專利名稱：CAL和mGluR的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用組織內(nèi)GST融合蛋白沉降、原核細胞內(nèi)GST融合蛋白沉降、真核細胞內(nèi)GST融合蛋白沉降、免疫共沉淀及細胞免疫熒光等技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證實了CAL和代謝型谷氨酸受體-5(mGluR5)相互作用。并通過轉(zhuǎn)染、Western Blot、RT-PCR等技術(shù)證實CAL蛋白的細胞表達能促進mGluR5的表達，推測了CAL促進mGluR5表達的可能性機制。對于闡述mGluR5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用提供了新的分子機制，為治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的潛在的藥物作用靶標。本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新方法、新蛋白的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
mGluR5在紋狀體、海馬及大腦皮質(zhì)區(qū)域大量表達。它經(jīng)G蛋白，1、4、5-三磷酸肌醇(IP3)和Ca2+等細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，如參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的可塑性、加強大腦皮質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞。在紋狀體內(nèi)，它可加強NMDA受體的神經(jīng)毒性作用，并與底丘腦核及多巴胺(DA)系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系，可能參與調(diào)節(jié)基底節(jié)的運動，并可能與帕金森病(PD)動物模型中錐體外系癥狀的產(chǎn)生有關(guān)。在海馬內(nèi)，mGluR5可形成長時程增強效應(yīng)(LTP)，與學(xué)習和記憶有關(guān)。此外，痙攣、癲癇、抑郁、焦慮與疼痛的發(fā)生都與mGluR5有密切的聯(lián)系，但目前對mGluR5作用的分子調(diào)控機制仍不十分清晰。
很多GPCRs的羧基端含有可以和PDZ結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的區(qū)域。mGluR5屬于GPCRs家族中的一員，其羧基末端也具有PDZ蛋白(含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))的結(jié)合序列(PDZ bindingmotif)ST/SL序列。2002年Kitano J等人報道m(xù)GluR5可以與PDZ蛋白Tamalin特異性結(jié)合而促經(jīng)mGluR5在細胞質(zhì)膜上的表達。
在GPCRs的研究領(lǐng)域中，目前非G蛋白對受體的調(diào)控是研究的熱點之一。本實驗室的研究結(jié)果顯示腎上腺能受體(β1AR)可以與一些PDZ蛋白如MAGI-2、MAGI-3以及CAL(cystic fibrosis transmembrane conductance regulatorassociatedligand)特異性結(jié)合。其中MAGI-2可促進β1AR的減敏，MAGI-3能抑制β1AR所引起的MAPK的活化而CAL可以調(diào)節(jié)新合成β1AR在細胞內(nèi)的運輸?；谖覀儗Ζ?AR的研究經(jīng)驗和Kitano J的報道，我們推測PDZ家族的其他成員也有可能與mGluR5相結(jié)合而調(diào)節(jié)其生理性質(zhì)。
由于mGluR5在紋狀體、海馬及大腦皮質(zhì)區(qū)域大量表達，我們利用mGluR5羧基末端的GST融合蛋白沉降腦組織蛋白裂解液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GST-mGluR5-CT與GST陰性對照比較在75KD-58KD之間和75KD以上的位置能沉降出幾種蛋白，提示mGluR5羧基末端可能與幾種兔腦蛋白相結(jié)合。將樣品經(jīng)雙向電泳分析，根據(jù)差異點的等電點和分子量，加上實驗室前期工作基礎(chǔ)上，我們推測在這幾種蛋白質(zhì)中可能存在CAL。沉降復(fù)合物用特異性的CAL抗體進行免疫印跡分析，結(jié)果顯示mGluR5羧基末端可以與CAL相結(jié)合。
發(fā)明目的通過組織內(nèi)GST融合蛋白沉降篩選出與mGluR5相結(jié)合的PDZ蛋白CAL。通過體外實驗(GST-Pull down)與細胞內(nèi)實驗(免疫共沉淀)相結(jié)合，生化及分子生物學(xué)方法與形態(tài)學(xué)方法(細胞免疫熒光)相結(jié)合，來充分研究mGluR5與CAL的相互作用。在確定CAL/mGluR5相互作用后，繼續(xù)研究CAL的細胞表達對mGluR5表達的影響，CAL蛋白不增加mGluR5基因的轉(zhuǎn)錄。
CAL和mGluR5相互作用并促進其表達對闡述mGluR5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的分子機制提供了新的理論依據(jù)，為治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的潛在的藥物作用靶標。內(nèi)容與要求CAL和mGluR5相互作用，CAL蛋白的細胞表達促進mGluR5的表達，而CAL蛋白不增加mGluR5基因的轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)明涉及以下幾個實驗結(jié)果1.GST-mGluR5對兔腦組織勻漿Pull-down考馬斯亮藍染色和免疫印跡分析結(jié)果，2.GST-mGluR5對CAL的PDZ結(jié)構(gòu)域Pull-down，3.GST-mGluR5對CAL完整蛋白質(zhì)分子Pull-down，4.mGluR5和CAL完整蛋白質(zhì)分子在COS-7細胞的免疫共沉淀，5.mGluR5和CAL完整蛋白質(zhì)分子在BHK細胞的激光共聚焦亞細胞共定位，6.CAL在COS-7中促進mGluR5表達的免疫印跡分析，7.CAL蛋白的細胞表達對mGluR5基因轉(zhuǎn)錄的影響。
以上所述及的實驗內(nèi)容和結(jié)果也即本發(fā)明的技術(shù)指標。


圖1.
組織Pull-downA.考馬斯亮蘭染色結(jié)果，結(jié)果顯示GST-mGluR5-CT與GST陰性對照比較在75KD-58KD之間和75KD以上的位置能沉降出幾種蛋白。提示mGluR5羧基末端可能與幾種兔腦蛋白相結(jié)合。
B.用特異性抗體CAL免疫印跡分析，第1道為含CAL蛋白的兔腦組織裂解液上清，進行GST融合蛋白沉降實驗后，在GST-mGluR5-CT的沉降復(fù)合物中能夠檢測到CAL蛋白的存在(第3道)，在單獨GST蛋白的沉降復(fù)合物中檢測不到CAL(第2道)。顯示mGluR5羧基末端與兔腦蛋白CAL相互作用，箭頭所指為蛋白質(zhì)CAL。
圖2.
原核Pull-down分析結(jié)果，第1道為含His-CAL-PDZ融合蛋白的細菌裂解液上清，進行GST融合蛋白沉降實驗后，在GST-mGluR5-CT-wt的沉降復(fù)合物中能夠檢測到His-CAL-PDZ蛋白的存在(第3道)，在單獨GST蛋白的沉降復(fù)合物中檢測不到His-CAL-PDZ(第2道)，當mGluR5羧基末端-1和-3位分別突變?yōu)楸彼釙r，在相應(yīng)的GST-mGluR5-CT融合蛋白的沉降復(fù)合物中均檢測不到His-CAL-PDZ蛋白的存在(第4道與第6道)，當mGluR5羧基末端0和-2位分別突變?yōu)楸彼釙r，在相應(yīng)的GST-mGluR5-CT融合蛋白的沉降復(fù)合物中均檢測His-CAL-PDZ蛋白的存在(第5道與第7道)。說明mGluR5羧基末端-1和-3位突變能明顯抑制其與CAL的結(jié)合。箭頭所指的為His-CAL。
圖3.
真核Pull-down分析結(jié)果，第1道為轉(zhuǎn)染HA-CAL的細胞裂解液，在等量的轉(zhuǎn)染HA-CAL的細胞裂解液進行GST融合蛋白沉降實驗后，在GST-mGluR5-CT-wt的沉降復(fù)合物中能夠檢測到HA-CAL蛋白的存在(第3道)，在單獨GST蛋白的沉降復(fù)合物中檢測不到HA-CAL(第2道)，當mGluR5羧基末端最后一個氨基酸Ser突變?yōu)锳la時，在相應(yīng)的GST-mGluR5-CT融合蛋白的沉降復(fù)合物中檢測不到CAL蛋白的存在(第4道)。說明mGluR5羧基末端能與CAL蛋白完整的蛋白質(zhì)分子發(fā)生作用，并且mGluR5羧基末端的突變能明顯抑制其與CAL的結(jié)合。箭頭所指的為HA-CAL。
圖4.
免疫共沉淀分析完整蛋白質(zhì)分子mGluR5和CAL的相互作用。
圖B第2道為單獨轉(zhuǎn)染HA-CAL的細胞裂解液，圖B和C第3道為共轉(zhuǎn)染HA-CAL和Flag-mGluR5的細胞裂解液。在單獨轉(zhuǎn)染HA-CAL的細胞內(nèi)，免疫沉淀復(fù)合物中檢測不到HA-CAL蛋白(A第2道)；在空白細胞COS-7內(nèi)，免疫沉淀復(fù)合物中檢測不到HA-CAL蛋白(A第1道)；而在共轉(zhuǎn)染HA-CAL和Flag-mGluR5的細胞內(nèi)，可在其免疫沉淀復(fù)合物中檢測到HA-CAL(第3道)。這表明在細胞內(nèi)完整的CAL蛋白能與mGluR5發(fā)生相互作用。
圖5.
免疫熒光激光共聚焦共定位a.mGluR5單獨轉(zhuǎn)染在BHK亞細胞定位 b.CAL單獨轉(zhuǎn)染在BHK亞細胞定位c.mGluR5在CAL存在條件下在BHK亞細胞定位 d.CAL在mGluR5存在條件下在BHK亞細胞定位e.CAL與mGluR5在BHK亞細胞共定位圖6.
隨著細胞內(nèi)CAL增加，mGluR5也隨之增加。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析(9B)顯示0.60ug組與對照組相比，兩組間的差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(**P＜0.01，n＝4)；0.15ug組、0.30ug、1.20ug組與對照組相比，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05，n＝4)。表明CAL能增加mGluR5蛋白的表達水平。
圖7.
A圖提取的細胞總RNA，第一道為-/pCDNA3-Flag-mGluR5組總RNA，第二道為pBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5組總RNA。
B圖第一、三道分別為-/pCDNA3-Flag-mGluR5、pBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5組β-actin PCR產(chǎn)物，第二、四道分別為-/pCDNA3-Flag-mGluR5、pBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5組mGluR5PCR產(chǎn)物。
C圖pBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5組細胞內(nèi)mGluR5的RNA水平低于-/pCDNA3-Flag-mGluR5組。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，兩組之間的差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05，n＝3)。
實施例1.GST-mGluR5-CT融合蛋白篩選兔腦組織中與其相結(jié)合的PDZ蛋白1.1腦蛋白制備1)取健康雌性新西蘭兔，用手術(shù)剪將頭部切除，用骨鉗剝離兔腦。將兔腦放在冰上，用PBS將腦組織清洗干凈，然后剪成組織碎塊，稱濕重。
2)勻漿將組織放入勻漿器并以100mg/ml比例加入組織裂解液。手動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
3)12000rpm離心，4℃，20min。
4)取少量上清進行定量。
組織裂解液的配制方法HEPES10mMNaCl 50mMEDTA 5mMTriton X-100 1.0％Benzamidine 1mM1.2GST-融合蛋白誘導(dǎo)與純化
1.2.1GST-融合蛋白誘導(dǎo)表達1)將構(gòu)建的GST融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21中，挑單克隆菌株接種到5-10ml LB培養(yǎng)液中(根據(jù)菌株抗性加入相應(yīng)抗生素)，在37℃搖床內(nèi)以250rpm/min搖菌過夜。
2)取3ml菌液接種到1L的LB培養(yǎng)液中(根據(jù)菌株的抗性加入相應(yīng)的抗生素)，在37℃搖床內(nèi)以250rpm/min搖菌2-3h，間斷性測菌液OD600吸光度值至0.6-0.7之間為最佳。
3)加入IPTG(終濃度達到500μmol/L)在37℃搖床內(nèi)以250rpm/min誘導(dǎo)細菌生長2h。
4)收集培養(yǎng)液4℃，以3000rpm離心30min，棄去上清，保留沉淀。
5)沉淀中加入25ml預(yù)先配制的預(yù)冷的Harvest buffer液重懸菌體，超聲破菌(輸出功率10w，總計10-15分鐘，脈沖1次/1.5s)。于4℃以15000rpm離心20min，上清移至新的高速離心管中。取部分上清加入等量的2×蛋白上樣緩沖液混勻，95℃ 5min后取出適量樣品進行SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色。
1.2.2GST-融合蛋白鑒定(考馬斯亮藍染色)(1)蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE。
(2)將PAGE膠放入染色液中，室溫輕搖1h。
(3)然后將膠放入脫色液中輕搖，直至膠的背景變?yōu)榘咨纯伞?br> (4)將膠應(yīng)用干膠儀干燥后保存。
試劑的配制(1)考馬斯亮藍染色液(1L/1×)Coomassie Blue R250 1g去離子水 500ml乙酸 100ml甲醇 400ml(2)脫色液 (1L/1×)去離子水 500ml乙酸 100ml甲醇 400ml1.2.3GST-融合蛋白純化1)鑒定蛋白表達成功后進行蛋白純化，加入硫酸鏈霉素(10mg/L)混勻，于4℃15000rpm離心20min，上清移至另一新的低速離心管中。
2)加入Glutathione-Sepharose 4B 60mg，4℃上下顛倒孵育3h。
3)4℃，3000rpm/min離心1min，吸棄上清，再加入30ml冰預(yù)冷的Harvest buffer液混勻后再離心(4℃，3000rpm/min，離心1min)。
4)重復(fù)上述步驟(3)兩次。
5)最后用1ml Harvest buffer重懸Glutathione-Sepharose 4B。
6)取50μl上述樣品加入50μl 2×蛋白上樣緩沖液混勻，置于95℃5min后取出適量樣品進行蛋白純化后的SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色鑒定蛋白純化的效果。
Harvest buffer配制的方法 總體積25mlHEPES液 (1mol/l pH7.4) 250μlNacl液 (1mol/l) 1.25mlBenzamidine 0.004gEDTA液 (0.5mol/l PH8.0) 250μlH2O23.25ml1.3GST融合蛋白沉降實驗1)取等量結(jié)合于Glutathione-Sepharose 4B的GST及GST-mGluR5-CT融合蛋白，加入1ml腦蛋白上清，于4℃旋轉(zhuǎn)孵育3h。
2)3000rpm 4℃2min離心收集Glutathione-Sepharose 4B，小心吸棄上清，留沉淀。
3)沉淀物加入1ml Wash Buffer I，輕輕混勻3000rpm 4℃2min，小心吸棄上清，留沉淀。
4)重復(fù)步驟3)三次。
5)沉淀物加入1ml Wash Buffer II，輕輕混勻3000rpm 4℃2min，小心吸棄上清，留沉淀。
6)在沉降復(fù)合物中加入適量的蛋白電泳上樣緩沖液，95℃5min，離心后取上清。樣品經(jīng)SDS-PAGE后，進行考馬斯亮藍染色與免疫印跡分析。
Wash Buffer IHEPES10mMNaCl 50-100mMEDTA 5mM
Tween20 0.1％BSA 3gBenzamidine 1mM(使用前臨時加入)Wash Buffer IIHEPES 10mMNaCl50-100mMEDTA5mMTween20 0.1％Benzamidine 1mM(使用前臨時加入)1.3.1考馬斯亮藍染色沉降復(fù)合物樣品(具體方法見1.2.2)1.3.2免疫印跡分析沉降復(fù)合物樣品(1)樣品經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。
(2)用封閉液室溫封閉1h，TBST洗膜三次，每次10min。
(3)加入用抗體稀釋液稀釋的一抗(anti-PIST，1∶1000)，室溫輕搖1h，TBST洗膜三次，每次10min。
(4)加入用抗體稀釋液稀釋的HRP標記的二抗(1∶3000)，室溫輕搖1h，TBST洗膜三次，每次10min。
(5)ECL試劑盒顯色3min，X-光片顯影。
2.原核細胞內(nèi)GST融合蛋白沉降實驗2.1His融合蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定1)將重組表達質(zhì)粒His-CAL-PDZ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21(DE3)中，挑單克隆菌株接種到5-10ml LB培養(yǎng)液中(根據(jù)菌株抗性加入相應(yīng)抗生素)，在37℃搖床內(nèi)以250rpm/min搖菌過夜。
2)取3ml菌液接種到1L的LB培養(yǎng)液中(根據(jù)菌株的抗性加入相應(yīng)的抗生素)，在37℃搖床內(nèi)以250rpm/min搖菌2-3h，間斷性測菌液OD600吸光度值，至0.6-0.7之間為最佳。
3)加入IPTG(終濃度達到500μmol/L)，在37℃搖床內(nèi)以250rpm/min誘導(dǎo)細菌生長2h。
4)4℃，3000rpm離心30min收菌，棄上清，留沉淀。
5)沉淀中加入25ml預(yù)先配制的預(yù)冷的Harvest buffer液重懸菌體，超聲破菌(輸出功率10w，總計10-15分鐘，脈沖1次/1.5s)。于4℃以15000rpm離心20min，上清移至新的高速離心管中。取部分上清加入等量的2×蛋白上樣緩沖液混勻，95℃5min后取出適量樣品進行SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色鑒定。
2.2GST融合蛋白沉降實驗(1)取等量經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的含His-CAL-PDZ的細菌裂解液上清。
(2)分別加入等量結(jié)合于Glutathione-Sepharose 4B的GST及GST-mGluR5-CT及其四個突變體的融合蛋白，于4℃旋轉(zhuǎn)孵育2h。
(3)離心收集Glutathione-Sepharose 4B，按1.3的方法充分洗滌。
(4)在沉降復(fù)合物中加入適量的蛋白電泳上樣緩沖液，95℃加熱5min，然后離心后取上清，得到免疫印跡分析樣品。
(5)將樣品進行免疫印跡分析，具體方法參見1.3.2，一抗為anti-His(1∶1000)。
3.真核細胞內(nèi)GST融合蛋白沉降實驗3.1細胞準備COS-7細胞在完全培養(yǎng)基(高糖DMEM，10％胎牛血清，1％青霉素，1％硫酸鏈霉素)37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.2轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前將細胞接種至塑料平皿中，在光鏡下觀察細胞，當細胞密度占培養(yǎng)皿生長表面70％-80％時轉(zhuǎn)染。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?，所需DNA的量不同。
具體步驟(1)稀釋DNA若轉(zhuǎn)染90mm平皿用250ul0.9％NaCl稀釋；若轉(zhuǎn)染至6-Well板用100ul0.9％NaCl稀釋；輕輕震蕩混勻，靜置5min。
(2)稀釋Hifectin II按1ugDNA∶2ul Hifectin II的比例將Hifectin II用0.9％NaCl稀釋；輕輕震蕩混勻，靜置5min。
(3)將稀釋Hifectin II加到稀釋DNA，輕輕震蕩混勻，靜置20min。
(4)同時將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基換為新鮮無血清培養(yǎng)基。
(5)放在37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后換成完全培養(yǎng)基。
(6)CO2恒溫培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時表達基因。
3.3GST融合蛋白沉降實驗3.3.1細胞蛋白的提取1)去培養(yǎng)液后用溫熱的PBS沖洗2～3遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。
2)90mm培養(yǎng)皿中加入1ml的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上2-5min。
3)用細胞刮刮下細胞，4℃，上下顛倒混勻30min。
4)12000rpm離心，4℃，15min，取上清至新鮮高壓滅菌的1.5ml EP中。
細胞裂解液的配制方法HEPES 10mMNaCl50mMEDTA5mMTriton X-1001.0％Benzamidine 1mM(使用前臨時加入)3.3.2GST融合蛋白沉降實驗1)取等量經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染表達含HA-CAL的細胞裂解液上清。
2)分別加入等量結(jié)合于Glutathione-Sepharose 4B的GST及GST-mGluR5-CT及其突變體SSSA的融合蛋白，于4℃旋轉(zhuǎn)孵育2h。
3)離心收集Glutathione-Sepharose 4B，按1.3的方法充分洗滌。
4)在沉降復(fù)合物中加入適量的蛋白電泳上樣緩沖液，95℃加熱5min，然后離心后取上清，得到免疫印跡分析樣品。
5)將樣品進行免疫印跡分析，具體方法參見1.3.2，一抗為anti-HA(1∶1000)。
4.免疫共沉淀4.1.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染COS-7細胞在含10％胎牛血清及1％青霉素和鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將-/PBK-CMV-HA-CAL以及PBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5轉(zhuǎn)染密度適宜的COS-7細胞，轉(zhuǎn)染試劑為Hifectin II，具體方法參見3.2。
4.2.細胞蛋白的提取具體方法見3.3.14.3免疫共沉淀1)取上清，留取少量作免疫印跡對照，1ml蛋白上清液中加入30μl anti-Flag M2 affinitygel，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2h。
2)3000rpm離心，4℃，1min收集免疫沉淀復(fù)合物按，1.3的方法充分洗滌。
3)在沉降復(fù)合物中加入適量的蛋白電泳上樣緩沖液，95℃加熱5min，然后離心后取上清，得到免疫印跡分析樣品。
4)將樣品進行免疫印跡分析，具體方法參見1.3.2，一抗為anti-HA(1∶1000)
5.細胞免疫熒光5.1玻璃爬片的處理將蓋玻片置入濃酸中浸泡2小時，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理過的蓋玻片投入十倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5min后取出于60℃干燥1小時或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
5.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染BHK細胞接種至玻璃爬片上在含10％胎牛血清及1％青霉素和鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達到適宜的密度時將-/PBK-CMV-HA-CAL、PBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5轉(zhuǎn)染至BHK細胞，轉(zhuǎn)染試劑為Hifectin II，具體方法參見3.2。
5.3細胞免疫熒光染色(1)細胞固定轉(zhuǎn)染后36h用D-PBS清洗細胞3次，每次5分鐘，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，用4％多聚甲醛室溫固定30分鐘。
(2)2％BSA/D-PBS漂洗細胞3次，每次5分鐘。
(3)細胞透化室溫下，用Saponin緩沖液室溫孵育30分鐘。
(4)一抗孵育將蓋玻片有細胞的一面朝上，用Saponin緩沖液(anti-HA 1∶100anti-Flag1∶250)稀釋一抗并點在蓋玻片上(如過進行雙免疫熒光分析則同時加入兩種一抗)，室溫1小時或4℃過夜。
(5)用Saponin緩沖液清洗細胞3次，每次5分鐘。
(6)孵育二抗將蓋玻片有細胞的一面朝上，用Saponin緩沖液稀釋二抗(FITC標記山羊抗兔IgG 1∶100，羅丹明標記山羊抗大鼠IgG 1∶100)并點在蓋玻片上(如過進行雙免疫熒光分析則同時加入兩種二抗)，室溫30分鐘。
(7)D-PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。
(8)封片取15ul封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細胞的一面朝下封片。有關(guān)緩沖液的配制(1)濃酸濃硝酸∶濃鹽酸＝2∶1(V/V)(2)D-PBS(PH7.4 1L/1×)NaCl 8.0gKCl 0.2gMgCl2·6H2O 0.1gNa2HPO4·12H2O 2.90g
CaCl2 0.1gKH2HPO4 0.2g(3)封閉液2％BSA/D-PBS(4)透化液Saponin Buffer(2％BSA/D-PBS/0.04％Saponin)(5)4％多聚甲醛固定液60ml D-PBS中加入4g多聚甲醛，在60-80℃水浴中滴加1mol/ml的NaOH至溶解透明。待溶液冷卻至15℃時用HCl將PH調(diào)至7.0。最后用D-PBS定容至100ml。
(6)封片劑用D-PBS制備70％的甘油6.CAL促進mGluR5蛋白表達的實驗6.1.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染(1)COS-7細胞在含10％胎牛血清及1％青霉素和鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2)將COS-7細胞接種至35ml的細胞培養(yǎng)皿中，當細胞密度達到80％左右時，將不同劑量的pBK-CMV-HA-CAL質(zhì)粒(0、0.15、0.30、0.60、1.20ug)分別和相同劑量pCDNA3-Flag-mGluR5(0.5ug)共同轉(zhuǎn)染COS-7細胞，轉(zhuǎn)染試劑為HifectinII，具體方法參見3.2。
6.2收集細胞樣品1)轉(zhuǎn)染后36小時，收集細胞樣品。
2)棄去舊的細胞培養(yǎng)基，用溫熱的PBS清洗細胞兩次。將培養(yǎng)皿倒扣到濾紙上，取出殘留的PBS。
3)加入200ul1.5×蛋白上樣緩沖液，用細胞刮刮下細胞至1.5mlEP管。
4)超聲(100～200w)3s，2次。
6.3免疫印跡分析細胞樣品具體方法參見1.3.2，一抗為anti-HA(1∶1000)、anti-mGluR5(1∶2000)以及anti-β-actin(1∶500)。
7.細胞總RNA的提取及RT-PCR實驗7.1轉(zhuǎn)染pBK-CMV-HA-CAL/pCDNA3-Flag-mGluR5、-/pCDNA3-Flag-mGluR5分別轉(zhuǎn)染COS-7細胞。
7.2總RNA提取轉(zhuǎn)染后36小時，分別提取各皿細胞的總RNA。(所有移液器吸頭及離心管均用DEPC處理過)1)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后的細胞吸棄培養(yǎng)基，DEPC處理過的PBS洗兩次，加入Trizol(1mlTrizol/直徑35mm的平皿)將樣品吹下并轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，冰上放置10min。
2)加入200μl氯仿/1ml Trizol裂解液，充分顛倒混勻，冰上放置5min。
3)4℃12000rpm離心15min。
4)小心吸取上層的水相移至新的離心管中，等體積的異丙醇(一般500μl/1ml Trizol裂解液)，冰上放置10min。
5)4℃12000rpm離心10min。
6)棄上清，加入1ml無RNA酶的75％的乙醇，懸浮沉淀在管底的RNA。
7)4℃12000rpm離心5min。
8)棄去乙醇并盡量完全吸去管壁上的液體，敞開管口室溫干燥10min。
9)加入20μl DEPC處理水/1ml Trizol裂解液溶解RNA沉淀。55℃-60℃水浴促進其溶解。
10)取1μl RNA用紫外分光光度計進行定量，其余放入-80℃冰箱保存。
11)以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的總RNA。
7.3RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按下表將各種成分加入PCR管中，總體積為20μl。

混勻，室溫放置10min，42℃保溫1h，冰上放置2min。獲得的cDNA于-20℃保存待用。
7.4RT-PCR
1)引物設(shè)計mGluR5的羧基末端引物5′-AAA CCA GAT CTG GAG GAG C-3′5′-CGA TGA AGA ACT CTG CGT G-3′β-actin引物5′-CCC ATC TAC GAG GGC TAC GC-3′5′-AGG AAG GAG GGC TGG AAC A-3′2)反應(yīng)體系如下表

3)PCR最佳反應(yīng)程序如下94℃5分鐘→94℃40秒→55℃40秒→72℃40秒→72℃7分鐘→30循環(huán)。
4)PCR產(chǎn)物的鑒定及分析取PCR產(chǎn)物5μl，加入6×上樣緩沖液1μl，在2％的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，并用紫外凝膠成像儀掃描并保存結(jié)果，以ImageJ軟件定量分析。
7.5統(tǒng)計方法采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及兩個蛋白mGluR5/CAL之間的相互作用以及CAL的細胞表達能促進mGluR5表達，并且CAL蛋白不增加mGluR5基因的轉(zhuǎn)錄。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之二個蛋白mGluR5/CAL之間的相互作用，其特征在于mGluR5羧基末端四個氨基酸，0、-1、-2號位的Ser換為Ala，-3號位的Leu換為Ala，體外原核GST-Pulldown結(jié)果mGluR5的-1和-3位突變會徹底破壞與CAL的相互作作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之二個蛋白mGluR5/CAL之間的相互作用，其特征在于在細胞內(nèi)兩完整蛋白質(zhì)分子相互作用，在mGluR5影響下CAL由彌散分布于胞漿轉(zhuǎn)為分布在細胞膜上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述之二個蛋白mGluR5/CAL之間的相互作用，其特征在于CAL的細胞表達能夠促進mGluR5的表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述CAL促進mGluR5表達的機制，CAL蛋白不增加mGluR5基因的轉(zhuǎn)錄。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩個蛋白質(zhì)mGluR
文檔編號C07K14/435GK101045925SQ200710086478
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
發(fā)明者張紅, 馬艷梅, 賀俊崎, 熊英 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)