專利名稱：酪氨酸激酶抑制劑組合物及其制造方法和在疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及受體酪氨酸激酶及其活化配體，運(yùn)用基因工程
產(chǎn)生可溶性ErbB配體連接分子，將修飾后的構(gòu)建體插入重組DNA載 體，得到通過細(xì)胞分泌的可溶性修飾型受體，以及應(yīng)用這些分了-治 療疾病。
背景技術(shù)：
癌癥是一類疾病的通稱，這類疾病是許多國家人口死亡的主要 原因。簡單來說，癌癥是山受損、失控細(xì)胞異常增殖引起的疾病。 某些控制正常細(xì)胞生長、發(fā)育和死亡的關(guān)鍵基因或基因組發(fā)生變 異，導(dǎo)致變異細(xì)胞生長。lH是由于這些變異細(xì)胞生長，導(dǎo)致腫瘤形 成。情況惡化時，腫瘤會越長越大，或者遍布全身，最后造成身體 多方面損害，直至死亡。
治療癌癥的主要方法是通過手術(shù)切除腫瘤，從而阻止腫瘤向健 康組織擴(kuò)散。但是手術(shù)的風(fēng)險比較高，而且并非適用所有患者。想 要用手術(shù)攻克每一種腫瘤，這也是不可能的，例如，長在腦區(qū)域的 腫瘤就不能進(jìn)行手術(shù)，或者例如白血病等疾病，也不能使用手術(shù)。
所以， 一直以來以及目前都在不斷研發(fā)其他治療方法，以治療 那些使用手術(shù)不可靠或不可能用手術(shù)切除的腫瘤。 一種替代手術(shù)的 方法就是放射治療。用放射線照射腫瘤，會消滅或損害靶腫瘤細(xì)胞， 但同時也會影響非腫瘤細(xì)胞，出現(xiàn)身體虛弱的副作用，這一點(diǎn)眾所 周知。
化學(xué)治療是另-類試圖通過向患者施用細(xì)胞毒性化合物來消火 體內(nèi)腫瘤組織的方法。這類方法既可以用作抗擊癌癥的單-療法， 獨(dú)立使用，也可以在手術(shù)或放射治療前后使用。但在放射治療中， 眾所周知，會產(chǎn)生身休虛弱副作用，所以，這種治療對患者健康的危害程度可能要比僅使用手術(shù)或射線更大一些。
為避免這些治療方法對非癌組織的損害及產(chǎn)生副作用，科研人 員一直在研究只消滅癌組織的治療方法。 一種治療就是使用腫瘤特 異性抗體，如結(jié)腸腫瘤特異性抗體，試圖不傷害健康組織。但是這 一治療的成功率較低。
另外，基于基因的治療法也正在研究當(dāng)中，研究顯示，有些基 因突變產(chǎn)生的蛋白(或稱靶)對藥物的反應(yīng)不同于野生型基因(或 稱正?；?編碼的正常蛋白對藥物的反應(yīng)。例如，使用藥物
Gleevec (Gleevec^是伊馬替尼的商品名)即為這類治療，該藥物 對治療慢性髓樣白血病(〃CML〃)非常有效，它能抑制^-期促使CML 進(jìn)展、稱之為BCR-ABL激酶的癌基因。另外發(fā)現(xiàn)G]eevec^是某些酪 氨酸激酶受體、尤其是許多胃腸道胃腫瘤("GIST")中發(fā)現(xiàn)的突變 型c-kit致癌受體的抑制劑。
另一種類似的治療劑gefitimb (Iressa ,阿斯利康公司商標(biāo)) 是一種靶向表皮生長因子受體("EGFR")的酪氨酸激酶活性的小分
子抑制劑。？0八已經(jīng)批準(zhǔn)11"63犯@用于治療非小細(xì)胞肺癌患者，這^
患者體內(nèi)腫癇對鉑基和多西紫杉醇化學(xué)治療沒冇反應(yīng)。雖然只有約 10%的患者對Iressa⑧有反應(yīng)，但這一部分人群確實(shí)對該藥物表現(xiàn)出
良好的臨床反應(yīng)。
再有--種方法就是攻擊控制腫瘤內(nèi)新血管形成或血管生成的受 體，并加以抑制。 一般認(rèn)為，血管為腫瘤生長提供營養(yǎng)，這是腫瘤 生長的關(guān)鍵所在。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子rVEGF")在這一過 程屮非常關(guān)鍵，當(dāng)VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受休結(jié)合時，會啟動 VEGF途徑。這些受體，VEGFR1和VEGFR2均為跨膜酪氨酸激酶，當(dāng) 與其胞外域上的VEGF結(jié)合時，會激活其固有的酪氨酸激酶活性，并 啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道利用阻斷抗VEGF抗體或抗VEGFR 抗體、作為"陷阱"(tr印)阻止VEGF與其受休結(jié)合的可溶性受體和 抑制VEGFR酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑，可以阻斷這--途徑。 Holash等人報(bào)道了一種可溶性受體的應(yīng)用，這種受體由與人免疫球 蛋白G]的Fc部分融合的VEGFR1和VEGFR2的胞外域構(gòu)成，是一種競爭性抑制劑，可作為陷阱捕獲VEGF，從而破壞VEGF級聯(lián)，抑制腫 瘤內(nèi)新血管形成(Holash， et al. ， 2002， PNAS， vol. 98， no. 17， pp 1簡-1398. )o
在可溶性受體的另一應(yīng)用中，炎性疾病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 中，腫瘤壞死因子-arTNF-oT)活化的前提是必須出現(xiàn)炎癥。TNF-a 介導(dǎo)的活動需要在TNF-a同源三聚體與細(xì)胞表面受體的胞外域結(jié)合 后啟動，之后這些細(xì)胞表面受體形成多聚體，隨后通過受體胞內(nèi)域 進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究顯示，雖然存在天然的、可溶性的TNF-a受休， 而且它們能作為競爭性抑制劑，用于抑制TNF-a與細(xì)胞表面受體結(jié) 合，但是從火多數(shù)炎性疾病中可以看到，光是用它們阻斷活件水平 還是不夠的?？龟P(guān)節(jié)炎藥物依那西普，商品名為Enbrel (Amgen 公^商標(biāo)，Thousand Oaks, California, USA)，是-'個完全人源化 三聚體融合蛋白，由人TNF-a受體的細(xì)胞外配體結(jié)合域和人1gGl的 Fc部分邇接而成，用作抑制TNF-a與細(xì)胞表面TNF受體結(jié)合的競爭 性抑制劑，從而抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)部位由TNF-a誘導(dǎo)的 炎癥反應(yīng)。依那西普用作細(xì)胞因子載體和TNF-a拮抗劑，使TNF-a 喪失生物活性(Goffe， et al. 2003， J. Am. Acad. Dermatol, vol. 49， no. 2， pp. S105—Sill; Goldenburg， M. ， 1999， C]inical Therapeutics, vol. 21， no. 1， pp. 75-87)。
另一種藥物英利昔單抗也耙向TNF-a受體，它是--種抗TNF-a 的單克隆嵌合抗體，阻止必定發(fā)生的結(jié)合，但是它同時與膜結(jié)合型 TNF-a和可溶性TNF_a結(jié)合，可能會引起某些不良副作用。
受體酪氨酸激酶是一些乳腺癌生長的關(guān)鍵酶。 一般來說，受體 酪氨酸激酶是糖蛋白，由(JO能與特定配體結(jié)合的胞外域，(2)跨 膜區(qū)，(3)近膜域，受體在此處受例如蛋白磷酸化的調(diào)控，酪 氨酸激酶域，它是受體的酶組分，和(5)羧端尾部組成(Davis," al曙，US 6， 441， 137， Aug. 27， 2002)。對乳腺癌來說，J型受體酪 氨酸激酶中的erbB家族是目前最重要的 一類受體酪氨酸激酶，它們 包括erbBl (又稱HER1 )、 erbB2 (HER2/neu)、 erbB3 (HER3)和erbB4 (HER4)。這些受體酪氨酸激酶在上皮組織、間葉組織和神經(jīng)組織中
6廣泛表達(dá)。 一些乳腺癌和其他各種惡性腫瘤中，erbB2或erbBl過度 表達(dá)與臨床結(jié)果惡化相關(guān)。
erbB受體在非活化狀態(tài)下以單體形式存在， 一旦與可溶性配體
結(jié)合后，受體內(nèi)構(gòu)象發(fā)生變化，從而形成受體同源和異源二聚體， 即活化受體。配體結(jié)合及后續(xù)同源或異源化過程刺激受體通過自磷 酸化反應(yīng)產(chǎn)生催化活性，也就是說，各個單體會將彼此的酪氨酸殘 基磷酸化。另外，有些磷酸化的酪氨酸殘基會給下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子 提供停泊位點(diǎn)(docking site)。
erbB受體活化會產(chǎn)生不同的下游結(jié)果，例如，增殖和細(xì)胞存活。 這些不同結(jié)果是通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生的，具體取決于與特 定受體結(jié)合的特定配體。配體結(jié)合后會向構(gòu)成同源或異源二聚休的 組分發(fā)出指示，最后形成二聚體。H前大量研究顯/J;-，結(jié)合配體的 類型和后續(xù)形成的同源或異源二聚體的類型使活化erbB受體上酪氨 酸殘基的磷酸化有所不同，例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulins) ("NRGs〃，又稱heregulins)是一個與erbB受休結(jié)合并促使增礦L、 分化、存活和轉(zhuǎn)移等不同反應(yīng)發(fā)生的配體家族。NRGip和NRG2p能與 erbB3結(jié)合，并誘導(dǎo)erbB2/erbB3異源二聚體形成但尾只有NRGip 能刺激培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞分化，其原因是，當(dāng)NRG2p和NRGip分別 被結(jié)合吋，募集到活化erbB2/erbB3異源二聚體的—卜'游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分 子各不相同。例如，雖然NRG1卩和NRG2p分別產(chǎn)生的erbB2酪氨酸 磷酸化總水平大致相當(dāng)，但是只有NRG]p能使PJ3K (p85)、 SHP2、 Grb2和She與受體發(fā)生聯(lián)系。
另一類可溶性肽配體家族可調(diào)控erbB受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括表皮 生長因子(〃EGF〃)和轉(zhuǎn)化生長因子("TGF-a")，它們均與受休crbBl 結(jié)合。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，配體EGF或TGF-a表達(dá)量增加，可作為某些癌 癥患者的不良預(yù)后指標(biāo)，甚至受體未過度表達(dá)，腫瘤微環(huán)境中EGF 或其他配體濃度局部增加也似乎能使異源二聚體保持活化狀態(tài)。
乳腺癌屮，erbBl和erbB2形成二聚體后會激活存活和增殖途 徑。ErbBl、 erbB2和erbB4都含有功能性催化域，它們是激活上述 途徑的關(guān)鍵特性。已經(jīng)出現(xiàn)--些旨在抑制erbBl和erbB2的治療方案，其中一種方案是使用抗體與這些受體胞外域結(jié)合，使受體降解， 另 一方案是使用小分子抑制劑，與這些受體胞內(nèi)域上的活化激酶域 結(jié)合。令人遺憾的是，這些方案均不能完全根治乳腺癌生長。
其原因可能在于，不是所有的ei"bB受體都含有能被小分子抑制 的功能性催化域。erbB3在受體激酶中比較特殊，因?yàn)樗谴呋蛉?陷型酶。雖然還有其他激酶缺陷型受體，即CCK-4m VIK/RYK、 Klg 和Rorl，但它們都是孤兒受體(orphan rec印tors)，沒有已知配體。 ErbB3與其他這些受體不同，它能與heregu] in (稱為HRG或神經(jīng)調(diào) 節(jié)蛋白(NDF))等配體結(jié)合。盡管erbB3缺少催化活性，但它仍然 非常重要，因?yàn)樗鼤cerbB2和erbB4發(fā)生異源二聚化，形成 erbB2/erbB3和erbB3/erbB4異源二聚體從而刺激乳腺癌中進(jìn)行信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(Lee， et al. ， 2001, Cancer Research 61， pp 4467-4473)。
已經(jīng)鑒定到天然存在的縮短型erbB3受體，它只含有erbB3受 體的胞外域。研究顯示，這些天然的可溶性受體可以與配體結(jié)合， 所以能用作細(xì)胞ErbB3受體的競爭性抑制劑，但是它們的含量不高. 不能對乳腺癌患者產(chǎn)生療效。尤其是，Lee等人報(bào)道，發(fā)現(xiàn)了一種 p85-可溶性erbB3受體及其作為erbB3配體的競爭性抑制劑的活 性。研究發(fā)現(xiàn)，這種受體是天然存在的體外erbB3抑制劑，可阻止 HRG與細(xì)胞表面受體結(jié)合，被認(rèn)為可能是眾多胞外負(fù)調(diào)控因子之一 (Lee， et al. ， 2001， Cancer Research, 61: 4467-4473)。
本發(fā)明的目的是要提供與erbB3配體競爭性結(jié)合的erbB3配體 拮抗劑，從而減少或消除這些配體與細(xì)胞erbB3受體間的結(jié)合。
本發(fā)明的優(yōu)選S的是要提供以單--'制劑或與其他癌癥治療聯(lián)合 的方式施用erbB3配體拮抗劑來治療癌癥的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本文是要公開一種新的基T ErbB的配體結(jié)合分子及其制備方法 和應(yīng)用。該結(jié)合分子可以是由重組DM分子表達(dá)的蛋白，該蛋白可 以含有能與活化配體結(jié)合的ErbB胞外域。這些結(jié)合元件可作為陷
8阱，與循環(huán)中的配體結(jié)合，將其隔離開，使之無法與細(xì)胞ErbB受體 扭么
5口 口 o
比較理想的情況是，上述蛋白可包括部分ErbB受體，并將與 ErbB配體結(jié)合。
本文還闡述了其他特征和優(yōu)點(diǎn)，可從以下詳細(xì)說明和附圖中顯 而易見。


圖l: ErbB單陷阱作用機(jī)理的示意圖。
圖2: ErbB3單陷阱和ErbB雙陷阱多肽的Western雜交。
具體實(shí)施例方式
本說明書現(xiàn)闡述一種能使配體與ErbB等受體結(jié)合的結(jié)合分子， 本文中將這種結(jié)合分子稱為"單陷阱"(single trap)。在一個實(shí)施 例中，該分子對所有ErbB配體有較強(qiáng)的親和力。該分子可用于單藥 治療或聯(lián)合治療，例如，在EGFR和ErbB2過度表達(dá)或者ErbB和配 休中均發(fā)生變化的腫瘤中，與EGFR和ErbB2抑制劑聯(lián)合使用。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種單抗原結(jié)合分子，該分子對 那^能與特定ErbB受體結(jié)合的配體有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。 一般來 說，所述配體將是能與特定受體結(jié)合的特定配體。結(jié)合分子最好是 水溶性分子。另外，結(jié)合分子也可以存在于一種能賦予其口了溶性或 親水性的制劑中，如脂質(zhì)體制劑。
在-一個實(shí)施例中，結(jié)合分子可以是一種受體胞外域的可溶性部 分。結(jié)合分子屮可以使用任何適合的受體。適合的受體…般耍包含 其中含有配體結(jié)合所必需和足夠的所有決定簇的胞外域。這些決定 簇可位-丁-相應(yīng)的mRNA或基因結(jié)構(gòu)上，而這些mRNA或基「大]結(jié)構(gòu)可以 直接從基因組中分離，或者可以從源于其本身宿主細(xì)胞的cDNA中分 離。某些實(shí)施例中，可使用ErbB受體家族制備結(jié)合分子。所以，結(jié) 合分子可以包括ErbB受體如ErbBl、 ErbB3或ErbB4的胞外配體結(jié) 合域。該結(jié)合域在其多肽鏈上可以存在其他元件，只要其仍然具有
9適合的受體結(jié)合活性即可。
結(jié)合分子可以包括由重組DNA分子表達(dá)的氨基酸序列。該重組 DNA分子可以包括首要的編碼部分受體蛋白的核苷酸序列。結(jié)合分子 中還可以包括其它元件，如IgGl的Fc部分。使用人IgGl的Fc部 分是所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員都熟知的一種設(shè)計(jì)，它一般有兩種用 途。第一，使單體可溶性受體與更高級別的結(jié)構(gòu)如二聚體和三聚體 等形成寡聚體。第二，使產(chǎn)生的分子更穩(wěn)定，與不含IgGl分子Fc 部分的分子相比，體內(nèi)半衰期延長。另一個元件可以是可操作地連 接配體結(jié)合元件和IgGl-Fc元件的接頭。例如，甘氨酸-絲氨酸 (Gly4Ser)3接頭。還冇一個元件可以是蛋白酶識別序列，必要時， 通過該序列能從結(jié)合分子屮切除IgGl-Fc元件。典型的序列包括Xa 因子或TEV蛋白酶識別序列。
某些實(shí)施例中，所述重組DNA分子包括ErbBl的序列。某些實(shí) 施例中，重組DNA分子包括來自ErbB3的序列。其他實(shí)施例中，重 組DNA分子可以包括來自ErbB4的序列。像這樣的任何一種情況下， 所選用的序列都會有很強(qiáng)的結(jié)合其相應(yīng)的ErbB配休的能力。
某些實(shí)施例中，將這些受體序列克隆到一個排列有轉(zhuǎn)錄和翻譯 序列的重組DNA構(gòu)建體中，從而可以在適合的宿主中表達(dá)結(jié)合分子。 選用可在適合的宿主中使用的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列，這是所屬技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員都很熟知的技術(shù)。許多情況下，受體會被糖基化，而糖 基化能影響配體結(jié)合。所以，選用何種宿主可根據(jù)該宿主細(xì)胞產(chǎn)生 的糖基化模式而定。例如，對于含ErbB的結(jié)合分子，可以使用哺乳 動物宿主細(xì)胞。
圖i所示為結(jié)合分子典型實(shí)施例的示意圖。利用5rbB受體胞外 域特異性抗體的識別，通過western雜交，可檢測到ErhB配體結(jié)合 域(圖2)。
本發(fā)明還提供了使用包含本發(fā)明化合物的藥物組合物的方法。 該藥物組合物可以采用注射或經(jīng)口、肺、鼻、透皮或其他施用方式。 一般來說，本發(fā)明包括藥物組合物，該組合物包括有效量的本發(fā)明 結(jié)合分子和藥用稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔料和/或載休。這些組合物包括具有各種緩沖物質(zhì)(例如Tris-HC1、醋酸鹽、磷酸 鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑；崩解劑和增溶劑等添加劑(例如 TWEEDtm80、聚山梨醇酯80);抗氧化劑(例如維生素C、焦亞硫酸 鈉)；防腐劑(例如Thimersol、苯甲醇)和增量物質(zhì)(例如乳糖、 甘露醇)；將材料加到特定聚合物制劑中，如聚乳酸、聚乙醇酸等， 或者加到脂質(zhì)體中。另外，也有可能使用透明質(zhì)酸，這有可能提高 在循環(huán)中的維持時間。這些組合物有可能影響本發(fā)明蛋白和衍生物 的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。例如參見 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990， Mack Publishing Co. ， Easton, PA 18042)第1435-1712頁，該文獻(xiàn)完整 引入以作參考。所述組合物可以制成液體劑，或者制成干粉劑，如 凍干劑?？芍踩氲木忈屩苿⑼钙ぶ苿┮捕己w在內(nèi)。
藥用載體包括碳水化合物，如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、 乳糖和山梨醇。制劑用的其他成分可以包括DPPC、 D0PE、 DSPC和 D0PC?？梢允褂锰烊换蚝铣傻谋砻婊钚詣?；可以使用PEG (不算蛋白 或類似物衍化過程中的使用)。葡聚糖類，如環(huán)葡聚糖，也可以使用。 可以使用膽鹽和其他相關(guān)增效劑。可以使用纖維素和纖維素衍生 物?？梢允褂冒被?，例如在緩沖液制劑中使用。
而且，脂質(zhì)體、微膠囊或微球體、包結(jié)配合物或其他類型載體 的使用也都為本發(fā)明所涵蓋。
治療方法中包含的用藥方案要由主治醫(yī)師考慮各種改變藥物作 用的因素后確定，例如患者年齡、健康狀況、體重、性別和飲食、 疾病嚴(yán)重程度、施用時間等臨床因素。 一般來說，每天的用藥劑量 應(yīng)為0. l-lOOOpg本發(fā)明化合物/千克體重，最好是0. 1-150|ig/kg。
實(shí)施例l
本例是闡述如何構(gòu)建一個有代表性的具有ErbB受體胞外域的單 陷阱分子組分，即，單重組基因構(gòu)建體中具有ErbB3受體胞外域。
通過引入ErbBl、 ErbB3或ErbB4的胞外域，可將ErbB單陷阱 設(shè)計(jì)成與ErbB家族的不同配體結(jié)合的分子。
將縮短型ErbB3克隆到以色列Rehovot'市Weizmann研究所Yosef Yarden博士的實(shí)驗(yàn)室提供的質(zhì)粒pEF-IRES-P中。本構(gòu)建體由 首要的分別稱作LI (域l)、 SI (域n)、 LII (域III)的三個ErbB3 胞外域和部分SII (域IV)構(gòu)成。與本片段3'端融合的其他蛋白域 包括PKA磷酸化位點(diǎn)、Xa因子切割位點(diǎn)和與3'端相連的人IgGl的 Fc片段。然后將這整個片段克隆到質(zhì)粒pEF-IRES-P的Nhel - Notl 位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pEF-ECD3IgG-IRES-P。
質(zhì)粒pEF-ECD3IgG-IRES-P經(jīng)改動后得到pEF-ECD3-IRES-P質(zhì) 粒。將ECD3IgG縮短，這樣便只表達(dá)ErbB3的LI、 SI、 L1I和部分 SII域。因?yàn)闆]有合適的限制性酶，所以設(shè)計(jì)了PCR引物來擴(kuò)增部分 ErbB3胞外域。止向引物上引入了一個XhoI位點(diǎn)，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)是離 SII域3'端最近的惟一一個限制性酶切位點(diǎn)，反向引物上引入了--個NotI位點(diǎn)(該位點(diǎn)是構(gòu)建休3'端原有的克隆位點(diǎn))、 一個嵌套式 Nhel位點(diǎn)和一個與Nhel位點(diǎn)重疊的終止密碼子。為了能構(gòu)建 pEF-IRES-P空質(zhì)粒對照，向反向引物上的Notl位點(diǎn)內(nèi)引入NheI位 點(diǎn)，因?yàn)槎嗫寺∥稽c(diǎn)(〃MCS〃) 5'端有一個Nhel位點(diǎn)，這樣在ErbB3 單陷阱構(gòu)建完成后，就可以將整個ErbB3胞外域片段切除。
用pEF-ECD3IgG-IRES-P作模板，進(jìn)行以下PCR反應(yīng)質(zhì)粒 pEF-ECD3IgG-IRES-P， 25ng; NEB 10xVent聚合酶緩沖液，2.5^1; dNTP (該溶液中，dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各10mM)， 0. 5p];」I-: 向引物和反向引物，0.5jxl; Vent聚合酶(5000U/mL) ,0.5^1。引物 序列為s-erbB3-Xho1， 5， AGC TCT CGA GCA ACA TTG ATG GAT TTG TGA ACT GC (SEQ ID NO l)和s-erbB3-Nhel-Notl， 5， AGC TGC GGC CGC TAG CTC AAC CAG GGC CTG GGC CCC AGC ATC (SEQ ID NO 2)c PCR條件如下95°C、 2分鐘；95°C、 45秒，55°C、 45秒和72。C、 2 分鐘，22個循環(huán)；最后72'C、 5分鐘。
將擴(kuò)增的PCR片段上樣到1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用Qiagen 凝膠問收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化。PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒 pEF-ECD31gG-iRES-P用Xhol和NoU酶切過夜，然后用1%瓊脂糖凝 膠分離，用Qiagen凝膠回收試劑盒純化。連接Xhol - Notl PCR片 段和XhoI -Notl酶切后的質(zhì)粒pEF-ECD3工gG-IRES-R然后轉(zhuǎn)化DII5a
12感受態(tài)細(xì)胞。用XhoI和NotI酶切，篩選重組克隆。用NheI酶切這 一新構(gòu)建體pEF-ECD3-IRES-P質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠分離片段，并 用Qiagen凝膠回收試劑盒純化，再將pIRES質(zhì)粒主干自我連接，即 得到對照質(zhì)粒pEF-IRES-P，該質(zhì)粒不含任何ErbB3或IgGl-Fc序列。 實(shí)施例2
本例是闡述來自重組DNA分子的雙陷阱分子在哺乳動物宿主細(xì) 胞中的表達(dá)及其活化形式的純化。將質(zhì)粒pEF-ECD3IgG-IRES-P、質(zhì) 粒pEF-ECD3-IRES-P和對照質(zhì)粒pEF-IRES-P分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞， 用嘌呤霉素選擇，以得到質(zhì)粒穩(wěn)定整合的細(xì)胞群。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞向 培養(yǎng)基屮分泌ECD3IgG和ECD3單陷阱多肽。
293T感染細(xì)胞的western雜交結(jié)果表明，ErbB3特異性抗體沒 冇識別ErbB3單陷阱(泳道1)，但是用該抗體檢測到表達(dá)^溶性 ErbB3和可溶性ErbBl (同一多肽表達(dá)的)的多肽(泳道3和4)。這 些多肽含有2個不同ErbB胞外配體結(jié)合域的胞外配體結(jié)合部分，故 稱之為ErbB雙陷阱。用于單陷阱和雙陷阱的ErbB3胞外配休結(jié)合部 分之間的惟一區(qū)別是雙陷阱中ErbB3胞外配體結(jié)合部分的羧端多加 了 3個氨基酸。所以將耍修飾ErbB3單陷阱，使它包括這另外3個 氨基酸以及TEV蛋白酶識別序列和組氨酸標(biāo)簽，其包括ErbB3單陷 阱現(xiàn)有形式中并不存在的雙陷阱多肽?？梢酝ㄟ^PCR等已知方法將 這些元件加到ErbB3單陷阱多肽中。
實(shí)施例3
為檢測ErbB3單陷阱的功能，收集來自293T細(xì)胞的調(diào)整培養(yǎng) 基，過濾后用于培養(yǎng)BT474乳腺癌細(xì)胞?？梢杂^察到，BT474細(xì)胞在 分別用來自表達(dá)pEF-ECD3-IRES-P質(zhì)粒的293T細(xì)胞的調(diào)整培養(yǎng)基培 養(yǎng)和用來自表込pEF-IRES-P對照質(zhì)粒的293T細(xì)胞的調(diào)整培養(yǎng)基培 養(yǎng)48小時后，前者細(xì)胞數(shù)量顯著減少。
權(quán)利要求
1.一種對ErbB配體有結(jié)合親和力的結(jié)合分子，其中，該整個結(jié)合分子是ErbB受體或其一部分的胞外區(qū)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中，所述結(jié)合分子基本上可溶于水溶液中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中，所述結(jié)合分子進(jìn)一步包括ErbB受體的胞外域。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其進(jìn)一步包括來自ErbBl的胞外域。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其進(jìn)一步包括來自ErtB3的胞外域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求]所述的結(jié)合分子，其進(jìn)--歩包括來自ErbB4的胞外域。
7. —種含有重組DNA分子的真核細(xì)胞，該重組DNA分子中含有編碼部分ErbB受體蛋白的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生對Er"bB單個配體或多個配體有結(jié)合親和力的結(jié)合分子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生對ErbB配體有結(jié)合親和力的結(jié)合分子，該結(jié)合分子可溶于水溶液中。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞，其中，所述結(jié)合分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到所述細(xì)胞外，進(jìn)入周圍介質(zhì)中。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞，其中，所述結(jié)合分子進(jìn)_ -步包括ErbB受體的胞外域。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞，其進(jìn)_ -步包括來IlErbB]的胞外域。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞，其進(jìn)一步包括來fil':rbB3的胞外域。
14. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞，其進(jìn)一步包括來自ErblM的胞外域。
15. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞，其中，所述重組DNA分子含有Xa因子切割位點(diǎn)和人免疫球蛋白Gl的Fc部分。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生對ErbB單個配體或多個配體有結(jié)合親和力的結(jié)合分子。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生對ErbB配體有結(jié)合親和力的結(jié)合分子，該結(jié)合分子可溶于水溶液中。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞，其中，所述結(jié)合分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到所述細(xì)胞外，進(jìn)入周圍介質(zhì)屮。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞，其屮，所述結(jié)合分子進(jìn)一歩包括ErbB受體的胞外域。
20. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞其進(jìn)一步包括來ftErbBl的胞外域。
21. 根據(jù)權(quán)利耍求15所述的真核細(xì)胞其進(jìn)一歩包括來fi Ei"bB3的胞外域。
22. 報(bào)據(jù)權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞其進(jìn)一步包括來自ErhB4的胞外域。
全文摘要
本申請公開了一種新的基于ErbB的配體結(jié)合分子及其制備方法和應(yīng)用。該結(jié)合分子是由重組DNA分子表達(dá)的蛋白，該蛋白具有能與活化配體結(jié)合的ErbB胞外域。這些結(jié)合元件可作為陷阱，與循環(huán)中的配體結(jié)合，將其隔離開，使之無法與細(xì)胞ErbB受體結(jié)合。
文檔編號C07K14/00GK101495503SQ200680015608
公開日2009年7月29日 申請日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者J·E·希爾, S·S·巴庫斯 申請人:塔蓋替德分子診斷有限公司