載體的示意圖。圖3是PHO-G-CSF-(NNT)65xpBSK載體的示意圖。圖4是PHO-G-CSF-(NNT)155xpBSK載體的示意圖。圖5是PHO-G-CSF-(NNT)155xpCE2載體的示意圖。圖6是幾種不同G-CSF-多肽偶聯(lián)物和未偶聯(lián)G-CSF的Western印跡。圖7是電泳前用PNG酶F處理的幾種不同G-CSF-多肽偶聯(lián)物和未偶聯(lián)G-CSF的Western印跡。圖8是用PROCH04-CDM培養(yǎng)基培養(yǎng)的CHOK1細(xì)胞中表達(dá)的G-CSF-(NNT)155和G-CSF-(NNT)65構(gòu)建物(一式兩份)的Western印跡。發(fā)明詳述本文所用術(shù)語(yǔ)"多肽"指沒(méi)有特定長(zhǎng)度的氨基酸聚合物，除非另有說(shuō)明。因此，"多肽"的定義包括肽和蛋白質(zhì)，在本說(shuō)明書(shū)、以及權(quán)利要求書(shū)中，可互換使用這些術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)"多肽"不排除翻譯后修飾，如具有共價(jià)連接的糖基、乙?；⒘姿峄鶊F(tuán)、脂質(zhì)基團(tuán)、脯氨酸或賴(lài)氨酸羥基化等的多肽。"多肽"的定義也包括其同源物。本文所用術(shù)語(yǔ)"純化"指生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物已純化的水平足以滿足其應(yīng)用所需?？偟膩?lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及包含生物活性多肽的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)重復(fù)單元肽基序的多肽，所述基序包含主要組件和次要組件，其中主要組件是選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基，次要組件是選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基，限制條件是所述氨基酸均不同時(shí)存在于所述主要組件和所述次要組件中。本發(fā)明蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的血槳半衰期長(zhǎng)于相應(yīng)的未偶聯(lián)生物活性多肽或蛋白質(zhì)。該基序的重復(fù)單元通常含有3-7(3、4、5、6或7)個(gè)氨基酸殘基。以N(Asn)為主要組件的代表性肽基序見(jiàn)表l。以G(Gly)為主要組件的代表性肽基序見(jiàn)表2。以Q(Glu)為主要組件的代表性肽基序見(jiàn)表3。此肽基序的數(shù)目為2個(gè)至約500個(gè)。因此，該多肽中存在的包括本文所列特定肽基序的所述基序含有以下數(shù)目的單元2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、,89、卯、'91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、m、m、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、37K372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、歌410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、柳、491、492、493、494、495、496、497、498、499和500(包括其中的任何子范圍)。如上所述，偶聯(lián)于所述生物活性多肽的多肽也可稱(chēng)為該生物活性多肽的氨基酸或聚氨基延伸物(以下稱(chēng)為"氨基酸延伸物")。所述氨基酸延伸物可位于該生物活性多肽序列的N末端、C末端或N末端和C末端。如果不受限于理論，申請(qǐng)人認(rèn)為，該氨基酸延伸物不采取穩(wěn)定的構(gòu)象，因此不干擾或影響蛋白質(zhì)的活性。還認(rèn)為將該氨基酸延伸物限制于兩種不同氨基酸能降低該氨基酸延伸物的化學(xué)復(fù)雜性，這有助于最大程度降低潛在的免疫原性，以及對(duì)物理化學(xué)特性的調(diào)節(jié)比僅采用一種類(lèi)型或種類(lèi)的氨基酸時(shí)廣泛得多。廣義上說(shuō)，所述生物活性多肽包括任何蛋白質(zhì)(包括天然多肽，即其體內(nèi)存在形式)或重組產(chǎn)生的多肽，如血漿半衰期經(jīng)改變的重組人G-CSF(rh-G-CSF)，從某些觀點(diǎn)，尤其是從治療觀點(diǎn)來(lái)看，需要這種改變，這意味著將其遞送給脊椎動(dòng)物時(shí)，能治療，如治愈、改善或減輕該脊椎動(dòng)物某給定疾病的癥狀，或者，通過(guò)最終減慢疾病的進(jìn)展延長(zhǎng)該脊椎動(dòng)物的生命。生物活性蛋白質(zhì)的類(lèi)型包括細(xì)胞因子、趨化因子、淋巴因子、配體、受體、激素、凋亡誘導(dǎo)多肽、酶、抗體和抗體片段以及生長(zhǎng)因子。受體的例子包括TNFI型受體、II型IL-l受體、IL-1受體拮抗劑、IL-4受體和任何化學(xué)或遺傳學(xué)修飾的可溶性受體。酶的例子包括活化的蛋白C、因子VII、膠原酶(如AdvanceBiofacturesCorporation以商品名Santyl出售)；agalsidase隱(3(如Genzyme以商品名Fabrazyme出售)；鏈球菌DNA酶-a(如Genentech以商品名Pulmozyme出售)；阿替普酶(如Genentech以商品名Activase出售)；PEG化天冬酰胺酶(如Enzon以商品名Oncaspar出售)；天冬酰胺酶(如Merck以商品名Elspar出售)；和伊米苷酶(如Genzyme以商品名Ceredase出售)。特異性多肽或蛋白質(zhì)的例子包括但不限于粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，集落刺激因子(CSF)，干擾素卩(IFN-p)，干擾素Y(IFN力，干擾素Y誘導(dǎo)因子I(IGIF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(3(TGF-I3)，RANTES(活化后調(diào)節(jié)，正常T-細(xì)胞表達(dá)，估計(jì)可能分泌)，巨噬細(xì)胞炎性蛋白(如MIP-l-a和MIP-l-卩)，利什曼蟲(chóng)延伸起始因子(LEIF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，腫瘤壞死因子(TNF)，生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-2(NT-2)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4(NT-4)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5(NT-5)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系-衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、纖毛神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，TNF-aII型受體，紅細(xì)胞生成素(EPO)，胰島素和可溶性糖蛋白，如gpl20和gpl60糖蛋白。gpl20糖蛋白是人免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，gpl60糖蛋白是gpl20糖蛋白的已知前體。在一些實(shí)施方式中，需要改變生物活性多肽的半衰期，以使其比固有半衰期縮短。這種實(shí)施方式包括重組活化的蛋白C(如EliLilly以商品名Xigris出售)和重組因子VII(NovoNordisk以商品名NovoSeven出售)。生物活性多肽可用于治療疾病，如帕金森—病、癌癥和心臟病。此外，治療性多肽可用于治療自身免疫病，如多發(fā)性硬化；斯耶格倫綜合征；結(jié)節(jié)??；胰島素依賴(lài)性糖尿??；自身免疫性甲狀腺炎；關(guān)節(jié)炎(如骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)；強(qiáng)直性脊柱炎；和硬皮病。同時(shí)，本發(fā)明治療性多肽可用于治療急性和慢性炎癥，以促進(jìn)身高增加、促進(jìn)傷口愈合和防止細(xì)胞、組織或器官移植后的排斥反應(yīng)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述多肽是G-CSF。G-CSF能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞快速增殖并釋放入血流，從而提供抵抗感染的療效。如美國(guó)專(zhuān)利6,831,158所述，重組人(rh)-G-CSF通常用于治療各種形式的白細(xì)胞減少癥(白細(xì)胞水平降低)和嗜中性粒細(xì)胞減少癥(嗜中性粒細(xì)胞水平降低)。白細(xì)胞減少癥和嗜中性粒細(xì)胞減少癥導(dǎo)致對(duì)各種感染的易感性增加?？色@得名為非格司亭(GRAN⑧和NEUPOGEN)、來(lái)格司亭(NEUTROGIN⑧和GRANOCYTE)和那托司亭(NEU-UP)的rh-G-CSF的市售制劑。01^忖@和NEUPOGEN⑧是非糖基化的，由重組大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)。NEUTROGIN②和GRANOCYTE⑧是糖基化的，由重組CHO細(xì)胞生產(chǎn)。NEU-UP是非糖基化的，重組大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)的完整rh-G-CSF的N末端區(qū)有5個(gè)氨基酸被取代。除了G-CSF本身以夕卜，也可采用具有生物學(xué)功能或生物學(xué)活性的G-CSF類(lèi)似物。制備rh-G-CSF的方法參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,810,643。美國(guó)專(zhuān)利4,810,643中也報(bào)道了各種G-CSF類(lèi)似物。美國(guó)專(zhuān)利5,985,265中提供了編碼rh-G-CSF的多核苷酸和rh-G-CSF的氨基酸結(jié)構(gòu)。本發(fā)明蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的氨基酸序列(和相應(yīng)的多核苷酸序列)的代表性例子見(jiàn)表4。包括了PHO前導(dǎo)序列。在氨基酸序列中，PHO前導(dǎo)序列位于氨基酸l-18，G-CSF位于氨基酸19-192，NNT,55氨基酸延伸物位于氨基酸193-347。用符號(hào)"*"標(biāo)出終止密碼子。如多核苷酸序列所示，核酸l-54編碼PHO前導(dǎo)序列，核酸55-576編碼G-CSF,核酸577-1041編碼NNT,55氨基酸延伸物。核酸1042-1044(TAG)構(gòu)成了終止密碼子。在一些實(shí)施方式中，重復(fù)肽單元的數(shù)目為75-225個(gè)。因此，就含有G-CSF和與其連接的含序列NNT肽基序重復(fù)單元的多肽的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物而言，本發(fā)明實(shí)施方式可包括以下任何一種蛋白質(zhì)偶聯(lián)物G-CSF-(NNT)75、G-CSF-(NNT)76、G-CSF-(NNT)77、G-CSF-(NNT)78、G-CSF-(NNT)79、G-CSF-(NNT)80、G-CSF-(NNT)81、G-CSF-(NNT)82、G-CSF-(NNT)83、G-CSF-(NNT)84、G-CSF-(NNT)85、G-CSF-(NNT)86、G-CSF-(NNT)87、G-CSF-(NNT)88、G-CSF-(NNT)89、G-CSF-(NNT>90、G-CSF-(NNT)91、G-CSF-(NNT)92、G-CSF-(NNT)93、G-CSF-(NNT)94、G-CSF-(NNT)95、G-CSF-(NNT)96、G-CSF-(NNT)97、G-CSF-(NNT)98、G-CSF-(NNT)99、G-CSF-(NNT)100、G-CSF-(NNT)101、G-CSF-(NNT)102、G-CSF-(麗T)03、G-CSF-(NNT),04、G-CSF-(NNT)105G-CSF-(NNT)賜、G-CSF-(NNT)07、G-CSF-(NNT)i08、G-CSF-(NNT)109G-CSF-(NNT)110、G-CSF-(NNT)11、G-CSF-(NNT;)12、G-CSF-(NNT)3G-CSF-(NNT)4、G-CSF-(NNT)15、G-CSF-(NNT)16、G-CSF-(NNT)117G-CSF-(NNT)118、G-CSF-(NNT)'19、G-CSF-(NNT),20、G-CSF-(NNT)121G-CSF-(NNT)122、G-CSF-(NNT)23、G-CSF-(NNT)24、G-CSF-(NNT)125G-CSF-(NNT)26、G-CSF陽(yáng)(NNT)27、G-CSF-(NNT)，28、G-CSF-(NNT)129G-CSF-(NNT)130、G-CSF-,T)31、G-CSF-(NNT)32、G-CSF-(NNT)133G-CSF-(NNT)134、G-CSF-(NNT)35、G-CSF-(NNT)'36、G-CSF-(NNT)137G-CSF-(NNT)138、G-CSF-(NNT)139、G-CSF-(NNT)mo、G-CSF-(NNT)14I、G-CSF-(麗)m、G-CSF-(NNT)143、G-CSF-(NNT)144、G-CSF-(NNT)145、G-CSF.■(NNT)146、G-CSF-(NNT)147、G-CSF-(NNT)148、G-CSF-(NNT)149、G-CSF-(NNT)I50、G-CSF-(NNT)151、G-CSF-(NNT)152、G-CSF-(NNT)153、G-CSF，T)154、G-CSF-(NNT)155、G-CSF-(NNT)156、G-CSF-(NNT)157、G-CSF-(麗)m、G-CSF-(NNT)159、G-CSF-(NNT)160、G-CSF-(NNT)161、G-CSF-■(NNT)162、G-CSF-(NNT)163、G-CSF-(NNT)I64、G-CSF-(NNT)165、G-CSF--(NNT)166、G-CSF-(NNT)167、G-CSF-(NNT)168、G-CSF-(NNT)169、G-CSF-(麗)170、G-CSF-(NNT)171、G-CSF-(NNT)172、G-CSF-(NNT)173、G-CSF-■(NNT)174、G-CSF-(NNT)175、G-CSF-(NNT)176、G-CSF-(NNT)177、G-CSF--(NNT)178、G-CSF-(NNT)179、G-CSF-(NNT)180、G-CSF-(NNT)i8i、G-CSF-■(NNT)182、G-CSF-(NNT)183、G-CSF-(NNT)184、G-CSF-(NNT)I85、G-CSF-■(NNT)186、G-CSF-(NNT)187、G-CSF-(NNT)188、G-CSF-(NNT)189、G-CSF.-(NNT)I90、G-CSF-(NNT)19I、G-CSF-(NNT)I92、G-CSF-(NNT)193、G-CSF-■(NNT)194、G-CSF-(NNT)195、G-CSF-(NNT)196、G-CSF-(NNT)197、G-CSF--(NNT)198、G-CSF-(NNT)199、G-CSF-(NNT)200、G-CSF-(NNT)201、G-CSF--(NNT)202、G-CSF-(NNT)203、G-CSF-(NNT)204、G-CSF-(NNT)205、G-CSF-，T)206、G-CSF-(NNT)207、G-CSF-(NNT)208、G-CSF-(NNT)209、G-CSF--(NNT)，、G-CSF-(NNT)211、G-CSF-(NNT)212、G-CSF-(NNT)213、G-CSF-.(麗)2"、G-CSF-(NNT)215、G-CSF-(NNT)216、G-CSF-(NNT)217、G-CSF.-(NNT)218、G-CSF-(NNT)219、G-CSF-,T)220、G-CSF-(NNT)221、G-CSF-(NNT)222、G-CSF-(NNT)223、G-CSF-(NNT)224和GCSF-(NNT)225。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，所述多肽是EPO。如Krantz，Blood77:419(1991)所述，天然產(chǎn)生的EPO刺激骨髓中定型紅系祖細(xì)胞分裂和分化，并通過(guò)結(jié)合受體和紅系前體細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)活性。用重組技術(shù)生物合成制備的EPO是將克隆的人EPO(hEPO)基因插入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物。參見(jiàn)Egrie等，Immunobiol.72:213-224(1986)。美國(guó)專(zhuān)利6,583,272中說(shuō)明了hEPO的顯性、完全加工形式的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)。在EPO中，Cys、Cys"'和Cys"-Cys"之間有兩個(gè)二硫橋鍵。不含糖部分的EPO多肽鏈分子量為18,236DA。在完整EPO分子中，在蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)此糖基化蛋白質(zhì)的糖基約占分子量的40%。參見(jiàn)Sasaki等，/說(shuō)o/.CT^m.262:12059(1987)。因?yàn)閔EPO是紅血球形成必需的，所以該激素可用于治療以紅細(xì)胞產(chǎn)量低或缺陷為特征的血液疾病。臨床上，EPO可用于治療慢性腎衰竭(CRF)患者的貧血。參見(jiàn)Eschbach等，NEJM316:73-78(1987);Eschbach等，j肌Mem.她c/.Ill:992(1989);Egrie等，扁w;;/"〃.33:262(1988);和Lim等，^肌Med110:108-114(1989)。EPO也可用于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者和接受化療的癌癥患者的貧血。參見(jiàn)R.RDanna等，ErythropoietinInClinicalApplications-AnInternationalPerspective301-324(M.B.Garnick編，MarcelDekker1990)。EPO和本發(fā)明所用的其它生物活性多肽的氨基酸及其相應(yīng)核苷酸的序列見(jiàn)表5。表6列出了EPO的兩種其它氨基酸序列。所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物還可包含一種或多種親和標(biāo)記物。通常，親和標(biāo)記物是有利于分離、純化或檢測(cè)含有該親和標(biāo)記物的融合蛋白的多肽節(jié)段。原理上，可獲得抗體或其它特異性結(jié)合制劑的任何肽或蛋白質(zhì)均可用作親和標(biāo)記物。代表性親和標(biāo)記物包括聚組氨酸束、蛋白A(Nilsson等，五Affi(9乂4:1075，(1985);Nilsson等，￡"2ymo/.198:3，(1991))、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith等，Ge朋67:31(1988))、麥芽糖結(jié)合蛋白(Kellerman等，五"矽wo/.卯459-463(1982);Guan等，67:21-30(1987))、Glu陽(yáng)Glu親和標(biāo)記物(Grussenmeyer等，尸rac.A^/.」cad82:7952-4(1985);參見(jiàn)oNDEPHO-lR)、P物質(zhì)、FlagTM肽(Hopp等，說(shuō)'o"c/mo/ogy6:1204-10(1988))、鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合肽、硫氧還蛋白、泛素、纖維素結(jié)合蛋白、T7聚合酶或其它抗原表位或結(jié)合域。通常參見(jiàn)，F(xiàn)ord等，ProteinExpressionandPurification2:95-107(1991)。編碼親和標(biāo)記物的DNA可購(gòu)自供應(yīng)商(如PharmaciaBiotech,Piscataway，NewJersey;NewEnglandBiolabs,-Beverly,Massachusetts;和EastmanKodak,NewHaven，Connecticut)。以氨基酸延伸物為例，可將親和標(biāo)記物安置于生物活性多肽序列的N末端、C末端或N末端和C末端。本發(fā)明也涉及制備該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的方法。該方法包括在表達(dá)DNA的條件下培養(yǎng)用編碼該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的嵌合DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而產(chǎn)生該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；和提取細(xì)胞或培養(yǎng)基(或細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(milleau))中嵌合DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物。與用化學(xué)方法制備的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物(如市售產(chǎn)品NEULASTA(PEG-G-CSF，一種重組甲硫氨酰人G-CSF和單甲硫氨酰聚乙二醇的共價(jià)偶聯(lián)物)相反，也與物理或化學(xué)方法相反，本發(fā)明是重組偶聯(lián)，產(chǎn)生的生物活性蛋白質(zhì)和多肽是蛋白質(zhì)的延續(xù)組分?？捎美玳L(zhǎng)約10-20個(gè)氨基酸的接頭連接該蛋白質(zhì)與氨基酸延伸物。該嵌合DNA分子包括編碼蛋白質(zhì)部分的基因或多核苷酸片段和一種或多種基因片段，如一起編碼該多肽或氨基酸延伸物的寡核苷酸。表7列出了編碼氨基酸延伸物中所含肽基序的寡核苷酸(并編碼本文特別公開(kāi)的肽基序)。表8中說(shuō)明了表7所用的單字母標(biāo)記。該DNA分子還可包含編碼親和標(biāo)記物、接頭以及5'和3'調(diào)控元件的片段。編碼蛋白質(zhì)部分的基因或多核苷酸可以是已知編碼所需蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)部分的多肽的任何基因或多核苷酸。這些基因和多核苷酸以及用于產(chǎn)生它們的引物是蛋白質(zhì)或多肽特異性的，是本領(lǐng)域熟知的?？砂凑丈鲜龊蛯?shí)施例1所述的方法產(chǎn)生編碼該多肽部分的連接的寡核苷酸。該寡核苷酸可以是任何長(zhǎng)度，但設(shè)計(jì)時(shí)優(yōu)選避免采用已知會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄的重復(fù)性DNA序列。例如，與僅由一個(gè)谷氨酸密碼子組成的多核苷酸相比，舍有兩個(gè)谷氨酸密碼子相組合的連接寡核苷酸不大可能采取可能阻礙基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。可工程改造編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的嵌合DNA分子，以在其5'端含有編碼甲硫氨酸(M)和/或脯氨酸(P)的密碼子，而有利于表達(dá)。通過(guò)分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)制備本發(fā)明偶聯(lián)物。在一些實(shí)施方式中，首先將編碼該生物活性蛋白質(zhì)的基因或多核苷酸克隆入構(gòu)建物，如質(zhì)?；蚱渌d體中。然后，通過(guò)連接或多聚化方案將編碼該多肽部分重復(fù)單元的寡核苷酸克隆入該構(gòu)建物，其中寡核苷酸連接在一起后形成編碼該多肽部分的多核苷酸。以此方式，將寡核苷酸加入編碼該蛋白質(zhì)部分的基因或多核苷酸，從而在構(gòu)建物中產(chǎn)生嵌合DNA分子。另外，可將嵌合DNA分子轉(zhuǎn)移或克隆入更合適表達(dá)載體的另一構(gòu)建物中。此時(shí)，用嵌合DNA分子轉(zhuǎn)化能表達(dá)該嵌合DNA分子的宿主細(xì)胞?？衫没虿焕幂d體，如表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后，在適合表達(dá)該嵌合DNA分子的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，導(dǎo)致編碼產(chǎn)生該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物?！景l(fā)明所用的連接或多聚化方法是熟知的。參見(jiàn)JosephSambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第二版，1.53(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的"定向克隆"實(shí)施克隆方法。定向克隆指以特定和預(yù)先確定的取向?qū)⒍嗪塑账岵迦胭|(zhì)?；蜉d體中。一旦克隆入載體后，可在其3'端延伸多核苷酸序列，或者在其5'和/或3'端插入其它多核苷酸。這種設(shè)計(jì)提供了一種有效且相對(duì)容易的方法來(lái)產(chǎn)生大的聚合物，而無(wú)須進(jìn)行多輪連接。載體優(yōu)選上游含有克隆多核苷酸的限制性位點(diǎn)，但下游含有表達(dá)所需的調(diào)控元件，以幫助插入第二種多核苷酸。為了有利于定向克隆，可將"銜接子寡核苷酸"連接于編碼該蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的嵌合DNA分子的5'和3'端。優(yōu)選地，該銜接子含有與表達(dá)載體中存在的銜接子相容的限制性位點(diǎn)。3'銜接子寡核苷酸也可含有終止密碼子，以確定與其連接的編碼序列的末端。宜將編碼該多肽部分的寡核苷酸加到過(guò)量銜接子寡核苷酸處，以提高連接后產(chǎn)生長(zhǎng)鏈多核苷酸的可能性。該方法不限于任何具體克隆方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用各種克隆方案來(lái)產(chǎn)生包含本發(fā)明嵌合DNA分子的構(gòu)建物?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將該嵌合DNA分子引入宿主細(xì)胞中。這些技術(shù)包括但不限于用磷酸鈣共沉淀嵌合DNA分子轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)試劑共轉(zhuǎn)染(即Lipofectamine)、電穿孔、使細(xì)胞接觸病毒以進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)、或?qū)⒃撉逗螪NA分子顯微注射入細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的合適原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(^c/〃z^犯6"http://力、鼠傷寒沙門(mén)菌(&2/mo"e〃a0^"'w"^ww)以及假單胞菌(尸wz^omo/ms)、鏈球菌(Sfre/^om:vce力和葡萄球菌(&a;/^/ococczw)屬內(nèi)各種，但也可選用其它細(xì)菌。用各種宿主/表達(dá)載體組合來(lái)表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和可顯示宿主細(xì)胞是否轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氣葉酸還原酶或新霉素抗性，或者例如大腸桿菌的四環(huán)素或氨節(jié)青霉素抗性，或者釀酒酵母(S.c"ev/s/ae)TRPl基因)，以及衍生自高表達(dá)基因能指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可衍生自編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、A-因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白等的操縱乎。在合適的時(shí)相中用翻譯起始序列和終止序列，在一些實(shí)施方式中，用能引導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物分泌的前導(dǎo)序列，來(lái)組裝異源結(jié)構(gòu)序列。所述載體還包含復(fù)制起點(diǎn)以保證維持該載體(如果需要)，在宿主內(nèi)擴(kuò)增。可采用的有效表達(dá)載體包括例如染色體、非染色體和合成DNA序列的節(jié)段。合適載體包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物，以及已知的細(xì)菌質(zhì)粒如colEI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、Sm他等(Gene57:31-40(1988))描述的pGEX、pMB9和它們的衍生物，質(zhì)粒如RP4，噬菌體DNA如噬菌體I的各種衍生物如NM989，以及其它噬菌體DNA如M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA;酵母質(zhì)粒如2微米質(zhì)?；?m質(zhì)粒的衍生物，以及著絲粒和整合酵母(integrativeyeast)穿梭載體；用于真核細(xì)胞的載體如用于昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體，如經(jīng)修飾采用噬菌體DNA或表達(dá)控制序列的質(zhì)粒等。要求是這些載體在選擇的宿主細(xì)胞中可復(fù)制和有活力?？砂葱枰捎玫涂截惢蚋呖截愝d體。例如，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，可采用非融合轉(zhuǎn)移載體，例如但不限于pVL941(5amHI克隆位點(diǎn)，獲自Summers等，Virology84:390-402(1978))、pVL1393CSflmM、SmaI、^Z^I、￡co/I、A^I、Zmain、5g/II和尸Wl克隆位點(diǎn)；Invitrogen)、pVL1392(Sg/11，尸WI，Mrt，義mflIII，五co/I，^Zw/1，和5amM克隆位點(diǎn)；Summers等，Virology84:390-402(1978)和Invitrogen)和pBlue5acIII(5amM、5g/II、尸M、Wcol和歷"c/in克隆位點(diǎn)，藍(lán)白斑重組篩選，Invitrogen)和融合轉(zhuǎn)移載體，例如但不限于pAc700(^aw//1和克隆位點(diǎn)，其中5。mM識(shí)別位點(diǎn)始于起始密碼子；Summers等，Virology84:3卯-402(1978))、pAc701和pAc70-2(與pAc700相同，但閱讀框不同)、pAc360(SamM克隆位點(diǎn)，多角體蛋白起始密碼子下游36個(gè)堿基對(duì)；I'nvitrogen(1995))和pBlueBacHisA、B、C(含有5awM、5g/H、尸Wl、Mrol和歷"^/in克隆位點(diǎn)的三種不同讀框，用于ProBond純化和藍(lán)白斑重組篩選噬菌體的N-末端肽；Invitrogen(220)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，還含有必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。由SV40剪接產(chǎn)生的DNA序列和聚腺苷酸化位點(diǎn)可用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件?？紤]用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如二氫葉酸還原酶啟動(dòng)子的載體，含有DHFR表達(dá)盒的任何表達(dá)載體或DHFR/甲氨蝶呤共擴(kuò)增載體如pED(尸Wl、5"a/I、幼al、Swal和五coiI克隆位點(diǎn)，該載體表達(dá)克隆基因和DHFR;RandalJ.Kaufman,1991，RandalJ.Kaufman,《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),16，12(1991))?；蛘?，谷胺酰胺合成酶/甲硫氨酸磺基肟共擴(kuò)增載體，如pEE14(歷"c/in、X6a/I、Swal、幼al、和5c/I克隆位點(diǎn)，其中該載體表達(dá)谷胺酰胺合成酶和克隆基因；Celltech)?？刹捎媚茉贓B病毒(EBV)或核抗原(EBNA)的控制下引導(dǎo)附加體表達(dá)的載體，如pREP4(5amM、斬I、Wol、AWI、A%el、///m/in、Mzel、和A^"I克隆位點(diǎn)，組成性RSV-LTR啟動(dòng)子，潮霉素選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pCEP4(5aw//1、S/I、Wol、Wort、A%el、///^/[11、A%d、尸v"ii和a:/7"i克隆位點(diǎn)，組成性hCMV立即早期基因啟動(dòng)子，潮霉素選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pMEP4(Kpnl、Pvul、Nhel、Hindin、Notl、Xhol、Sfil、BamHI克隆位點(diǎn)、誘導(dǎo)型金屬硫蛋白(methallothionein)IIa基因啟動(dòng)子、潮霉素選擇性標(biāo)記，Invitrogen)，pREP8(5amflT、屈ol、Mrt、/^'Win、A^el和《jwl克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子，組氨醇選擇性標(biāo)記；Invitrogen)、pREP9(X/I、A%el、i^>^III、M)rt、屈ol、斬I、^w/ZI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子，G418選擇性標(biāo)記；Invitrogen),和pEBVHis(RSV-LTR啟動(dòng)子，潮霉素選擇性標(biāo)記，可通過(guò)ProBond樹(shù)脂純化并用腸激酶切割的N末端肽；Invitrogen)。用于本發(fā)明的選擇性哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括但不限于pRc/CMV(Z/immi、&m、7Vort、幼al和j;al克隆位點(diǎn)，G418選擇，Invitrogen)、pRc/RSV(/Z/"dl、Spel、5w^1、H克隆位點(diǎn)，G418選擇，Invitrogen)等。可用于本發(fā)明的牛痘病毒哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(參見(jiàn)例如，RandallJ.Kaufman,《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》16.12(FrederickM.Ausubel等編，Wiley1991)包括但不限于pSCll(Smal克隆位點(diǎn)，TK-和p-gal選擇)、pMJ601CSa/1、Swal、4/1、^a"I、5s;MI、5"wM、^;al、A^el、SflcII、A:/"I和州Min克隆位點(diǎn)；TK-和(3-gal選擇)、pTKgptFlS(五co/I、尸Wl、5WH、^ccl、///^/11、幼al、Sam/ZI和Hpa克隆位點(diǎn)，TK或XPRT選擇)等。也可用于本發(fā)明的酵母表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于非融合pYES2載體(Wa1、5^1、幼o(hù)l、iVort、GW"、五coiI、5^YI、5aw/ZI、Sflcl、《;"I和州'm/HI克隆位點(diǎn)，Invitrogen)，融合pYESHisA、B、CCWg/1、印W、幼o(hù)l、Wofl、&^1、五coiI、Bam/fl、Sad、和克隆位點(diǎn)，用ProBond純化和用腸激酶切割的N末端肽；Invitrogen)，pRS載體等。用于本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的載體是質(zhì)粒pCE2?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法獲得pCE2質(zhì)粒。Leung等，/Voc.7Vaf/.JcadSc/.52:4813曙4817(1995)描述了實(shí)施例2.A.中所用的一種這樣的方法。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可將嵌合DNA分子插入已含有轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的嵌合DNA分子所必需的元件的表達(dá)載體中。此外，含有該嵌合DNA分子的表達(dá)載體可包含藥物選擇標(biāo)記。這種標(biāo)記有助于克隆和選擇或鑒定含有嵌合DNA分子的載體。例如，能賦予對(duì)新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、二氫葉酸還原酶(DHFR)、鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT)、零霉素和組氨醇抗性的基因是有用的選擇性標(biāo)記?；蛘撸刹捎妹?，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)。也可釆用免疫標(biāo)記?？刹捎萌魏我阎x擇性標(biāo)記，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)。選擇性標(biāo)記的其它例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括報(bào)道物，如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)、卩半乳糖苷酶(p-gal)或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)。因此，哺乳動(dòng)物，一般是人類(lèi)細(xì)胞，以及細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)和植物細(xì)胞可用作本發(fā)明的宿主細(xì)胞，可用本文所述的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在一些細(xì)胞宿主，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可"分離"含有該嵌合DNA分子的細(xì)胞，即將其從原始環(huán)境(例如，如果是天然產(chǎn)生的細(xì)胞，則是天然環(huán)境)中取出。在其它實(shí)施方式中，例如在植物中，不必分離細(xì)胞，即可利用整個(gè)植株，而非植物細(xì)胞或其部分的培養(yǎng)物。合適細(xì)胞的例子包括但不限于VERO細(xì)胞、HELA細(xì)胞如ATCC編號(hào)CCL2、CHO細(xì)胞系如ATCC編號(hào)CCL61、COS細(xì)胞如COS-7細(xì)胞和ATCC編號(hào)CRL1650細(xì)胞、WI38、BHK、HepG2、3T3如ATCC編號(hào)CRL6361、A549、PC12、K562細(xì)胞、293細(xì)胞、Sf9細(xì)胞如ATCC編號(hào)CRL1711和Cvl細(xì)胞如ATCC編號(hào)CCL70?？捎糜诒景l(fā)明的其它合適細(xì)胞包括但不限于原核宿主細(xì)胞系，如大腸桿菌(如DH5-a菌株)，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門(mén)菌或假單胞菌、鏈球菌和葡萄球菌屬的菌株?？捎糜诒景l(fā)明的其它合適細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，如&cc/wram;;cw屬的釀酒酵母細(xì)胞。可用經(jīng)修改適合激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(如Ham營(yíng)養(yǎng)混合物)培養(yǎng)含有感興趣多核苷酸的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等是先前用于表達(dá)所選擇宿主細(xì)胞的條件，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的。一般通過(guò)離心收獲細(xì)胞，用物理或化學(xué)方法破裂細(xì)胞，保留得到的粗提取物用于進(jìn)一步純化。可用任何常規(guī)方法，包括凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或采用細(xì)胞裂解制劑來(lái)破裂用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所有這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。包括細(xì)胞裂解實(shí)施方式可能必須采用含有蛋白酶抑制劑的緩沖液以抑制該嵌合DNA分子表達(dá)后的降解。合適的蛋白酶抑制劑包括亮抑肽酶、抑胃酶肽或抑肽酶。然后可用濃度遞增的飽和硫酸銨溶液沉淀上清?？赏ㄟ^(guò)一種或多種技術(shù)純化該蛋白質(zhì)偶聯(lián)產(chǎn)物。一般地，純化包括各步驟，如凝膠過(guò)濾、親和純化、鹽分級(jí)、離子交換色譜、分子大小排阻色譜、羥基磷灰石吸附色譜、疏水作用色譜和凝膠電泳。如果需要，可采用蛋白質(zhì)再折疊步驟來(lái)完成蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的構(gòu)型。高效液相色譜(HPLC)常用于最后的純化步驟。通常參見(jiàn)RobertK.Scopes,《蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐》(ProteinPurification:PrinciplesandPractice)(CharlesR.Castor編，Springer-Verlag1994)和JosephSambrook，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第2版(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)。Baron等，iev.5,o^c/mo/.10:179-90(19卯)禾卩Below等，CAramato^:A679:67-83(1994)也描述了多步純化分離的例子。測(cè)定所述偶聯(lián)物，然后用于測(cè)定與未偶聯(lián)蛋白質(zhì)相比該偶聯(lián)物是否具有改變的血漿半衰期。例如，在用G-CSF和各種氨基酸延伸物如(NNT)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在一種情況下半衰期延長(zhǎng)，在其它情況下半衰期縮短?？砂凑諏?shí)施例3所示的藥代動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行該測(cè)試。此方法包括將預(yù)定劑量的偶聯(lián)物給予動(dòng)物，優(yōu)選實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物如小鼠，經(jīng)預(yù)定的時(shí)間間隔收集動(dòng)物血槳，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)("ELISA")分析血漿，以測(cè)定偶聯(lián)物的濃度，直到不能檢測(cè)到。可通過(guò)非代謝區(qū)藥代動(dòng)力學(xué)分析(如釆用WINNonLin軟件版本4.1)計(jì)算半衰期。除了最后一次檢測(cè)到偶聯(lián)物濃度的時(shí)間(tf)外，該分析還包括觀察或計(jì)算以下主要參數(shù)^，與表觀末期相關(guān)的表觀末期速率常數(shù)，通過(guò)曲線的單次冪末端部分血漿濃度的對(duì)數(shù)與時(shí)間的線性回歸分析估計(jì)，W^為表觀末期半衰期，按照以下公式計(jì)算t1/2，z=ln(2)/^;AUC為零時(shí)間點(diǎn)至無(wú)限時(shí)的血漿濃度-時(shí)間的曲線下面積；AUC/D為每單位劑量血漿濃度-時(shí)間的曲線下面積；MRT為平均滯留時(shí)間，根據(jù)一階曲線的曲線下面積AUMC與AUC之間的比例計(jì)算；CL為全身清除率，通過(guò)CL-D/AUC計(jì)算；Vss為穩(wěn)態(tài)分布容積，通過(guò)Vs『CI^MRT計(jì)算。本發(fā)明另一方面涉及包含所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物和載體的組合物。廣義上說(shuō)，該載體可以是培養(yǎng)基或基質(zhì)(如純化基質(zhì))。在一些實(shí)施方式中，該載體是藥學(xué)上可接受的載體，在這種情況下該組合物可用于預(yù)防或治療人或動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物的失調(diào)和/或疾病，或者用于診斷目的。作為該組合物的活性成分，所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物優(yōu)選為可溶形式。通常，該組合物包含藥學(xué)有效量的能獲得所需效果(如治療或診斷效果)的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物?？筛鶕?jù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)估計(jì)藥學(xué)有效量。例如，可以確定動(dòng)物模型中的劑量，以獲得在體外系統(tǒng)中具有所需效果的包括或包含濃度點(diǎn)或范圍的循環(huán)濃度范圍。參見(jiàn)例如Molineux等，￡平//em加o/.27:1724-34(1999)。因此，此信息可用于準(zhǔn)確地確定其它哺乳動(dòng)物，包括人和動(dòng)物的劑量。通常，以對(duì)象體重計(jì)，劑量范圍約為1ng/kg-10mg/kg?？捎脴?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測(cè)定這種化合物的毒性和療效。參見(jiàn)例如Molineux等，鄉(xiāng).//謹(jǐn)to/.27:1724-34(1999)。例如，可用本領(lǐng)域已知的方法確定LD50(使50%群體致死的劑量)以及ED50(在50%群體中有效治療的劑量)。毒性與療效之間的劑量比是治療指數(shù)，可表示為具有高治療指數(shù)的化合物的LD50與ED50之比。從細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于確定這種化合物的劑量范圍，優(yōu)選位于包括毒性很小或無(wú)毒時(shí)ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)任何合適途徑給予該組合物，例如局部、口服、全身、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)粘膜、透皮(如通過(guò)貼劑)?？蓪⑺鼈儼街|(zhì)體、微粒、微膠囊、納米顆粒等中?！独酌黝D藥物科學(xué)和實(shí)踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)(AlfonsoR.Gennaro等編，PhiladelphiaCollegeofPharmacyandScience2000)中也描述了配制和給予生物活性多肽的技術(shù)。為了充分說(shuō)明本發(fā)明和其優(yōu)點(diǎn)，給出了以下具體實(shí)施例，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅為說(shuō)明性，不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1嵌合DNA分子的克隆為了有利于下游蛋白質(zhì)純化，決定使G-CSF-聚合物蛋白質(zhì)分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。采用各種細(xì)胞因子-聚合物構(gòu)建物和細(xì)菌(ST2)分泌信號(hào)的先前經(jīng)驗(yàn)表明，它們?cè)谠撕驼婧讼到y(tǒng)中分泌效率低。然而，已知采用phol+酸性磷酸酶(PHO)的粟酒裂殖酵母(Sc/^aracc/zaram少ce"/om6e)分泌信號(hào)序列能使異源蛋白(GFP和HPV16E7)分泌入培養(yǎng)基。因此，用下述G-CSF-聚合物構(gòu)建物在CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中測(cè)試了此分泌信號(hào)。下面也描述了生產(chǎn)G-CSF-聚合物構(gòu)建物和表達(dá)G-CSF-聚合物而合成的載體。l.A.PHOxpBSK構(gòu)建物的產(chǎn)生PHOxpBSK構(gòu)建物合成的第一種構(gòu)建物僅僅是克隆入細(xì)菌克隆載體pBSK的PHO前導(dǎo)序列。PHO分泌信號(hào)的氨基酸序列見(jiàn)下。MFLQNLFLGFLAVVCANA通過(guò)將兩組互補(bǔ)的DNA寡核苷酸融合在一起并將它們克隆入pBSK中合成了PHO分泌信號(hào)。寡核苷酸設(shè)計(jì)中考慮的最重要因素是將前導(dǎo)序列與G-CSF-聚合物的N末端融合是直接融合，沒(méi)有任何間插序列。這保證了可在加工期間從該分子上剪除整個(gè)分泌信號(hào)，與天然產(chǎn)生和臨床上已采用的G-CSF相比產(chǎn)生了不含氨基端修飾的分泌形式的G-CSF。以此方式制備構(gòu)建物，不僅可直接與G-CSF和PEG-G-CSF作比較，而且可通過(guò)在重組G-CSF蛋白中引入額外氨基酸而抑制其潛在的免疫原性。通過(guò)將限制性位點(diǎn)摻入以下寡核苷酸中將PHO前導(dǎo)肽克隆入pBSK，以及隨后將G-CSF克隆入PHOxpBSK，滿足了這些要求。所用寡核苷酸見(jiàn)下。oNDEPHO-1F:5'-GGCCGCCATATGTTCTTGCAAAATTTATTCCTTGGCT-3'oNDEPHO-1R:5'-CCAAAAAGCCAAGGAATAAATTTTGCAAGAACATATGGC-3'oNDEPHO-2F:5'-TTTTGGCCGTTGTTTGCGCAAACGCGTCCCGCAGGTG-3'oNDEPHO-2R:5'-GATCCACCTGCGGGACGCGTTTGCGCAAACAACGG國(guó)3'PHOxpBSK載體結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。用A^I和5amM將PHO前導(dǎo)肽(PhoA)克隆入pBSK。用&;M和SamM位點(diǎn)將成熟G-CSF序列克隆入此構(gòu)建物。此載體在細(xì)菌中生長(zhǎng)時(shí)具有氨芐青霉素抗性(Wa)。構(gòu)建方法用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化寡核苷酸互補(bǔ)對(duì)(oNDEPHO-lF與oNDEPHO-lR)和(oNDEPHO-2F與oNDEPHO-2R)。熱滅活T4PNK，在冰上使該寡核苷酸對(duì)緩慢退火。用TE稀釋反應(yīng)物，與事先用A^I和^mM消化的pBSK連接。將連接產(chǎn)物引入T叩IO電穿孔感受態(tài)細(xì)胞，并在LB-氨芐青霉素平板上培養(yǎng)。對(duì)氨芐青霉素抗性菌落進(jìn)行小抽分離DNA和診斷性消化鑒定推定的克隆。序列分析確定哪個(gè)推定克隆是正確的。l.B.PHO-G-CSF-NNxpBSK構(gòu)建物的產(chǎn)生PHO-G-CSF-NNxpBSK構(gòu)建利用和BflmM將對(duì)應(yīng)于成熟G-CSF編碼序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PHOxpBSK載體產(chǎn)生此構(gòu)建物。如前所述，利用限制性酶S^M設(shè)計(jì)用于此目的的寡核苷酸，以保證PHO與G-CSF之間的連接沒(méi)有間插序列。而且，將G-CSF的C末端與兩個(gè)天冬酰胺殘基(NN)和酶朋1yI和JBam//I的限制性位點(diǎn)直接融合。隨后用朋sl直接將NNT聚合物添加到G-CSF的C末端，而用Bam//1將GCSF-NN克隆入載體。合成的用于擴(kuò)增G-CSF的寡核苷酸如下oBspMIGCSF:5'-CGATCGACCTGCAAGTCGCGACTCCGCTGGGTCCAGCTA-3'oGCSFBbsBam:5'-CGGGATCCGAAGACGTGTTGTTAGGCTGGGCAAGGTGGC-3'PHO-G-CSF-NNxpBSK載體結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖2。用^s;M(破壞的)和5amM將成熟G-CSF-NN的序列克隆入PHOxpBSK。隨后添加NNT聚合物利用了該質(zhì)粒圖上所示的BM和位點(diǎn)。此載體在細(xì)菌中生長(zhǎng)時(shí)具有氨芐青霉素抗性(bla)。構(gòu)建方法用oBspMIGCSF和oGCSFBbsBam寡核苷酸通過(guò)PCR擴(kuò)增G-CSF。從瓊脂糖凝膠上切下對(duì)應(yīng)于成熟G-CSF的=520bp條帶并純化。用和SawM消化該純化片段，純化并連接入用相同酶酶切的PHOxpBSK。將連接產(chǎn)物引入T叩IO電穿孔感受態(tài)細(xì)胞，在LB-氨芐青霉素平板上培養(yǎng)。對(duì)氨芐青霉素抗性菌落進(jìn)行小抽分離DNA和診斷性消化鑒定推定的克隆。序列分析確定哪個(gè)推定克隆是正確的。l.C.PHO-G-CSF-(NNT)65xpBSK構(gòu)建物的產(chǎn)生PHO-G-CSF-(NNT)65xpBSK構(gòu)建此聚合物的氨基酸組成編碼哺乳動(dòng)物共有的N-連接糖基化位點(diǎn)N-X-(S/T)。因此，當(dāng)此構(gòu)建物在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該聚合物在其延伸物的蘇氨酸殘基上可能糖基化。預(yù)計(jì)翻譯產(chǎn)物的聚合性提高和翻譯后修飾會(huì)調(diào)節(jié)G-CSF的pK參數(shù)，使該蛋白質(zhì)的血清半衰期延長(zhǎng)，而不降低其生物學(xué)活性。用寡核苷酸連接/多聚化方案構(gòu)建此聚合物。用5fel切割PHO-G-CSF-NNxpBSK構(gòu)建物后，在加入G-CSF的C末端的兩個(gè)天冬酰胺殘基中產(chǎn)生了一個(gè)四堿基懸垂端(GTTG)。通過(guò)設(shè)計(jì)編碼重復(fù)性NNT三聯(lián)體以及能與GTTG懸垂端退火結(jié)合的寡核苷酸互補(bǔ)組，可能使編碼9個(gè)氨基酸的寡核苷酸聚合成更長(zhǎng)的鏈。加入低比率的含有終止密碼子、和進(jìn)一步延伸該聚合物的5M位點(diǎn)和5,M位點(diǎn)的短銜接子，以終止聚合，并允許將5M-5。m//I聚合物片段克隆入PHO-G-CSF-NNxpBSK。用于合成(NNT)65聚合物的寡核苷酸見(jiàn)下聚合物主鏈寡核苷酸。3NNTF:5，-CAACACCAACAATACCAACAATACAAA-3'。3NNTR:5,-GTTGTTTGTATTGTTGGTATTGTTGGT-3'銜接子寡核苷酸oDent3F:5'誦CAACTAGTCTTCG-3'oDent3R:5'-GATCCGAAGACTA-3'以下序列(NTNNTNNTN)是用聚合物主鏈寡核苷酸o3NNTF和o3NNTR產(chǎn)生的NNT聚合物的重復(fù)單元，分別顯示了用于聚合該聚合物的CAAC突出端和GTTG懸垂端。、'TNNTNNTN5'—CRACACCAACAATACC,AACAATACAAA-3'(03NNTE*):3,_7GG:TG.TTATGGTTCTTATGTTTGTTG-5'《o3!TOTR)下面是構(gòu)建完成時(shí)該聚合物的終止銜接子分子，它包括終止密碼子、用于進(jìn)一步延伸該聚合物的位點(diǎn)和克隆所必需的SamM位點(diǎn)。終止銜接子分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>PHO-G-CSF-NNT65xpBSK載體的結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖3。加入NNT65聚合物利用位于G-CSF的C末端的5&I位點(diǎn)(破壞)和5aw//1。如圖3所示，在NNT65聚合物的末端再生5fol位點(diǎn)，用于進(jìn)一步延伸長(zhǎng)度。此載體在細(xì)菌中生長(zhǎng)時(shí)具有氨芐青霉素抗性(bla)。構(gòu)建方法用T4PNK磷酸化聚合物主鏈寡核苷酸的互補(bǔ)對(duì)(o3NNTF和03NNTR)和銜接子寡核苷酸(oDent3F和oDent3R)。熱滅活T4PNK，在冰上使寡核苷酸對(duì)緩慢退火。將聚合物和銜接子雙鏈體(duplex)以20:1和40:1混合用T4連接酶進(jìn)行聚合物聚合。熱滅活T4連接酶，用Bam別消化整個(gè)連接反應(yīng)物過(guò)夜。沉淀這兩個(gè)反應(yīng)物，在丙烯酰胺凝膠上跑電泳。剪下250bp-800bp之間的物質(zhì)進(jìn)行凝膠純化。用此物質(zhì)與用和5amM消化的PHO-G-CSF-麗xpBSK連接。用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，在LB-氨芐青霉素平板上培養(yǎng)。進(jìn)行小抽分離DNA和診斷性消化鑒定推定的克隆。序列分析確定哪個(gè)推定克隆是正確的。此方法分離到的最長(zhǎng)克隆為PHO-G-CSF-NNT65xpBSK。l.D.PHO-G-CSF-(NNT)155xpBSK構(gòu)建物的產(chǎn)生PHO-G-CSF-(NNT)155xpBSK構(gòu)建此克隆的構(gòu)建需要用相同的寡聚化方案將額外的NNT殘基加到PHO-G-CSF-(NNT)65xpBSK構(gòu)建物中。改變用于此延伸的寡核苷酸的核苷酸組成，以鑒定原始聚合物與該延伸物之間的連接。這些改變維持該聚合物的原始NNT組成，并利用相同的GTTG懸垂端和CAAC突出端方法。用朋sl和^mM消化PHO-GCSF-(NNT)65后，可采用與先前相同的寡核苷酸聚合方法延長(zhǎng)該聚合物長(zhǎng)度。用于將(NNT)65聚合物延長(zhǎng)至(NNT)155的寡核苷酸見(jiàn)下聚合物主鏈寡核苷酸。3麗TextF:5，-CAACACCAATAATACCAACAATACAAA-3'。3麗TextR:5，陽(yáng)GTTGTTTGTATTGTTGGTATTATTGGT-3'銜接子寡核苷酸oDent3F:5,匿CAACTAGTCTTCG國(guó)3'oDent3R:5'陽(yáng)GATCCGAAGACTA-3'隨著PHO-G-CSF-(NNT)65xpBSK構(gòu)建物的產(chǎn)生，NTNNTNNTN是用聚合物主鏈寡核苷酸Q3NNTextF和o3NNTextR產(chǎn)生的NNT聚合物延伸的重復(fù)單元，其中仍用CAAC突出端和GTTG懸垂端使聚合物聚合，與原始NNT65聚合物相比氨基酸組成未改變。:rNNTWMTw5'-CAACACCAA工AATACCAftc:AAT織AA-3'(c3卵TextF)3'-tgs:T5rrAtogrs\;ttatctttgttg-s'(03咖rex'tR〗上面03NNTextF和o3NNTextR中下劃線的核苷酸分別與o3NNTF和o3NNTR中相同位置的核苷酸不同。下面是構(gòu)建完成時(shí)NNT155聚合物的終止銜接子分子，包括克隆所必需的5amM位點(diǎn)。oDent3F和oDent3F是用于起始NNT65聚合物的相同寡核苷酸。終止銜接子分子N'*5'-CAACTAGTCTTCG-3,《oDent3F)3,-ATCAGAAGCCTAG-5,(oE5ent3R)幼sI3as;inPHO-G-CSF-(NNT)155xpBSK載體結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖4。NNT65聚合物延伸90AA利用了位于PHO-G-CSF-NNT65xpBSK的C末端的5fel位點(diǎn)(破壞)和Bam別。應(yīng)注意，在NNT155聚合物末端再生Sfol位點(diǎn)用于進(jìn)一步延長(zhǎng)長(zhǎng)度。此載體在細(xì)菌中生長(zhǎng)時(shí)具有氨芐青霉素抗性(bla)。構(gòu)建方法用T4PNK磷酸化聚合物主鏈寡核苷酸互補(bǔ)對(duì)03NNTextF和o3NNTextR以及銜接子寡核苷酸oDent3F和oDent3R。熱滅活T4PNK，在冰上使寡核苷酸對(duì)緩慢退火。將聚合物和銜接子雙鏈體(duplex)以20:1和40:1混合用T4連接酶進(jìn)行聚合物聚合。熱滅活T4連接酶，用Baw/ZI消化整個(gè)連接反應(yīng)物過(guò)夜。沉淀這兩個(gè)反應(yīng)物，在丙烯酰胺凝膠上跑電泳。剪下250bp-800bp之間的物質(zhì)進(jìn)行凝膠純化。將此物質(zhì)連接入用5&I和5"m州消化的PHO-G-CSF-NNT65xpBSK。用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)&612細(xì)胞，在LB-氨節(jié)青霉素平板上培養(yǎng)。進(jìn)行小抽分離DNA和診斷性消化鑒定推定的克隆。序列分析確定哪個(gè)推定克隆是正確的。此方法分離到的最長(zhǎng)克隆為PHO-G-CSF-(NNT)155xpBSK。實(shí)施例2宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和嵌合DNA分子的表達(dá)2.A.PHO-G-CSF-(NNT)155xpCE2構(gòu)建物的產(chǎn)生制備載體pCE2通過(guò)以下操作從質(zhì)粒pREP7b產(chǎn)生質(zhì)粒pCE2。首先，缺失2000bpEBNA編碼區(qū)。其次，用pKS-ori取代pBR322ori。然后，用CMV增強(qiáng)子和延長(zhǎng)因子-la(EF-la)啟動(dòng)子和內(nèi)含子替換RSV啟動(dòng)子區(qū)。CMV增強(qiáng)子衍生自用以下引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)由pCEP4(Invitrogen，SanDiego，CA)產(chǎn)生的380bpXbal-Sphl片段5，-GGCTCTAGATATTAATAGTAATCAATTAC-3';和5，-CCTCACGCATGCACCATGGTAATAGC-3'。EF誦la啟動(dòng)子和內(nèi)含子(Uetsuki等，J5!W.264:5791-5798(1989))衍生自用以下引物通過(guò)PCR由人基因組DNA產(chǎn)生的1200bpSpW-^^7181片段5,-GGTGCATGCGTGAGGCTCCGGTGC-3，；和5'-GTAGTTTTCACGGTACCTGAAATGGAAG陽(yáng)3'。將這兩個(gè)片段連接入Z&al"印7181消化的pREP7b衍生載體中，產(chǎn)生pCE2。PHO-G-CSF-(NNT)155xpCE2構(gòu)建為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PHO-G-CSF-(NNT)155，必須將它移入載體pCE2中。此載體含有側(cè)接立即早期CMV增強(qiáng)子的人延長(zhǎng)因子-l-a的最小啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子。該載體也含有用于哺乳動(dòng)物選擇的潮霉素B抗性標(biāo)記。PHO-G-CSF-(NNT)155xpCE2載體結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖5。驅(qū)動(dòng)CHO細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子是Pcmv/ef-la。為了進(jìn)入電穿孔的CHO細(xì)胞，用使該載體線性化。此載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有潮霉素B抗性，在細(xì)菌中生長(zhǎng)時(shí)具有氨芐青霉素抗性(bla)。構(gòu)建方法分離和凝膠純化PHO-G-CSF-(NNT)155xpBSK的1100bpA^I-5flmM片段，以產(chǎn)生此構(gòu)建物。將此構(gòu)建物連接入用WWI和Sfl/wM消化的pCE2。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)及612細(xì)胞，在LB-氨芐青霉素平板上培養(yǎng)。進(jìn)行小抽分離DNA和診斷性消化鑒定推定的克隆。進(jìn)行大規(guī)模大抽分離微克級(jí)質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞。2.B.轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的產(chǎn)生為了產(chǎn)生上述聚合物，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。此時(shí)，選擇中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。在制藥工業(yè)中廣泛采用CHO細(xì)胞來(lái)表達(dá)重組蛋白治療劑，包括G-CSF和EPO。如下所述，建立G-CSF-聚合物構(gòu)建物在CHO細(xì)胞中的表達(dá)培養(yǎng)物。貼壁培養(yǎng)物的建立用5"a/I酶使PHO-G-CSF-(NNT)155xpCE2載體線性化。沉淀消化產(chǎn)物重懸于50pLTE。將1嗎該質(zhì)粒用于電穿孔的5X1()S個(gè)CH0細(xì)胞。用含有10%FBS的Ham營(yíng)養(yǎng)混合培養(yǎng)液F-12(F-12Ham培養(yǎng)基)培養(yǎng)貼壁CHO細(xì)胞。使細(xì)胞恢復(fù)過(guò)夜，第二天加入含有700嗎/mL潮霉素B的培養(yǎng)基開(kāi)始選擇抗性細(xì)胞。在2-3周過(guò)程中，根據(jù)需要每2-3天更換一次培養(yǎng)基。分離抗性細(xì)胞集合，在潮霉素B存在下再傳代兩次。為了檢測(cè)這些細(xì)胞是否將PHO-G-CSF-(NNT)155分泌到培養(yǎng)基中，用含有少量血清(0.5%)的Ham培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3-5天。分離培養(yǎng)基用于Western印跡采用G-CSF的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖6和7為重現(xiàn)的印跡。印跡之間的差異在于圖7中對(duì)樣品還進(jìn)行過(guò)肽N糖苷酶F(PNG酶F)處理。如圖6所示，印跡顯示免疫反應(yīng)性物質(zhì)遷移到表觀分子量"95kDa處。如圖7所示，用能去除N-連接糖基化鏈的糖苷酶(PNG酶F)消化這些相同樣品，能將免疫反應(yīng)性物質(zhì)的表觀分子量降低至"49kDa。這大約對(duì)應(yīng)于未修飾的G-CSF-(NNT)155蛋白的理論大小。天然G-CSF電泳遷移至"18kDa處；將NNT聚合物添加到C-末端顯著增加了該重組聚合物分子的質(zhì)量。此種表達(dá)看起來(lái)也相當(dāng)穩(wěn)定；對(duì)于條件培養(yǎng)基中存在的未純化蛋白質(zhì)，沒(méi)有觀察到顯著的蛋白水解性降解。而且，如圖7所示，PNG酶F處理后該構(gòu)建物的分子量減小提示，該重組蛋白質(zhì)構(gòu)建物發(fā)生了顯著量的糖基化。懸浮培養(yǎng)物的建立為了有利于純化建立的CHO培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的G-CSF-(NNT)155，用化學(xué)成分確定的低蛋白、無(wú)血清培養(yǎng)基(PR0CH04-CDM，Cambrex)培養(yǎng)細(xì)胞。在使細(xì)胞適應(yīng)此培養(yǎng)基的過(guò)程中，細(xì)胞從貼壁生長(zhǎng)適應(yīng)了懸浮生長(zhǎng)。在T-185培養(yǎng)瓶中用F-12Ham+10。/。FBS培養(yǎng)細(xì)胞至接近匯合，胰酶處理，懸浮于PROCH04-CDM培養(yǎng)基。將107個(gè)細(xì)胞加入50mLPROCH04-CDM中，在T-185培養(yǎng)瓶中孵育。4-5代后，約卯％細(xì)胞不再貼壁，生長(zhǎng)成單細(xì)胞混合物和凝聚的細(xì)胞塊。對(duì)于條件培養(yǎng)基，一般用60mL新鮮PROCH04-CDM培養(yǎng)基孵育7-8mL高密度細(xì)胞培養(yǎng)物5-6天。離心培養(yǎng)液去除細(xì)胞，然后用0.2微米濾器濾清培養(yǎng)液。用western印跡定量培養(yǎng)液的G-CSF-(NNT)155產(chǎn)率(一般是100-200pg/L)，儲(chǔ)存待用。2.C.在PROCH04-CDM中表達(dá)G-CSF-NNT構(gòu)建物樣品是在PROCH04-CDM中培養(yǎng)6天的上述CHO細(xì)胞系的條件培養(yǎng)液。用抗G-CSF多克隆抗體檢測(cè)Western印跡。如圖8所示，兩種構(gòu)建物的大小與Ham培養(yǎng)液(如上所述)中所見(jiàn)相同，在G-CSF(NNT)155細(xì)胞系中沒(méi)有觀察到降解。2.D.表達(dá)的優(yōu)化在嘗試確定最大表達(dá)所需產(chǎn)物所必需的培養(yǎng)條件過(guò)程中，測(cè)試了各種化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)添加劑以及各種環(huán)境參數(shù)。以下方法導(dǎo)致蛋白質(zhì)累積增加?；瘜W(xué)添加劑雖然已知并非所有化學(xué)添加劑都能導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加，但發(fā)表的文獻(xiàn)表明，加入腺苷或AMP至2.5mM會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯；有效延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物活力，伴有蛋白質(zhì)累積增加。對(duì)CHO-介導(dǎo)的用ProCH04化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(CDM)生產(chǎn)的G-CSF-(NNT)155產(chǎn)品，檢測(cè)AMP的效果。在ProCH04CDM中加入AMP，使其終濃度為lmM。與對(duì)照相比，沒(méi)有觀察到細(xì)胞活力降低。加入AMP導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量稍有增加。環(huán)境參數(shù)溫度變化降低CHO培養(yǎng)物的培育溫度可導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平顯著提高。正如用其它蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強(qiáng)方法所見(jiàn)的那樣，觀察到的效果是由于細(xì)胞周期阻滯期間蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加所致。檢測(cè)了將重組CHO細(xì)胞系的培育溫度從37t:降低到28r的效果。雖然與37"C相比，培養(yǎng)物在28X:能在長(zhǎng)得多的時(shí)間內(nèi)維持活力，但較低溫度不能導(dǎo)致較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。適應(yīng)懸浮培養(yǎng)將CHO細(xì)胞群轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件下。用ProCH04CDM培養(yǎng)介導(dǎo)了對(duì)懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)。適應(yīng)后，在T-培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增細(xì)胞，以各種密度接種到含有ProCH05CDM的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中。在適應(yīng)ProCH05CDM懸浮培養(yǎng)過(guò)程中觀察到蛋白質(zhì)產(chǎn)量顯著增加，不論細(xì)胞處于靜態(tài)培養(yǎng)或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。不同細(xì)胞系用作宿主優(yōu)化表達(dá)的一種方法可能是采用新細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞。因此，從ATCC獲得新運(yùn)到的CHO-Kl細(xì)胞。增殖該新細(xì)胞群，在早期傳代時(shí)保存一部分以備將來(lái)使用。用這種明確的培養(yǎng)物來(lái)產(chǎn)生表達(dá)感興趣重組蛋白的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系。簡(jiǎn)言之，用感興趣載體(轉(zhuǎn)染)電穿孔的CHO-Kl細(xì)胞，選擇穩(wěn)定表達(dá)潮霉素的細(xì)胞。分離到92個(gè)集落，評(píng)價(jià)感興趣重組蛋白的表達(dá)。許多這些集落的表達(dá)水平顯著高于上述原始轉(zhuǎn)染細(xì)胞群的表達(dá)水平。結(jié)果用lmMAMP處理培養(yǎng)物時(shí)，觀察到表達(dá)有非常輕微的增加。降低培養(yǎng)溫度能提高培養(yǎng)物壽命，但不會(huì)增加蛋白質(zhì)表達(dá)。適應(yīng)ProCH05CDM懸浮培養(yǎng)條件后，該重組蛋白的表達(dá)顯著提高。另外，ATCC-確定的CHO-K1細(xì)胞系產(chǎn)生的分離克隆表達(dá)所需蛋白質(zhì)的水平顯著高于原始的分離細(xì)胞群。實(shí)施例3G-CSF-(NNT)155偶聯(lián)物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)了G-CSF-(NNT)155蛋白偶聯(lián)物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。包括了三種其它化合物作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照是Neulasta(PEG-G-CSF)、Neupogen(rh-G-CSF)和G-CSF化合物。通過(guò)以下方法測(cè)試該化合物單次靜脈內(nèi)(i.v.)給予小鼠，給藥后72小時(shí)收集血液。用ELISA法分析血槳。3.A.分析方法該試驗(yàn)采用定量夾心酶免疫試驗(yàn)技術(shù)。用G-CSF特異性單克隆抗體預(yù)先包被微孔板。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入各孔。該固定的抗體結(jié)合存在的G-CSF。洗掉未結(jié)合物質(zhì)后，將G-CSF特異性酶聯(lián)多克隆抗體加入各孔。洗去未結(jié)合的抗體-酶試劑后，將底物溶液加入各孔，產(chǎn)生的顏色與最初步驟中結(jié)合的G-CSF量成正比。終止發(fā)色，測(cè)定顏色強(qiáng)度。試劑采用以下試劑和材料G-CSF微孔板用抗G-CSF的鼠單克隆抗體包被96孔聚苯乙烯微孔板(12X8)。G-CSF偶聯(lián)物21mL偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的抗G-CSF多克隆抗體，含有防腐劑。G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品2小瓶用基礎(chǔ)蛋白質(zhì)(proteinbase)緩沖液配制的重組人G-CSF(25ng/mL)，含有防腐劑，凍干。試驗(yàn)稀釋液RD1A:llmL含有防腐劑的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)緩沖液。校準(zhǔn)稀釋液RD5:21mL含有防腐劑的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)緩沖液。用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品。校準(zhǔn)稀釋液RD6A:21mL含有防腐劑的動(dòng)物血清。用于血清/血漿樣品。濃縮洗滌緩沖液21mL含有防腐劑的表面活性劑緩沖液的25倍濃縮溶液。顯色試劑A:12.5mL穩(wěn)定的過(guò)氧化氫液。顯色試劑B:12.5mL穩(wěn)定的色原(四甲基聯(lián)苯胺)液。終止溶液6mL2N硫酸。平板覆蓋物4條粘膠帶。試劑制備用去離子水或蒸餾水稀釋20mL濃縮洗滌緩沖液，以制備500mL洗滌緩沖液。用1mL去離子水或蒸餾水重建G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品。此重建產(chǎn)生25000pg/mL的母液。將G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品溫和振蕩最少15分鐘，然后進(jìn)行稀釋。將2500pg/mL的900[iL校準(zhǔn)稀釋液RD6A移入一試管中。將600pL同一稀釋液移入其余4個(gè)試管中。用母液制備以下連續(xù)稀釋液25000pg/mL(l:10)—2500pg/mL，25000pg/mL(l:3)—833.3pg/mL(l:3)—277.8pg/mL(l:3)—92.6pg/mL(l:3)—30.9pg/mL。徹底混合各試管內(nèi)容物，然后進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)移。2500pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品用作高標(biāo)準(zhǔn)品。校準(zhǔn)稀釋液RD6A用作零標(biāo)準(zhǔn)品(Opg/mL)。用6個(gè)點(diǎn)2500-833.3-277.8-92.6-30.9-0pg/mL各點(diǎn)兩復(fù)孔制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于底物溶液，臨用前15分鐘內(nèi)將等體積顯色試劑A和B混合在一起。該試劑需避光保存。試驗(yàn)步驟臨用前將所有試劑和樣品移入室溫。制備所有試劑和工作標(biāo)準(zhǔn)品。將100pL試驗(yàn)稀釋液RD1A加入各孔，各孔還加入100pL標(biāo)準(zhǔn)品和適當(dāng)體積的樣品。用粘膠帶覆蓋各孔，室溫孵育2小時(shí)。吸出各孔液體，用400nL洗滌緩沖液洗滌，重復(fù)兩次，總共洗滌三次。最后一次洗滌后，吸出或傾析去除殘留的洗滌緩沖液。倒轉(zhuǎn)平板，在干凈的紙巾上拍干。各孔加入200pLG-CSF偶聯(lián)物。用新粘膠帶覆蓋各孔。室溫孵育各孔2小時(shí)。重復(fù)上述吸出/洗滌過(guò)程。各孔加入200pL底物溶液。室溫下孵育各孔20分鐘。各孔需避光保存。然后，將50pL終止溶液加入各孔。最后，用設(shè)定為450nm、570nm校正(OD450nm-OD570nm)的微孔板閱讀器(VersaMax-MolecularDevice)測(cè)定30分鐘內(nèi)各孔的光密度。藥代動(dòng)力學(xué)分析采用非區(qū)室藥代動(dòng)力學(xué)分析(WINNonLin軟件版本4.1)。觀察或計(jì)算各GCSF構(gòu)建物的以下主要參數(shù)tf為可檢測(cè)到各化合物濃度的最后時(shí)間；^為與表觀末期相關(guān)的表觀末期速率常數(shù)，通過(guò)曲線的單次冪末端部分血漿濃度的對(duì)數(shù)與時(shí)間的線性回歸分析估計(jì)；t^為表觀末期半衰期，按照以下公式計(jì)算11/2，2=111(2)/^;AUC為從零時(shí)間點(diǎn)室無(wú)限時(shí)的血漿濃度-時(shí)間的曲線下面積；AUC/D為每單位劑量血漿濃度-時(shí)間的曲線下面積；MRT為平均滯留時(shí)間，根據(jù)一階曲線的曲線下面積AUMC與AUC的比例計(jì)算；CL為全身清除率，通過(guò)CL-D/AUC計(jì)算；Vss為穩(wěn)態(tài)分布容積，通過(guò)VsfCI^MRT計(jì)算。結(jié)果如表9所示，小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，G-CSF-(NNT)155的半衰期(6.2h)比G-CSF對(duì)照(1.53小時(shí))、NEUPOGEN化合物(1.13小時(shí))或NEULASTA化合物(3.04小時(shí))長(zhǎng)。與所有三個(gè)對(duì)照相比，G-CSF-(NNT)155的較長(zhǎng)的半衰期對(duì)應(yīng)于更持久的作用。觀察到G-CSF-(NNT)155相應(yīng)的全身清除率顯著降低，即9.5mL/h/kg全身清除率。與對(duì)照相比，含有本文所述氨基酸延伸物的其它偶聯(lián)物的半衰期縮短。實(shí)施例4G-CSF-(NNT)155偶聯(lián)物的生物利用度和效率中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)低為嗜中性粒細(xì)胞減少癥，是一種抗感染力嚴(yán)重?fù)p傷的疾病。為了刺激外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，可用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥或與其它刺激因子聯(lián)用收集移植用細(xì)胞。測(cè)定部分純化的G-CSF-(NNT)155、PEG-G-CSF(NEULASTA)禾卩rh-G-CSF(NEUPOGEN)的生物利用度，通過(guò)i.v.(靜脈內(nèi))和s.c.(皮下)給藥進(jìn)行比較。NEUPOGEN化合物是一種重組甲硫氨酰人G-CSF。NEULASTA化合物是一種重組甲硫氨酰人G-CSF與單甲氧基聚乙二醇的共價(jià)偶聯(lián)物。如上所述，G-CSF-(NNT)155是G-CSF的氨基酸延長(zhǎng)和/或糖基化形式。4.A.通過(guò)ELISA檢測(cè)生物利用度為了評(píng)價(jià)G-CSF-(NNT)155的生物利用度，通過(guò)i.v.和s.c.注射給予小鼠G-CSF-(NNT)155、PEG-G-CSF和rh-G-CSF獲得的血漿樣品進(jìn)行ELISA分析。試驗(yàn)和對(duì)照樣品如下部分純化的G-CSF-(NNT)115、PEG-G-CSF(NEULASTA)、rh-G-CSF(NEUPOGEN)和載體對(duì)照(150mMNaCl+20mMNaOAc+0.004%吐溫-20);各自以可接受的方式通過(guò)指定的i.v.和s.c.給予動(dòng)物而制備。通過(guò)i.v和s.c.給予小鼠一定劑量的G-CSF-(NNT)155、PEG-G-CSF、rh-G-CSF(各自劑量為125pg/kg)和載體對(duì)照。分離小鼠血漿樣品。如果要，稀釋小鼠血漿樣品。然后，用G-CSFELISA分析小鼠樣品。通過(guò)ELISA分析血漿樣品的主要目的僅僅是定性、而非定量(即不須獲得極準(zhǔn)確的血漿水平濃度)。G-CSFELISA結(jié)果提供了血漿中存在試驗(yàn)樣品的肯定定性結(jié)果，或血槳中不存在試驗(yàn)樣品的否定定性結(jié)果。用兩種稀釋度一式三份的血漿樣品進(jìn)行分析。結(jié)果是，靜脈內(nèi)給予G-CSF-(NNT)155后72小時(shí)仍可檢測(cè)到，而PEG-G-CSF僅24小時(shí)可檢測(cè)到。此外，皮下給予G-CSF-(NNT)155和PEG-G-CSF后72小時(shí)可檢測(cè)到?？稍?5分鐘和2小時(shí)的取樣時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到皮下給予的rh-G-CSF。4.B.G-CSF-(NNT)155和PEG-G-CSF對(duì)小鼠造血功能的影響的單劑量比較在G-CSF-(NNT)155生物利用度和效力的另一次評(píng)價(jià)中，對(duì)獲自通過(guò)i.v.和s.c.給予一定劑量的G-CSF-(NNT)155、PEG-G-CSF和rh-G-CSF的小鼠的血漿樣品進(jìn)行了包括白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定的血液學(xué)分析。試驗(yàn)和對(duì)照樣品與上述G-CSFELISA評(píng)價(jià)相同。獲得血漿樣品的步驟也與G-CSFELISA評(píng)價(jià)相同。血液學(xué)分析結(jié)果如下。經(jīng)i.v.和s.c.給藥時(shí)，載體對(duì)照的白細(xì)胞計(jì)數(shù)平均數(shù)據(jù)范圍分別是0.76X103/^L至4.35X103^iL和1.27X103/|iL至4.25X103/|iL。經(jīng)i.v.禾卩s.c.給藥時(shí)，載體對(duì)照的平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的范圍分別是O.UXIOV^L至0.55X103/nL和0.29X1034iL至0.35X103^iL。G-CSF-(NNT)155的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的1.44X10L增加到i.v.給藥后72小時(shí)的11.45X1034iL。G-CSF-(NNT)155的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的3.15X103/|iL增加到s.c.給藥后72小時(shí)的11.45X1034iL。相似地，G-CSF-(NNT)155的平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)從給藥后15分鐘的0.04X10L增加到i.v.給藥后72小時(shí)的4.24X103/pL。G-CSF-(NNT)155的平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的0.25X10、L增加到給藥后72小時(shí)的2.04X103/nL，在s.c.給藥120小時(shí)后下降到0.14X1034iL。PEG-G-CSF(Neulasta)的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的1.36X103/&增加到給藥后24小時(shí)的6.03X103/^iL，然后在i.v.給藥后72小時(shí)降低到3.01X103/|iiL。PEG-G-CSF(Neulasta)的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的1.47X1034iL增加到給藥后24小時(shí)的4.58X103/^iL，然后在s.c.給藥120小時(shí)后下降到2.47X103/|iL。PEG-G-CSF(Neulasta)的平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的0.05X10VnL增加到給藥后24小時(shí)的1.83X103L，然后在i.v.給藥后72小時(shí)降低到0.20X103/pL。PEG-G-CSF(Neulasta)的平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的0.18X10VpL增加到給藥后24小時(shí)的1.04X10V^L，然后在s.c.給藥120小時(shí)后下降到0.22X10、L。rh-G-CSF(Neupogen)的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的1.30X103/^iL下降到s.c.給藥后2小時(shí)的1.19X10、L。rh-G-CSF(Neupogen)的平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)從給藥后15分鐘的0.11X103/nL增加到s.c.給藥后2小時(shí)的0.49X103/^iL。此結(jié)果表明，給藥后72小時(shí)，靜脈內(nèi)給予G-CSF-(NNT)155顯著提高了白細(xì)胞計(jì)數(shù)，與絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加直接相關(guān)。這意味著，其增加超過(guò)了載體對(duì)照的白細(xì)胞計(jì)數(shù)約260%。相似地，給藥后72小時(shí)，s.c.給予G-CSF-(NNT)155引起的白細(xì)胞計(jì)數(shù)平均增加量超過(guò)了載體對(duì)照和PEG-G-CSF的平均增加量約295%。然而，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在給藥后120小時(shí)回到載體對(duì)照和PEG-G-CSF的水平。在一些實(shí)施方式中，所述肽含有序列NNT、NNNNT或NNNNNT，n是約150-160的一個(gè)整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，所述生物活性蛋白質(zhì)是G-CSF。本說(shuō)明書(shū)引用的所有發(fā)表文獻(xiàn)代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有這些發(fā)表物納入本文作參考的程度如同特別和單獨(dú)將所述各發(fā)表物納入作參考的那樣。雖然參照具體實(shí)施方式描述了本文所述的本發(fā)明，但是應(yīng)理解，這些實(shí)施方式僅說(shuō)明了本發(fā)明的原理和應(yīng)用。因此應(yīng)理解，可對(duì)本文說(shuō)明性實(shí)施方式作出許多修改，可設(shè)計(jì)其它安排，而不背離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明構(gòu)思和范圍。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>SSNNN、SNS麗、SNNSN、SNNNS、NSSNN、NSNSN、NS麗S、麗SSN、麗SNS、NNNNNS、SNNNNN、NSNNNN、麗SNNN、NNNS麗、NNNNSN、NNNNSS、SSNNNN、SNSNNN、S麗S麗、SNNNSN、SNNNNS、NSSNNN、NSNS麗、NS麗SN、NSNNNS、NNSSNN、麗SNSN、麗S麗S、NNNSSN、NNNSNS、NNKNSSS、SSSNNNN、SNSSNNN、SNSNS麗、SNS順SN、SNSNNNS、S麗SS麗、S麗SNSN、SNNS麗S、SNNNSNS、SNNNSSN、SNNNNSS、SSNSNNN、SS麗S麗、SSNNNSN、SSNNNNS、NSSSNNN、NSSNS麗、NSSNNSN、NSSNNNS、NSNSSNN、NS麗SSN、NSNNNSS、NSNSNSN、NSNSNNS、NS麗SNS、麗SSSNN、麗SSNSN、麗SS麗S、NNSNSSN、麗SNSNS、NNS麗SS、NNNSSSN、NNNSSNS、NNNSNSS、NNNNNSS、SSN1NNNN、SNSNNNN、S麗SNNN、SNNNSNN、SNNKNSN、SNNNNNS、NSSNNNN、NSNSNNN、NS雨SNN、NSNNNSN、NSNNNNS、麗SSNNN、麗SNS麗、NNSNNSN、順SNNNS、NNNSS麗、NNNSNSN、NNNS麗S、NNNNSSN、NNNNSNSNNNNNNS、SNNNNNN、NSNNNNN、NNSNNNN、NNNSNNN、NNNNS麗、NNNNNSN、麗Q、Q麗、NQN、NNNQ、QNNN、NQ麗、麗QN、NNNNQ、QNNNN、NQNNN、NNQ麗、NNNQN、NNNQQ、QQNNN、QNQ麗、Q麗QN、QNNNQ、NQQ麗、NQNQN、NQNNQ、NNQQN、麗QNQ、NNNNNQ、QNNNNN、NQNNNN、NNQNNN、NNNQNN、NNNNQN、NNNNQQ、QQNNKN、QNQNNN、QNNQ麗、QNNNQN、QNNNNQ、NQQNNN、NQNQ麗、NQ麗QN、NQNNNQ、蘭QQ麗、麗QNQN、麗Q麗Q、NNNQQN、NNNQNQ、NNNNQQQ、QQQNNNN、QNQQNNN、QNQNQ麗、QNQ麗QN、QNQNNNQ、QNNNQNQ、QQNKNNQ、NQNNQQN、麗QQNQN、NNNQQNQ、QNNNQNN、NQNNNQN、NNNQQ麗、NNNNQNQNNNNNNQ、QNNNNNN、NNNNQ麗、NNNNNQN、麗E、E麗、NEN、NNNE、ENNN、NENN、NNEN、NNNNE、ENNNN、NENNN、NNENN、NNNEN、NNNEE、EENNN、ENE亂E麗EN、ENNNE、NEE麗、NENEN、NE麗E、麗EEN、麗ENE、NNNNNE、ENNNNN、NENNNN、NNENNN、NNNE麗、NNNNEN、NNNNEE、EENNNN、ENENNN、E麗E麗、ENNNEN、ENNNNE、NEENNN、NENE麗、NE麗EN、36QNNQQ麗、QQNQNNN、NQQ麗QN、NQNQNNQ、麗QNQNQ、QQNNNNN、NQQNNNN、麗QNQ麗、NNNNQQN-NNNQNNN、Q麗QNQN、QQ麗Q麗、NQQNNNQ、NQ麗QNQ、麗QNNQQ、QNQNNNN、NQNQNNN、NNQ麗QN、QNNQ麗Q、QQNNNQN、NQNQQ麗、麗QQQNN、NNNQQQN、QNNQNNN、NQNNQNN、QNNNQQN、NQQQNNN、NQNNNQQ、NNQQ麗Q、NNNQNQQ、QNNNNQN、NQNNNNQ'NNNQNQN、NQNNKNN、QNNNNQQ、NQQNQ麗、NQNQNQN、NNQNQQN、NNNNNQQ、QNNNNNQ、NNQQNNN、NNNQ麗Q、麗QNNNN、NENNNE、麗EENN、NNENEN、NNENNE、NNNEEN、NNNENE、NNNNEEE、EEENNNN、ENEENNN、ENENENN、ENE麗EN、ENENNNE、E麗EE麗、E麗ENEN、E麗E麗E、ENNNENE、ENNNEEN、ENNNNEE、EENENNN、EE麗E麗、EENNNEN、EENNNNE、NEEENNN、NEENENN、NEENNEN、NEENNNE、NENEE麗、NE麗EEN、NENNNEE、NENENEN、NENE麗E、NE麗ENE、麗EEENN、NNEENEN、麗EENNE、麗ENEEN、NNENENE、NNENNEE、NNNEEEN、NNNEENE、NNNENEE、NNNNNEE、EENNNNN、ENENNNN、ENNENNN、ENNNE麗、ENNNNEN、ENNNNNE、NEENNNN、NENENNN、NE麗E麗、NENNNEN、NENXNNE、麗EENNN、麗ENE麗、麗E麗EN、NNENNNE、NNNEE麗、NNNENEN、NNNENNE、NNNNEEN、NNNNENE.NNNNNNE、ENNNNKN、NENNNNN、麗ENHNN、NNNENNN、NNNNE麗、NNNNNEN、NNH、HNN、NHN、NNNH、HNNN、NHNN、NNHN、NNNNH、HNNNN、NHNNN、NNHNN、NNNHN、NNNHH、HHNNN、HNHNN、HNNHN、HNNNH、NHHNN、NHNHN、NHNNH、麗HHN、麗HNH、NNNNNH、HNNNNN、NHNNNN、麗HNNN、NNNHNN、NNNNHN、NNNNHH、HHNNNN、HNHNNN、HNNHNN、HNNNHN、HNNNNH、NHHNNN、NHNHNN、NHNNHN、NHNNNH、麗HHNN、麗HNHN、NNHNNH、NNNHHN、NNNHNH、NNNNHHH、HHHNNNN、HNHHNNN、HNHNHNN、HNHNNHN、HNHNNNH、HNNHHNN、HNNHNHN、HNNHNNH、HNNNHNH、HNNNHHN、HNNNNHH、HHNHNNN、HHNNHNN、HHNNNHN、HHNNNNH、麗HHNNN、NHHNHNN、麗HNNHN、麗HNNNH、NHNHHNN、NHNNHHN、NHNNNHH、NHNHNHN、NHNHNNH、NHNNHNH、NNHHHNN、麗HHNHN、NNHHNNH、—麗HNHHN、NNHNHNH、NNHNNHH、NNNHHHN、NNNHHNH、NNNHNHH、NWWNHH、HHNNNNN、HNHNNNN、HNNHNNN、HNNNHNN、HNNNNHN、HNNNNNH、NHHNNNN、NHNHNNN、NHNNHNN、NHNNNHN、NHNNNNH、NNHHNNN、麗HNHNN、NNHNNHN、NNHNNNH、NNNHHNN、NNNHNHN、NNNHNNH、NNNNHHN、NNNNHNHNNNNNNH、HNNNNNN、NHNNNNN、NNHNNNN、NNNHNNN、NNNNHNN、NNNWfHN、麗D、DNN、NDN、NNND、DNNN、ND亂NNDN、NNNND、DNNNN、NDNNN、NND麗、NNNDN、NNNDD、DDNNN、DND麗、D麗DN、DNNND、NDD麗、NDNDN、ND麗D、NNDDN、NNDND、NNNNND、DNNNNN、NDNNNN、麗DNNN、NNNDNN、NNNNDN、NNNNDD、DDNNNN、DNDNNN、DNNDNN、DNNNDN、DNNNND、NDDNNN、NDND麗、NDNNDN、NDNNND、麗DDNN、麗DNDN、NNDNND、NNNDDN、NNNDND、NNNNDDD、DDDNNNN、DNDDNNN、DNDND順、DND麗DN、DNDNNND、DNNDD麗、DDNDN、DDNND、DNNNDND、DNNNDDN、DNNNNDD、DDNDNNN、DDNND、DDNNNDN、DDNNNND、NDDDNNN、NDDNDNN、NDDDN、NDDNNND、NDNDD、NDNND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GCNAAY-GCN-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY陽(yáng)AAY-GCN-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-GCN-GCNGCN-AAY-GCN-AAY-AAY-AAYGCN-AAY-AAY-AAY-GCN-AAYAAY-GCN-GCN-AAY-AAY-AAYAAY-GCN國(guó)AAY-AAY-GCN-AAYAAY-AAY-GCN-GCN-AAY-AAYAAY-GCN-AAY-AAYGCN-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-GCN隱AAYGCN-AAY-GCN-AAY隱AAYAAY-GCN-GCN隱AAY-AAYAAY-AAY垂GCN-GCN-AAY、AAY-AAY陽(yáng)AAY-GCN、AAY-AAY-GCN-AAY、AAY-GCN-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY陽(yáng)GCN-GCN、GCN-AAY-AAY隱GCN-AAY、AAY-GCN-AAY國(guó)GCN-AAY、AAY-AAY隱GCN-AAY國(guó)GCN、GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-GCN-AAY-AAY國(guó)AAY、AAY-AAY-AAY誦AAY-GCN-AAY、GCN-GCN-AAY-AAY-AAY-AAY、GCN-AAY-AAY-GCN-AAY-AAY、GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-GCN、AAY陽(yáng)GCN陽(yáng)AAY-GCN陽(yáng)AAY-AAY、AAY-GCN-AAY-AAY-AAY-GCN、AAY陽(yáng)AAY-GCN-AAY-GCN-AAY、AAY-AAY-GCN-AAY-AAY-G門(mén)NAAY-AAY-AAY-GCN-AAY-GCN,G門(mén)N-GCN-GCN-AAY-AAY-AAY-AAYG門(mén)N-AAY-GCN-AAY-GCN-AAY-AAYG門(mén)N-AAY-GCN-AAY-AAY-AAY-G門(mén)NG門(mén)N-AAY-AAY-GCN-AAY-GCN-AAYG門(mén)N-AAY-AAY-AAY-GCN-AAY-G門(mén)NG門(mén)N-AAY-AAY-AAY-AAY-GCN-G門(mén)NG門(mén)N-GCN-AAY-AAY-GCN-AAY-AAYG門(mén)N曙GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-GCNAAY-GCN-GCN-AAY-GCN-AAY-AAYAAY-GCN-GCN-AAY-AAY-AAY-G門(mén)NAAY-GCN-AAY-AAY-GCN-GCN-AAYAAY-GCN-AAY-GCN-AAY-GCN-AAYAAY-GCN-AAY-AAY-GCN-AAY-G門(mén)NAAY-AAY-GCN-GCN-AAY-GCN-AAYAAY-AAY-GCN-AAY-GCN-GCN-AAYAAY-AAY-GCN-AAY-AAY-GCN-GONAAY-AAY-AAY-GCN-GCN-AAY-G門(mén)NAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GCN-G門(mén)NG門(mén)N-AAY-GCN曙AAY-AAY-AAY-AAYG門(mén)N-AAY-AAY-AAY-GCN-AAY-AAYG門(mén)N-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GCNAAY-GCN-AAY闘GCN-AAY-AAY-AAYAAY-GCN-AAY-AAY-AAY-GCN-AAYAAY-AAY-GCN-GCN-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-GCN-AAY-AAY-GCN-AAYAAY-AAY-AAY-GCN-GCN-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-GCN-AAY-AAY-GCNAAY-AAY-AAY-AAY-GCN-AAY-G門(mén)N-GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-GCN-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-GCN-AAY-AAYyAAY-AAY-AGYyAGY-AAY-AAY,AAY-AAY-AAY-GCN-GCN-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-GCN-GCN-G門(mén)N7GCN-AAY-GCN-GCN-AAY-AAY-AAY"GCN-AAY-GCN-AAY-AAY-GCN-AAY>GCN-AAY-AAY-GCN-GCN-AAY-AAY>GCN-AAY-AAY-GCN-AAY-AAY-G門(mén)N,GCN-AAY-AAY-AAY-GCN-GCN-AAY>GCN-GCN-AAY-GCN-AAY-AAY-AAY,GCN-GCN-AAY-AAY-AAY-GCN曙AAY>AAY-GCN-GCN-GCN-AAY-AAY-AAY,AAY-GCN-GCN-AAY-AAY-GCN-AAY>AAY-GCN-AAY-GCN-GCN-AAY-AAY,AAY-GCN-AAY-AAY-AAY-GCN-G門(mén)NyAAY-GCN-AAY-GCN-AAY-AAY-G門(mén)N,AAY-AAY-GCN-GCN-GCN-AAY-AAYzAAY-AAY-GCN-GCN-AAY-AAY-GCN,AAY-AAY-GCN-AAY-GCN-AAY-G門(mén)N一AAY-AAY-AAY-GCN-GCN-GCN-AAYzAAY-AAY-AAY-GCN-AAY-GCN-OGN>GCN-GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY>GCN-AAY-AAY-GCN-AAY-AAY-AAYyGCN-AAY-AAY-AAY-AAY-GCN-AAY>AAY-GCN-GCN-AAY-AAY-AAY-AAY一AAY-GCN-AAY-AAY-GCN-AAY-AAY7AAY-GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-GCN,AAY-AAY-GCN-AAY-GCN-AAY-AAY,AAY-AAY-G門(mén)N-AAY-AAY-AAY-GC:N,AAY-AAY-AAY-GCN-AAY-GCN-AAY>AAY-AAY-AAY-AAY-GCN-GCN-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-G門(mén)N>AAY-GCN-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY,AAY-AAY-AAY-GCN-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GCN-AAYsAAY-AGY-AAY.AAY-AAY-AAY-AGYAGY-AAY墨AAY-AAY、AAY-AAY-AAY國(guó)AAY-AGYAAY-AAY-AGY-AAY-AAYAGY-AGY-AAY-AAY-AAYAGY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY-AGY陽(yáng)AAY-AAY陽(yáng)AGYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY隱AGY-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AGY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-AGY陽(yáng)AGYAGY-AAY-AGY-AAY-AAY-AAYAGY-AAY扁AAY-AAY-AGY-AAYAAY-AGY扁AGY-AAY-AAY-AAYAAY-AGY隱AAY-AAY扁AGY-AAYAAY-AAY-AGY-AGY-AAY-AAYAAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AGYAAY-AAY-AAY-AGY-AAY-AGYAGY-AGY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAYAGY-AAY-AGY-AAY-AGY-AAY-AAYAGY-AAY-AGY-AAY-AAY-AAY-AGYAGY-AAY-AAY-AGY-AAY-AGY-AAYAGY-AAY-AAY-AAY-AGY-AAY-AGY.AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGY-AGYAGY-AGY-AAY-AAY-AGY-AAY-AAYAGY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY-AGY-AGY-AAY-AGY墨AAY-AAYAAY-AGY-AGY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AGYAAY-AGY-AAY-AAY-AGY-AGY-AAYAAY-AGY-AAY-AGY-AAY-AGY-AAYAAY-AGY-AAY-AAY-AGY-AAY-AGYAAY-AAY-AGY-AGY-AAY國(guó)AGY-AAYAAY-AAY墨AGY-AAY-AGY-AGY-AAYAAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AGY-AGYAAY誦AAY-AAY-AGY-AGY-AAY-AGYAAY-AAY-AGY-AAY、AAY-AGY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AGY-AGY、AGY-AAY-AAY-AGY-AAY、AAY-AGY-AAY-AGY-AAY、AAY-AAY陽(yáng)AGY-AAY-AGY、AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY陽(yáng)AAY-AAY-AGY-AAY、AGY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAY、AGY-AAY-AAY-AGY國(guó)AAY-AAY、AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGY、AAY-AGY-AAY-AGY-AAY-AAY、AAY隱AGY-AAY-AAY-AAY-AGY、AAY-AAY-AGY-AAY陽(yáng)AGY-AAY、AAY-AAY-AAY-AGY-AGY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AGY-AGY-AGY、AGY-AAY-AGY-AGY-AAY-AAY-AAY、AGY-AAY-AGY陽(yáng)AAY-AAY陽(yáng)AGY-AAY、AGY-AAY-AAY-AGY-AGY-AAY-AAY、AGY-AAY-AAY-AGY陽(yáng)AAY-AAY-AGY、AGY-AAY-AAY-AAY-AGY-AGY-AAY、AGY-AGY-AAY-AGY-AAY陽(yáng)AAY-AAY、AGY-AGY-AAY-AAY墨AAY-AGY-AAY、AAY-AGY-AGY-AGY隱AAY-AAY-AAY、AAY-AGY-AGY-AAY-AAY-AGY-AAY、AAY-AGY-AAY-AGY-AGY-AAY-AAY、AAY陽(yáng)AGY-AAY-AAY-AAY-AGY-AGY、AAY-AGY-AAY-AGY-AAY-AAY-AGY、AAY隱AAY-AGY-AGY-AGY-AAY-AAY、AAY-AAY-AGY-AGY-AAY陽(yáng)AAY-AGY、AAY-AAY-AGY-AAY-AGY-AAY-AGY、AAY-AAY-AAY-AGY-AGY-AGY-AAY、AAY-AAY-AAY-AGY層AAY-AGY-AGY、AAY-AGY-AAY-AAY、、AGY-AAY國(guó)AAY-AAY-AAY、、AAY-AAY陽(yáng)AAY-AGY-AAY、、AGY隱AAY-AGY-AAY-AAY、、AAY-AGY-AGY-AAY-AAY、、AAY-AAY-AGY-AGY-AAY、AAY-AAY陽(yáng)AAY-AAY-AAY-AGY-AGYAGY-AAY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAYAGY-AAY-AAY-AAY-AGY-AAY-AAYAGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY-AGY隱AAY-AGY-AAY-AAY-AAYAAY-AGY-AAY-AAY-AAY-AGY-AAYAAY-AAY-AGY-AGY-AAY層AAY-AAYAAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AGY-AAYAAY-AAY-AAY-AGY隱AGY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AGYAAY-AAY-AAY-AAY-AGY-AAY-AGY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AGY誦AAY陽(yáng)AAY-AAY-AAYAGY-AGY-AAY-AAY-AAY層AAY-AAYAGY-AAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AAYAGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGY-AAYAAY-AGY-AGY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AAYAAY-AGY-AAY-AAY-AGY-AAY-AAYAAY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY-AAY-AGY-AAY-AGY-AAY-AAYAAY-AAY-AGY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY-AAY-AAY-AGY陽(yáng)AAY-AGY-AAYAAY-AAY國(guó)AAY-AAY誦AGY-AGY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGYAAY-AGY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY國(guó)AAY-AGY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AGY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AGY腳AAY含有3-7個(gè)氨基酸殘基的肽基序的寡核苷酸，該肽基序含N(天冬酰胺)作為主要組件、O(谷氨酰胺)作為次要組件AAY-AAY-CAR、CAR-AAY-AAYAAY-CAR陽(yáng)AAYCAR-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-CARAAY-AAY-CAR-AAY-AAYCAR-CAR-AAY-AAY-AAYCAR陽(yáng)AAY-AAY-AAY-CARAAY-CAR-AAY-AAY-CARAAY誦AAY隱AAY-AAY陽(yáng)AAY誦CARAAY-CAR-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY陽(yáng)AAY-CAR-AAY陽(yáng)AAYAAY-AAY-AAY-AAY-CAR-CARCAR-AAY-CAR-AAY-AAY-AAYCAR-AAY-AAY-AAY-CAR-AAYAAY-CAR-CAR-AAY-AAY-AAYAAY-CAR-AAY-AAY-CAR-AAYAAY-AAY-CAR-CAR-AAY-AAYAAY-AAY-CAR-AAY-AAY-CARAAY隱AAY-AAY-CAR-AAY-CARAAY-CAR隱AAY-AAYCAR-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-CAR-AAYCAR-AAY-CAR-AAY-AAYAAY-CAR陽(yáng)CAR-AAY-AAYAAY-AAY-CAR-CAR-AAY、AAY-AAY-AAY-CAR、AAY-AAY-CAR-AAY、AAY-CAR-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-CAR-CAR、CAR-AAY-AAY-CAR-AAY、AAY-CAR陽(yáng)AAY-CAR-AAY、AAY-AAY-CAR-AAY-CAR、CAR-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-CAR-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY隱CAR-AAY、CAR-CAR-AAY-AAY-AAY-AAY、CAR-AAY-AAY-CAR-AAY-AAY、CAR-AAY-AAY-AAY-AAY-CAR、AAY-CAR-AAY-CAR-AAY-AAY、AAY-CAR-AAY-AAY-AAY-CAR、AAY-AAY-CAR-AAY-CAR-AAY、AAY-AAY-AAY-CAR-CAR-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-CAR-CAR-CAR、76<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>含有3-7個(gè)氨基酸殘基的肽基序的寡核苷酸，該肽基序含N(天冬酰胺)作為主要組件、E(谷氨酸)作為次要組件GAR-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-GARAAY-AAY-GAR-AAY-AAYGAR-GAR-AAY-AAY-AAYGAR-AAY-AAY-AAY-GARAAY-GAR-AAY-AAY-GARAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GARAAY-GAR-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAR-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY隱GAR-GARGAR-AAY-GAR-AAY-AAY-AAYGAR-AAY-AAY-AAY-GAR-AAYAAY-GAR-GAR-AAY-AAY-AAYAAY-GAR-AAY-AAY-GAR-AAYAAY-AAY-GAR-GAR-AAY-AAYAAY-AAY-GAR陽(yáng)AAY-AAY-GARAAY-AAY-AAY-GAR-AAY-GARGAR-GAR-GAR-AAY陽(yáng)AAY-AAY-AAYGAR-AAY-GAR-AAY-GAR-AAY-AAYGAR-AAY-GAR陽(yáng)AAY-AAY-AAY-GARGAR-AAY-AAY-GAR-AAY-GAR-AAYGAR-AAY-AAY-AAY-GAR-AAY-GARGAR-AAY誦AAY-AAY-AAY-GAR-GARGAR-GAR-AAY-AAY陽(yáng)GAR-AAY-AAYGAR-GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-GARAAY-GAR-GAR-AAY-GAR-AAY-AAYAAY隱GAR-GAR-AAY-AAY-AAY-GARAAY-GAR陽(yáng)AAY-AAY-GAR-GAR-AAYAAY陽(yáng)GAR-AAY-GAR-AAY-GAR-AAYAAY-GAR-AAY-AAY-GAR-AAY-GARAAY-AAY-GAR-GAR-AAY-GAR-AAYAAY-AAY-GAR-AAY-GAR-GAR-AAYAAY-AAY-GAR-AAY-AAY-GAR-GARAAY-AAY-AAY-GAR-GAR-AAY-GARAAY-AAY-GAR-AAY、AAY-GAR-AAY-AAY-AAY、AAY陽(yáng)AAY-AAY-GAR-GAR、GAR-AAY-AAY-GAR-AAY、AAY-GAR-AAY-GAR-AAY、AAY-AAY-GAR-AAY-GAR、GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY國(guó)GAR-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-GAR-AAY、GAR-GAR-AAY-AAY-AAY-AAY、GAR-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY、GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-GAR、AAY-GAR-AAY-GAR-AAY-AAY、AAY-GAR-AAY-AAY-AAY隱GAR、AAY-AAY-GAR-AAY-GAR-AAY、AAY-AAY-AAY-GAR-GAR-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-GAR-GAR-GAR、GAR-AAY-GAR-GAR-AAY-AAY-AAY、GAR陽(yáng)AAY-GAR-AAY-AAY-GAR陽(yáng)AAY、GAR-AAY陽(yáng)AAY-GAR-GAR-AAY-AAY、GAR-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY-GAR、GAR-AAY-AAY-AAY-GAR-GAR-AAY、GAR-GAR-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY、GAR-GAR-AAY-AAY-AAY-GAR-AAY、AAY-GAR-GAR-GAR-AAY-AAY-AAY、AAY-GAR-GAR-AAY-AAY陽(yáng)GAR-AAY、AAY-GAR陽(yáng)AAY-GAR匿GAR陽(yáng)AAY-AAY、AAY-GAR-AAY-AAY-AAY-GAR-GAR、AAY-GAR-AAY-GAR-AAY-AAY-GAR、AAY-AAY-GAR-GAR-GAR-AAY-AAY、AAY-AAY-GAR-GAR-AAY-AAY-GAR、AAY-AAY-GAR-AAY-GAR-AAY陽(yáng)GAR、AAY隱AAY-AAY-GAR-GAR-GAR-AAY、AAY-AAY-AAY-GAR-AAY-GAR陽(yáng)GAR、78AAY-GAR-AAY-AAY、、GAR-AAY-AAY-AAY-AAY、、AAY-AAY-AAY-GAR-AAY、、GAR隱AAY-GAR-AAY-AAY、、AAY陽(yáng)GAR-GAR-AAY-AAY、、AAY-AAY-GAR-GAR陽(yáng)AAY、AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AAY-GAR-GAR、GAR-GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、GAR-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY-AAY、GAR-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY、GAR-AAY-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY、GAR-AAY-AAY-AAY誦AAY-GAR-AAY、GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)GAR、AAY-GAR-GAR陽(yáng)AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-GAR-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY、AAY-GAR-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY、AAY-GAR-AAY-AAY-AAY-GAR-AAY、AAY陽(yáng)GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-GAR、AAY-AAY-GAR-GAR-AAY-AAY國(guó)AAY、AAY墨AAY-GAR-AAY-GAR-AAY-AAY、AAY-AAY-GAR-AAY-AAY-GAR-AAY、AAY陽(yáng)AAY-GAR-AAY-AAY-AAY-GAR、AAY-AAY-AAY-GAR-GAR-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-GAR-AAY-GAR-AAY、AAY-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY-GAR、AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)GAR-GAR國(guó)AAY、AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)GAR-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AAY-AAY-GAR、GAR-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-GAR陽(yáng)AAY陽(yáng)AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY誦AAY、AAY-AAY-AAY-GAR-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY隱GAR-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY隱AAY-GAR-AAY含有3-7個(gè)氨基酸殘基的肽基序的寡核苷酸，該肽基序含N沃冬酰胺)作為主要組件、H(組氨酸)作為次要組件AAY-AAY隱CAY、CAY-AAY-AAY、AAY-CAY-AAY、AAY-AAY-AAY-CAY、CAY-AAY陽(yáng)AAY-AAY、AAY-CAY-AAY陽(yáng)AAY、AAY-AAY-CAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-CAY、CAY-AAY-AAY-AAY-AAY、AAY-CAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-CAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-CAY-AAY、AAY-AAY-AAY-CAY-CAY、CAY-CAY-AAY-AAY-AAY、CAY-AAY-CAY-AAY-AAY、CAY-AAY-AAY陽(yáng)CAY-AAY、CAY-AAY-AAY-AAY-CAY、AAY陽(yáng)CAY-CAY-AAY-AAY、AAY-CAY-AAY陽(yáng)CAY隱AAY、AAY-CAY-AAY-AAY-CAY、AAY陽(yáng)AAY-CAY-CAY-AAY、AAY-AAY-CAY-AAY-CAY、AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-CAY、CAY-AAY國(guó)AAY-AAY陽(yáng)AAY-AAY、AAY-CAY陽(yáng)AAY陽(yáng)AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-CAY-AAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-CAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-CAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)CAY-CAY、CAY-CAY-AAY-AAY-AAY-AAY、CAY-AAY-CAY-AAY-AAY-AAY、CAY陽(yáng)AAY陽(yáng)AAY-CAY-AAY誦AAY、CAY-AAY-AAY-AAY-CAY-AAY、CAY-AAY-AAY-AAY-AAY-CAY、AAY-CAY-CAY-AAY-AAY-AAY、AAY-CAY-AAY-CAY國(guó)AAY-AAY、AAY-CAY-AAY-AAY-CAY陽(yáng)AAY、AAY-CAY-AAY-AAY-AAY-CAY、AAY-AAY-CAY-CAY-AAY-AAY、AAY-AAY陽(yáng)CAY-AAY-CAY-AAY、AAY-AAY-CAY-AAY-AAY-CAY、AAY-AAY-AAY-CAY-CAY-AAY、AAY-AAY-AAY-CAY-AAY-CAY、AAY-AAY-AAY-AAY-CAY-CAY-CAY、門(mén)AY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY,門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY,門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY>門(mén)AY-AAY-CAY-AAY-AAY-C:AY-AAY>門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY>門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY,AAY,門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-CAY-AAY,門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY>門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY,門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY"CAY-AAY.AAY-AAY-AAY-CAY-門(mén)AY>門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY>門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY>CAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY,門(mén)AY-CAY-AAY-AAY-AAY-AAY-CAY,AAY-CAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY,AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY,AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY,AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AA.Y-C:AY>AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY>AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY>AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AYyAAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY>AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-C:AY,AAY-CAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY>AAY-AAY-門(mén)AY-CAY-C:AY-AAY-AAY>AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY>AAY-AAY-CAY-門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY>AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY"AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AYAAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AYyAAY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-CAY-AAY>AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AYyAAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-CAY-門(mén)AY,AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-C:AY>門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY,門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY>門(mén)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAYy門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY"CAY-AAY-AAY-AAY,AAY-門(mén)AY-AAY,門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY>AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY〉A(chǔ)AY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY>AAY-CAY-AAY-AAY-CAY-AAY-AAY,AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY,AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY一AAY-AAY-門(mén)AY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY"AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY>AAY-AAY-CAY-AAY-AAY-CAY-AAY,AAY-AAY-CAY-AAY-AAY-AAY-CAYyAAY-AAY-AAY-門(mén)AY-CAY-AAY-AAY〉A(chǔ)AY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-C:AY-AAY,AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-C:AY,AAY,AAY-AAY-AAY-CAY-C:AY-AAY>AAY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY曙AAY-AAY-AAY-門(mén)AY,門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAYyAAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAYyAAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY-AAY,AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAY-AAY-AAY,AAY-AAY-AAY-AAY-C:AY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-門(mén)AY-AAYAAY-AAY-GAY,GAY-AAY-AAY,AAY-GAY-AAY>AAY-AAY-AAY-GAY,GAY-AAY-AAY-AAY〉A(chǔ)AY-GAY-AAY-AAYyAAY-AAY-GAY-AAY,AAY-AAY-AAY-AAY-GAY>GAY-AAY-AAY-AAY-AAYyAAY-GAY-AAY-AAY-AAY,AAY陽(yáng)AAY-GAY-AAY-AAYGAY-GAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-GAY-AAY-AAY-GAYAAY-AAY-AAY-GAY-AAYGAY-AAY-GAY-AAY-AAYAAY-GAY-GAY-AAY-AAYAAY-AAY陽(yáng)GAY-GAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAY-GAYGAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-GAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-GAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY陽(yáng)AAY陽(yáng)GAY-GAYGAY-AAY-GAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-GAY-GAY-AAY-AAY-AAYAAY國(guó)GAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY-GAY-GAY-AAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-AAY-GAYAAY陽(yáng)AAY-AAY-GAY-AAY-GAYGAY-GAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-GAY-AAY-GAY-AAY-AAYGAY-AAY-GAY陽(yáng)AAY-AAY-AAY-GAYGAY-AAY-AAY-GAY-AAY-GAY-AAYGAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAY-GAYGAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAY-GAYGAY-GAY-AAY-AAY-GAY-AAY-AAYGAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-GAY-GAY-AAY-GAY-AAY-AAYAAY-GAY-GAY-AAY-AAY隱AAY-GAYAAY-GAY-AAY-AAY-GAY-GAY-AAYAAY-GAY-AAY-GAY-AAY-GAY國(guó)AAYAAY-GAY-AAY-AAY-GAY-AAY-GAYAAY-AAY-GAY-GAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-GAY-GAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-AAY-GAY-GAYAAY-AAY-AAY-GAY-GAY-AAY-GAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAY-GAYGAY-AAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-AAY-AAYAAY陽(yáng)AAY-AAY-AAY-GAY-AAYGAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-GAY-AAY國(guó)AAYGAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-GAY-AAY-GAY-AAY-AAYAAY-GAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-AAY-GAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAY-GAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-GAY-GAY-GAYGAY-AAY-GAY-GAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-GAY-AAY-AAY-GAY-AAYGAY-AAY-AAY-GAY陽(yáng)GAY-AAY-AAYGAY-AAY國(guó)AAY-GAY-AAY-AAY-GAYGAY-AAY-AAY-AAY-GAY-GAY-AAYGAY-GAY-AAY-GAY-AAY-AAY陽(yáng)AAYGAY隱GAY-AAY陽(yáng)AAY-AAY-GAY-AAYAAY-GAY隱GAY-GAY-AAY陽(yáng)AAY-AAYAAY陽(yáng)GAY-GAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-GAY-AAY國(guó)GAY-GAY-AAY-AAYAAY-GAY-AAY-AAY-AAY-GAY-GAYAAY-GAY-AAY-GAY-AAY-AAY-GAYAAY-AAY-GAY-GAY-GAY-AAY陽(yáng)AAYAAY-AAY-GAY-GAY-AAY-AAY-GAYAAY-AAY-GAY-AAY-GAY-AAY-GAYAAY-AAY匿AAY-GAY-GAY-GAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAY-AAY-GAY-GAYGAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-GAY-AAY-AAY隱AAYGAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-GAY陽(yáng)AAY-GAY陽(yáng)AAY-AAY-AAYAAY-GAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY-GAY-GAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAY-GAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-GAY-AAY誦AAY-GAYAAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAY-GAY-GAY-AAY-AAY-AAY墨AAY-AAY-AAYAAY-AAY隱GAY-AAY-AAY-AAY-AAYGAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAYAAY-GAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAYAAY-GAY-AAY-AAY-GAY-AAY-AAYAAY-GAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-AAY-GAY-AAY陽(yáng)GAY-AAY-AAYAAY-AAY-GAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-AAY-AAY-GAY-AAY-GAY-AAYAAY-AAY隱AAY-AAY-GAY-GAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAYAAY-GAY-AAY-AAY-AAY陽(yáng)AAY-AAYAAY-AAY國(guó)AAY-GAY-AAY-AAY-AAYAAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAY-AAY、AAY-AAY-AAY-AAY-AAY-GAY-AAY含G(甘氨酸)作為主要組件GGN-GGN陽(yáng)ACN、ACN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN、GGN-GGN-GGN-ACN、ACN隱GGN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN-GGN、GGN-GGN-ACN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-ACN、ACN-GGN-GGN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN陽(yáng)ACN-GGN隱GGN、GGN-GGN-GGN-ACN-GGN、GGN-GGN-GGN-ACN-ACN、ACN國(guó)ACN-GGN-GGN國(guó)GGN、ACN陽(yáng)GGN-ACN陽(yáng)GGN-GGN、ACN-GGN國(guó)GGN-ACN-GGN、ACN-GGN-GGN隱GGN-ACN、GGN誦ACN-ACN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN-ACN-GGN、GGN-ACN-GGN陽(yáng)GGN-ACN、GGN-GGN-ACN-ACN-GGN、GGN-GGN-ACN-GGN-ACN、GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACNGGN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGNGGN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGNGGN-GGN-GGN-GGN-ACN-ACNACN-GGN-ACN-GGN國(guó)GGN-GGNACN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGNGGN-ACN-ACN-GGN-GGN-GGNGGN-ACN-GGN-GGN-ACN國(guó)GGNGGN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGNGGN-GGN-ACN-GGN-GGN陽(yáng)ACNGGN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN、ACN-ACN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGNACN-GGN-ACN-GGN-ACN-GGN-GGNACN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-ACNACN-GGN-GGN-GGN-GGN陽(yáng)GGNGGN-GGN-ACN誦GGN-GGN-GGNGGN-GG化GGN-GGN-ACN-GGNACN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGNACN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGNACN-GGN隱GGN-GGN-GGN-ACNGGN-ACN-GGN-ACN-GGN-GGNGGN-ACN-GGN-GGN-GGN-ACNGGN-GGN-ACN-GGN-ACN-GGNGGN-GGN-GGN-ACN-ACN-GGNGGN-GGN-GGN-GGN-ACN-ACN-ACNACN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGN-GGNACN-GGN-ACN-GGN-GGN-ACN-GGNACN-GGN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGNACN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN-GGN、ACN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-ACN、ACN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN、ACN-GGN-GGN-GGN陽(yáng)ACN-ACN-GGN、ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-ACN、ACN-ACN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN、ACN-ACN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGN、ACN-ACN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN、ACN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN、GGN-ACN-ACN-ACN-GGN陽(yáng)GGN-GGN、GGN-ACN國(guó)ACN-GGN-ACN-GGN-GGN、GGN-ACN-ACN-GGN-GGN-ACN-GGN、GGN-ACN陽(yáng)ACN-GGN-GGN-GGN-ACN、GGN-ACN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGN、GGN隱ACN-GGN-GGN-ACN-ACN-GGN、GGN-ACN-GGN-GGN-GGN陽(yáng)ACN-ACN、GGN-ACN陽(yáng)GGN-ACN-GGN-ACN-GGN、GGN-ACN隱GGN-ACN-GGN-GGN-ACN、GGN-ACN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN、GGN-GGN-ACN-ACN-ACN陽(yáng)GGN-GGN、GGN-GGN-ACN-ACN-GGN-ACN-GGN、GGN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGN-ACN、GGN-GGN-ACN-GGN-ACN-ACN-GGN、GGN-GGN-ACN-GGN-ACN-GGN-ACN、GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-ACN-ACN、GGN-GGN-GGN-ACN-ACN-ACN-GGN、GGN-GGN-GGN-ACN-ACN-GGN-ACN、GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN-ACN、GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-ACN、ACN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN、ACN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN、ACN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN、ACN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGN、ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN、ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN隱ACN、GGN-ACN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN-GGN陽(yáng)ACN-GGN-GGN、GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN、GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN、GGN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-ACN隱GGN-ACN-GGN-GGN、GGN-GGN陽(yáng)ACN-(3GN-GGN-ACN-GGN、GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-ACN、GGN-GGN-GGN-ACN-ACN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN-GGN、GGN國(guó)GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-ACN、GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-ACN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN、ACN-GGN-GGN-GGN.GGN-GGN-GGN、GGN.ACN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-ACN-GGNGGN-GGN-GCN、GCN-GGN-GGN、GGN-GCN-GGN、GGN-GGN陽(yáng)GGN-GCN、GCN-GGN-GGN-GGN、GGN-GCN-GGN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-GCN、GCN-GGN-GGN-GGN陽(yáng)GGN、GGN陽(yáng)GCN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-GCN-GGN、GGN-GGN-GGN-GCN-GCN、GCN-GCN-GGN-GGN-GGN、GCN-GGN-GCN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GCN-GGN、GCN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GCN-GCN-GGN-GGN、GGN-GCN-GGN-GCN-GGN、GGN-GCN-GGN-GGN-GCN、GGN-GGN-CGGN-GGN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GCN-GGN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-GCN.GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-GCN-GCN、GCN-GGN-GCN-GGN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GGN-GCN-GGN、GGN-GCN-GCN-GGN-GGN-GGN、GGN-GCN-GGN-GGN-GCN.GGN、GGN-GGN-GCN-GCN-GGN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN-GGN-GCN、GGN-GGN-GGN-GCN-GGN-GCN、GCN-GCN-GCN-GGN-GGN-GGN-GGN、GCN-GGN-GCN-GGN-GCN-GGN-GGN、GCN-GGN國(guó)GCN-GGN-GGN-GGN-GCN、GCN-GGN-GGN-GCN-GGN-GCN.GGN、GCN陽(yáng)GGN-GGN-GGN-GCN-GGN-GCN、GCN-GGN-GGN-GGN-GGN-GCN-GCN、GCN-GCN-GGN-GGN-GCN-GGN-GGN、GCN-GCN-GGN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GCN-GCN-GGN-GCN-GGN-GGN、GGN-GCN-GCN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GCN-GGN-GGN-GCN-GCN-GGN、GGN-GCN-GGN-GCN-GGN-GCN-GGN、GGN-GCN-GGN-GGN-GCN-GGN-GCN、GGN-GGN-GCN-GCN-GGN-GCN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN-GCN-GCN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN-GGN-GCN-GCN、GGN-GGN-GGN-GCN-GCN-GGN-GCN、GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-GCN-GCN、GCN-GGN-GCN-GGN-GGN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GGN-GCN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GCN陽(yáng)GGN-GCN-GGN-GGN-GGN、:N-GCN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN-GCN、GCN-GGN-GGN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-GCN-GGN-GGN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-GCN-GGN、GCN-GCN-GGN-GGN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GCN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GCN-GGN-GCN-GGN-GGN、GGN-GCN-GGN-GGN-GGN-GCN、GGN-GGN-GCN-GGN-GCN-GGN、GGN-GGN-GGN-GCN-GCN-GGN、GGN-GGN-GGN-GGN-GCN-GCN-GCN、GCN-GGN-GCN-GCN-GGN-GGN-GGN、GCN-GGN-GCN-GGN-GGN-GCN-GGN、GCN-GGN-GGN-GCN-GCN-GGN-GGN、GCN-GGN-GGN-GCN-GGN-GGN-GCN、GCN-GGN-GGN-GGN-GCN-GCN-GGN、GCN-GCN-GGN-GCN-GGN-GGN-GGN、GCN-GCN-GGN-GGN-GGN-GCN-GGN、GG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AR-CAR-CAR-AAY-AAY-AAY-CAR,門(mén)AR-CAR-門(mén)AR-AAY-AAY-門(mén)AR-AAY>門(mén)AR-門(mén)AR-門(mén)AR-AAY-門(mén)AR-AAY-AAY,CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-AAY-AAY/AAY-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR乂AAY-CAR-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR>AAY-CAR-CAR-AAY-CAR-CAR-CARyAAY-CAR-CAR-CAR-AAY-CAR-CAR,AAY-CAR-CAR-CAR-CAR曙AAY-CAR"AAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-AAY,CAR-AAY-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR>門(mén)AH-AAY-CAR-AAY.CAR-CAR-CAR,CAR-AAY-CAR-CAR-AAY-CAR-CAR>門(mén)AR-AAY-CAR-CAR-CAR-AAY-CAR,CAR-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR-AAY,門(mén)AR-CAR-AAY-AAY-CAR-CAR-CAR,CAR-CAR-AAY-CAR-AAY-CAR-CARz門(mén)AR-CAR-AAY-CAR-CAR-AAY-CAR,CAR-CAR-AAY-CAR-CAR-CAR-AAY.門(mén)AR曙CAR-CAR-AAY-AAY-CAR-CARyCAR-CAR-CAR-AAY-CAR-AAY-CAR,門(mén)AR曙CAR-CAR-AAY-CAR-CAR-AAY>CAR-CAR-CAR-CAR-AAY-AAY-CAR>門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-AAY-CAR-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-AAY,AAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-CAU〃CAR-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR一門(mén)AH-CAR-AAY-CAR-CAR-CAR-CAR>CAR—CAR-CAR-AAY-CAR-CAR-CAR"門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-AAY-CAR-CAR^CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-AAY-門(mén)AR門(mén)AR-CAR-GAY>GAY-CAR-CAR,CAR-GAY-CAR>CAR,CAR-CAR-GAY"GAY-CAR-CAR-CAR>CAR-GAY,dAR-CAR,CAR-CAR-GAY-CARy門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-GAY7GAY-CAR-CAR,CAR-CAR>CAR-GAY-CAR-CAR-CARyCAR-CAR-GAY-CAR-CAR>CAR-CAR曙CAR-GAY-CAR^CAR曙CAR-CAR-GAY-GAY"GAY-GAY-CAR-CAR-CARyGAY-CAR-GAY-CAR-CAR>GAY-CAR-CAR-GAY-CAR>GAY-CAR-CAR-CAR-GAY>CAR-GAY-GAY-CAR-CAR>CAR-GAY-CAR-GAY-CAR,門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-GAY"CAR-CAR-GAY-GAY-CAR>CAR-CAR-GAY-CAR-GAY>門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY>GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR>門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR>CAR-CAR-GAY-CAR-CAR-CARy門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR>CAR-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR,門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-GAY-GAY>GAY-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR〃GAY-CAR-GAY-CAR-CAR-CARyGAY-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR.GAY-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR>GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-GAYz門(mén)AR-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR>CAR-GAY-CAR-GAY-CAR-CAR>轉(zhuǎn)溢齒被98/101:K門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-GAY-門(mén)Ail門(mén)AR-門(mén)AR-GAY-GAY-門(mén)AR-門(mén)AR門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-CAR-GAY>GAY-GAY-GAY-門(mén)AR-門(mén)AR-門(mén)AH-門(mén)ARGAY-CAR-GAY-CAR-GAY-CAR-CARGAY-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR-GAYGAY-CAR-CAR-GAY-CAR-GAY-門(mén)AnGAY-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR-GAYGAY-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY-GAYGAY-GAY-CAR-CAR-GAY-CAR-門(mén)ARGAY-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY門(mén)AR-GAY-GAY-CAR-GAY-CAR-CAR門(mén)AR-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR-GAY門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-GAY-GAY-CAR.門(mén)AR-GAY-CAR-GAY-CAR-GAY-門(mén)AR門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-GAY-CAR-GAY門(mén)AR-CAR-GAY-GAY-CAR-GAY-門(mén)AR門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-GAY-GAY-門(mén)AR門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY-GAY門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-GAY-CAR-GAY門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY-GAYGAY-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR-門(mén)ARGAY-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR-門(mén)ARGAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-GAYCAR-GAY-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-CAR-GAY-門(mén)AR門(mén)AR-CAR-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY-門(mén)ARCAR-CAR-CAR-GAY-GAY-CAR-CAR門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR門(mén)AR-GAY-門(mén)AR-門(mén)AR-門(mén)AR-GAY一門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-GAY-CAR7門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-GAY-CAR,門(mén)AR-CAR-CAR-CAR-GAY-GAY-GAY,GAY-CAR-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR,GAY-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY-CAR,GAY-門(mén)AR-門(mén)AR-GAY-GAY-門(mén)AR-C:AR,GAY-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY>GAY-CAR-CAR-CAR-GAY-GAY-CAR,GAY-GAY-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR,GAY-GAY-CAR-CAR-CAR-GAY-CARy門(mén)AR-GAY-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR,門(mén)AR-GAY-GAY-CAR-門(mén)AR-GAY-門(mén)AR>門(mén)AR-GAY-CAR-GAY-GAY-CAR-CAR,CAH.-GAY-CAR-CAR-CAR-GAY-GAYy門(mén)AR-GAY-CAR-GAY-CAR-CAR-GAY,門(mén)AR-門(mén)AR-GAY-GAY-GAY-門(mén)AR-門(mén)AR,門(mén)AR-CAR-GAY-GAY-CAR-CAR-GAY,門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-GAY-CAR-GAY>門(mén)AH.-門(mén)AR-門(mén)AR-GAY-GAY-GAY-c:AIl,CAR-CAR-CAR-GAY-CAR-GAY-GAY,GAY-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR,GAY-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR,GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR.門(mén)AR-GAY-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR>門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR.CAR-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY,CAR-CAR-GAY-CAR-GAY-CAR-CARy門(mén)AR-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR-GAY,門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-CAR-GAY-CAR^門(mén)AR-門(mén)AR-門(mén)AR-門(mén)AR-GAY-GAY-門(mén)AR,CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY>門(mén)AR-GAY-CAR-CAR-CAR-CAR-CAR,門(mén)AR-CAR-CAR-GAY-CAR-CAR-CAR>CAR-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR陽(yáng)CAR、CAR-CAR-CAR-CAR-CAR-GAY-CAR表8<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>權(quán)利要求1.一種含有生物活性多肽的生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)包含主要組件和次要組件的肽單元的多肽，其中主要組件是選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基，次要組件是選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基，限制條件是沒(méi)有一種所述氨基酸同時(shí)存在于所述主要組件和所述次要組件中，因而與未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期相比，該生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的血漿半衰期有所改變。2.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽包含3-6個(gè)氨基酸殘基。3.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽包含3個(gè)氨基酸殘基。4.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽包含4個(gè)氨基酸殘基。5.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽包含5個(gè)氨基酸殘基。6.如權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述次要組件包含所述肽的1個(gè)氨基酸殘基。7.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽包含6個(gè)氨基酸殘基。'8.如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述次要組件包含所述肽的1個(gè)氨基酸殘基。9.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽的序列由N和T氨基酸殘基組成。10.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽的序列由N和E氨基酸殘基組成。11.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽的序列由Q和S氨基酸殘基組成。12.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述肽的序列由N和Q氨基酸殘基組成。13.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述多肽是所述生物活性多肽的N末端。14.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述多肽是所述生物活性多肽的C末端。15.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述多肽位于所述生物活性多肽的N和C末端。16.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽是細(xì)胞因子。17.如權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述細(xì)胞因子是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。18.如權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述細(xì)胞因子是人生長(zhǎng)激素。19.如權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述細(xì)胞因子是干擾素。20.如權(quán)利要求19所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述干擾素是P-干擾素。21.如權(quán)利要求19所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述干擾素是Y-干擾素。22.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括抗體、抗體片段、抗體的蛋白水解片段或結(jié)構(gòu)域、單鏈抗體、遺傳或化學(xué)優(yōu)化的抗體或其片段。23.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括可溶性gpl20或gpl60糖蛋白。24.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括凝血因子。25.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括可溶性受體。26.如權(quán)利要求25所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述可溶性受體包括腫瘤壞死因子(TNF)-aII型受體。27.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括紅細(xì)胞生成素。28.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其半衰期經(jīng)改變比未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期縮短。29.如權(quán)利要求28所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括重組活化的蛋白C。30.如權(quán)利要求28所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽包括重組因子VII。31.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽是治療性酶。32.—種組合物，其包含權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物和載體。33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述載體是藥學(xué)上有效的載體。34.—種嵌合DNA分子，其編碼權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。35.—種載體，其包含權(quán)利要求34所述的嵌合DNA分子。'36.如權(quán)利要求35所述的載體，所述載體是質(zhì)粒。37.如權(quán)利要求36所述的載體，其特征在于，所述質(zhì)粒是pCE2。38.—種用權(quán)利要求35所述的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。39.如權(quán)利要求38所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。40.如權(quán)利要求39所述的細(xì)胞，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。41.如權(quán)利要求38所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是細(xì)菌。42.如權(quán)利要求41所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)菌是大腸桿菌。43.如權(quán)利要求38所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是酵母。44.一種制備含生物活性多肽的生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的方法，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)包含主要組件和次要組件的肽單元的多肽，其中主要組件是選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基，次要組件是選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基，限制條件是沒(méi)有一種所述氨基酸同時(shí)存在于所述主要組件和所述次要組件中，因而與未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期相比，該生物活性蛋白質(zhì)的血漿半衰期有所改變，所述方法包括在表達(dá)所述DNA分子的條件下培養(yǎng)用編碼所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的嵌合DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；和從所述細(xì)胞中提取所述嵌合DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，通過(guò)將所述嵌合DNA分子插入一載體中，隨后將其轉(zhuǎn)化入所述細(xì)胞，從而將所述嵌合DNA分子引入所述細(xì)胞。46.—種測(cè)定某給定蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的血漿半衰期相對(duì)于未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期是否改變的方法，所述方法包括a)制備包含生物活性多肽的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)重復(fù)單元肽基序的多肽，所述基序包含主要組件和次要組件，其中主要組件包含選自Gly(G)、Asn(N)或Gln(Q)的一種氨基酸的兩個(gè)或多個(gè)殘基或由其組成，次要組件包含選自Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Asp(D)、Gln(Q)、Glu(E)、His(H)或Asn(N)的一種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基或由其組成，沒(méi)有一種所述氨基酸同時(shí)存在于所述主要組件和所述次要組件中，和b)檢測(cè)所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物以確定所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的血漿半衰期相對(duì)于所述未偶聯(lián)的生物活性多肽的固有半衰期是否改變。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了含有生物活性多肽的生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，所述生物活性多肽通過(guò)肽鍵偶聯(lián)于含有2個(gè)至約500個(gè)重復(fù)單元肽基序的多肽，所述生物活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物顯示的血漿半衰期與未偶聯(lián)生物活性多肽或蛋白質(zhì)的固有半衰期相比有所改變。本發(fā)明也公開(kāi)了制備和應(yīng)用偶聯(lián)蛋白的方法，以及確定某給定偶聯(lián)物的半衰期相對(duì)于未偶聯(lián)多肽的固有半衰期是否改變的方法。文檔編號(hào)C07K14/435GK101111516SQ200680002871公開(kāi)日2008年1月23日申請(qǐng)日期2006年1月25日優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日發(fā)明者D·里昂,J·辛格,M·貝斯曼,S·齊普曼申請(qǐng)人:細(xì)胞治療學(xué)公司