專利名稱：新型水溶性稀土有機(jī)螯合物熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于熒光免疫分析及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種雙功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶 三甲酸、其水溶性稀土熒光探針PTA: Sm"和PTA: Dy"及其制備方法。
背景技術(shù)：
時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)是20世紀(jì)80年代初期由Soini和Kojola等建立起來的一種非放射性 免疫分析技術(shù)，因靈敏度高、操作簡單、示蹤物穩(wěn)定、無放射性污染、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍明 顯優(yōu)于其它技術(shù)，最為引人關(guān)注。稀土元素作為金屬離子，很難直接與生物體結(jié)合，因此在 標(biāo)記上需要一種具有雙功能基團(tuán)的螯合劑， 一端與稀土金屬離子連接， 一端與生物體的自由 氨基或羧基連接。
稀土熒光探針主要是一些稀土元素Sm3、 Eu3+、 Tb3+、 D,+的配合物，在紫外光的照射下， 可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光。稀土配合物用作探針標(biāo)記進(jìn)行免疫分析具有的優(yōu)越性:(l)激發(fā)光譜帶較 寬，有利于提高激發(fā)能，提高標(biāo)記物的比活性;(2撥射光譜帶很窄，有利于降低本底，提高分 辨率;(3)Stokes位移較大，有利于排除非特異性熒光的干擾;(4)熒光壽命較長， 一般在100 1000
IJs，而背景熒光衰變時(shí)間只有1 10 ns，相差5 6個(gè)數(shù)量級，因此可采用時(shí)間分辨檢測技術(shù)，
延遲測量時(shí)間，待背景熒光完全衰減后測定，所測得的便是稀土有機(jī)配合物的熒光，從而消 除蛋白質(zhì)背景熒光的干擾;(5)稀土標(biāo)記物比較穩(wěn)定，可以保存1 2年，克服了同位素、酶等標(biāo) 記物的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種雙功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶三甲酸PTA。 本發(fā)明的目的之二在于提供一種由雙功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶三甲酸PTA為配體形成 的用作生物標(biāo)記的水溶性稀土熒光探針PTA: Sm"和PTA: D +。
本發(fā)明的目的之三在于提供上述兩種水溶性稀土熒光探針的制備方法。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案-
一種雙功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶三甲酸，其特征在于該有機(jī)配體的結(jié)構(gòu)式為
42H2。
OH OH 。
一種水溶性稀土熒光探針，其特征在于該稀土熒光探針具有以下兩種結(jié)構(gòu)
a.三(2， 4， 6-吡啶三甲酸)合釤(III)酸鈉二元配合物，即N06[Sm(PTA)3]德20， 具體結(jié)構(gòu)為一種制備上述的水溶性稀土熒光探針的方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a. 將2, 4， 6-三甲基吡啶與去離子水按一定體積比混合，室溫?cái)嚢柘戮徛尤脒^量的氧 化劑KMn04，室溫?cái)嚢?0~15小時(shí)，40 50'C下攪拌10~15小時(shí)，趁熱過濾，熱水 洗滌，調(diào)節(jié)濾液的pH=l 2，白色固體析出，過濾，冷水洗滌，95'C下緩慢滴加濃 HC1直至大部分白色固體溶解，趁熱過濾，0 5'C下靜置有白色固體析出，既得到雙 功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶三甲酸;
b. 水溶性稀土熒光探針的制備方法將步驟a所得PTA溶于去離子水中，緩慢滴加SmCl3 水溶液或到DyCL水溶液；其中SmCl3或DyCl3與PTA的摩爾比為1: 3;調(diào)節(jié)溶液pH 至8~9， 6(TC攪拌反應(yīng)8 12小時(shí)，過濾，室溫下靜置待其析出后，洗滌，真空干燥， 得無色晶體，即為水溶性稀土熒光探針Na6[Sm(PTA)3] .18H20或 Na6[Dy(PTA)3]'18H20。
本發(fā)明所制備的稀土熒光探針PTA: Sm"和PTA: DyS+的特點(diǎn)為
a. 自身具有良好的水溶性和穩(wěn)定性；
b. 具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和較大的熒光量子產(chǎn)率；
C.易于生物分子標(biāo)記，且毒性小，對所標(biāo)記的生物分子的影響較??； d.制備工藝簡單，成本低，不使用有機(jī)溶劑，不會(huì)對環(huán)境造成污染。 由于該標(biāo)記探針具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度、較好的水溶性及穩(wěn)定性、易于生物分子標(biāo)記、對 所標(biāo)記的生物分子的影響小等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于標(biāo)記免疫分析、核酸測定、疾病診斷、細(xì) 菌、病毒、微生物的檢測等，另外由于其制備工藝簡單、所用原料成本低且設(shè)備投資少，因 此在拓展其應(yīng)用范圍方面又具有實(shí)際意義。


圖1為Na6[Sm(PTA)3] .18H20和Na6[Dy(PTA)3].18H20在固體狀態(tài)下的激發(fā)光譜和發(fā)射 光譜，其中(a)為Na6[Dy(PTA)3].18H20的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，(b)為Na6[Sm(PTA)3] 481120 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(5300PC,高靈敏度，Na6[Dy(PTA)3]的激發(fā)和發(fā)射狹縫均為1.5 nm， Na4Sm(PTA)3]的激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為3 nm和1.5 nm)。
圖2為Na6[Sm(PTA)3]和Na6[Dy(PTA)3]在水溶液狀態(tài)(濃度為l.OXl(T4 mol/L)下的激 發(fā)光譜和發(fā)射光譜，其中(a)為Na6[Dy(PTA)3].18H20的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，(b)為 Na6[Sm(PTA)3] .18H20的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(5300PC,高靈敏度，Na6[Sm(PTA)3]溶液的激發(fā) 和發(fā)射狹縫分別為10 nm禾n 5 nm， Na6[Dy(PTA)3]溶液的激發(fā)和發(fā)射狹縫均為3 nm)。
具體實(shí)施例方式
以下用實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限于此。 實(shí)施實(shí)例一雙功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶三甲酸(PTA)的具體制備方法如下
以2， 4， 6-三甲基吡啶(純度為99.99%)和KMn04(A.R.)為原料，將2， 4， 6-三甲基吡 啶與去離子水按體積比l: 20混合，室溫?cái)嚢柘戮徛尤脒m量KMn04，之后室溫?cái)嚢?0 15 h， 40 50。C下攪拌10-15 h，趁熱過濾，熱水洗滌三次，濾液用濃HCl調(diào)至pH4，白色固體 析出，過濾，冷水洗滌三次，95'C下緩慢滴加濃HC1直至大部分白色固體溶解，趁熱過濾， 0 5'C下靜置有白色固體(PTA)析出，得二水合目標(biāo)產(chǎn)物。產(chǎn)率54.5%， m.p. 232.8°C (分解)， 該化合物的結(jié)構(gòu)是<formula>formula see original document page 7</formula>元素分析C8H5N06，實(shí)驗(yàn)值(理論值)C: 38.62 (38.88)， N: 5.64 (5.67)， H: 3.65 (3.67),
C/N :6.85 (6.86). IR (KBr) / cm": 3501.8 (vc訓(xùn)),3157.7 (vc.H)， 1729.6 (vc=0), 1701.7 (vc=0),
1614.9 (vc=N,inPy)， 1568.6 (vc=c,,in'H-NMR (DMSO， S /ppm) :8.52 (s , 2H , py)。 實(shí)施例二 Nae[Sm(PTA)3] 181120的具體制備方法如下
將1.2mmolPTA溶于少量去離子水中，待固體全部溶解后，加去離子水使體系總體積達(dá)
到50 mL。然后將2.0 mL( 0.4 mmol) SmCl3水溶液緩慢加入到上述PTA溶液中，用1.0 mol.I/1NaOH水溶液將pH調(diào)至8左右，6(TC水浴攪拌8小時(shí)，室溫下靜置數(shù)天析出無色晶體 Nae[Sm(PTA)3] 18H20，產(chǎn)率60%。
元素分析SmNa6C24H42N3036(Nae[Sm(PTA)3].18H20)，實(shí)驗(yàn)值(理論值)C: 23.2 (23.31)， N: 3.26 (3.40)， H: 3.34 (3.42), C / N 7.12 (6.86). IR (KBr) / cm": 3452.0 (vc訓(xùn))，1633.3 (vc=0), 1558.9 (vc=N,inPy)， 1437.4 (vc=c,inPy)， 1374.6 (vc=0)， 463.3 (vSm.0). 實(shí)施例三Na6[Dy(PTA)3].18H20的具體制備方法如下
本制備方法與實(shí)施例二中Na6[Sm(PTA)3H8H20的制備方法基本相同，所不同的是將 實(shí)施例二中的SmCl3水溶液換成DyCl3水溶液。
元素分析DyNa6C24H42N3036 (Na6[Dy(PTA)3] .18H20)，實(shí)驗(yàn)值(理論值)C 22.43 (23.08)， H 3.09 (3.39), N 3.35 (3.36)， C /N 6.70 (6.86). IR (KBr) / cm—1: 3441.8 (vcoo.H), 1628.7 coo)， 1367.4(vs,coo-)， 1558.8 (vc=N,inPy)， 1437.5 (vCK;'inPy)， 539.7 (vDy.0)
圖1為Na6[Sm(PTA)3] .18^0和Na6[Dy(PTA)3].18H20在固體狀態(tài)下的激發(fā)光譜和發(fā) 射光譜(5300PC，高靈敏度，Na6[Dy(PTA)3]的激發(fā)和發(fā)射狹縫均為1.5 nm， Nae[Sm(PTA)3]的 激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為3 nm和1.5 nm)。圖2為Nae[Sm(PTA)3]和Na6[Dy(PTA)3]在水溶液狀 態(tài)(濃度為1.0X10—4 mol/L)下的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(5300PC,高靈敏度，Na6[Sm(PTA)3] 溶液的激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為10 nm和5 nm， Na6[Dy(PTA)3]溶液的激發(fā)和發(fā)射狹縫均為3 nm)。從圖中可以看出該探針激發(fā)光譜帶較寬，有利于提高激發(fā)能，提高標(biāo)記物的比活性; 發(fā)射光譜帶很窄，有利于降低本底，提高分辨率；在稀水溶液中仍然具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度， 且易溶于水，在水溶液中可以穩(wěn)定存在，有望廣泛應(yīng)用于標(biāo)記免疫分析、核酸測定、疾病診 斷、細(xì)菌、病毒、微生物的檢測等領(lǐng)域。
8
權(quán)利要求
1.一種雙功能有機(jī)配體2，4，6-吡啶三甲酸，其特征在于該有機(jī)配體的結(jié)構(gòu)式為
2. —種水溶性稀土熒光探針，采用根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶二 甲酸為配體，其特征在于該稀土熒光探針具有以下兩種結(jié)構(gòu)-a.三(2， 4， 6-吡啶三甲酸)合釤(III)酸鈉二元配合物，即Nae[Sm(PTA)3].18H20， 具體結(jié)構(gòu)為b.三(2， 4， 6-吡啶三甲酸)合鏑(III)酸鈉二元配合物，艮卩Na6[Dy(PTA)3].18H20， 具體結(jié)構(gòu)為18H，0
3. —種制備根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性稀土熒光探針的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a. 將2， 4， 6-三甲基吡啶與去離子水按一定體積比混合，室溫?cái)嚢柘戮徛尤脒^量的氧 化劑KMn04，室溫?cái)嚢?0~15小時(shí)，40 5(TC下攪拌10~15小時(shí)，趁熱過濾，熱水 洗滌，調(diào)節(jié)濾液的pH=l 2，白色固體析出，過濾，冷水洗滌，95'C下緩慢滴加濃 HC1直至大部分白色固體溶解，趁熱過濾，0 5'C下靜置有白色固體析出，既得到雙 功能有機(jī)配體2， 4， 6-吡啶三甲酸；b. 水溶性稀土熒光探針的制備方法將步驟a所得PTA溶于去離子水中，緩慢滴加SmCl3 水溶液或到DyCl3水溶液；其中SmCl3或DyCl3與PTA的摩爾比為1: 3;調(diào)節(jié)溶液pH 至8~9， 60'C攪拌反應(yīng)8 12小時(shí)，過濾，室溫下靜置待其析出后，洗滌，真空干燥， 得無色晶體，即為水溶性稀土熒光探針Na6[Sm(PTA)3] .18H20或 Na6[Dy(PTA)3].18H20。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型水溶性稀土有機(jī)螯合物熒光探針及其制備方法，該稀土熒光探針由雙功能有機(jī)配體2，4，6-吡啶三甲酸(PTA)分別和SmCl₃和DyCl₃在水溶液中以摩爾比3∶1配位反應(yīng)制得。該標(biāo)記探針具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度、較好的水溶性及穩(wěn)定性、易于生物分子標(biāo)記、對所標(biāo)記的生物分子的影響小等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于標(biāo)記免疫分析、核酸測定、疾病診斷、細(xì)菌、病毒、微生物的檢測等。另外由于其制備工藝簡單、所用原料成本低且設(shè)備投資少，因此在拓展其應(yīng)用范圍方面也具有實(shí)際開發(fā)價(jià)值。
文檔編號C07D213/00GK101648908SQ200910053878
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者任媛媛, 安保禮 申請人:上海大學(xué)