專(zhuān)利名稱(chēng)：用于在微流體裝置中檢測(cè)分離的mRNA的緩沖液的制作方法
用于在微流體裝置中檢測(cè)分離的mRNA的緩沖液 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
該申請(qǐng)要求提交于2006年3月2日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/779， 312的權(quán)利，該申請(qǐng)作為參考引入此處。
背景技術(shù)：
目前已有用于從細(xì)胞裂解物中制備mRNA的緩沖液會(huì)裂解細(xì)胞核， 并且是高電導(dǎo)率的(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2005/0053952 )。高 電導(dǎo)率使目前的緩沖液不適用于微流體裝置中或結(jié)合使用流體和電動(dòng) 流動(dòng)的微流體操作中，包括選擇性離子提取(SIE)。此外，細(xì)胞核的 破裂會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞裂解物中污染基因組DNA。
本發(fā)明通過(guò)提供電導(dǎo)率足夠低的、適用于微流體操作并且不破壞 細(xì)胞核的完整性的緩沖液解決了這些缺點(diǎn)。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了使用低電導(dǎo)率的緩沖液制備能直接用作mRNA檢測(cè) 模板的、沒(méi)有基因組DNA污染的細(xì)胞裂解物的方法和試劑盒。
相應(yīng)的，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中檢測(cè)mRNA方法。 在一些實(shí)施方案中，該方法包括
a) 使細(xì)胞和緩沖液接觸，由此生成包含完整細(xì)胞核的細(xì)胞裂解物， 其中所述緩沖液具有IO mS/cm或更低的電導(dǎo)率；
b) 從裂解物中分離細(xì)胞核，由此產(chǎn)生含有mRNA的上清；
c) 通過(guò)微流體分離，使上清中的mRNA從逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和DNA 聚合酶抑制劑中分離出來(lái)；和
d) 用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增至少一個(gè)mRNA序列， 由此檢測(cè)細(xì)胞中的mRNA。
在一些實(shí)施方案中，微流體分離包括選擇性離子提取(SIE)。 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)離心實(shí)行從裂解物中分離細(xì)胞核的步驟。 在實(shí)行本方法中，優(yōu)選的，基因組DNA(gDNA)是不可擴(kuò)增檢出的。 在另一個(gè)方面，發(fā)明提供的試劑盒包含
i) 包含微流體通道的底板；和
ii) ii)具有10 mS/cm或更低電導(dǎo)率的緩沖液。 在一些實(shí)施方案中，所述底板適用于選擇性離子提取(SIE)。 對(duì)于方法和試劑盒的實(shí)施方案，所述緩沖液可以具有大約9、 8、
7、 6、 5、 4、 3、 2、 1 mS/cm或者大約0. 5-10 mS/cm之間的任意值的 電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，所述緩沖液具有5 mS/cm或更低的電導(dǎo) 率。在一些實(shí)施方案中，所述緩沖液具有2 mS/cm或更低的電導(dǎo)率。
在一些實(shí)施方案中，所述緩沖液包含具有如下濃度的下述組分 至多50mM的氯化鈉，例如，10、 20、 30、 40、 50mM，或者5-20mMNaCl; 至多50 mM的生物學(xué)緩沖試劑，pH 6.0-8.3，例如10、 20、 30、 40、 50mM，或者5-20mM生物學(xué)緩沖試劑，pH為例如6. 0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.2、 7.4、 7.5、 7.7、 8.0、 8.3;至多15mM的氯化鎂，例如大約1-5 mM、 3、 5、 7、 10、 12、 15 mM MgCl2;至多5.0 % (v/v)的非離子型 去污劑，例如，0.2-5.0 %、 0. 5-2. 0°/。， 0.2、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0 %的非離子型去污劑。
所述緩沖液可以進(jìn)一步包含RNA酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中， 非離子型去污劑選自NP-40、 Triton-Xn (n - 100-500)、聚氧乙烯 嵌段共聚物(polyoxyalkylene block copolymer)、聚乙二醇月旨肪 酸酯、甘油酯。其它的非離子型表面活性劑列于(例如)美國(guó)專(zhuān)利 6， 383， 471中，此處被引用作為參照。在一些實(shí)施方案中，生物學(xué)緩 沖試劑選自于檸檬酸鹽、磷酸鹽、ACES、 BES、 EPPS、甘氨酸、組氨酸、 HEPES、 BIS-TRIS、 TRIS和MES。其它的生物學(xué)緩沖試劑可購(gòu)于，例如， Sigma-Aldrich， St. Louis, M0。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液包含如下濃度的如下組分、基本 上由如下濃度的如下組分組成或者由如下濃度的如下組分組成
10 mM氯化鈉；
10 mM TRIS， pH 7.4;
3 mM氯化鎂；
0. 5 % (v/v) NP-40;以及 任選地，RNA酶抑制劑。 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖l圖示了經(jīng)受緩沖液E處理的HeLa細(xì)胞的完整細(xì)胞核。格A: 未用緩沖液E裂解的完整細(xì)胞核的相差成像。格B:細(xì)胞的完整細(xì)胞 核的熒光成像，裝載Hoechst 33258染料，并且未用緩沖液E裂解細(xì) 胞。格C:用緩沖液E裂解細(xì)胞的細(xì)胞完整細(xì)胞核的相差成像。格D: 用緩沖液E裂解細(xì)胞的細(xì)胞完整細(xì)胞核的熒光成像。在用緩沖液E裂 解的細(xì)胞中，細(xì)胞核仍然是完整的，并且基因組DNA未被釋放到裂解 物中。所有的成像都釆用40X放大。
圖2圖示了從新鮮的HeLa細(xì)胞從基因組DNA ( gDNA )中擴(kuò)增凝結(jié) 因子5基因的結(jié)果。藍(lán)色曲線(xiàn)Ambion的Cells-to-cDNATM裂解緩沖 液。黑色曲線(xiàn)gDNA陽(yáng)性對(duì)照。紅色曲線(xiàn)緩沖液E。從使用緩沖液 E制備的裂解物中沒(méi)有擴(kuò)增出基因組DNA擴(kuò)展子。該數(shù)據(jù)和顯示于

圖1 中的數(shù)據(jù)一致。
圖3圖示了使用利用Cells-to-cDNATM試劑盒(Ambion)或者本發(fā) 明的緩沖液E產(chǎn)生的mRNA進(jìn)行的微管蛋白mRNA序列的實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。兔藍(lán)色曲線(xiàn)Ambion的CelIs-to-cDNATM 裂解緩沖液。綠色曲線(xiàn)緩沖液E。緩沖液E的所有稀釋液的循環(huán)閾 值(Ct)都和Cells-to-cDNATM裂解緩沖液的Ct值相同。因此，對(duì)于兩 種緩沖液，從細(xì)胞中提取的HeLa mRNA的量是相等的。緩沖液E在對(duì) 目標(biāo)mRNA序列的擴(kuò)增中的表現(xiàn)和市場(chǎng)銷(xiāo)售的緩沖液相當(dāng)。
發(fā)明詳述 介紹
本發(fā)明提供了用于制備細(xì)胞裂解物的方法和試劑盒，所述裂解物
適用于微流體分離技術(shù)，可被直接用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 擴(kuò)增混合物中用于擴(kuò)增mRNA序列，沒(méi)有不想要的基因組DNA的擴(kuò)增。 提供的用于裂解真核細(xì)胞的方法和試劑盒帶有低電導(dǎo)率的緩沖液，該 緩沖液裂解胞外細(xì)胞膜，不破壞細(xì)胞核的完整性。 定義
術(shù)語(yǔ)"微流體(microfluidic)"指的是裝置或底板以及使用裝 置或底板的方法，所述裝置或底板具有一個(gè)或多個(gè)通道，所述通道具 有至少一個(gè)小于1 mm內(nèi)部交叉截面尺寸，并且有時(shí)小于500 pm,例 如，0.1-500 pm。
短語(yǔ)"微流體分離"指的是使用微流體裝置或底板分離兩種或兩 種以上的分子。
"微流體底板"是一種適用于微流體分離過(guò)程的底板。可以用任 意合適的材料制備微流體底板，包括，例如，塑料或玻璃。
術(shù)語(yǔ)"選擇性離子提取"或"SIE"指的是在微流體裝置中聯(lián)合利用 流體流動(dòng)和電動(dòng)流動(dòng)控制的一種分離技術(shù)。在應(yīng)用選擇性離子提取中， 根據(jù)電泳遷移率，被運(yùn)送到微流體底板中的T形接頭(即，微流體芯 片)中的化合物或分子的混合物能被完全分離到不同的通道中。參加， 例如，Kerby等人，Anal Chem (2002) 74:5175。并參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利 號(hào)10/386， 900和10/744, 915;國(guó)際轉(zhuǎn)錄公開(kāi)號(hào)WO 03/076052，在此
處上述每個(gè)公開(kāi)都被整體引用僅作為參考。
術(shù)語(yǔ)"電導(dǎo)率，，或"電導(dǎo)系數(shù)"指的是材料或溶液引導(dǎo)電流的能 力?？梢砸詥挝籗iemens每米(S/m)或mhos (ohms的倒數(shù))/m來(lái)度量電 導(dǎo)率或電導(dǎo)系數(shù)。
實(shí)施例
方法
本方法適合于檢測(cè)任意真核細(xì)胞中的信使核糖核酸(mRNA)，包括， 例如，酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、爬蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞和 哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？梢詮慕M織培養(yǎng)中制備細(xì)胞，或者可以從取自受試者 的組織樣品中直接制備細(xì)胞。例如，可以從個(gè)體的活組織切片或血液
組織獲得細(xì)胞。可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)， Manassas, VA 獲得通過(guò)組織培養(yǎng)制備的細(xì)胞系。
如果需要，可以將低電導(dǎo)率裂解緩沖液制備為濃縮儲(chǔ)備液(例如， 5X、 IOX、 20X)，在使用前可以將所述濃縮儲(chǔ)備液稀釋。在一些實(shí)施 方案中，在裂解緩沖液和細(xì)胞接觸來(lái)裂解細(xì)胞之前在其中加入巰基乙 醇I3-(BME)，或者其它還原試劑，和/或RNA酶抑制劑。
緩沖液的合適體積依賴(lài)于待裂解細(xì)胞的數(shù)量和大小。在一些實(shí)施 方案中，向大約100000個(gè)細(xì)胞中加入大約100 juL的裂解緩沖液。也 可以采用更大體積的裂解緩沖液，例如，對(duì)于細(xì)胞大小較大的100， 000 個(gè)細(xì)胞(例如，上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞) 也可以采用更小體積的裂 解緩沖液，例如，對(duì)于細(xì)胞大小較小的100，000個(gè)細(xì)胞(例如，淋巴 細(xì)胞，包括B或T細(xì)胞)。
通過(guò)將細(xì)胞樣品加入到發(fā)明的緩沖液中，細(xì)胞的胞外膜被裂解， 所述緩沖液具有大約10mS/cm或更低的電導(dǎo)率。細(xì)胞在裂解緩沖液中、 在足以有效裂解胞外膜并同時(shí)保持細(xì)胞核膜完整的條件下孵育?？梢?br> 在體溫(37x:)、室溫(25t:)或冷藏溫度(4x:)、或其它適當(dāng)溫度 下將細(xì)胞暴露于裂解緩沖液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞和裂解緩沖 液接觸，并隨后置于水上。通常在半小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)完成細(xì)胞裂解，
例如，在大約30、 20、 10、 5或更少的分鐘內(nèi)。細(xì)胞暴露于裂解緩沖
液中的、足以裂解胞外膜的時(shí)間長(zhǎng)短依賴(lài)于幾種因素，包括細(xì)胞大小、 單位體積的裂解緩沖液中的細(xì)胞數(shù)量、孵育溫度等等。可以進(jìn)一步機(jī) 械裂解細(xì)胞來(lái)促進(jìn)裂解，例如，利用數(shù)次通過(guò)吸管操縱器，或者利用
旋渦振蕩。
在裂解胞外膜之后，從裂解物中分離完整的細(xì)胞核。可以通過(guò)， 例如，細(xì)胞裂解物離心來(lái)實(shí)現(xiàn)。隨后分離沉淀和上清，沉淀中含有細(xì) 胞核。
隨后通過(guò)對(duì)上清進(jìn)行微流體分離操作，從上清中的其它分子中移
出或分離出mRNA，所述其它分子包括逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的抑制劑。 將上清加載到合適的、微流體底板的泵或通道中，例如，通過(guò)注射或 毛細(xì)管攝取。隨后對(duì)底板和細(xì)胞上清施加電流和/或正或負(fù)電壓，直到 分離充分完成。進(jìn)行微流體分離操作的裝置和底板可購(gòu)于，例如，
Caliper Life Sciences, Hopkinton， MA; 和Agilent Technologies, Palo Alto, CA。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微流體分離操作為選擇性離子提取(SIE)。在 SIE中，通過(guò)正流體壓力和電場(chǎng)一起驅(qū)動(dòng)微流體底板中的通道區(qū)段中 的流體，并且通過(guò)改變?cè)谕ǖ谰W(wǎng)絡(luò)中的不同通道區(qū)段所釆用的壓力和 電場(chǎng)來(lái)分離流體填充物中的多種物質(zhì)。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) 10/386, 900和10/744, 915;以及國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO 03/076052,在此
處上述每個(gè)公開(kāi)都被整體引用僅作為參考。
隨后，分離的含mRNA的上清部分可用于任何的需要mRNA的目的。 在一些實(shí)施方案中，含mRNA的上清部分不經(jīng)進(jìn)一步的處理(可選的) 就被直接用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)中或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中。上清 部分可按照所需直接用于一步或兩步RT-PCR反應(yīng)中。使用反應(yīng)進(jìn)行的 RNA或DNA模板的擴(kuò)增是人們所熟知的(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4， 683，195和 4,683,202， PCR操作流程A Guide to Methods and Applications (Innis et al， eds， 1990))。優(yōu)選在熱循環(huán)儀中進(jìn)行該反應(yīng)來(lái)便于 在所需溫度下進(jìn)行孵育周期。參見(jiàn)，例如，PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach， ed. 2003)冷泉港出版。典型的，能使擴(kuò)增子 擴(kuò)增的示例性的PCR反應(yīng)條件包括2或3步循環(huán)。
2步循環(huán)具有一個(gè)變性步驟，隨后進(jìn)行一個(gè)雜交/延長(zhǎng)步驟。3步 循環(huán)包括一個(gè)變性步驟，隨后進(jìn)行一個(gè)雜交步驟，隨后進(jìn)行一個(gè)單獨(dú) 的延長(zhǎng)步驟。如所需，可以擴(kuò)增一種或多種mRNA序列。在一些實(shí)施方 案中，產(chǎn)生一個(gè)cDNA庫(kù)，并且隨意克隆到合適的載體中，用于進(jìn)一步 的處理、表達(dá)等等。
試劑盒
發(fā)明進(jìn)一步提供了試劑盒，包括發(fā)明的低電導(dǎo)率裂解緩沖液和具 有一個(gè)或多個(gè)微流體通道的微流體底板(即，微流體芯片)，如上所 述，用于所述方法。可選的，該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種對(duì)照核酸，
例如， 一種對(duì)照mRNA序列。此外，該試劑盒可以包括擴(kuò)增試劑，包括 核苷酸(例如，A、 C、 G和T) ， DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，引物(例 如，寡聚dT、隨機(jī)的或特異性的)以及合適的緩沖液、鹽和其它試劑 來(lái)方便進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。該試劑盒還可以包括書(shū)面的、使用試劑盒進(jìn)行 擴(kuò)增并控制目標(biāo)mRNA序列擴(kuò)增的使用說(shuō)明書(shū)。參見(jiàn)，例如，Au s ube 1等 人，Current Protocols in Molecular Biology, 1995-2006， John Wiley & Sons, 或 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第三版，2001，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版。
實(shí)施例
實(shí)施例1
下面的實(shí)施例表明，當(dāng)使用"緩沖液E"進(jìn)行細(xì)胞裂解時(shí)，基因 組DM未被釋放到溶液中，因?yàn)榧?xì)胞核未被裂解。 材料
議新鮮的HeLa細(xì)胞系，生長(zhǎng)于加入10 %胎牛血清(FBS) 、 1 mM丙 酮酸鈉和非必需氨基酸的DMEM中。 "磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS) 國(guó)胰蛋白酶
■HeLa S3 RNA (Ambion) 國(guó)人gDNA
"Script cDNA合成試劑盒 ■iQ Sybrgreen Supermix ■iQ Supermix
"用于從mRNA中擴(kuò)增人微管蛋白基因的引物 "基因組DNA中擴(kuò)增凝結(jié)因子5基因的引物
"重組RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promega ^^司的產(chǎn)品目錄號(hào) N2511)
■Cells-to-cDNA II (Ambion) "Aurum總RNA迷你試劑盒
國(guó)緩沖液E: 10 mM NaCl， 10 mM Tris， pH 7.4， 3 mM MgCl2，和
0. 5 % NP40。 裝置-.
"旋渦振蕩器 ■iCycler /MyCycler
國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)箱 "血細(xì)胞計(jì)數(shù)器
操作 細(xì)胞培養(yǎng)
將HeLa細(xì)胞接種到75 cm2的矩形瓶中并使細(xì)胞生長(zhǎng)到90-95%會(huì) 合。隨后通過(guò)胰蛋白酶處理來(lái)收集細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照大約 100， 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分裝。
細(xì)胞核染色
也將HeLa細(xì)胞接種到24-孔粘附細(xì)胞培養(yǎng)板中，使其生長(zhǎng)到90-95 °/。會(huì)合。首先，用Hoechst 33258染料染色24孔板中的細(xì)胞，使能夠 在顯微鏡下使用UV光目檢到細(xì)胞核。完整的細(xì)胞核是容易辨認(rèn)的，因 為當(dāng)染料結(jié)合到DNA雙鏈上后細(xì)胞核發(fā)射出藍(lán)色的熒光。隨后向平板 中的孔中加入緩沖液E。漩渦振蕩平板來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)裂解。在顯微鏡 下觀(guān)察裂解物來(lái)研究細(xì)胞核是否被緩沖液所裂解。
細(xì)胞裂解
從10x儲(chǔ)備液制備緩沖液E，并且加入1 % BME和核糖核酸酶抑 制劑。向分裝的100， 000個(gè)HeLa細(xì)胞中加入100 的每種裂解緩沖 液(緩沖液E和Ambion CelIs-to-cDNA II緩沖液("C-to-C buffer"))。使細(xì)胞裂解物數(shù)次通過(guò)吸管操縱器，并漩渦振蕩來(lái)進(jìn)一 步打破細(xì)胞。按照說(shuō)明書(shū)，使用熱循環(huán)儀在75匸下孵育 Cells-to-CdnaTM裂解物10分鐘。在室溫下以5, 000 x g離心所有的 細(xì)胞裂解物10分鐘，來(lái)去除細(xì)胞碎片。離心旋壓后，每份裂解物中的 上清都被轉(zhuǎn)移到一些新管中，并置于冰上。采用緩沖液E裂解細(xì)胞的 完整的細(xì)胞核顯示于圖1。
對(duì)于每種緩沖液并對(duì)于50 pL的PCR反應(yīng)，使用2pL的細(xì)胞裂
解物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來(lái)從人gDM中擴(kuò)增出凝結(jié)因子5基因。該反應(yīng)進(jìn)行 兩份。結(jié)果顯示于圖2。
從細(xì)胞裂解物中制備10倍系列稀釋。從每個(gè)稀釋樣品中取2 jaL 來(lái)用于使用逆轉(zhuǎn)錄酶的40jjL的cDM合成。合成cDNA后，使用10 p L的cDNA釆用100 jiL PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來(lái)擴(kuò)增微管蛋白基因。 該反應(yīng)進(jìn)行三份。結(jié)果顯示于圖3中。
結(jié)論
使用緩沖液E，我們裂解了HeLa細(xì)胞，并將部分細(xì)胞裂解物直接 用于RT-PCR反應(yīng)中。和市場(chǎng)銷(xiāo)售的試劑盒一樣，緩沖液E也能用于目 標(biāo)mRNA序列的擴(kuò)增，但是不破壞細(xì)胞核，因此避免了或者最小化了基 因組DNA污染的引入。
提供上面的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明發(fā)明但不對(duì)其范圍進(jìn)行限制。對(duì)于本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員，發(fā)明的其它變通是非常明顯的，并且被包括在附加 的權(quán)利要求中。此處引用的所有的出版物、數(shù)據(jù)庫(kù)、Genbank序列、 專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)都被引入作為參考。
權(quán)利要求
1. 檢測(cè)細(xì)胞中的mRNA的方法，所述方法包括a)讓細(xì)胞和緩沖液接觸，由此生成包含完整細(xì)胞核的細(xì)胞裂解物，其中所述緩沖液具有10mS/cm或更低的電導(dǎo)率；b)從裂解物中分離細(xì)胞核，由此產(chǎn)生含有mRNA的上清；c)通過(guò)微流體分離使上清中的mRNA從逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和DNA聚合酶抑制劑中分離出來(lái)；和d)用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增至少一種mRNA序列，由此檢測(cè)細(xì)胞中的mRNA。
2. 權(quán)利要求1的方法， (SIE)。
3. 權(quán)利要求1的方法
4. 權(quán)利要求1的方法 導(dǎo)率。
5. 權(quán)利要求1的方法 導(dǎo)率。
6. 權(quán)利要求1的方法 組分至多50 mM的氯化鈉； 至多50 mM的生物緩沖試劑，pH 6.0-8.3; 至多15 mM的氯化鎂； 至多5.0 % (v/v)的非離子型去污劑。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述緩沖液進(jìn)一步包含RNA酶抑制劑。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中所述非離子型去污劑是NP-40。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中所述生物緩沖試劑選自于檸檬酸鹽、 砩酸鹽、TRIS和MES。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述緩沖液包含具有如下濃度的如 下組分其中所述微流體分離包括選擇性離子提取，其中分離步驟b)包括離心。，其中所述緩沖液具有5mS/cm或更低的電，其中所述緩沖液具有2mS/cm或更低的電 ，其中所述緩沖液包含具有如下濃度的如下 10 mM氯化鈉；10 mM TRIS， pH 7.4;3 mM氯化鎂；0. 5 % (v/v) NP-40;和RNA酶抑制劑。11. 權(quán)利要求l的方法，其中基因組DNA是不能擴(kuò)增檢測(cè)出的。12. 試劑盒，包括i )包含微流體通道的底板；和ii)一種具有10 mS/cm或更低電導(dǎo)率的緩沖液。13. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液具有5mS/cm或更低 電導(dǎo)率的緩沖液。14. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液具有2mS/cm或更低電導(dǎo)率的緩沖液。15. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液包含下面的組分 至多50 mM的氯化鈉；至多50 mM的生物緩沖試劑，pH 6.0-8.3;至多15 mM的氯化鎂；至多5.0 % (v/v)的非離子型去污劑。16. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述緩沖液進(jìn)一步包含RNA酶抑制劑。17. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述非離子型去污劑是NP-40。18. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述生物緩沖試劑選自于檸檬酸 鹽、磷酸鹽、TRIS和MES。19. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液包含下面的組分10 mM氯化鈉；10 mM TRIS， pH 7, 4; 3 mM氯化鎂； 0. 5 % (v/v) NP-40;和 RNA酶4中制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用低電導(dǎo)率的緩沖液在微流體裝置中檢測(cè)從細(xì)胞裂解物中分離的mRNA的方法和試劑盒。緩沖液不影響細(xì)胞核的完整性，因此能夠產(chǎn)生不含有基因組DNA的、能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增反應(yīng)中直接用作模板的細(xì)胞裂解物。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101395169SQ200780007477
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者L·尤戈佐利 申請(qǐng)人:Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室公司