專利名稱：特異性檢測(cè)結(jié)核桿菌感染的多肽、方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及能夠特異性檢測(cè)結(jié)核桿菌感染的 多肽、方法及試劑盒。 '
背景技術(shù)：
結(jié)核病(包括肺結(jié)核)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。診斷 結(jié)核病的方法有痰涂片檢查、病原體培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮下注射等傳統(tǒng)方法
和新興的ELISPOT免疫診斷方法。新興的ELISPOT診斷方法能將結(jié)核桿菌 的感染者與僅僅是注射了卡介苗的人相區(qū)別，所以比起傳統(tǒng)的方法，在靈 敏度與特異性上都有很大的提高。
ELISPOT方法診斷結(jié)核病的技術(shù)原理如下取被診斷者的血液，分離 出血液中的淋巴細(xì)胞，然后用結(jié)核桿菌特異性的抗原剌激這些細(xì)胞。如果 被診斷者是結(jié)核病感染者，那它的細(xì)胞就會(huì)在體外對(duì)結(jié)核桿菌抗原表現(xiàn)出 陽性反應(yīng)，這種陽性反應(yīng)可以通過ELISPOT技術(shù)以一系列的斑點(diǎn)(spot)的 方式顯示出來。否則就是陰性反應(yīng)，不會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)。
因此，決定結(jié)核病ELISPOT診斷技術(shù)特異性的物質(zhì)就是用于刺激的結(jié) 核桿菌抗原，它必須是結(jié)核桿菌特有的抗原，并且不能與人類自身抗原產(chǎn) 生交叉反應(yīng)。否則，應(yīng)用該方法診斷的特異性會(huì)降低，假陽性與假陰性會(huì) 增加。
目前，常見的采用ELISPOT方法診斷結(jié)核病的方案有兩種， 一種是英 國Immunotec公司的商業(yè)化的結(jié)核病診斷試劑盒TB-SPOT;另一種是以意大 利科學(xué)家Paolo Scarpellini為代表的科研用途的結(jié)核病診斷方案，該方案在文 獻(xiàn)Selected Pool of Peptides from ESAT-6 and CFP-10 Proteins for Detection of Mycobacterium tuberculosis Infection (該文獻(xiàn)的PubMed號(hào)為15297485)中有 詳細(xì)的說明。
這兩種方案都使用了結(jié)核桿菌的兩個(gè)蛋白ESAT-6和CFP-IO上的多肽 片段作為結(jié)核桿菌抗原，用作診斷用的ELISPOT剌激物。CFP-10上的多 肽片段51-70 (即取自該蛋白的第51-70氨基酸組成的多肽，序列為 AQAAVVRFQEAANKQKQELD)(序列表中Seq ID No.l)以其強(qiáng)烈的細(xì)
胞免疫原性，是目前所有結(jié)核病ELISPOT診斷方案中的必選多肽。在其它 多肽的選擇上，這兩種方案有些多肽相同，有些有差別。
但是，我們?cè)趯?shí)際的研究中，發(fā)現(xiàn)作為刺激物的多肽CFP-10 51-70的 特異性不夠理想，具體表現(xiàn)為假陽性偏高。也就是說，容易把非結(jié)核菌感 染者診斷為結(jié)核病人。但是如果去掉這條多肽，剩下的多肽的刺激強(qiáng)度又 不夠，容易漏檢真正的結(jié)核病人，也就是說假陰性偏高。因此，面對(duì)現(xiàn)有 結(jié)核病ELISPOT診斷技術(shù)這一缺點(diǎn)，迫切需要開發(fā)新的技術(shù)來解決這一問 題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種既能夠大大降 低檢測(cè)的假陽性率同時(shí)保證檢測(cè)準(zhǔn)確性的結(jié)核桿菌特異性抗原多肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述多肽，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試 驗(yàn)(ELISPOT)檢測(cè)生物樣品是否感染結(jié)核桿菌的方法。
本發(fā)明的再一 目的在于提供一種包含上述多肽并用于檢測(cè)生物體是否 感染結(jié)核桿菌的試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
本發(fā)明公開了一種具有結(jié)核桿菌免疫原性的多肽，所述多肽含有序列 表中Seq ID No.2所示的序列。
優(yōu)選的，所述多肽具有序列表中SeqlDNo.2所示的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測(cè)生 物樣品是否感染結(jié)核桿菌的方法，所述方法包括分離生物樣品的淋巴細(xì)胞， 并用結(jié)核桿菌特異性抗原進(jìn)行刺激，所述結(jié)核桿菌特異性抗原包含一種多 肽，所述多肽含有序列表中Seq ID No.2所示的序列。
優(yōu)選的，所述結(jié)核桿菌特異性抗原包含一種多肽，所述多肽具有序列 表中SeqlDNo.2所示的序列。
本發(fā)明還公開了一種用于檢測(cè)生物體是否感染結(jié)核桿菌的試劑盒，所 述試劑盒中包含結(jié)核桿菌特異性抗原，所述結(jié)核桿菌特異性抗原包含一種 多肽，所述多肽含有序列表中SeqlDNo.2所示的序列。
優(yōu)選的，所述結(jié)核桿菌特異性抗原包含一種多肽，所述多肽具有序列 表中Seq ID No.2所示的序列。
由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果 由于選用了特定的抗原性多肽，采用本發(fā)明的多肽、方法及試劑盒進(jìn)
行結(jié)核桿菌感染性檢測(cè)時(shí)，假陽性率大大降低，而真陽性率保持不變。
具體實(shí)施例方式
經(jīng)過精細(xì)的生物信息學(xué)研究和反復(fù)的臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，我們找到了結(jié)核
桿菌多肽CFP-IO 51-70作為剌激物的特異性差的真正原因。因?yàn)镃FP-IO 51-70的局部序列與人類基因組中的一個(gè)蛋白家族myosin 18A高度相似，進(jìn) 而導(dǎo)致二者存在細(xì)胞免疫學(xué)意義上的交叉反應(yīng)。CFP-10 51-70中的第10-19 個(gè)氨基酸的序列為EAANKQKQEL，而人類myosin 18A蛋白家族的isoform a (gi:28416946)及isoformb (gi:42794779)的第1784-1793個(gè)氨基酸的序列 為EEANKEKQEL?？梢钥吹?，在這個(gè)局部的epitope上，9個(gè)氨基酸中，竟 有7個(gè)完全相同。生物信息學(xué)的研究表明，二者的結(jié)構(gòu)非常相似。
Myosin基因家族是人類細(xì)胞中表達(dá)量極其豐富的一個(gè)蛋白家族，比如 組成肌肉的肌球蛋白就是它的成員myosin2。另有Myosinl、 2、 5都存在于 非肌細(xì)胞中，2型參與形成應(yīng)力纖維和胞質(zhì)收縮環(huán)，1、 5型結(jié)合在膜上與膜 泡運(yùn)輸有關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞富含myosin5。目前對(duì)myosin 18A的研究還不是很充 分，不知道它的具體功能。但是有一點(diǎn)非常明確，myosin 18A也是一種在 細(xì)胞中大量表達(dá)的蛋白。
根據(jù)獨(dú)特型免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說理論，為了維持人類免疫系統(tǒng)的平衡，每一 種人類自身抗原都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體或者自身抗原致敏的T細(xì)胞。由于 二者之間能保持一種恰當(dāng)?shù)钠胶猓@些自身免疫拮抗不僅沒有害，而且對(duì) 于維持免疫系統(tǒng)的正常功能是必須的。正是由于這類對(duì)自身myosin 18A蛋 白致敏的T淋巴細(xì)胞的存在，如果用靈敏度極高的ELISPOT技術(shù)，采用和人 類自身myosin 18A蛋白有交叉反應(yīng)的CFP-10 51-70多肽作為刺激物，可以在 正常人中也檢測(cè)出弱陽性反應(yīng)。這就是現(xiàn)在結(jié)核病ELISPOT診斷中特異性 不高(具體表現(xiàn)為假陽性偏高)的真正原因。
本發(fā)明就是要消除這種交叉反應(yīng)，提高結(jié)核病ELISPOT診斷中的特異性。
由于我們找到了導(dǎo)致現(xiàn)有結(jié)核病ELISPOT診斷方法特異性不高的真正 原因，所以我們可以采取正確的措施來消除這種細(xì)胞免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)， 從而提高診斷的特異性。經(jīng)過研究，我們采用了氨基酸保守替代法，即對(duì)
多肽CFP-IO 51-70上的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行保守替代，讓其在保持結(jié)核桿菌免疫 原性的同時(shí)，消除與人類myosinl8A蛋白抗原的交叉反應(yīng)。
經(jīng)過反復(fù)的研發(fā)與臨床實(shí)驗(yàn),我們將CFP-IO 51-70上的第17個(gè)氨基酸谷 氨酰胺(Q)替換成谷氨酸(E)，從而獲得了一條既能保持結(jié)核桿菌免疫原性， 又能消除與人類myosin 18A蛋白抗原的交叉反應(yīng)的新刺激物，我們命名為 DKW 51-70，其序列為AQAAWRFQEAANKQKEELD (序列表中Seq ID No.2)。生物信息學(xué)的研究表明，這個(gè)氨基酸的替換發(fā)生在引起交叉反應(yīng) 的7個(gè)相同氨基酸序列的核心部位，使得二者被混合識(shí)別而產(chǎn)生交叉反應(yīng)的 概率大大降低。同時(shí)，用谷氨酸代替谷氨酰胺又屬于同源替換，替換之后 仍然可以代表結(jié)核桿菌的抗原(但是已經(jīng)不能代表人類基因myosin 18A的 抗原了)，仍然可以有效刺激結(jié)核病人的T淋巴細(xì)胞。
我們的臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這種替換帶來的積極效果。采用新刺激物 DKW 51-70替換掉原來的CFP-10 51-70之后，結(jié)核病ELISPOT診斷試劑
盒的假陽性率明顯下降，而真陽性率維持不變。
下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。 實(shí)施例1
選擇58名健康志愿者，經(jīng)過傳統(tǒng)的結(jié)核桿菌素皮試檢測(cè)均為陰性反應(yīng)。 采用常規(guī)方法提取每一健康志愿者血液中的淋巴細(xì)胞，并把他們的淋巴細(xì) 胞分作兩部分，分別做結(jié)核病ELISPOT檢查。
具體步驟按照文獻(xiàn)Selected Pool of Peptides from ESAT-6 and CFP-10 Proteins for Detection of Mycobacterium tuberculosis Infection (PubMed 15297485)所列的方法進(jìn)行。其中第一部分使用的刺激多肽庫完全采用該 文獻(xiàn)中所列的多肽庫，即含有多肽CFP-IO 51-70 (SeqIDNo.l)。第二部分 使用同樣的多肽庫，但將其中的CFP-IO 51-70替換為本發(fā)明的多肽DKW 51-70 (SeqIDNo.2)。
健康志愿者都不應(yīng)該出現(xiàn)陽性反應(yīng)，凡是出現(xiàn)陽性反應(yīng)的都屬于假陽 性。結(jié)果使用CFP-10 51-70的試劑組，有12名出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，假陽性率 22%;使用DKW 51-70的試劑組只有7名出現(xiàn)假陽性反應(yīng)(其中5名CFP-10 51-70也診斷為陽性)，假陽性率12%。由此看出，采用本發(fā)明的多肽進(jìn)行 結(jié)核桿菌感染性檢測(cè)，假陽性率明顯降低。
實(shí)施例2
選擇23名臨床診斷為結(jié)核病患者的病人。采用常規(guī)方法提取病人血液 中的淋巴細(xì)胞，并把他們的淋巴細(xì)胞分作兩部分，分別做結(jié)核病ELISPOT檢查。
具體步驟按照文獻(xiàn)Selected Pool of Peptides from ESAT-6 and CFP-10 Proteins for Detection of Mycobacterium tuberculosis Infection (PubMed 15297485)所列的方法進(jìn)行。其中第一部分使用的刺激多肽庫完全采用該 文獻(xiàn)中所列的多肽庫，即含有多肽CFP-IO 51-70 (SeqIDNo.l)。第二部分 使用同樣的多肽庫，但將其中的CFP-10 51-70替換為本發(fā)明的多肽DKW 51-70 (SeqIDNo.2)。
結(jié)果兩個(gè)試劑組中，都有20名出現(xiàn)陽性反應(yīng)，診斷的靈敏度完全相同， 都是87%。這說明，對(duì)于結(jié)核病患者，本發(fā)明的多肽DKW 51-70(Seq ID No.2) 與現(xiàn)有的CFP-IO 51-70 (Seq ID No.l)相比，可以獲得完全相同的刺激效果， 真陽性率保持不變。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說 明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若 干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表 <110>深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司 <120>特異性檢測(cè)結(jié)核桿菌感染的多肽、方法及試劑盒 <130> 0710220JYC <160> 2
< 170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 20
<212〉 PRT <213>人工序列
<400> 1
Ala Gin Ala Ala Val Val Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys Gin Lys 15 10 15
Gin Glu Leu Asp 20
<210> 2
<211> 20
<212〉 PRT <213>人工序列
<400> 2
Ala Gin Ala Ala Val Val Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys Gin Lys 15 10 15
Glu Glu Leu Asp 20
權(quán)利要求
1.一種具有結(jié)核桿菌免疫原性的多肽，其特征在于所述多肽含有序列表中Seq ID No.2所示的序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有結(jié)核桿菌免疫原性的多肽，其特征 在于所述多肽具有序列表中Seq ID No.2所示的序列。
3、 一種采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測(cè)生物樣品是否感染結(jié) 核桿菌的方法，所述方法包括分離生物樣品的淋巴細(xì)胞，并用結(jié)核桿菌特 異性抗原進(jìn)行刺激，其特征在于所述結(jié)核桿菌特異性抗原包含一種多肽， 所述多肽含有序列表中Seq ID No.2所示的序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述結(jié)核桿菌特異性抗 原包含一種多肽，所述多肽具有序列表中Seq ID No.2所示的序列。
5、 一種用于檢測(cè)生物體是否感染結(jié)核桿菌的試劑盒，所述試劑盒中包 含結(jié)核桿菌特異性抗原，其特征在于所述結(jié)核桿菌特異性抗原包含一種 多肽，所述多肽含有序列表中SeqlDNo.2所示的序列。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述結(jié)核桿菌特異性 抗原包含一種多肽，所述多肽具有序列表中SeqlDNo.2所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有結(jié)核桿菌免疫原性多肽，所述多肽含有序列表中Seq ID No.2所示的序列。本發(fā)明還公開了利用上述多肽檢測(cè)生物樣品是否感染結(jié)核桿菌的ELISPOT方法，以及包含上述多肽的試劑盒。采用本發(fā)明的多肽、方法及試劑盒進(jìn)行結(jié)核桿菌感染性檢測(cè)時(shí)，假陽性率大大降低，而真陽性率保持不變。
文檔編號(hào)C07K7/00GK101367867SQ20071007574
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2007年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月14日
發(fā)明者朱義鑫 申請(qǐng)人:深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司