專利名稱：一種二維毛細(xì)管電泳裝置及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二維毛細(xì)管電泳裝置，具體地說(shuō)是一種新型二維毛細(xì)管電
泳(2D-CE)分離裝置及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管電泳(CE)具有分離效率高、分析速度快和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。 但是常規(guī)的CE方法，由于受到應(yīng)用電壓的限制，所采用分離柱的長(zhǎng)度有限， 進(jìn)而影響了實(shí)際柱效和可能達(dá)到的峰容量。此外，由于毛細(xì)管的光程短， 所以CE的檢測(cè)靈敏度較低。這些缺點(diǎn)都限制了 CE在復(fù)雜生物樣品分析中 的應(yīng)用。因此，通過(guò)選擇正交的CE模式，發(fā)展具有高峰容量和高檢測(cè)靈敏 度的2D-CE具有重要意義。
目前，2D-CE在分離蛋白質(zhì)方面已有諸多報(bào)道[文獻(xiàn)1: Michels， D. A.; Hu, S.; Schoenherr, R. M.; Eggertson, M. J.; Dovichi, N. J. Mol. Cell. Proteomics 2002, 7, 69-74. 文獻(xiàn)2: S. Hu, D. Michels， M.A. Fazal, C. Ratisoontom, M丄.Cunningham, N.J. Dovichi, Anal. Chem.,2004, 76, 4044-4049. 文獻(xiàn)3: Sheng, L.; Pawliszyn， J. Analyst 2002, 127, 1159-1163.]。 由于C正F具有較強(qiáng)的富集能力(Shen, Y.等[文獻(xiàn)4: Shen， Y.; Berger, S. J.; Anderson, G. A.; Smith, R. D. Anal. Chem. 2000, 72， 2154-2159.]報(bào)道C正F的 富集倍數(shù)高達(dá)540倍)，是2D-CE的最佳第一維分離模式。目前已被用于 CIEF-CZE分離核糖核酸酶[文獻(xiàn)5: C. Yang， L. Zhang， H. Liu, W. Zhang， Y. Zhang, J.Chromatog.A, 2003， 1018， 97—103.]和肌紅蛋白、血紅蛋白的混合 物[文獻(xiàn)6: H. Liu, L. Zhang, G. Zhu, W. Zhang, and Y. Zhang, Anal. Chem. 2004,76,6506-6512.]、 CIEF-CGE分離血紅蛋白[文獻(xiàn)7: C. Yang, H. Liu, Q. Yang, L. Zhang, W. Zhang, and Y. Zhang, Anal. Chem. 2003, 75, 215-218.]、 C正F-CNGSE分離小鼠肺癌細(xì)胞的分泌蛋白提取物[文獻(xiàn)8: H. Liu, C. Yang, Q. Yang, W. Zhang, Y. Zhang, J. Chromatogr. B, 2005, 817 , 119—126.]、 CIEF-CITP/CZE分離細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A和碳酸酐酶的酶解產(chǎn)物[文獻(xiàn) 9 : Mohan, D., Lee, C. S., Electrophoresis 2002, 23, 3160—3167.]、 CIEF-HFF1FFF分離人的尿蛋白[文獻(xiàn)10: Dukjin Kang and Myeong Hee Moon, Anal. Chem. 2006, 78, 5789-5798.]和CIEF-CEC分離去除白蛋白的人血清[文 獻(xiàn)l 1: M. Zhang and Rassi Z. E.， J. Proteome Res., 2006, 5, 2001-2008.] 。 CIEF 使用的兩性電解質(zhì)不僅具有較高的緩沖能力，并且有助于建立穩(wěn)定的pH梯 度。然而，兩性電解質(zhì)在低紫外波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)，會(huì)降低樣品的檢測(cè)靈敏 度。盡管在上述構(gòu)建的二維系統(tǒng)中均有去除兩性電解質(zhì)的接口，但是去除 效果不是很完全，會(huì)影響后續(xù)的分離檢測(cè)。ChunYang等[文獻(xiàn)12: C.Yang,G. Zhu， L. Zhang, W. Zhang, Y. Zhang, Electrophoresis 2004, 25， 1729—1734.]
通過(guò)將兩性電解質(zhì)共價(jià)鍵合到毛細(xì)管整體柱中形成固定化pH梯度可以有效 地解決上述問(wèn)題，但尚未用于2D-CE的構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可顯著提高蛋白質(zhì)分離能力的二維毛細(xì)管 電泳(2D-CE)分離裝置(圖1)及其應(yīng)用；利用該裝置，第一維使用固定 化pH梯度毛細(xì)管整體(M-IPG)柱不僅可以起到富集分離樣品的作用，而 且在緩沖液中不用添加兩性電解質(zhì)，避免了對(duì)第二維分離的干擾。此外， 采用2D-CE的分離模式，可以顯著提高系統(tǒng)的峰容量，從而滿足復(fù)雜生物 樣品的分析需要。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種二維毛細(xì)管電泳裝置，可用于蛋白質(zhì)樣品的分離，包括一個(gè)2D-CE 接口； 一根固定化pH梯度毛細(xì)管整體(M-IPG)柱作為2D-CE的第一維 分離柱，其出口端通過(guò)連接管與2D-CE接口的一端相連，其進(jìn)樣端置于裝 有堿性緩沖液的入口貯槽中或與一個(gè)注射泵相連； 一根毛細(xì)管作為2D-CE 的第二維分離柱，其進(jìn)樣端通過(guò)連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出 口端置于裝有酸性緩沖液的貯槽中；2D-CE接口置于裝有酸性緩沖液貯槽 中。
所述2D-CE接口為聚四氟乙烯接口、膜接口和毛細(xì)管刻蝕接口；固定 化pH梯度整體柱的內(nèi)徑可以為100 jim 250 (am，長(zhǎng)度為10 40 cm;第 二維分離柱毛細(xì)管的內(nèi)徑為50或75 |im，長(zhǎng)度為10 50 cm;所述第二維 分離柱毛細(xì)管為內(nèi)壁涂層毛細(xì)管或者非涂層毛細(xì)管。
應(yīng)用本發(fā)明時(shí)，在第一維毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)分離完成后，生物 大分子組分流經(jīng)接口分段地進(jìn)入第二維毛細(xì)管進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)2D-CE。由 于該二維系統(tǒng)采用M-IPG柱作為第一維，不僅可以起到富集分離樣品的作 用，而且在緩沖液中不用添加兩性電解質(zhì)，避免了對(duì)第二維分離的干擾。 此外，由于該柱可產(chǎn)生較大的反壓，需要采用恒流泵為系統(tǒng)提供驅(qū)動(dòng)力。 當(dāng)生物大分子組分流經(jīng)接口時(shí)，在較大驅(qū)動(dòng)力存在的情況下不會(huì)向接口外 擴(kuò)散，因此不會(huì)引起樣品的損失和稀釋。
具體的操作如下
在聚焦前，首先將蛋白質(zhì)樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);
1) 在聚焦時(shí)，第一維分離柱的進(jìn)樣端置于裝有堿性緩沖液的入口lt槽 中，2D-CE接口置于酸性緩沖液貯槽中，第二維分離柱出口端與一裝有酸 性緩沖液的出口貯槽相連接； 一臺(tái)工作高壓直流電源的地線插入2D-CE接 口處的貯槽中，負(fù)極插入第一維分離柱進(jìn)樣端入口貯槽中；入口貯槽中加 負(fù)高壓，2D-CE接口處接地，蛋白質(zhì)樣品在第一維分離柱屮聚焦；
2) 在分離時(shí)，將第一維分離柱從入口貯槽中取出，第一維分離柱的進(jìn) 樣端與一個(gè)注射泵相連，其他連接方式不變；在不加電的情況下用注射泵將第一維聚焦的組分區(qū)帶分段送入第二維分離柱中；
3)待樣品組分進(jìn)入第二維時(shí)，停止注射泵， 一臺(tái)工作高壓直流電源的
地線插入2D-CE接口處的酸性緩沖液貯槽中和注射泵處，負(fù)極插入第二維分離柱出口端緩沖液的出口貯槽中；出口貯槽加負(fù)高壓，2D-CE接口和注射泵處接地，進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的2D-CE分離。
所述第二維分離柱的分離模式可以為毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜、毛細(xì)管凝膠電泳或者毛細(xì)管電色譜；恒流泵的流速可以為0.25 1.0 (Al/min;所述直流電源于第一維或第二維分離柱施加的電壓為5 20kV。
所述堿性緩沖可以為PH>10的氫氧化鈉水溶液或者氨水；酸性緩沖可以為PH<3.5甲酸、磷酸或者谷氨酸水溶液；本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 具有不同CE模式聯(lián)用的特點(diǎn)。本發(fā)明可通過(guò)在2D-CE接口處向分離系統(tǒng)中添加小分子(包括酸、堿或鹽)等，實(shí)現(xiàn)不同CE模式的組合，即構(gòu)建多種2D-CE分離模式。
2、 接口簡(jiǎn)單。本發(fā)明采用的M-IPG柱解決了在緩沖溶液中添加兩性載體帶來(lái)的干擾問(wèn)題，降低了對(duì)接口置換能力的要求，使接口制作簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)。
3、 檢測(cè)靈敏度高。本發(fā)明采用M-IPG柱，可有效避免兩性電解質(zhì)對(duì)214 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外檢測(cè)的干擾；此外，M-IPG-C正F本身具有樣品富集作用。因此，該系統(tǒng)具有較高的檢測(cè)靈敏度。
4、 峰容量高。在分離模式正交的情況下，2D-CE系統(tǒng)的峰容量應(yīng)該為每一維峰容量的乘積。因此，該系統(tǒng)具有較高的分離能力，可滿足復(fù)雜樣品的分離需要。


圖1為本發(fā)明的固定化pH梯度整體柱等電聚焦一毛細(xì)管區(qū)帶電泳(2D-M-IPG-CIEF-CZE)分離平臺(tái)結(jié)構(gòu)示意圖，(1)聚焦時(shí)，(2)分離時(shí)；圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的一維分離譜圖，A: CZE譜
圖；B: M-IPG-CIEF譜圖3為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的固2D-M-IPG-CIEF-CZE分
離譜圖；各圖的標(biāo)號(hào)為所處的組分?jǐn)?shù)；
圖4為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的二維投影圖5為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中牛奶蛋白的一維分離譜圖6為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中牛奶蛋白的2D-M-IPG-CIEF-CZE分離譜
圖；各圖的標(biāo)號(hào)為所處的組分?jǐn)?shù)；
圖7為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中牛奶蛋白的二維投影圖。
具體實(shí)施例方式
一種二維毛細(xì)管電泳裝置，可用于蛋白質(zhì)樣品的分離，包括一個(gè)2D-CE接口；
一根固定化pH梯度毛細(xì)管整體柱作為2D-CE的第一維分離柱，其出口端通過(guò)連接管與2D-CE接口的一端相連，其進(jìn)樣端置于裝有堿性緩沖液的入口貯槽中或與一個(gè)注射泵相連；
一根毛細(xì)管作為2D-CE的第二維分離柱，其進(jìn)樣端通過(guò)連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出口端置于裝有酸性緩沖液的貯槽中；
2D-CE接口置于裝有酸性緩沖液貯槽中。
所述2D-CE接口為聚四氟乙烯接口 。
如圖l所示，具體操作過(guò)程為
在聚焦前，首先將蛋白質(zhì)樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);
1) 在聚焦時(shí)，第一維分離柱D的進(jìn)樣端置于裝有堿性緩沖液的入口貯槽A中，2D-CE接口B置于酸性緩沖液貯槽中，第二維分離柱G出口端與一裝有酸性緩沖液的出口貯槽C相連接； 一臺(tái)工作高壓直流電源I的地線插入2D-CE接口 B處的貯槽中，負(fù)極插入第一維分離柱D進(jìn)樣端入口貯槽A中；在入口貯槽A處加負(fù)高壓，2D-CE接口B處接地，蛋白質(zhì)樣品在第一維分離柱(D)中聚焦；
2) 在分離時(shí)，將第一維分離柱D從入口貯槽A中取出，第一維分離柱D的進(jìn)樣端與一個(gè)注射泵J相連，其他連接方式不變；在不加電的情況
下用注射泵J將第一維聚焦的組分區(qū)帶分段送入第二維分離柱G中；
3) 待樣品組分進(jìn)入第二維時(shí)，停止注射泵J， 一臺(tái)工作高壓直流電源I的地線插入2D-CE接口 B處的酸性緩沖液貯槽中和注射泵J處，負(fù)極插入第二維分離柱G出口端緩沖液的出口貯槽C中；出口貯槽C加負(fù)高壓，注射泵J和2D-CE接口 B處接地，進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的2D-CE分離。
其中E為聚四氟乙烯連接管，F(xiàn)為連接毛細(xì)管，H為檢測(cè)窗口；實(shí)施例1 一 一
如圖1所示，第一維采用M-IPG CIEF的方法，正極緩沖液為20 mmol/L谷氨酸，負(fù)極緩沖液為j0mmol/LNaOH。將樣品充滿整個(gè)M-IPG柱，整體柱長(zhǎng)20cm (本發(fā)明中釆用過(guò)的長(zhǎng)度為15， 20， 30禾Q40cm)，內(nèi)徑100)im(可以為100， 200和250 pm)。第二維采用CZE分離，分離緩沖為20 mmol/L谷氨酸，毛細(xì)管總長(zhǎng)為30cm (本發(fā)明中采用的過(guò)長(zhǎng)度為20和30cm)，有效長(zhǎng)為20cm (本發(fā)明中采用的過(guò)長(zhǎng)度為10和20cm)，內(nèi)徑50iLim (可以為75拜)。
樣品為7種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的混合液分別為胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor, pi 4.5)、牛血清白蛋白(BSA， pi 4.8)、白蛋白(albumin, pi 4.9)、卩-乳球蛋白(卩-lactoglobulin， pi 5.0)、血紅蛋白(Hemoglobin, pi 7.1)、尿素酶(urease, pi 9.0)和核糖核酸酶A (Ribonuclease A， pi 9.5)。樣品溶于10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度相同，總濃度為0.033mg/mL。在聚焦前，首先將蛋白質(zhì)樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);
一在第一維M-IPG-CIEF分離時(shí)給第一維毛細(xì)管柱上施加14 kV (本發(fā)明 中采用的過(guò)的電壓為12、 14和16 kV)電壓。聚焦完成后，固定化pH梯 度整體柱(D)從裝有堿性緩沖液的入口貯槽(A)中取出，接上恒流泵(J)， 緩沖液貯槽(C)加負(fù)高壓，恒流泵和二維毛細(xì)管電泳接口 (B)中接地， 恒流泵(J)，將第一維聚焦的組分分段地送入第二維分離毛細(xì)管(G)，此 時(shí)不加電。待樣品組分進(jìn)入第二維時(shí)，停止恒流泵(J)，第二維施加電壓， 進(jìn)行二維分離，;到第一維組分輸送完全。具體操作是恒流泵流速0.5 ^L/min (本發(fā)明采用過(guò)的流速為0.2， 0.3， 0.5和1.0 |uL/min)，輸送1.5min (本發(fā)明采用過(guò)的時(shí)間0.5， 1， 1.5禾P2min)。將第一維的一段樣品區(qū)帶送 入第二維，這相當(dāng)于進(jìn)樣過(guò)程，然后停泵，第二維施加電壓14kV，分離時(shí) 間為8min。如此循環(huán)，直到第一維組分輸送完全，第二維不出峰為止，從 而實(shí)現(xiàn)2D-M-IPG-CIEF-CZE分離。 一共切換了22個(gè)組分，平均峰寬0.063 min，分離時(shí)間8min，峰容量2794。
如圖2A所示，采用CZE方式，7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白只分成了兩個(gè)峰，分離效 果較差；如圖2B所示，M-IPG-CIEF分離了大約7個(gè)小峰，但分離度較小， 沒(méi)有實(shí)現(xiàn)基線分離。如圖3所示，采用2D-M-IPG-CIEF-CZE，蛋白質(zhì)的分 離結(jié)果得到了明顯的改善。由圖4可以看出，7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得了較好的分 離。
實(shí)施例2
與實(shí)施例1不同處在于所采用的樣品為牛奶中提取的蛋白，實(shí)驗(yàn)操作與 實(shí)施例1相同。
如圖5所示，采用一維M-IPG-CIEF分離牛奶蛋白的效果很差，蛋白沒(méi) 有分開(kāi)。如圖6所示，釆用2D-M-IPG-CIEF-CZE，牛奶中蛋白質(zhì)的分離結(jié) 果得到了明顯的改善。由圖7可以看出，牛奶蛋白獲得了較好的分離。
權(quán)利要求
1. 一種二維毛細(xì)管電泳裝置，可用于蛋白質(zhì)樣品的分離，包括一個(gè)2D-CE接口；其特征在于一根固定化pH梯度毛細(xì)管整體柱作為2D-CE的第一維分離柱，其出口端通過(guò)連接管與2D-CE接口的一端相連，其進(jìn)樣端置于裝有堿性緩沖液的入口貯槽中或與一個(gè)注射泵相連；一根毛細(xì)管作為2D-CE的第二維分離柱，其進(jìn)樣端通過(guò)連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出口端置于裝有酸性緩沖液的貯槽中；2D-CE接口置于裝有酸性緩沖液貯槽中。
2. 按照權(quán)利要求1所述二維毛細(xì)管電泳裝置，其特征在于所述的 2D-CE接口為聚四氟乙烯接口 、膜接口和毛細(xì)管刻蝕接口 。
3. 按照權(quán)利要求1所述二維毛細(xì)管電泳裝置，其特征在于所述的固 定化pH梯度整體柱的內(nèi)徑可以為100 |Lim 250 |Lim，長(zhǎng)度為10 40cm。
4. 按照權(quán)利要求l所述二維毛細(xì)管電泳裝置，其特征在于所述第二 維分離柱毛細(xì)管的內(nèi)徑為50或者75pm，長(zhǎng)度為10 50cm。
5. 按照權(quán)利要求l所述二維毛細(xì)管電泳裝置，其特征在于所述第二 維分離柱毛細(xì)管為內(nèi)壁涂層毛細(xì)管或者非涂層毛細(xì)管。
6. —種權(quán)利要求l所述二維毛細(xì)管電泳裝置的應(yīng)用，其特征在于 在聚焦前，首先將蛋白質(zhì)樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);1) 在聚焦時(shí)，第一維分離柱(D)的進(jìn)樣端置于裝有堿性緩沖液的入 口貯槽(A)中，2D-CE接口 (B)貯槽中裝有酸性緩沖液，第二維分離柱(G)出口端與一裝有酸性緩沖液的出口貯槽(C)相連接； 一臺(tái)工作高壓 直流電源(I)的地線插入2D-CE接口 (B)處的貯槽中，負(fù)極插入第一維 分離柱(D)進(jìn)樣端入口貯槽(A)中；在入口貯槽(A)處加負(fù)高壓，2D-CE 接口 (B)處接地，蛋白質(zhì)樣品在第--維分離柱(D)中聚焦；2) 在分離時(shí)，將第一維分離柱(D)從入口貯槽(A)中取出，第一 維分離柱(D)的進(jìn)樣端與一個(gè)注射泵(J)相連，其他連接方式不變；在 不加電的情況下用注射泵(J)將第一維聚焦的組分區(qū)帶分段送入第二維分離柱(G)中；3) 待樣品組分進(jìn)入第二維時(shí)，停止注射泵(J)， 一臺(tái)工作高壓直流電 源(I)的兩根地線分別插入2D-CE接口 (B)處的酸性緩沖液貯槽中和注 射泵(J)處，負(fù)極插入第二維分離柱(G)出口端緩沖液的出口貯槽(C) 中；出口貯槽(C)加負(fù)高壓，注射泵(J)禾Q 2D-CE接口 (B)處接地， 進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的2D-CE分離。
7. 按照權(quán)利要求6所述二維毛細(xì)管電泳裝置的應(yīng)用，其特征在于 所述第二維分離柱的分離模式可以為毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色 譜、毛細(xì)管凝膠電泳或者毛細(xì)管電色譜。
8 二按照權(quán)利要求6所述二維毛細(xì)管電泳裝置的應(yīng)用，其特征在于所述恒流泵的流速可以為0.25 1.0 |jl/min。
9. 按照權(quán)利要求6所述二維毛細(xì)管電泳裝置的應(yīng)用，其特征在于 所述直流電源于第一維或第二維分離柱施加的電壓為5 20kV。
10. 按照權(quán)利要求6所述二維毛細(xì)管電泳裝置的應(yīng)用，其特征在于 所述堿性緩沖為PH〉10的氫氧化鈉水溶液或者氨水；酸性緩沖為PH<3.5 甲酸、磷酸或者谷氨酸水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及二維毛細(xì)管電泳裝置，具體地說(shuō)是一種新型二維毛細(xì)管電泳分離裝置及其應(yīng)用，可用于蛋白質(zhì)樣品的分離，包括一個(gè)2D-CE接口；一根固定化pH梯度毛細(xì)管整體柱作為2D-CE的第一維分離柱，其出口端通過(guò)連接管與2D-CE接口的一端相連，其進(jìn)樣端置于裝有堿性緩沖液的入口貯槽中或與一個(gè)注射泵相連；一根毛細(xì)管作為2D-CE的第二維分離柱，其進(jìn)樣端通過(guò)連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出口端置于裝有緩沖液的貯槽中；2D-CE接口置于裝有酸性緩沖液貯槽中。采用本發(fā)明可以顯著提高系統(tǒng)的峰容量，從而滿足復(fù)雜生物樣品的分析需要。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101469015SQ20071015929
公開(kāi)日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者孫良亮, 張麗華, 張玉奎, 朱貴杰, 振 梁, 王婷婷, 鄧啟良 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所