專利名稱：治療血小板減少癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于包含抗IihD重組多克隆抗體產(chǎn)物之醫(yī)藥及診斷性組合物及其在血小板減少癥之治療中之用途。血小板減少癥之治療可為癥狀性、改善性、預(yù)防性及/或治愈性的?？筂iD重組多克隆抗體產(chǎn)物及其制備在PCT/DK2005/000501中揭示。
背景技術(shù)：
恒河猴Rhesus)血型抗原位于跨膜紅細(xì)胞蛋白質(zhì)上，其涵蓋所謂C、c、E、e及D抗原。由于遺傳多態(tài)現(xiàn)象，故約16%之白種人族群為恒河猴D陰性(I hD(-))。此外，存在多個(gè) MiD之遺傳學(xué)及血清學(xué)變異體(分成II-VII類)，其中IihDvi最具臨床相關(guān)性。因?yàn)榕c其它種類之RBC相比，VI類陽性紅細(xì)胞(RBC)承載較少D蛋白質(zhì)之各種表位，所以IihDvi (+)個(gè)體可形成針對(duì)來自其它MiD陽性(RhD (+))個(gè)體之RBC的同種抗體(Issitt，P.D.及Anstee， D. J. , 1998. The Rh Blood Group System,Montgomery Scientific Publications,Durham, North Carolina，第 315 頁-第 423 頁)。
特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)為一種血液病癥，其中自體抗體導(dǎo)致脾臟及肝臟中之血小板清除加速。ITP之發(fā)病率估計(jì)為每百萬人中出現(xiàn)介于50至100個(gè)之間的新病例。 已證明抗D免疫球蛋白適用于治療ITP (George，J. N. ,2002. Blood Rev. 16，37-38)。皮質(zhì)類固醇及靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIg)通常構(gòu)成第一線治療，但已證明源自捐血者之抗恒河猴D 免疫球蛋白安全有效且日益用作ITP之第一線治療。在重度病例中，脾臟被移除。然而，此舉由于嚴(yán)重副作用故不可用于嬰兒中，因此需要如抗D免疫球蛋白之替代法治療。
ITP系由血小板計(jì)數(shù)< 150X 109/L[150，000/mm3]定義且特性在于碰傷傾向增加。 然而，在血小板計(jì)數(shù)小于20X 109/L[20，000/mm3]之個(gè)體中，ITP通常隨自發(fā)性出血而出現(xiàn)。 血小板計(jì)數(shù)< 10X109/L[10，000/mm3]之患者可能出現(xiàn)重度皮膚出血、齒齦出血、流鼻血、 血尿癥或月經(jīng)過多。在血小板計(jì)數(shù)低于5X109/L[5，000/mm3]之重度血小板減少癥中可觀察到自發(fā)性顱內(nèi)出血及其它內(nèi)出血(Stasi 2004)。在常規(guī)全血球計(jì)數(shù)之后，最通常順便診斷血小板計(jì)數(shù)大于30X 109/L[30，000/mm3]之個(gè)體中之ITP。ITP特性亦在于未成熟周邊血小板比例之增加，且在某種程度上特性在于脊髓中巨核細(xì)胞比例之增加。成人之ITP臨床特征不同于兒童期所觀察到之ITP臨床特征，在兒童期臨床特征中約80%之患者自動(dòng)痊愈。兒童之ITP通常為在病毒感染之后兩至三周發(fā)生之急性疾病，而成人之ITP通常具隱襲發(fā)作性且為慢性過程。此外，亦存在疾病之繼發(fā)形式。
ITP中之作用機(jī)制 ITP系由針對(duì)血小板表面抗原之自體抗體介導(dǎo)。經(jīng)自體抗體調(diào)理之血小板由RES 之吞噬細(xì)胞快速消除，從而導(dǎo)致血小板減少癥。經(jīng)由RES消除血小板之主要(但并非僅有) 部位涉及脾臟，且亦認(rèn)為脾臟為抗血小板自體免疫性抗體反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展及擴(kuò)增之主要部位(Cines 2002)。
當(dāng)前抗D免疫球蛋白在ITP中之最可接受之作用機(jī)制似乎為RES中!^e γ受體 (Fe y R)、最可能為對(duì)經(jīng)IgG調(diào)理粒子及IgG免疫復(fù)合物具有高親合力之具吞噬能力的巨噬細(xì)胞上之Fc γ RII及Fc γ RIII之競(jìng)爭(zhēng)性阻斷。由于IVIg在ITP治療中之有效性，故最初提出此抗D之作用機(jī)制。該假定已藉由抗D免疫球蛋白在MiD+ITP患者中之功效及在I hD_患者中缺乏功效得到進(jìn)一步支持。脾臟切除患者不對(duì)抗D治療作出反應(yīng)證明抗D在RES/脾臟環(huán)境中發(fā)揮其作用(Lazarus 2003 ；Salama 1983 ；Salama 1984)。
然而，阻斷FcyR介導(dǎo)之血小板吞噬作用可能并非說明抗D治療所提供之所有治療效益之唯一機(jī)制。已描述用抗D免疫球蛋白成功治療I hD_患者之一個(gè)病例?？紤]到在當(dāng)前可獲得之源自血漿的抗D產(chǎn)品中抗D特異性抗體僅構(gòu)成免疫球蛋白總量之約1 %，不能完全排除就IVIg之功效所提出之替代免疫調(diào)節(jié)機(jī)制(Lazarus 2003)。
ITP之當(dāng)前治療 如美國血液病協(xié)會(huì)(American Society of Hematology) 1996年所制定之ITP治療準(zhǔn)則中所推薦，皮質(zhì)類固醇及IVIg主要用于治療ITPGtasi 2004) (George 1996)。已證明抗 D 安全且有效(Blanchette 1994 ；Bussel 1991 ；Cooper 2002 ；Newman 2001 ；Sandler 2001 ；Scaradavou 1997)且日益用作ITP之第一線治療方案(Cines 2005)。通常，血小板計(jì)數(shù)大于30X 109/L[30，000/mm3]之患者除非經(jīng)受可能誘發(fā)失血之過程，否則不需要治療 (George 1996)。約三分之二的患者對(duì)潑尼龍(prednisolone) (1毫克/公斤/日，歷時(shí)2-4 周)有反應(yīng)。亦已證明在75%之病例中，IVIg有效提高血小板計(jì)數(shù)，其中一半將達(dá)成正常血小板計(jì)數(shù)。然而，反應(yīng)短暫且并未證明持久效應(yīng)。IVIg系以400mg/kg之高劑量歷時(shí)5日或lg/kg歷時(shí)2日給予(1 ；4)。將對(duì)第一線治療無反應(yīng)或需要不可接受之高劑量皮質(zhì)類固醇之病例定義為難治愈ITP。已將高劑量皮質(zhì)類固醇以及高劑量IVIg(例如1公克/公斤 /日)通常與皮質(zhì)類固醇之組合用作難治愈ITP患者之第二線治療(Stasi 2004)。
脾切除術(shù)可降低抗體介導(dǎo)之血小板清除，但脾臟外RES組織(例如肝臟)仍可傳播該疾病(Cines 2005)。三分之二經(jīng)受脾切除術(shù)之ITP患者將達(dá)成正常血小板計(jì)數(shù)，此通常在無額外治療之情況下仍維持。
用抗D治療可消除或顯著延緩對(duì)脾切除術(shù)之需要，在已測(cè)試其它治療策略且發(fā)現(xiàn)無效之后進(jìn)行該脾切除術(shù)。視成功準(zhǔn)則而定，已展示在60% -90%之成人中，靜脈內(nèi)抗D提高血小板計(jì)數(shù)(Bussel 1991 ；Newman 2001 ；Scaradavou 1997 ；Bussel 2001)。
重組多克隆抗D制劑之基本原理 當(dāng)前市售之抗D免疫球蛋白產(chǎn)物包含獲自人類抗D高免疫捐血者之免疫球蛋白， 其中僅小部分具抗D特異性。此等制劑含有抗人群中所有主要M1D類別的抗體。
此外，來自人類血漿之IihD免疫球蛋白除抗D IgG外含有低效價(jià)之其它血型抗體， 且近來已表明在接受抗D免疫球蛋白用于治療ITP之后血紅蛋白血癥或血紅蛋白尿癥之一些稀有但嚴(yán)重急性之不良反應(yīng)除與I^hD反應(yīng)之血型抗體以外還應(yīng)歸因于被動(dòng)獲得之的血型抗體(Gaines 2005 及 Schwartz 2006)。
Rhophvlac 及 WinRho Rhophylac &WinRho 均為源自血漿之抗D產(chǎn)品，其由經(jīng)混合不相關(guān)之源自人類血液之IgG免疫球蛋白及一小部分恒河猴D特異性抗體組成。此等產(chǎn)品之效能已針對(duì)WHO 國際參考品(International Reference Preparation)石角定(International standard for minimum potency of the anti-D blood grouping reagents 2005)。
已證明WinRho 適用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)。然而，不應(yīng)將 WinRho 投予I h。(D)陰性患者或脾被切除的患者。在WinRho 標(biāo)簽中，陳述以下若患者具有與正常血紅蛋白水平相比較低之血紅蛋白水平(小于10g/dL)，則應(yīng)給予每公斤體重125至200IU(25至40微克)之低劑量以使患者貧血嚴(yán)重性增加之風(fēng)險(xiǎn)最小化。對(duì)于 WinRho 已提出關(guān)于血管內(nèi)溶血及散播性血管內(nèi)凝血(DIC)之藥物警告(FDA藥物警告 12-5-2005)。
特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)亦可用Rhophylac 治療。然而，Rhophylac
之缺點(diǎn)為已患有貧血之患者必須權(quán)衡Rhophylac 的益處與貧血嚴(yán)重性增加之潛在風(fēng)險(xiǎn)。
此外，文獻(xiàn)中已報(bào)導(dǎo)源自血清之抗D導(dǎo)致ITP患者溶血，且此為主要不良事件 (Scaradavou 等人，1997, Intravenous Anti-D treatment of immune thrombocytopenic purpura =Experience in 272patients, Blood 89:2689-2700)。最終,對(duì)健康志愿者之研究推斷在抗D之劑量增加與溶血之間存在統(tǒng)計(jì)上顯著之線性趨勢(shì)(amich等人，A dose ranging evaluation of the effect of a single administration of RH(D) globulin intravenous in healthy volunteers, Abstract #2641, Blood 1994 ;84 ( ±曾干Ij ) :664a)。
與源自血漿之抗D相比，各個(gè)抗IihD單克隆抗體展示在將MiD+紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)投予IihD-個(gè)體之后誘發(fā)紅細(xì)胞自血液循環(huán)中更不均勻及更慢的清除速率。因此，與多克隆抗D產(chǎn)品相比，投予單克隆抗D抗體導(dǎo)致紅細(xì)胞半衰期延長(Kumpel 1995 ；Kumpel 2003 ； Miescher 2004)。報(bào)告表明單克隆抗D抗體展示對(duì)ITP患者無功效(概括于karadavou 等人，1997 中)且至少一份 艮告(Godeau 等人，1997，Treatment of chronic autoimmune thrombocytopenic purpura with monoclonal anti-D, Transfusion,36 :328-30)展Tj^單克隆抗D抗體導(dǎo)致溶血且甚至貧血癥，從而推斷此單克隆抗D抗體不能用以治療自體免疫 ITP。
總之，需要開發(fā)安全有效且無WinRho 及Rhophylac 之缺點(diǎn)的ITP之抗D治療。
發(fā)明_既述 本發(fā)明系關(guān)于用諸如PCT/DK2005/000501中所揭示的產(chǎn)物(SymOOl)之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療血小板減少癥。
文獻(xiàn)中之證據(jù)暗示對(duì)于可靠功效而言需要現(xiàn)有抗D產(chǎn)品的天然多克隆性，且因此已選擇SymOOl組合物以反映供體群體中所觀測(cè)到之抗D抗體之天然多樣性。同時(shí)，如 SymOOl之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物代表有限數(shù)量的抗體，所有皆為IgGl子類，其可在生產(chǎn)期間及生產(chǎn)之后根據(jù)對(duì)明確定義之生物產(chǎn)物的要求而描繪特性。因此，與現(xiàn)有源自血漿之抗D相比，如SymOOl之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物的特性可為實(shí)質(zhì)上較高程度。諸如SymOOl之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物亦具有與源自血漿之產(chǎn)物(其中抗體譜系視各個(gè)供血漿者中存在之譜系而改變)可見之批次間差異相比更具可重現(xiàn)性之組成。 對(duì)于如SymOOl之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物而言，使用重組DNA技術(shù)之產(chǎn)生策略確保每次皆產(chǎn)生出相同抗體，而不存在任何不相關(guān)免疫球蛋白分子。
對(duì)患者而言，導(dǎo)入本發(fā)明中所揭示之重組多克隆抗D抗體產(chǎn)物之益處系關(guān)于與基于血液之產(chǎn)物相比當(dāng)使用重組產(chǎn)物時(shí)傳播人類病原體之風(fēng)險(xiǎn)降低及更有利之供應(yīng)情形。與源自血液之產(chǎn)物相比，更具特異性之抗MiD活性可產(chǎn)生較佳風(fēng)險(xiǎn)/益處特征。
另一益處為如SymOOl之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物不會(huì)導(dǎo)致血管外溶血及 /或血紅蛋白水平顯著降低。因此，如SymOOl之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物可用于治療ITP，而不必考慮患者治療之前或之后的血紅蛋白水平。此產(chǎn)生安全且有效之ITP治療。
本發(fā)明系關(guān)于用于治療或預(yù)防血小板減少癥之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物， 其中該抗體產(chǎn)物經(jīng)制備以供以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予，該重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物包含各個(gè)抗體的指定子集，呈現(xiàn)與恒河猴D抗原上之至少一個(gè)表位的結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物之用途，其用于制造供治療或預(yù)防血小板減少癥之藥物，其中該抗體經(jīng)制備以供以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予。
本發(fā)明之另一方面系關(guān)于治療個(gè)體血小板減少癥之方法，該方法包含向該罹患血小板減少癥之個(gè)體投予治療有效量之重組抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，其中該抗體系以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予。本發(fā)明亦系關(guān)于罹患血小板減少癥且亦患有貧血癥之個(gè)體的治療。
在一具體實(shí)例中，可將抗恒河猴D抗體產(chǎn)物靜脈內(nèi)或皮下投予。
本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于在罹患血小板減少癥之個(gè)體中于基于抗恒河猴D治療的期間避免血管外溶血之方法，該方法包含向罹患血小板減少癥之個(gè)體投予治療有效量之重組抗恒河猴D抗體，其中該抗體系以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予。
本發(fā)明之另一方面系關(guān)于治療血小板減少癥之組合物，其包含抗恒河猴D抗體產(chǎn)物及生理學(xué)上可接受之載劑及/或醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑。
本發(fā)明亦系關(guān)于組份試劑盒(kit-of-parts)，其包含抗恒河猴D抗體產(chǎn)物及至少一種其它組份。
定義及縮寫 術(shù)語“抗體”描述血清之功能組份且通常稱為分子(抗體或免疫球蛋白)之集合或稱為一個(gè)分子(抗體分子或免疫球蛋白分子)?？贵w分子能夠與特異性抗原決定子(抗原或抗原表位)結(jié)合或反應(yīng)，其轉(zhuǎn)而可導(dǎo)致誘發(fā)免疫效應(yīng)機(jī)制。通常將各個(gè)抗體分子視為單特異性的，且抗體分子之組合物可為單克隆(亦即由相同抗體分子組成)或多克隆的(亦即由與相同抗原或甚至相異不同抗原上之相同或不同表位反應(yīng)之不同抗體分子組成)。各抗體分子均具有能使其與其相應(yīng)抗原特異性結(jié)合之獨(dú)特結(jié)構(gòu)，且所有天然抗體分子均具有具兩個(gè)相同輕鏈及兩個(gè)相同重鏈之相同整體基本結(jié)構(gòu)?？贵w亦統(tǒng)稱為免疫球蛋白。如本文所用之術(shù)語抗體亦意欲包括嵌合及單鏈抗體，以及抗體之結(jié)合片段，諸如Fab、Fab'或F(ab)2 分子、Fv片段或scFv片段或任何其它穩(wěn)定片段，以及全長抗體分子及多聚體形式，諸如二聚體IgA分子或五價(jià)IgM。
術(shù)語“編碼抗IihD抗體之核酸區(qū)段”描述包含一對(duì)Vh及\遺傳成分之核酸區(qū)段。 區(qū)段可進(jìn)一步包含輕鏈及/或重鏈恒定區(qū)遺傳成分，例如κ或λ輕鏈恒定區(qū)及/或恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2、CH3或CH4中之一或多者，其選自IgGl同種型、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、 IgA2、IgM、IgD及IgE中之一者。較佳同型為IgGl及/或IgG3。核酸區(qū)段亦可包含一或多個(gè)啟動(dòng)子匣，任一者均有助于編碼之序列的雙向或單向轉(zhuǎn)錄。其它轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯成分，諸如將基因產(chǎn)物引入分泌路徑之功能前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸信號(hào)序列、UCOE及/或IRES 亦可存在于該區(qū)段中。
術(shù)語“抗IihD重組多克隆抗體”或“抗MiD rpAb”描述重組產(chǎn)生之多樣性抗體分子之組合物，其中具體成員能夠與恒河猴D抗原上之至少一個(gè)表位結(jié)合。
該組合物較佳由單一生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生。多克隆抗體之多樣性位于可變區(qū)(Vh及八區(qū))，尤其位于CDRl、CDR2及CDR3區(qū)。
術(shù)語“抗I hD rpAb之具體成員”表示重組多克隆抗體組合物之具體抗體分子，其包含可變區(qū)內(nèi)之一或多段，其特性在于與多克隆蛋白質(zhì)之其它具體成員相比氨基酸序列之差異。此等段尤其位于⑶Rl、⑶R2及⑶R3區(qū)中。
術(shù)語“免疫球蛋白”通常用作血液或血清中所見之抗體混合物之集合名稱，但亦可用以表示來源于其它來源之抗體的混合物或用于術(shù)語“免疫球蛋白分子”中。
術(shù)語“多克隆抗體”描述不同(互異)抗體分子之組合物，其能夠與相同或不同抗原上之若干不同特異性抗原決定子結(jié)合或反應(yīng)。通常，多克隆抗體之可變性位于所謂多克隆抗體之可變區(qū)，尤其位于CDR區(qū)。當(dāng)陳述多克隆抗體之成員與抗原結(jié)合時(shí)，本文意謂結(jié)合常數(shù)小于ImM、較佳小于ΙΟΟηΜ、甚至更佳小于IOnM之結(jié)合。
術(shù)語“重組抗體”用以描述由用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染之細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)之抗體分子或若干分子，該載體包含并非天然與細(xì)胞有關(guān)之蛋白質(zhì)之編碼序列。若抗體分子互異或不同， 則術(shù)語“重組多克隆抗體”系根據(jù)多克隆抗體之定義應(yīng)用。
以下書寫型式“VH:LC”及“VH:VJ指示特定可變重鏈序列與輕鏈或可變輕鏈序列對(duì)。該等特定Vh及\序列對(duì)可為核酸序列或多肽。在本發(fā)明中，特定對(duì)向恒河猴 D抗原賦予結(jié)合特異性。
術(shù)語“恒河猴D”亦系指恒河猴D變異體。
縮寫抗RhD rpAb =抗恒河猴D重組多克隆抗體。CASY =細(xì)胞計(jì)數(shù)器+分析器系統(tǒng)。ELISA=酶聯(lián)免疫吸附檢定。ITP =特發(fā)性血小板減少性紫癜。pWCP=多克隆工作細(xì)胞池。RBC=紅細(xì)胞。IihD=恒河猴D。RhD (-)=恒河猴D陰性。IihD (+)=恒河猴D陽性。I^hDvi = VI類恒河猴D抗原。抗D=針對(duì)來自高免疫供體之IihD之多克隆免疫球蛋白制劑。


圖IA-C 編碼56個(gè)所選IihD克隆之可變重鏈(Vh)之核酸序列的排比。排比右邊指示各個(gè)克隆名稱，排比上方指示⑶R區(qū)之位置。
圖2A-E 編碼56個(gè)所選IihD克隆之整個(gè)輕鏈之核酸序列的排比。排比右邊指示各個(gè)克隆名稱以及為κ或λ鏈之指示，且排比上方指示⑶R區(qū)之位置。
圖3 與56個(gè)所選IihD克隆之Vh對(duì)應(yīng)之氨基酸序列的排比。排比右邊指示各個(gè)克隆名稱，且排比上方指示⑶R區(qū)之位置。
圖4Α-Β 與56個(gè)所選IihD克隆之\對(duì)應(yīng)之氨基酸序列的排比，其中㈧與κ鏈對(duì)應(yīng)且(B)與λ鏈對(duì)應(yīng)。排比右邊指示各個(gè)克隆名稱，且排比上方指示⑶R區(qū)之位置。
圖5 來自等分試樣3948及3949之抗I hD rpAb組合物培養(yǎng)9周后之陽離子交換層析圖。下圖對(duì)應(yīng)等分試樣3949，上圖對(duì)應(yīng)等分試樣3948。已移動(dòng)上圖之Y軸，以使其與下圖分開。峰A-J包含凈電荷有差異之抗體及顯現(xiàn)電荷不均一性之各個(gè)抗體。
圖6:展示對(duì)來源于培養(yǎng)11周之后產(chǎn)生抗I hD rpAb之多克隆細(xì)胞系等分試樣 3948+及3949+(FCW06Q之RT-PCR產(chǎn)物的Hinf 1 RFLP分析之凝膠圖。可指示特異性克隆的條帶已被標(biāo)識(shí)出。
圖7 (A) 5L規(guī)模補(bǔ)料分批培養(yǎng)中產(chǎn)生的3批(Sym04 :21、Sym04 :23及Sym04 :24) 抗I hD pAb (有25個(gè)成員)的效能比較。pAb與IihD陽性紅細(xì)胞之結(jié)合用FACS量測(cè)，平均熒光強(qiáng)度(MFI)以ng/ml pAb濃度之函數(shù)顯示。此外，在ADCC/吞噬組合檢定中，對(duì)Sym04 21及Sym04 24量測(cè)具有25個(gè)成員之抗I hD pAb之功能活性。(B)顯示IihD陽性及IihD陰性紅細(xì)胞特異性裂解百分比所示的ADCC結(jié)果，是以ng/ml計(jì)的pAb濃度的函數(shù)。(C)展示 RhD陽性及IihD陰性紅細(xì)胞之吞噬百分比，是以ng/ml計(jì)之pAb濃度的函數(shù)。
圖8 用體外功能試驗(yàn)比較SymOOl及血漿來源的抗D產(chǎn)品Winrho。A =RhD陽性或陰性RBC之PBMC介導(dǎo)之ADCC百分比，B =RhD陽性或陰性RBC之PBMC介導(dǎo)之吞噬百分比， C 經(jīng)調(diào)理血小板之THP-I細(xì)胞系介導(dǎo)之吞噬百分比，是SymOOl或Wir^ho中抗D抗體濃度的函數(shù)。每次量測(cè)都是一式三份。標(biāo)準(zhǔn)偏差由橫杠指示。
圖9 恒河猴D陽性個(gè)體以不同劑量水平給藥SymOOl或給藥安慰劑后，基線以及給藥后不同時(shí)間點(diǎn)之間的平均血紅蛋白水平的變化。在所有劑量水平于給藥后之任何時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于基線之變化均不具統(tǒng)計(jì)顯著性或臨床重要性。血紅蛋白之最大平均下降在25 μ g/ kg組中于第21日觀測(cè)到且為0.42g/dL，75yg/kg組中之最大平均下降在第14日及第21 日觀測(cè)到且為0. 3g/dL。
發(fā)明詳述 血小板減少癥 本發(fā)明系關(guān)于用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療血小板減少癥。血小板減少癥系指在血液中存在相對(duì)少血小板。在一具體實(shí)例中，用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療血小板減少癥可為癥狀性及/或改善性及/或預(yù)防性及/或治療性的。
在人類中，正常血小板計(jì)數(shù)在每立方毫米(微升)150,000至450，000之范圍內(nèi)。 然而，此等界限藉由第2. 5下百分位數(shù)及上百分位數(shù)來確定，且偏差不一定意味著任何疾病形式。在一具體實(shí)例中，本發(fā)明系關(guān)于用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療具有以下特性之個(gè)體(諸如人類)之血小板減少癥血小板計(jì)數(shù)低于每立方毫米(微升)150，000， 諸如低于每立方毫米140，000，例如低于每立方毫米130，000，諸如低于每立方毫米 120，000，例如低于每立方毫米110，000，諸如低于每立方毫米100，000，例如低于每立方毫米80，000，諸如低于每立方毫米60，000，例如低于每立方毫米40，000或諸如低于每立方毫米 20，000。
血小板減少癥之診斷 血小板減少癥可藉由不同實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)診斷，該等試驗(yàn)可包括以下量測(cè)全血計(jì)數(shù)、 量測(cè)肝酶、量測(cè)腎臟功能、量測(cè)維生素B12水平、葉酸水平、紅細(xì)胞沈降速率及/或周邊血液抹片。若低血小板計(jì)數(shù)之原因仍不清楚，則通常進(jìn)行脊髓活體組織檢查以區(qū)分低血小板計(jì)數(shù)是歸因于產(chǎn)生減少還是周邊破壞。
本發(fā)明系關(guān)于用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療已藉由包括本文以上所列舉之方法的任何方法診斷出之血小板減少癥。
血小板減少癥之起因 血小板計(jì)數(shù)降低可歸因于許多疾病過程，包括本文以下所提及之疾病過程。本發(fā)明系關(guān)于用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療任何類型血小板減少癥。血小板減少癥之起因可為(但不限于)本文以下所列舉之起因中之一或多者。
A)由以下所列舉之一或多個(gè)因素引起的血小板產(chǎn)生減少 -維生素B12或葉酸缺乏 -白血病或脊髓發(fā)育不良綜合征 -在肝衰竭中，由肝臟產(chǎn)生血小板生成素減少 -敗血癥、全身性病毒或細(xì)菌感染 -登革熱(Denguefever)，其可藉由直接感染脊髓導(dǎo)致血小板減少癥 -巨核細(xì)胞以及免疫縮短血小板存活 -遺傳綜合征 -先天性無巨核細(xì)胞的血小板減少癥(CAMT) -血小板減少合并橈骨缺失綜合征 -范可尼貧血(Fanconi anemia) -巨大血小板綜合征(Bernard-Soulier syndrome)，與大血小板有關(guān) -梅-海格林異常(May-Hegglinanomaly)，血小板減少癥、淡藍(lán)白血球包涵體及巨大血小板之組合 -灰色血小板綜合征 -奧爾波特綜合征(Alport syndrome) B)由一或多個(gè)以下所列舉因素引起之血小板破壞增加 -溶血性尿毒癥綜合征(HUS) -散播性血管內(nèi)凝血(DIC) -陣發(fā)性夜間血尿癥(PNH) -抗磷脂綜合征 -全身性紅斑狼瘡(SLE) -輸血后紫癜 -新生兒同種免疫性血小板減少癥(NAITP) -歸因于脾機(jī)能亢進(jìn)之血小板之脾隔離癥 -登革熱，其已展示導(dǎo)致縮短血小板存活及免疫性血小板破壞 -HIV C)藥物誘發(fā)之血小板減少癥 -肝素 -丙戊酸 -奎寧定(Quinidine) -阿昔單抗(Abciximab) -磺胺抗生素 -干擾素 -麻疹-流行性腮腺炎-風(fēng)疹三聯(lián)疫苗 -糖蛋白Ilb/IIIa抑制劑 -氯吡格雷(Clopidogrel) -萬古霉素(Vancomycin) -利奈唑胺(Linezolid) -法莫替丁(Famotidine) -美貝維林(Mebeverine) -替硝唑(Tinidazole)/甲硝唑(Metronidazole) -用于直接脊髓抑制之藥物，諸如丙戊酸、甲氨蝶呤(Methotrexate)、卡鉬 (Carboplatin)、干擾素及其它化療藥。
-用于免疫性血小板破壞之藥物，諸如結(jié)合抗體之Fab部分之藥物(例如奎寧定組藥物)、結(jié)合Fc之藥物及結(jié)合且活化血小板之藥物抗體復(fù)合物。
治療血小板減少癥 治療由病因及疾病嚴(yán)重性引導(dǎo)。治療血小板減少癥之主要概念為消除潛在問題， 意謂中止導(dǎo)致血小板減少癥之可疑藥物或治療潛在敗血癥。
本發(fā)明系關(guān)于用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療任何類型血小板減少癥。在一具體實(shí)例中，用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療血小板減少癥可與一或多種其它血小板減少癥治療組合，該等其它治療包括一或多種本文以下所列舉之治療。
-栓塞性血小板減少性紫癜(TTP) 在二十世紀(jì)八十年代，藉由應(yīng)用血漿去除法使TTP治療發(fā)生巨大改變。根據(jù)呋蘭-替塞假說(Furlan-Tsai hypothesis)，此治療理論上藉由移除針對(duì)溫韋伯因子(von Willebrand factor)裂解蛋白酶(ADAMTS-13)之抗體起作用。血漿去除程序亦向患者添加活性ADAMTS-13蛋白酶蛋白質(zhì)，從而恢復(fù)溫韋伯因子多聚體之更具生理性狀態(tài)。
-特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP) ITP之治療包括潑尼松及其它皮質(zhì)類固醇、靜脈內(nèi)Y球蛋白、脾切除術(shù)、達(dá)那唑 (Danazol)、利妥昔單抗(Rituximab)、血小板生成素類似物及AMG 531 (Romiplostim,商標(biāo)名 Nplate)。
治療性組合物 在本發(fā)明之一具體實(shí)例中，包含抗恒河猴D抗體產(chǎn)物之醫(yī)藥組合物意欲用以治療血小板減少癥。
在一具體實(shí)例中，醫(yī)藥組合物進(jìn)一步包含醫(yī)藥學(xué)上可接受之賦形劑。
抗恒河猴D抗體產(chǎn)物可以存于醫(yī)藥學(xué)上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑內(nèi)之單位劑型投予?？衫贸Ｒ?guī)藥學(xué)實(shí)踐向患者投予合適配制劑或組合物。在一較佳具體實(shí)例中， 投予為預(yù)防性的。
可利用任何適當(dāng)投藥途徑，例如投予可為非經(jīng)腸、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、 腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、霧劑、栓劑或經(jīng)口投予。
舉例而言，治療性配制劑可呈液體溶液或懸浮液形式；對(duì)于經(jīng)口投藥而言，配制劑可呈錠劑或膠囊、口嚼錠或糊劑形式，且對(duì)于鼻內(nèi)配制劑而言，呈粉末、滴鼻劑或霧劑形式。
以自身已知之方式，例如藉助于常規(guī)溶解、冷凍干燥、混合、?；虺尚头椒ㄖ苽浔景l(fā)明之醫(yī)藥組合物?？筛鶕?jù)常規(guī)藥學(xué)實(shí)踐調(diào)配醫(yī)藥組合物(例如參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第 20 版)，A. R. Gennaro 編，2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. Swarbrick 及 J. C. Boylan 編，1988-1999，Marcel Dekker, New York, NY)。
較佳使用活性成份之溶液以及懸浮液，且尤其等張水溶液或懸浮液，例如在冷凍干燥組合物之情況下，對(duì)于在使用之前制造之該等溶液或懸浮液而言，可僅包含活性成份或包含活性成份以及載劑(例如甘露糖醇)。醫(yī)藥組合物可經(jīng)滅菌及/或可包含賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑及/或乳化劑、增溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓之鹽及/或緩沖劑，且以自身已知之方式，例如藉助于常規(guī)溶解或冷凍干燥方法來制備。該等溶液或懸浮液可包含黏度增加物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明膠。
注入組合物系在無菌條件下以慣用方式來制備；同時(shí)亦適用于將組合物引入至安瓿或小瓶中且密封容器。
用于經(jīng)口投藥之醫(yī)藥組合物可藉由使活性成份與固體載劑組合來獲得，若需要將所得混合物?；胰粜枰虮匾獣r(shí)，在向錠劑、藥丸或膠囊中添加適當(dāng)賦形劑之后加工該混合物，該等錠劑、藥丸或膠囊可用蟲膠、糖或兩者涂布。其亦可并入使活性成份以量測(cè)數(shù)量擴(kuò)散或釋放之塑料載劑中。對(duì)于經(jīng)口投藥而言，醫(yī)藥組合物可經(jīng)保護(hù)以預(yù)防該組合物在胃中之胃酸中消化。
醫(yī)藥組合物包含約至約95%、較佳約20%至約90%之活性成份。根據(jù)本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可呈(例如)單位劑量形式，諸如呈安瓿、小瓶、栓劑、片劑、丸劑或膠囊形式。 可將配制劑以治療或預(yù)防有效量(例如預(yù)防、消除或減輕病理狀況之量)投予人類個(gè)體以治療疾病或病況。待要投予之治療劑之較佳劑量可視諸如病癥之類型及程度、特定患者之整體健康狀態(tài)、化合物賦形劑之配方及其投藥途徑之變數(shù)而定。
在一較佳具體實(shí)例中，用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療血小板減少癥準(zhǔn)備以每劑量每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予，該劑量諸如每公斤患者體重10-25微克特異性抗體、例如每公斤患者體重25-50微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重50-75微克特異性抗體、例如每公斤患者體重75-100微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重100-125微克特異性抗體、例如每公斤患者體重125-150微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重150-175微克特異性抗體、例如每公斤患者體重175-200微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重200-225微克特異性抗體、例如每公斤患者體重225-250微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重250-275微克特異性抗體、例如每公斤患者體重275-300微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重300-325微克特異性抗體、例如每公斤患者體重325-350微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重350-375微克特異性抗體、例如每公斤患者體重375-400微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重400-425微克特異性抗體、例如每公斤患者體重425-450 微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重450-475微克特異性抗體或例如每公斤患者體重 475-500微克特異性抗體。
在一具體實(shí)例中，用重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物治療脾被切除的患者或恒河猴陰性患者之血小板減少癥包含以每劑量每公斤患者體重10-2000微克特異性抗體之劑量投予重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，該劑量諸如每公斤患者體重10-25微克特異性抗體、例如每公斤患者體重25-50微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重50-75微克特異性抗體、例如每公斤患者體重75-100微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重100-125微克特異性抗體、例如每公斤患者體重125-150微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重150-175微克特異性抗體、例如每公斤患者體重175-200微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重200-225 微克特異性抗體、例如每公斤患者體重225-250微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重 250-275微克特異性抗體、例如每公斤患者體重275-300微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重300-325微克特異性抗體、例如每公斤患者體重325-350微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重350-375微克特異性抗體、例如每公斤患者體重375-400微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重400-425微克特異性抗體、例如每公斤患者體重425-450微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重450-475微克特異性抗體、例如每公斤患者體重475-500微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重500-550微克特異性抗體、例如每公斤患者體重550-600微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重600-650微克特異性抗體、例如每公斤患者體重650-700 微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重700-750微克特異性抗體、例如每公斤患者體重 750-800微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重800-850微克特異性抗體、例如每公斤患者體重850-900微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重900-950微克特異性抗體、例如每公斤患者體重950-1000微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1000-1050微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1050-1100微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1100-1150微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1150-1200微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1200-1250 微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1250-1300微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重 1300-1350微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1350-1400微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1400-1450微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1450-1500微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1500-1550微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1550-1600微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1600-1650微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1650-1700 微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1700-1750微克特異性抗體、例如每公斤患者體重 1750-1800微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1800-1850微克特異性抗體、例如每公斤患者體重1850-1900微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重1900-1950微克特異性抗體或例如每公斤患者體重1950-2000微克特異性抗體。
本發(fā)明組合物的治療性用途 本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用于治療、改善或預(yù)防諸如人類之哺乳動(dòng)物的血小板減少癥。
本發(fā)明之一個(gè)方面為在動(dòng)物或人類中治療、改善或預(yù)防疾病之方法，其中投予有效量之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物。
在一具體實(shí)例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可一次投予、每日一次、以一或多日之時(shí)間間隔(諸如2日、3日、4日、5日、6日、7日)重復(fù)投予或以每周一次或兩次，或每月一次或兩次或每年一次或兩次重復(fù)投予。
血紅蛋白水平 本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于治療諸如貧血人類之個(gè)體的血小板減少癥。將貧血或貧血癥定義為血紅蛋白(一種可見于紅細(xì)胞內(nèi)之分子)之定性或定量缺乏。血紅蛋白水平視個(gè)體之年齡及性別而定。
在本發(fā)明之一具體實(shí)例中，個(gè)體之血紅蛋白水平小于15g/dL，諸如小于14g/dL、例如小于13g/dL、諸如小于12g/dL、例如小于llg/dL、諸如小于10g/dL、例如小于9g/dL、諸如小于8g/dL。
可將貧血癥定義為，用藥前血紅蛋白值(pre-dose value)比針對(duì)性別及年齡之實(shí)驗(yàn)室正常范圍之下限低2. Og/dL的值還低?？蓪⑿詣e分成男性及女性組?？蓪⒛挲g分成新生兒組、兒童組和成人組。成人組包含懷孕成年女性。
貧血癥的另一定義為，血紅蛋白水平比針對(duì)年齡及性別之正常實(shí)驗(yàn)室范圍低2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差約相當(dāng)于2g/dL。
成人貧血之標(biāo)準(zhǔn)診斷對(duì)應(yīng)于女性血紅蛋白值< 12g/dL且男性血紅蛋白值< 14g/ dL，且基于來自以下之參考文獻(xiàn)WH0 世界衛(wèi)生組織(World Health Organization) Nutritional Anemia :Report of a WHO Scientific Group. Geneva :世界衛(wèi)生組織，1968。
正常血紅蛋白值視個(gè)體實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)而定，但約為如下(來源http://WWW. medical-library, net/content/view/297/41/) 成年男性13-18g/dL血紅蛋白 成年女性12-16g/dL血紅蛋白 懷孕女性ll_12g/dL血紅蛋白 新生兒17-19g/dL血紅蛋白(此值之77%為胎兒血紅蛋白，4月齡時(shí)降至總數(shù)之約 23% ) 兒童14-17g/dL血紅蛋白。
重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物 用于本發(fā)明之重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物已揭示于PCT/DK2005/000501中且亦描述于下文中。
在本發(fā)明之另一具體實(shí)例中，抗IihD重組多克隆抗體組合物包含各個(gè)抗體的指定子集，此系基于抗體呈現(xiàn)與恒河猴D抗原上之至少一個(gè)表位(例如印D1、印D2、印D3、印D4、 印D5、印D6/7、印D8及/或印D9)結(jié)合，而不會(huì)或極微弱結(jié)合恒河猴C、c、E、e抗原之普遍特征。較佳地，抗RhD rpAb組合物系由至少一個(gè)結(jié)合印D3、epD4及印D9之抗體(VI類RhD 抗原結(jié)合抗體)及至少組合地結(jié)合剩下的表位印D1、印D2、印D5、epD6/7及印D8之其它抗體(例如針對(duì)II類或III類MiD抗原之抗體，或與針對(duì)VII類抗原之抗體組合之IV類或 V類MiD抗原結(jié)合抗體)構(gòu)成?？筂iD rpAb組合物通常具有至少5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、50個(gè)、 100個(gè)或500個(gè)不同變異體成員。較佳變異體成員數(shù)介于5至100之范圍內(nèi)，甚至更佳介于 5與50之間且最佳介于1+與30之間，諸如在10與25之間。
除Vh及\區(qū)，尤其⑶R區(qū)之可變性之外，恒定區(qū)亦可根據(jù)同型而變化。此表示可產(chǎn)生具有變化的恒定重鏈同型(例如人類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、lgA2、IgM、IgD及 IgE)之一個(gè)特定對(duì)。因此，抗MiDrpAb可包含多個(gè)抗體分子，它們的特性為，這些抗體分子在可變區(qū)(V區(qū))以及恒定區(qū)中有序列差異。抗MiD rpAb組合物可由具有任何以上所提及之重鏈同型或其組合之抗體構(gòu)成。較佳抗RhD rpAb組合物含有IgGl恒定區(qū)、IgG3 恒定區(qū)或IgGl及IgG3恒定區(qū)。在本發(fā)明之一較佳具體實(shí)例中，每一或一些Vh及\對(duì)經(jīng)表達(dá)具有人類IgGl、IgG3、IgAl及/或lgA2恒定重鏈。
為提供編碼抗IihD抗體之核酸區(qū)段的文庫，可利用許多此項(xiàng)技術(shù)中已知之方法。 包含編碼Vh及\之區(qū)段的第一文庫可藉由組合技術(shù)(例如EP 0 368 684)或維持同源對(duì)(來源于相同細(xì)胞之編碼可變區(qū)之序列對(duì)，描述于WO 05/042774中)之技術(shù)而產(chǎn)生。此外， 編碼Vh及\之區(qū)段文庫可藉由將經(jīng)分離⑶R基因片段并入適當(dāng)構(gòu)架中(例如Soderlind， Ε.等人，2000. Nat. Biotechnol. 18,852-856)或藉由使一或多個(gè)編碼抗RhD Vh及\之序列突變而產(chǎn)生。針對(duì)產(chǎn)生對(duì)MiD具有結(jié)合特異性之抗體或片段的編碼Vh及\之核酸區(qū)段篩選此第一文庫，從而產(chǎn)生編碼抗MiD Ab之核酸區(qū)段文庫。詳言之，對(duì)于組合文庫而言，在篩選之前為富集步驟，例如所謂生物淘選步驟。已知的生物淘選技術(shù)為噬菌體展示(Kang， Α. S.等人，1991. Proc Natl Acad Sci USA 88，4363-4366)、核糖體展示(Schaffitzel, C.等人，1999. J. Immunol. Methods 231，119-135)、DNA 展示(Cull, Μ. G.等人，1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89，1865-1869)、RNA 肽展示(Roberts，R. W.、Szostak. J. W.，1997. Proc Natl Acad Sci U S A 94，12四7_12302)、共價(jià)展示(W0 98/37186)、細(xì)菌表面展示(Fuchs, P.等人，1991. Biotechnology 9，1369-1372)、酵母菌表面展示(Boder, Ε. T.、 Wittrup, K. D.，1997. Nat Biotechnol 15，553-557)及真核生物病毒展示(Grabherr. R.、 Ernst, W.，2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4，185-192)。使用標(biāo)記抗原之 FACS 及磁珠分選亦適用于富集(淘選)目的。針對(duì)恒河猴D結(jié)合劑之篩選通常由諸如凝集、 FACS, ELISA、FLISA及/或免疫墨點(diǎn)檢定之免疫偵測(cè)檢定進(jìn)行。
篩選之后，通常需要將所產(chǎn)生之編碼Vh及\之核酸區(qū)段的子文庫由篩選載體轉(zhuǎn)移至適用于在所要宿主細(xì)胞中位點(diǎn)特異性整合及表達(dá)之表達(dá)載體。重要的是在轉(zhuǎn)移期間維持編碼各個(gè)Vh Vl對(duì)之序列。此可藉由使子文庫之具體成員分離及挨個(gè)移動(dòng)編碼Vh及\之序列中來達(dá)成。或者，匯集構(gòu)成子文庫之載體，且使編碼對(duì)之序列以區(qū)段形式移動(dòng)，在轉(zhuǎn)移期間保持編碼Vh及\之序列在一起。此方法亦稱為質(zhì)量轉(zhuǎn)移，且能使所有所選VH:八對(duì)易于由一個(gè)載體轉(zhuǎn)移至另一載體。
抗恒河猴D抗體產(chǎn)物較佳包含對(duì)D+及所有測(cè)試變異體(DIN、DIV, DV、I-III型 DVI、DVII、DFR、RoHAR、D0L、DAR、DHMi、DBTHDSl、2、3、4&12)具有活性之抗體。
本發(fā)明系關(guān)于抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，該抗體產(chǎn)物包含具有由克隆I hD157、159、 160、162、189、191、192、196、197、199、201、202、203、207、240、241、245、293、301、305、306、 317、319、321及3 編碼之25個(gè)抗體之CDR序列的抗體。
本發(fā)明亦系關(guān)于抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，該抗體產(chǎn)物包含具有由克隆I hD157、159、 160、162、189、191、192、196、197、199、201、202、203、207、240、241、245、293、301、305、306、 317、319、321及3 編碼之25個(gè)抗體之VhVl序列的抗體。
在一較佳具體實(shí)例中，本發(fā)明系關(guān)于抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，該抗體產(chǎn)物包含由克隆 RhD157、159、160、162、189、191、192、196、197、199、201、202、203、207、240、241、245、293、 301、305、306、317、319、321 及 324 編碼之抗體。
在一較佳具體實(shí)例中，抗恒河猴D抗體產(chǎn)物系在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制造，更佳其系由可由在CHO細(xì)胞中表達(dá)獲得之糖基化作用制造。
抗RhD rpAb之結(jié)構(gòu)特性描繪 由于混合物之復(fù)雜性(克隆多樣性、非同質(zhì)性及糖基化作用)，故多克隆抗體之結(jié)構(gòu)特性描繪需要高分辨率。在抗MiD rpAb中，諸如凝膠過濾、離子交換層析或電泳之傳統(tǒng)方法可能不具有足夠分辨率以區(qū)分各個(gè)抗體。二維聚丙烯酰胺凝膠電泳0D-PAGE)已用于剖析復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，繼之以質(zhì)譜分析(MQ或液相層析(LC)-MS(例如蛋白質(zhì)粒研究)。已證明組合基于蛋白質(zhì)之電荷及質(zhì)量分離之2D-PAGE適用于在血清樣品中區(qū)分多克隆、寡株及單克隆免疫球蛋白。然而，此方法具有一些限制。層析技術(shù)，尤其毛細(xì)管及LC與電噴霧電離MS聯(lián)用日益用于復(fù)合肽混合物之分析。LC-MS已用于單克隆抗體之特性描繪且近來亦用于多克隆抗體輕鏈之剖析。極復(fù)雜樣品之分析需要更具解析力之層析系統(tǒng)，其可藉由以二維(或超過二維)分離獲得。該方法系基于在第一維中離子交換及在第二維中逆相層析(或疏水性相互作用)，視情況與MS聯(lián)用。
抗RhD rpAb之功能特件描繪 抗RhD rpAb抗體可(例如)經(jīng)由與抗D免疫球蛋白產(chǎn)物或抗RhD mAb之可比性研究功能上描繪特性?？审w外以及活體內(nèi)進(jìn)行該等研究。
抗I hD rpAb之體外功能特性描繪方法可為(例如)吞噬檢定(基于51Cr或基于 FACS)、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)及玫瑰試驗(yàn)(Rosetting assay)。如下簡(jiǎn)要描述該等檢定 ADCC 檢定(基于 aCr) 將人類PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞，且將MiD陰性及陽性RBC (ABO系統(tǒng)中之0)用作目標(biāo)。 首先，將RBC(I hD(+)及I hD(-))標(biāo)記51Cr,洗滌且接著在各種稀釋液中用抗MiD抗體(例如抗I hD rpAb、抗D或抗I hD mAb)致敏。將效應(yīng)細(xì)胞(PMBC)添加至致敏RBC中QO 1 之比率)且培育隔夜。將細(xì)胞旋落離心(spin down)且將上清液由孔中轉(zhuǎn)移至固態(tài)閃爍定量盤(Lumaplate) (PerkinElmer)中。包括自發(fā)釋放之對(duì)照組(僅具有51Cr之RBC)及總體釋放之對(duì)照組(添加曲拉通-X-100 (Triton-X-IOO)至51Cr標(biāo)記RBC中)。干燥固態(tài)閃爍定量盤且于頂部計(jì)數(shù)器(Topcounter) (PerkinElmer)中計(jì)數(shù)。
吞噬檢定(基于aCr) 可與ADCC檢定組合量測(cè)吞噬作用。在收集ADCC檢定中之上清液之后，移除剩余上清液且藉由添加低滲緩沖液(hypotonic buffer)裂解紅細(xì)胞。洗滌細(xì)胞且移除上清液。 將PBS+1%曲拉通-X-100添加至所有孔中且將固定量轉(zhuǎn)移至固態(tài)閃爍定量盤中，干燥且如前所述計(jì)數(shù)。
吞噬檢定(基于FACS) 此檢定系基于吞噬細(xì)胞之黏著性。人類白血病成單核細(xì)胞細(xì)胞系U937可用于此檢定。使用IOnM PMA分化U937細(xì)胞。兩天后，移除60%之培養(yǎng)基且經(jīng)無PMA之培養(yǎng)基置換。根據(jù)制造商方案(Sigma)用(PE)染色紅細(xì)胞(RhD (+) ^RhD(-))之細(xì)胞膜。在各種稀釋液中用抗MiD抗體致敏RBC且藉由洗滌移除過量抗體。第3日，藉由洗滌移除非黏附性細(xì)胞U937細(xì)胞且將經(jīng)致敏RBC (RhD (+)及IihD (-))添加至孔中。將培養(yǎng)盤于恒溫箱中培育隔夜。藉由若干步驟洗去未吞噬RBC。藉由添加低滲緩沖液，之后再洗滌來裂解經(jīng)黏附而未吞噬之RBC。藉由用胰蛋白酶培育使U937細(xì)胞與孔分離。經(jīng)FACS分析細(xì)胞。
測(cè)定對(duì)血小板吞噬作用之抑制的檢定 此功能檢定測(cè)定血小板吞噬作用之劑量依賴性抑制。簡(jiǎn)言之，將血小板用CM綠標(biāo)記且用抗體調(diào)理且與效應(yīng)細(xì)胞THP-1 ( 一種單核細(xì)胞系)一起培育。如實(shí)施例4中所述制備血小板、紅細(xì)胞及THP-I細(xì)胞。如下所述測(cè)定血小板之吞噬作用。將血小板(對(duì)于 1 20 E T比率而言，2X IO8/毫升，50微升/孔)、RBC(對(duì)于1 40 E T比率而言， 4X IO8/毫升，50微升/孔)及THP細(xì)胞(1 X IO7/毫升，50微升/孔)混合且于濕潤恒溫箱(5% C02-37°C )中培育2小時(shí)。添加100微升以PBS 1 1預(yù)稀釋之臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue,Fluka)以阻斷THP細(xì)胞之外的非特異性結(jié)合。用200微升/孔PBS (210g，+4°C，3分鐘)洗滌一次，添加200微升/孔裂解溶液(BD)且在4°C下培育15分鐘。用200微升/孔 PBS洗滌一次且再懸浮于200微升/孔PBS中。在FACS Calibur上由高通量篩選(HTS)經(jīng)由側(cè)向散射(SSC)及前向散射(FSC)獲得細(xì)胞之生存門(live gate)且分析FI_1之中值熒光強(qiáng)度。
玫瑰試騎 玫瑰試驗(yàn)僅僅是Fc受體結(jié)合檢定。使致敏紅細(xì)胞與如上所述制備之分化U937細(xì)胞一起培育。將RBC(I hD(-)及I hD(+))于各種稀釋液中用抗MiD抗體致敏且藉由洗滌移除過量抗體，之后將其與U937細(xì)胞混合。培育一小時(shí)且洗去未結(jié)合RBC。計(jì)算有兩個(gè)或超過兩個(gè)RBC與表面連接之細(xì)胞的百分比。
抗RhD抗體之活體內(nèi)功能特性描繪系由Miescher (Miescher，S.等人，2004, Blood 103,4028-4035)描述，涉及將MiD (+)細(xì)胞注入I hD(-)個(gè)體中，之后投予抗MiD抗體。分析供體之RBC清除及抗IihD抗體感覺。
產(chǎn)生重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物 重組多克降蛋白質(zhì)表汰系統(tǒng) 本發(fā)明提供用于由一個(gè)或少許細(xì)胞系穩(wěn)定制造抗IihD重組多克隆抗體(抗IihD rpAb)之重組多克隆抗體表達(dá)系統(tǒng)。抗MiD重組多克隆抗體(抗I hD rpAb)可如PCT/ DK2005/000501中所述制造及/或純化及/或特性描繪。
除Vh及\區(qū)，尤其⑶R區(qū)之可變性之外，恒定區(qū)亦可根據(jù)同型而變化。此表示可產(chǎn)生具有變化的恒定重鏈同型(例如人類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、lgA2、IgM、IgD及 IgE)之一個(gè)特定Vh及\對(duì)。因此，抗IihDrpAb可包含以特性為可變區(qū)(V區(qū))以及恒定區(qū)各個(gè)抗體分子之間的序列差異之抗體分子?？筂iD rpAb組合物可由具有任何以上所提及之重鏈同型或其組合之抗體構(gòu)成。較佳抗MiD rpAb組合物含有IgGl恒定區(qū)、IgG3恒定區(qū)或 IgGl及IgG3恒定區(qū)。在本發(fā)明之一較佳具體實(shí)例中，每一或一些Vh及\對(duì)由人類IgGl、 IgG3、IgAl及/或lgA2恒定重鏈表達(dá)。
為提供編碼抗IihD抗體之核酸區(qū)段的文庫，可利用許多此項(xiàng)技術(shù)中已知之方法。 包含編碼Vh及\之區(qū)段的第一文庫可藉由組合技術(shù)(例如EP 0 368 684)或維持同源對(duì) (來源于相同細(xì)胞之編碼可變區(qū)之序列對(duì)，描述于WO 05/042774中)之技術(shù)產(chǎn)生。此外， 編碼Vh及\之區(qū)段文庫可藉由將經(jīng)分離⑶R基因片段并入適當(dāng)構(gòu)架中(例如Soderlind， Ε.等人，2000. Nat. Biotechnol. 18,852-856)或藉由使一或多個(gè)編碼抗RhD Vh及\之序列突變而產(chǎn)生。針對(duì)產(chǎn)生對(duì)MiD具有結(jié)合特異性之抗體或片段的編碼Vh及\之核酸區(qū)段篩選此第一文庫，從而產(chǎn)生編碼抗MiD Ab之核酸區(qū)段之文庫。詳言之，對(duì)于組合文庫而言， 在篩選之前為富集步驟，例如所謂生物淘選步驟。已知生物淘選技術(shù)為噬菌體展示(Kang， Α. S.等人，1991. Proc Natl Acad Sci U S A 88，4363-4366)、核糖體展示(Schaffitzel, C.等人，1999. J. Immunol. Methods 231，119_1；35)、DNA 展示(Cull, Μ. G.等人，1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89，1865-1869)、RNA 肽展示(Roberts，R. W.、Szostak. J. W.，1997. Proc Natl Acad Sci U S A 94，12四7_12302)、共價(jià)展示(W0 98/37186)、細(xì)菌表面展示(Fuchs, P.等人，1991. Biotechnology 9，1369-1372)、酵母菌表面展示(Boder, Ε. T.、Wittrup, K. D.，1997. Nat Biotechnol 15，553-557)及真核生物病毒展示(Grabherr. R.、 Ernst, W.，2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4，185-192)。使用標(biāo)記抗原之 FACS 及磁珠分選亦適用于富集(淘選)目的。針對(duì)恒河猴D結(jié)合劑之篩選通常由免疫偵測(cè)檢定進(jìn)行，諸如凝集、FACS, ELISA、FLISA及/或免疫墨點(diǎn)檢定。
篩選之后，通常需要將所產(chǎn)生之編碼Vh及\之核酸區(qū)段子文庫由篩選載體轉(zhuǎn)移至適用于在所要宿主細(xì)胞中位點(diǎn)特異性整合及表達(dá)之表達(dá)載體。重要的是在轉(zhuǎn)移期間維持編碼各個(gè)Vh Vl對(duì)之序列。此可藉由使子文庫之具體成員分離及挨個(gè)移動(dòng)編碼Vh及\之序列中來達(dá)成。或者，匯集構(gòu)成子文庫之載體，且使編碼Vh Vl對(duì)之序列以區(qū)段形式移動(dòng)，在轉(zhuǎn)移期間保持編碼Vh及\之序列在一起。此方法亦稱為質(zhì)量轉(zhuǎn)移，且能夠使所有所選VH:八對(duì)易于由一個(gè)載體轉(zhuǎn)移至另一載體。
在本發(fā)明之另一具體實(shí)例中，抗IihD重組多克隆抗體組合物包含各個(gè)抗體的指定子集，此系基于抗體呈現(xiàn)與恒河猴D抗原上之至少一個(gè)表位(例如印D1、印D2、印D3、印D4、 印D5、印D6/7、印D8及/或印D9)結(jié)合，而不會(huì)或極微弱結(jié)合恒河猴C、c、E、e抗原之普遍特征。較佳地，抗RhD rpAb組合物系由至少一個(gè)結(jié)合印D3、epD4及印D9之抗體(VI類RhD 抗原結(jié)合抗體)及至少組合地結(jié)合剩下的表位印D1、印D2、印D5、epD6/7及印D8之其它抗體(例如針對(duì)II類或III類MiD抗原之抗體，或與針對(duì)VII類抗原之抗體組合之IV類或 V類MiD抗原結(jié)合抗體)構(gòu)成。通?？笽 hD rpAb組合物具有至少5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、50個(gè)、 100個(gè)或500個(gè)不同變異體成員。較佳變異體成員數(shù)介于5至10之范圍內(nèi)，甚至更佳介于 5與50之間且最佳介于10與30之間，諸如在10與25之間。
本發(fā)明之另一具體實(shí)例為重組多克隆生產(chǎn)細(xì)胞系，其包含用編碼抗IihD多克隆抗體之核酸區(qū)段之文庫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集合，其中集合中之各細(xì)胞能夠表達(dá)文庫中之一個(gè)成員， 其編碼抗MiD rpAb或片段之不同成員且其位于該集合中之各個(gè)細(xì)胞基因組的相同位點(diǎn)處， 其中該核酸區(qū)段并非天然與集合中之該細(xì)胞有關(guān)聯(lián)。
在另一具體實(shí)例中，編碼抗I hD rpAb之變異體核酸區(qū)段均來源于天然存在之序列，例如以組合Vh Vl對(duì)或以同源對(duì)自供體分離，且不會(huì)由突變衍生。
WO 02/44361中已描述含有變異體核酸之細(xì)胞組合物，該等變異體核酸位于各細(xì)胞內(nèi)基因組中之單一特異性位點(diǎn)處。此文獻(xiàn)揭示使用細(xì)胞鑒別具有所需特性之分子，但該參考文獻(xiàn)并未討論生產(chǎn)系統(tǒng)之供應(yīng)或以與抗原特異性結(jié)合描繪特性之多克隆抗體之供應(yīng)。
克隆多樣性/多克隆性 多克隆抗體之一個(gè)特性為其由許多各個(gè)抗體分子構(gòu)成，其中各抗體分子與多克隆抗體之其它分子同源，而且具有以多克隆抗體之具體成員之間的氨基酸序列差異描繪特性的可變性。此等差異通常限于可變區(qū)，尤其⑶R區(qū)(⑶R1、⑶R2及⑶R3)。亦可將多克隆抗體之此可變性描述為功能層次多樣性，例如對(duì)位于一或多個(gè)目標(biāo)處相同或不同抗原上之不同抗原決定子具有不同特異性及親和力。在重組多克隆抗體中，該多樣性構(gòu)成源自供體之免疫球蛋白產(chǎn)物中所觀測(cè)到之多樣性子集。將該子集關(guān)于其結(jié)合所要目標(biāo)抗原(在此具體情況下為恒河猴D抗原)之能力謹(jǐn)慎選擇且描繪特性。
關(guān)于產(chǎn)生重組多克隆抗體之一個(gè)關(guān)注點(diǎn)可為在最終產(chǎn)物中是否仍維持克隆多樣性。可藉由對(duì)來自表達(dá)抗MiD rpAb之細(xì)胞的(RT)-PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)或定序來分析克隆多樣性。亦可藉由功能測(cè)試(例如ELISA)對(duì)由細(xì)胞系所產(chǎn)生之抗MiD rpAb、藉由抗遺傳型抗體針對(duì)具體成員或藉由層析法在蛋白質(zhì)層次上分析多樣性。
若存在克隆偏倚(clonal bias)，則其可藉由比較用于轉(zhuǎn)染之最初文庫的克隆多樣性與表達(dá)抗MiD rpAb之細(xì)胞池(多克隆細(xì)胞系)中可見之多樣性來估計(jì)。
可以多克隆組合物中之具體成員的分布評(píng)估抗I hD rpAb之克隆多樣性。此分布可以最終多克隆抗體組合物中不同具體成員之總數(shù)與在轉(zhuǎn)染期間最初引入細(xì)胞系中之不同編碼序列之?dāng)?shù)目相比來評(píng)估。在此情況下，當(dāng)至少50%最初用于轉(zhuǎn)染之編碼序列可識(shí)別為最終抗MiD rpAb之不同具體成員時(shí)，即認(rèn)為獲得足夠多樣性。較佳至少75%之用于轉(zhuǎn)染之編碼抗MiD抗體之序列可識(shí)別為最終組合物中之抗體。甚至更佳至少85%至95%，且最佳100%之用于轉(zhuǎn)染之編碼抗IihD抗體之序列可識(shí)別為最終組合物中之抗體。
抗I hD rpAb組合物之具體成員之分布亦可根據(jù)具體成員中之相互分布來評(píng)估。 在此情況下，若組合物之單一成員未在最終抗MiD rpAb組合物中構(gòu)成超過具體成員總數(shù)之 75%，則認(rèn)為獲得足夠克隆多樣性。較佳地，具體成員不超過最終多克隆組合物中具體成員總數(shù)之50%、甚至更佳不超過25%且最佳不超過10%。基于多克隆組合物中具體成員分布之克隆多樣性之評(píng)估可藉由RFLP分析、序列分析或蛋白質(zhì)分析(諸如稍后針對(duì)多克隆組合物之特性描繪所述之方法)來進(jìn)行。
克隆多樣性可a)因可在克隆過程中出現(xiàn)克隆偏倚，b)因細(xì)胞增殖變化或C)經(jīng)由混雜多個(gè)整合子(integrant)而降低。若該等偏倚出現(xiàn)，則克隆多樣性損失之此等根源中之每一者均易于藉由對(duì)如本文所述方法進(jìn)行微小修改來補(bǔ)救。
為限制藉由將可變結(jié)構(gòu)域克隆至適當(dāng)載體中而引入之偏倚，所關(guān)注基因由一個(gè)載體轉(zhuǎn)移至另一載體可經(jīng)設(shè)計(jì)以使克隆偏倚受限。用于擴(kuò)增之大腸桿菌(E.coli)品系之質(zhì)量轉(zhuǎn)移技術(shù)及謹(jǐn)慎選擇可降低克隆偏倚。另一可能性為在篩選載體與用于位點(diǎn)特異性整合之載體之間使編碼多克隆抗體之具體成員之各多核苷酸各個(gè)轉(zhuǎn)移。
細(xì)胞系中各個(gè)細(xì)胞之細(xì)胞增殖速率的變化經(jīng)長時(shí)間可向抗I hD rpAb表達(dá)中引入偏倚，從而增加或降低由細(xì)胞系表達(dá)之抗MiD rpAb之一些成員的存在率。該等增殖速率變化之一個(gè)原因可為構(gòu)成用于初始轉(zhuǎn)染之起始細(xì)胞系之細(xì)胞群體非同質(zhì)。已知細(xì)胞系中之各個(gè)細(xì)胞經(jīng)長時(shí)間發(fā)育有差異。為確保起始物質(zhì)更同質(zhì)，在用所關(guān)注文庫轉(zhuǎn)染之前可使用使細(xì)胞系降至單細(xì)胞層次之限制稀釋且使各單細(xì)胞生長為新穎細(xì)胞群體來進(jìn)行細(xì)胞系之次克隆(所謂藉由限制稀釋進(jìn)行之細(xì)胞次克隆)。接著一或多個(gè)此等細(xì)胞群體基于其增殖及表達(dá)特性選擇為起始物質(zhì)。此外，用于確保僅接收位點(diǎn)特異性整合子之細(xì)胞生存之選擇壓力可影響多克隆細(xì)胞系內(nèi)各個(gè)細(xì)胞之增殖速率。此可歸因于偏愛進(jìn)行某些遺傳學(xué)變化以適合于選擇壓力之細(xì)胞。因此，選擇標(biāo)記之選擇亦可影響增殖速率誘發(fā)之偏倚。若此現(xiàn)象出現(xiàn)，則應(yīng)測(cè)試不同選擇標(biāo)記。在選擇系基于對(duì)細(xì)胞有毒之物質(zhì)的情況下，應(yīng)謹(jǐn)慎測(cè)試最佳濃度以及在整個(gè)生產(chǎn)期或僅在初始階段中是否需要選擇。
確保明確定義之細(xì)胞群體的其它方法為在轉(zhuǎn)染及選擇程序之后使用熒光活化細(xì)胞分選(FACS)。熒光標(biāo)記抗體可用以富集來源于用IgG構(gòu)建體轉(zhuǎn)染之細(xì)胞池之高產(chǎn)細(xì)胞 (Brezinsky 等人，J. 2003. Immunol Methods 277,141-155)。此方法亦可用以分選表達(dá)類似水平免疫球蛋白之細(xì)胞，從而關(guān)于生產(chǎn)力產(chǎn)生同質(zhì)細(xì)胞群體。同樣地，藉由由熒光染料5， 6-羧基熒光素二乙酸丁二酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記，可藉由FACS方法選擇展示類似增殖速率之細(xì)胞。此外，抗MiD rpAb之具體成員之表達(dá)水平的差異經(jīng)長時(shí)間亦可向最終產(chǎn)物中引入偏倚。
若多克隆細(xì)胞系系藉由在選擇之后混合分別轉(zhuǎn)染之克隆來產(chǎn)生，則可在混合之前針對(duì)各個(gè)克隆在細(xì)胞培養(yǎng)層次上建立以下選擇準(zhǔn)則增殖速率必須在M與32小時(shí)之間，生產(chǎn)力應(yīng)超過1. 5皮克抗體/細(xì)胞/日，且培養(yǎng)應(yīng)展示藉由細(xì)胞內(nèi)染色法所評(píng)估之同質(zhì)細(xì)胞群體。若需要更同質(zhì)細(xì)胞群體，則各各個(gè)克隆可在藉由在群體之特定區(qū)域門控而混合各個(gè)克隆之前由Brezinsky所述之表面染色法連同F(xiàn)ACS分析獲得。
即便出現(xiàn)增殖速率誘發(fā)或生產(chǎn)力誘發(fā)之偏倚，依賴于最終抗I hD rpAb產(chǎn)物之多樣性要求，具體成員之損失或過度表達(dá)亦可能不一定關(guān)鍵。
在具有位點(diǎn)特異性單一整合子之細(xì)胞中，細(xì)胞僅在待表達(dá)抗體之可變區(qū)序列方面不同。因此，消除由整合位點(diǎn)及基因調(diào)節(jié)組件之變化所施加之不同細(xì)胞效應(yīng)且整合區(qū)段對(duì)細(xì)胞增殖速率具有極小作用?；祀s或多次整合均不可能導(dǎo)致生產(chǎn)細(xì)胞系之增殖速率方面的問題，此系因?yàn)榇说然祀s或多次整合為稀有事件。隨機(jī)整合通常在約10_5之效率下出現(xiàn)，然而在約10_3之效率下出現(xiàn)位點(diǎn)特異性整合。若多次整合出乎意料地造成問題，則替代方法為重復(fù)用抗MiD抗體表達(dá)載體文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)染，此系因?yàn)槿缟纤鍪录噩F(xiàn)之可能性極小。
考慮到統(tǒng)計(jì)學(xué)，大量細(xì)胞之成批轉(zhuǎn)染亦構(gòu)成避免不當(dāng)克隆偏倚之方式。在此方法中，宿主細(xì)胞系用抗MiD抗體表達(dá)載體之文庫成批轉(zhuǎn)染。該文庫構(gòu)成文庫之各不同成員之許多拷貝。較佳應(yīng)將此等拷貝整合至大量宿主細(xì)胞中。較佳使至少100、1000、10000或 100000個(gè)各個(gè)細(xì)胞用變異體核酸區(qū)段文庫之不同成員之拷貝轉(zhuǎn)染。因此，若不同變異體核酸區(qū)段之文庫系由1000個(gè)各整合至1000個(gè)各個(gè)細(xì)胞中之不同成員構(gòu)成，則IO6個(gè)含有位點(diǎn)特異性整合之編碼抗MiD抗體之區(qū)段的克隆應(yīng)由轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生。如此，兩倍速率之各個(gè)細(xì)胞之高斯曲線(gausian curve)應(yīng)僅以極小程度影響一般群體。此將增加保持克隆組合物恒定之機(jī)率，即便低百分比之制造細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)異常生長及/或表達(dá)特性。
或者可使用先前所述之半批量轉(zhuǎn)染或各個(gè)轉(zhuǎn)染方法。
實(shí)施例 實(shí)施例1 產(chǎn)生抗恒河猴D重組多克隆抗體 供體 供體登記于Aalborg Sygehus Nord。以來源于RhD(+)個(gè)體之RhD(+)紅細(xì)胞使總計(jì)8個(gè)I hD(-)女性免疫。供體具有關(guān)于促升數(shù)目及用于免疫之MiD(+)紅細(xì)胞之來源之不同免疫歷史。表1中給出不同供體之免疫歷史。
表1
權(quán)利要求
1.重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，其系用于治療或預(yù)防血小板減少癥，其中該抗體產(chǎn)物經(jīng)制備以供以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予，該重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物包含各個(gè)抗體的指定子集，呈現(xiàn)與恒河猴D抗原上至少一個(gè)表位的結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的抗體產(chǎn)物，其中該至少一個(gè)表位系選自由印D1、印D2、印D3、印D4、 印D5、印D6/7、epD8及/或印D9所組成之群組。
3.權(quán)利要求1的抗體產(chǎn)物，其中所述各個(gè)抗體中至少一種與印D3、印D4及印D9(VI 類MiD抗原)特異性結(jié)合，且其它成員單獨(dú)或組合地結(jié)合剩下的恒河猴D抗原表位epDl、 印D2、印D5、印D6/7及印D8。
4.權(quán)利要求1的抗體產(chǎn)物，其中所述各個(gè)抗體不結(jié)合或僅微弱地結(jié)合恒河猴C、c、E及 e抗原。
5.權(quán)利要求1的抗體產(chǎn)物，其中該抗體系以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體， 諸如每公斤患者體重10-25微克特異性抗體、例如每公斤患者體重25-50微克特異性抗體、 諸如每公斤患者體重50-75微克特異性抗體、例如每公斤患者體重75-100微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重100-125微克特異性抗體、例如每公斤患者體重125-150微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重150-175微克特異性抗體、例如每公斤患者體重175-200微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重200-225微克特異性抗體、例如每公斤患者體重225-250 微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重250-275微克特異性抗體、例如每公斤患者體重 275-300微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重300-325微克特異性抗體、例如每公斤患者體重325-350微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重350-375微克特異性抗體、例如每公斤患者體重375-400微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重400-425微克特異性抗體、例如每公斤患者體重425-450微克特異性抗體、諸如每公斤患者體重450-475微克特異性抗體或例如每公斤患者體重475-500微克特異性抗體之劑量投予。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的抗體產(chǎn)物，其中該血小板減少癥系于患有貧血癥之個(gè)體中治療。
7.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體具有比該個(gè)體所屬之性別及年齡之平均值低超過2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差之血紅蛋白水平。
8.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體具有比針對(duì)性別及年齡之實(shí)驗(yàn)室正常范圍之下限低2. Og/dL的值更低之血紅蛋白水平。
9.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，該個(gè)體具有小于10g/dL之血紅蛋白水平。
10.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為具有小于12-16g/dL，諸如小于12g/dL的血紅蛋白水平之成年女性。
11.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為具有小于13-18g/dL，諸如小于14g/dL的血紅蛋白水平之成年男性。
12.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為具有小于ll-12g/dL的血紅蛋白水平之孕婦。
13.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為具有小于17-19g/dL的血紅蛋白水平之新生兒。
14.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為具有小于14-17g/dL的血紅蛋白水平之兒里。
15.權(quán)利要求6的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體具有比針對(duì)該個(gè)體之年齡及性別之正常水平低不到2D之血紅蛋白水平且其中該重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物劑量不受該個(gè)體之血紅蛋白水平影響。
16.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中投予該抗體導(dǎo)致在90%所治療個(gè)體中血紅蛋白水平下降至多30%，諸如至多25%、諸如至多20%、諸如至多15%、諸如至多10%、諸如至多5%、諸如至多1%。
17.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該劑量實(shí)質(zhì)上不會(huì)導(dǎo)致血管外溶血。
18.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中投予該抗體并不會(huì)導(dǎo)致需要輸血的貧血。
19.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為恒河猴D陽性。
20.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體為恒河猴D陰性。
21.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體的脾未被切除。
22.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該個(gè)體的脾被切除。
23.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該血小板減少癥涉及免疫組份。
24.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，該血小板減少癥不涉及免疫組份。
25.權(quán)利要求23的抗體產(chǎn)物，其中該血小板減少癥可選自由以下者所組成之群組ITP、抗磷脂抗體綜合征、后天選擇性低巨核細(xì)胞發(fā)育不全(Acquired selective amegacariyocyte aplasia)、歸因于傳染因子(尤其而非排他性地為幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)、HIV及/或C型肝炎)之免疫性血小板減少癥、新生兒自體或異體免疫性血小板減少癥(歸因于母體經(jīng)胎盤傳遞之抗體)及與藥物依賴性抗體相關(guān)之藥物誘發(fā)之血小板減少癥。
26.權(quán)利要求M的抗體產(chǎn)物，其中該血小板減少癥可選自由以下者所組成之群組先天性血小板減少癥、栓塞性血小板減少性紫癜、歸因于溶血性尿毒綜合征之血小板減少癥、 歸因于化療之血小板減少癥、歸因于輻射之血小板減少癥、歸因于營養(yǎng)缺乏之血小板減少癥及歸因于脊髓發(fā)育不良綜合征之血小板減少癥。
27.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該多克隆抗體產(chǎn)物包含至少3種不同抗體，諸如至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、 至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少M(fèi)種或至少25種不同抗體。
28.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該多克隆抗體產(chǎn)物包含能夠結(jié)合至少3種不同表位，諸如至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、 至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少M(fèi)種或至少25種不同表位之抗體。
29.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該抗體為IgGl同種型。
30.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該抗體為多價(jià)的。
31.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該重組抗恒河猴D抗體包含人類恒定區(qū)。
32.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該等抗體包含人類可變區(qū)。
33.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中來自Vh:八對(duì)之⑶R1、⑶R2及⑶R3區(qū)系選自圖3及圖4中所述之⑶R1、⑶R2及⑶R3區(qū)。
34.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該抗體產(chǎn)物通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生 用 25 種單克隆抗 MiD 抗體生成細(xì)胞系(I hD157、159、160、162、189、191、192、196、197、199、 201、202、203、207、240、241、245、293、301、305、306、317、319、321、324)產(chǎn)生含抗 RhD rpAb 之pWCP。
35.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該抗體產(chǎn)物包含多種抗體，它們具有25種抗體的 CDR 序列，所述 25 種抗體由克隆 RhD157、159、160、162、189、191、192、196、197、199、 201、202、203、207、240、241、245、293、301、305、306、317、319、321、324 編碼。
36.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物，其中該抗體產(chǎn)物包含多種抗體，它們具有25種抗體的 VhVl 序列，所述 25 種抗體由克隆 RhD157、159、160、162、189、191、192、196、197、199、 201、202、203、207、240、241、245、293、301、305、306、317、319、321、324 編碼。
37.在先權(quán)利要求之一的抗體產(chǎn)物的用途，其系用于制造供治療或預(yù)防血小板減少癥之藥物，其中該抗體經(jīng)制備以供以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量進(jìn)行投予。
38.治療個(gè)體血小板減少癥之方法，該方法包含向該罹患血小板減少癥之個(gè)體投予治療有效量之重組抗恒河猴D抗體產(chǎn)物，其中該抗體系以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該罹患血小板減少癥之個(gè)體亦患有貧血癥。
40.權(quán)利要求38或39的方法，其中該抗恒河猴D抗體系靜脈內(nèi)投予。
41.權(quán)利要求38或39的方法，其中該抗恒河猴D抗體系皮下投予。
42.在罹患血小板減少癥之個(gè)體中于基于抗恒河猴D治療期間避免血管外溶血之方法，該方法包含向罹患血小板減少癥之個(gè)體投予治療有效量之重組抗恒河猴D抗體，其中該抗體系以每公斤患者體重10-500微克特異性抗體之劑量投予。
43.權(quán)利要求42的方法，其中該罹患血小板減少癥之個(gè)體亦患有貧血癥。
44.用于治療血小板減少癥之組合物，該組合物包含權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的抗體產(chǎn)物及生理學(xué)上可接受之載劑。
45.用于治療血小板減少癥之組合物，該組合物包含權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的抗體產(chǎn)物及醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑。
46.組份試劑盒，其系用于同時(shí)、分開或連續(xù)治療血小板減少癥，該試劑盒包含權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的抗體產(chǎn)物及至少一種其它組份。
47.權(quán)利要求46的組份試劑盒，其中該其它組份為皮質(zhì)類固醇。
48.權(quán)利要求46的組份試劑盒，其中該其它組份為潑尼龍(prednisolone)。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于用包含重組多克隆抗恒河猴D抗體產(chǎn)物作為活性成份之醫(yī)藥組合物治療血小板減少癥。
文檔編號(hào)C07K16/34GK102186882SQ200980140881
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者克里斯琴·邁耶, 安妮·M·V·詹森, 埃瓦·林登斯特羅姆, 安·V·埃斯-約翰遜 申請(qǐng)人:西福根有限公司