專利名稱：抗hsv 抗體的制作方法
抗HSV抗體
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及如權(quán)利要求中定義的抗HSV抗體，包含有效量的所述抗體的藥物組合物，包含編碼所述抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體，包含所述核苷酸序列的宿主細(xì)胞，能夠產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞和所述抗體作為藥物的用途，特別涉及用于制備用于預(yù)防性或治療性處理受試者中的HSV相關(guān)疾病的藥物的用途；如權(quán)利要求中所定義。人致病性單純皰疹病毒(HSV)是嗜皮膚的和嗜神經(jīng)的DNA病毒，其臨床表現(xiàn)主要起源于皮膚和附近的粘膜，繼發(fā)性導(dǎo)致神經(jīng)并發(fā)癥，例如神經(jīng)炎、腦膜炎、腦炎、脊髄炎、多神經(jīng)根炎等等。在先天性、獲得性和醫(yī)原性的免疫缺陷的情況下，報(bào)告了一定程度上的嚴(yán)重進(jìn)展，具有高致死性。由于具有I型HSV(HSV-1，95%;唇皰疹，角膜皰疹，皰疹性濕疹)和2型HSV(HSV-2，10-30%;生殖器皰疹，新生兒皰疹)的群體的高感染率，并且由于該病毒經(jīng)常被重新激活，在感覺和自主神經(jīng)節(jié)中持續(xù)終生潛伏，所以HSV具有特別的臨床意義。與病毒的類型無關(guān)，原發(fā)或復(fù)發(fā)性HSV感染的征候治療目標(biāo)是抑制病毒復(fù)制、縮短患病時(shí)間，和 預(yù)防影響復(fù)發(fā)頻率的系統(tǒng)性并發(fā)癥。在早識(shí)別和正確用藥劑量的情況下，病毒抑制試劑被成功用于抗病毒治療。最常見的病毒抑制試劑(例如阿昔洛韋，噴昔洛韋，膦甲酸，碘苷)是核苷或焦磷酸鹽類似物，其共同的活性原理是基于在病毒感染的細(xì)胞中抑制DNA的合成。治療HSV感染的最重要的治療劑之一是嘌呤核苷類似物阿昔洛韋。其被病毒胸苷激酶磷酸化，然后干擾病毒DNA聚合酶。與此相反，人的DNA聚合酶對(duì)于阿昔洛韋的易感性僅有1/50至1/30，因此僅觀察到邊際效應(yīng)。然而，雖然在選擇性作用的病毒抑制試劑上有進(jìn)展，但是病毒性疾病的化學(xué)治療仍然是嚴(yán)重的問題。特別地，在長時(shí)間的預(yù)防性和治療性處理免疫抑制患者時(shí)觀察到的針對(duì)常見的化療劑的抗性株系的出現(xiàn)是個(gè)問題。因此，在10%以上的病例中，由于缺乏有效的病毒抑制試劑，觀察到了迅速進(jìn)展的泛發(fā)的感染，具有致死性進(jìn)展。目前，焦磷酸鹽類似物膦甲酸特別用于在免疫抑制患者中抵抗阿昔洛韋抗性皰疹病毒。該試劑引起病毒DNA聚合酶的直接抑制，并且對(duì)于胸苷激酶沒有影響。然而，膦甲酸的使用導(dǎo)致嚴(yán)重的不希望的副作用，例如腎衰竭、心臟問題、對(duì)于骨髄具有毒性，并且還可能導(dǎo)致皮膚潰瘍。由于其致畸形效應(yīng)，在環(huán)孕期間也不能施用膦甲酸。此外，觀察到交叉抗性株系的形成，這使得替代性治療劑的開發(fā)成為高度必需的。目前沒有被動(dòng)免疫預(yù)防。一些針對(duì)HSVl和HSV2的主動(dòng)免疫的實(shí)驗(yàn)性疫苗未顯示出可證實(shí)的成功?？贵w對(duì)于治療癌癥、自身免疫病癥和病毒感染具有極大的前景。JP6135854描述了針對(duì)單純皰疹病毒感染的治療劑，其中通過靜脈內(nèi)點(diǎn)滴以注射的形式同時(shí)或相繼施用針對(duì)HSV的人單克隆抗體和抗病毒核酸類似物例如阿昔洛韋(ACV)。DK 187286公開了顯示出針對(duì)來自HSV-I和HSV-2的糖蛋白D(gD) (HSV gD_l和gD_2)的多特異性免疫反應(yīng)性的抗體。WO 1997/26329描述了對(duì)于診斷和治療HSV-I和HSV-2有用的人單克隆抗體。后者的抗體與HSV 863單克隆抗體競爭與HSV-I和HSV-2的糖蛋白D抗原的結(jié)合。US 4，950，595公開了小鼠-人雜交瘤，其產(chǎn)生抗病毒-人抗體，其制備方法，以及抗病毒-人單克隆抗體。
此外，描述了特異于HSV1/2的另ー鼠單克隆抗體(Fd79) (Kogae et al.，1986)的人源化(Co, M. S. et al.，1991; Zeitlin L. et al.，1998)。該抗體識(shí)別 HSVl 和 HSV2 的糖蛋白B(gB)的共有表位。此外，已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物和真核細(xì)胞系SP2/0中產(chǎn)生了人源化Fd79，井隨后進(jìn)行了表征，顯示出53nM的親和性。鼠單克隆抗體H1815識(shí)別糖蛋白B(gB)的氨基酸263-283的區(qū)域中的相似但不同的表位(Navarro et al.，1992)。然而，H1815不能進(jìn)行病毒中和或抑制“細(xì)胞至細(xì)胞的傳播”。最后，US 6，180,370描述了人源化的免疫球蛋白及其制備方法。此外，WO2003/105782涉及鼠抗體特異性接枝至人框架。因此，化療劑具有不希望的副作用，并且觀察到數(shù)目漸增的抗性株系。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供能夠中和HSV感染并抑制細(xì)胞至細(xì)胞的傳播的(人源 化的)抗HSV抗體。此外，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于治療HSV相關(guān)疾病的預(yù)防劑和/或治療劑，其克服了常規(guī)應(yīng)用的化療劑的上述缺點(diǎn)。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的抗體實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。因此，本發(fā)明提供了用于治療HSV感染的本領(lǐng)域已知的治療劑的有前景的替代物，其是基于重組產(chǎn)生的抗體，其可以是人源化的。這些抗體能夠阻斷病毒在宿主內(nèi)傳播的兩種機(jī)理。它們有效地中和無細(xì)胞的病毒顆粒，并抑制病毒的直接的細(xì)胞至細(xì)胞傳播。由于該抗體特異性結(jié)合HSVl和HSV2被膜的表面糖蛋白B(gB)的高度保守的表位，而gB對(duì)于病毒復(fù)制周期是必不可少的，所以，藥物抗性的出現(xiàn)是極不可能的。雖然本發(fā)明的鼠抗體的效應(yīng)已經(jīng)部分地被描述,見參考文獻(xiàn)Eis-Hiibinger et aI.，Intervirology (1991) ; 32:351-360 和 Eis-Hiibinger et al. , Journal of GeneralVirology (1993) ; 74:379-385，但是從未公開過或使公眾可獲得抗體本身或本發(fā)明的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列，以及其所結(jié)合的表位?？傊?人源化的)抗體提供了以下一項(xiàng)或多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)■已經(jīng)證明了本發(fā)明的鼠單克隆抗體的功效(見Eis-Hiibinger etal. , 1991;Eis-Hubinger et al.，1993)。此外,本發(fā)明人在實(shí)施例部分證明了本發(fā)明的人源化抗體也能夠在體外中和HSVl和HSV2病毒感染，并通過抑制“細(xì)胞至細(xì)胞傳播”機(jī)制而抑制病毒傳播。在人類中的感染進(jìn)展的情境中，人免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生用于有效預(yù)防HSV1/2典型性細(xì)胞至細(xì)胞傳播的抗體特異性。■保守性化療劑例如阿昔洛韋和膦甲酸的經(jīng)常性和長期性的預(yù)防性以及治療性應(yīng)用導(dǎo)致抗性病毒株系的形成増加。該抗性問題可以通過単獨(dú)施用的或與病毒抑制試劑例如阿昔洛韋和/或膦甲酸組合施用的本文描述的(人源化)抗HSV抗體得以克服，因?yàn)槠湟蕾囉诓煌淖饔脵C(jī)理?！霰疚拿枋龅目贵w特異性結(jié)合HSV gB蛋白的表位。預(yù)期不會(huì)有針對(duì)本發(fā)明的抗體的HSV抗性的出現(xiàn)，因?yàn)間B蛋白的突變會(huì)導(dǎo)致病毒感染カ的喪失?！鼋上到y(tǒng)性施用常規(guī)的病毒抑制試劑的患者特別地獲益于本文描述的(人源化)抗體
發(fā)明內(nèi)容
因此，提供了包含如SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示的互補(bǔ)決定區(qū)的抗體。另外，提供了與包含SEQ ID N0:l_6所示的互補(bǔ)決定區(qū)的抗體識(shí)別相同表位的抗體。此外，還提供了包含有效量的本文描述的抗體和至少ー種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。此外，提供了包含編碼如權(quán)利要求中定義的抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體,包含所述核苷酸序列的細(xì)胞，和能夠產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞。最后，本文還提供了用作藥物的如權(quán)利要求中定義的抗體，如權(quán)利要求中定義的抗體用于制備用于預(yù)防性或治療性處理受試者中的HSV相關(guān)疾病的藥物的用途。如獨(dú)立權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明的各個(gè)方面和包含于從屬權(quán)利要求中的優(yōu)選實(shí)施方式通過引用方式并入本文。

發(fā)明詳述因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含如SEQ ID NO: I (TSGMSVG)，SEQID NO:2(HIffffNNDKYYKPALKS),SEQ ID NO:3(I YYGYRPYAMDY),SEQ IDNO: 4 (RSSQSIVHSNGNTYLE), SEQID NO: 5 (KVSNRFS)和 SEQ ID NO: 6 (FQGSHVPffS)所示的互補(bǔ)決定區(qū)的抗體。抗體或免疫球蛋白是Y球蛋白，其天然形式由通過ニ硫鍵連接的兩條大的重鏈和兩條小的輕鏈組成(參考圖3)。有5種類型的哺乳動(dòng)物Ig重鏈a，S，e，Y和y。所存在的重鏈的類型確定了抗體的類(同種型)；它們分別是IgA，IgD, IgE, IgG和IgM抗體。每條重鏈具有2個(gè)區(qū)域恒定區(qū)和可變區(qū)。恒定區(qū)在相同物種的相同同種型的所有天然產(chǎn)生的抗體中幾乎是相同的。輕鏈也由I個(gè)恒定區(qū)和I個(gè)可變區(qū)組成。在哺乳動(dòng)物中有2種類型的免疫球蛋白輕鏈入和K。雖然所有抗體的一般結(jié)構(gòu)是非常相似的，但是給定抗體的獨(dú)特性質(zhì)是由可變區(qū)(V)決定的。更具體地，可變環(huán)(在輕鏈上有3個(gè)，在重鏈(Vh)上有3個(gè))負(fù)責(zé)與抗原的結(jié)合，即負(fù)責(zé)其抗原特異性。這些環(huán)被稱作互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。由于來自Vh和ん結(jié)構(gòu)域的CDR都對(duì)抗原結(jié)合位點(diǎn)有貢獻(xiàn)，所以，重鏈和輕鏈的組合決定了最終的抗原特異性，而非単獨(dú)的重鏈或輕鏈。如本文使用的術(shù)語“抗體”意指任何能夠結(jié)合抗原的多肽，其中結(jié)合特異性由SEQID N0:1至6所示的⑶R決定。因此，“抗體”意在涉及包含至少ー個(gè)抗原結(jié)合片段的任何多肽?？乖Y(jié)合片段至少由重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域組成，按照“兩個(gè)結(jié)構(gòu)域一起能夠結(jié)合特異性抗原”的方式排列。“抗體”包括完整抗體或抗體片段，例如Fab-片段、F (ab) 2-片段或scFv-片段(參考圖3)。就術(shù)語“完整抗體”而言，意思是具有天然產(chǎn)生的抗體的典型的總體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(即包含3或4個(gè)恒定域的重鏈和I個(gè)恒定域的輕鏈以及各個(gè)可變域)的任意抗體，雖然每個(gè)結(jié)構(gòu)域可以包含另外的修飾，例如突變、刪除或插入，它們不改變總體的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。“抗體片段”也包含至少ー個(gè)如上文定義的抗原結(jié)合片段，并顯示出與該片段所衍生自的完整抗體相同的功能和特異性。Fab片段可以使用木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白而產(chǎn)生。木瓜蛋白酶在鉸鏈區(qū)下切割，因此，在ニ硫鍵下切割，所以形成F(ab)2K段。此外，重鏈和輕鏈的可變區(qū)可以融合在一起以形成單鏈可變片段(scFv)。
另外，術(shù)語“抗體”意在包括所有上述的免疫球蛋白同種型，即，抗體可以是IgA, IgD, IgE, IgG或IgM抗體，包括這些同種型的任何亞類。優(yōu)選地，抗體是IgG抗體，更優(yōu)選為IgGl或IgG2抗體。由于可以重組地表達(dá)和產(chǎn)生抗體，所以抗體也可以包含2個(gè)不同的重鏈恒定區(qū)，例如，I個(gè)IgGl和I個(gè)IgG2重鏈，或來自不同物種的重鏈。然而，重鏈優(yōu)選來自相同的物種。此外，抗體可以包含入或K輕鏈。如實(shí)施例2所示，抗體的價(jià)數(shù)(valency)對(duì)于介導(dǎo)病毒中和以及抑制細(xì)胞至細(xì)胞的傳播的效カ具有重大影響，使用ニ價(jià)抗體顯示出了最佳的結(jié)果，即，使用具有兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的抗體。ニ價(jià)抗體的實(shí)例為完整抗體或ニ價(jià)抗體片段，例如F(ab)2-片段。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體是ニ價(jià)抗體，優(yōu)選地，其中所述抗體是完整抗體或抗體片段，特別地，其中所述抗體片段是F(ab)2-片段。在替代的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體是多價(jià)抗體，即，具有多于2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體,包括重組抗體或其片段,優(yōu)選為triabody或tetrabody,或者完整的免疫球蛋白，例如IgM五聚物，或連接的免疫球蛋白。這些抗體形式是本領(lǐng)域已知的。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體，優(yōu)選地，其中所述抗體是鼠抗體，嵌合抗體或人源化抗體，更優(yōu)選地，其中所述人源化抗體衍生自人種系序列，如下文所討 論。嵌合抗體是這樣的抗體其中一種物種的免疫球蛋白的至少ー個(gè)區(qū)域通過遺傳工程化融合至另一物種的免疫球蛋白的另一區(qū)域，從而降低其免疫原性。嵌合抗體的實(shí)例如圖3A所示，其描繪了與人免疫球蛋白的剰余部分融合的鼠\和Vh區(qū)。嵌合抗體的特別類型是人源化抗體。人源化抗體是通過將編碼非人類抗體的CDR的DNA接枝到編碼人類抗體框架的DNA而產(chǎn)生的。然后，得到的DNA構(gòu)建體可用于表達(dá)和產(chǎn)生免疫原性通常低于非人類親代抗體或低于嵌合抗體的抗體，因?yàn)閮H有CDR是非人類的。在ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體能夠抑制HSV感染從ー個(gè)被感染的細(xì)胞傳播至鄰近的另ー個(gè)未被感染的細(xì)胞(細(xì)胞至細(xì)胞的傳播)。細(xì)胞至細(xì)胞的傳播是皰疹病毒從ー個(gè)被感染的細(xì)胞傳播至鄰近的未被感染的細(xì)胞的能力，而不釋放無細(xì)胞的顆粒。為了檢查某抗體是否能夠抑制HSV從ー個(gè)被感染的細(xì)胞向鄰近的另ー個(gè)未被感染的細(xì)胞的傳播(細(xì)胞至細(xì)胞的傳播)，可以使用如下測(cè)定法。使用400TCID5(i/孔的恒定病毒量感染在24孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片上生長至匯合的Veix)細(xì)胞，感染在37°C持續(xù)4小吋。I個(gè)“中值組織培養(yǎng)物感染劑量”(ITCID5tl)是在50%的接種的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)的致細(xì)胞病變?cè)噭?、例如病毒的量。然后除去病毒接種物，以PBS洗滌細(xì)胞2次，在包含過量的不同的抗HSV抗體或多克隆抗HSV對(duì)照血清(以阻止病毒通過上清液傳播)的Iml DMEM, 2%FCS, Pen/Strep中在37°C再溫育2天。使用突光標(biāo)記的多克隆山羊抗HSV血清(BETHYL Labolatories, Montgomery, TXUSA, Catalog No. A190-136F, Lot No. A190-136F-2)檢測(cè)感染了 HSV 的細(xì)胞的病毒抗原。優(yōu)選地，如果在上述測(cè)定中少于20%的鄰近細(xì)胞被感染，優(yōu)選地，少于15%、少于10%、少于5%，更優(yōu)選少于3%、最優(yōu)選少于1%的鄰近細(xì)胞被感染，則抗體能夠抑制細(xì)胞至細(xì)胞的傳播。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體具有至多40nM、優(yōu)選至多30nM、更優(yōu)選至多20nM、再更優(yōu)選至多15nM、例如至多13nM、至多10nM、最優(yōu)選至多7nM的解離常數(shù)KD。Kd代表解離常數(shù)，作為復(fù)合物可逆地解離為其組分的傾向性的度量(即，抗體對(duì)抗原的親和性)，并且是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)?？梢愿鶕?jù)Scatchard等式計(jì)算KD，用于確定Kd的方法是本領(lǐng)域熟知的。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，濃度為至多20nM、優(yōu)選至多16nM、更優(yōu)選至多12nM、例如至多10nM、例如至多8nM或至多6nM、最優(yōu)選至多4nM的抗體能夠中和IOOTCID5ci的確定量的HSV至80%以上，優(yōu)選90%以上，例如95%以上，更優(yōu)選96%以上，例如97%以上，最優(yōu)選98%以上，例如99%以上，或甚至100%。“中和”在本文中意思是抗體調(diào)理病毒，從而病毒不能再感染任何其它細(xì)胞。用于測(cè)定濃度為至多20nM的抗體是否能夠中和IOOTCID5ci的確定量的 HSV 的測(cè)定法提供于Eis-Hiibinger et al.，1991 和 Eis-Hiibinger et al.，1993,以及下文的實(shí)施例I和2中。此外，在ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體包含在框架區(qū)與SEQ ID N0:9的位置I至30，38至51，68至99，112至122 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至30，36至49，66至 94，103 至 113)和 SEQ ID NO: 10 的位置 I 至 23，40 至 54，62 至 93，103 至 113 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至23，35至49，57至88，98至108)的氨基酸殘基具有至少70%、優(yōu)選至少75%、至少80%、更優(yōu)選至少85%、至少90%、再更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選98%的(總體)序列同一性的氨基酸序列，如圖4所示。 SEQ ID NO:9:QVTLKESGPG ILLPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMSVGffIR QPSGKGLEffL GHIffffNNDKYYKPALKSRLT ISKDTSNKQV FLKIASVVTA DTATYYCARI YYGYRPYAMD YffGQGTSVTV SSSEQ ID NO: 10:DVLMTQTPLS LPVSL⑶QAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLEff YLQKPGQSPK LLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP WSFGGGTKLE IKR如果SEQ ID N0:9或10與目標(biāo)多肽的最佳匹配序列比對(duì)時(shí)，所比對(duì)的兩個(gè)序列之間的氨基酸同一性在SEQ ID勵(lì):9的位置1至30，38至51，68至99，112至122(或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至30，36至49，66至94，103至113)和SEQ ID NO: 10的位置I至23，40至54，62至93，103至113 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至23，35至49，57至88，98至108)上是至少X%，則多肽在框架區(qū)與SEQ ID NO:9或10具有“至少X%的序列同一性”。氨基酸序列的這種比對(duì)可以使用例如公眾可獲得的計(jì)算機(jī)同源性程序、例如“ BLAST”程序來進(jìn)行，所述程序提供于國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的主頁，見httD://WWW, ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast, cgi，イ密用其中手是イ共的缺省用于計(jì)算一組氨基酸序列或核酸序列的序列同一性百分率的其它方法是本領(lǐng)域已知的。備選地，在另ー優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體包含在框架區(qū)與SEQ ID N0:7的位置I至30，38至51，68至99，112至122 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至30，36至49，66至94，103至113)和SEQ ID NO:8的位置I至23，41至55，63至94，104至114 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至23，35至49，57至88，98至108)的氨基酸殘基具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、再更優(yōu)選至少95%、例如98%、最優(yōu)選100%的(總體)序列同一性的氨基酸序列，如圖4所示。如果SEQ IDN0:7或8與目標(biāo)多肽的最佳匹配序列比對(duì)時(shí)，所比對(duì)的兩個(gè)序列之間的氨基酸同一性在SEQ ID NO:7的位置I至30，38至51，68至99，112至122 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至30，36至49，66至94，103至113)和SEQ ID NO: 8的位置I至23，41至55，63至94，104至114 (或者，根據(jù)Kabat編號(hào)，分別為位置I至23，35至49，57至88，98至108)是至少X%，則多肽在框架區(qū)與SEQ ID NO: 7或8具有“至少X%的序列同一性”。SEQ ID N0:7和8源自人種系序列。雖然非種系人免疫球蛋白框架序列是人類來源的，但是一般不能排除它們不是免疫原性的。因此，本發(fā)明人注意了種系序列，因?yàn)樗鼈儾皇浅蛔?，因此，預(yù)期不是免疫原性的。因此，人源化的抗體優(yōu)選衍生自人種系序列，例如衍生自SEQID N0:7和/或8。SEQ ID N0:7和8如下所示SEQ ID NO:7:QVTLKESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMRVSffIR QPPGKALEffL ARIDffDDDKFYSTSLKTRLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCARX XXXXXXXYFD YffGQGTLVTV SSSEQ ID NO:8:DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL DSDDGNTYLE WYLQKPGQSP QLLIYTLSYRASGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQRIEF PffTFGQGTKV EIKR在本發(fā)明的上下文中，已經(jīng)確定了 通過使用SEQ ID N0:7和8來產(chǎn)生本發(fā)明的人源化抗體，無需回復(fù)突變以實(shí)現(xiàn)如親代抗體一樣的親和性，這可能暗示了對(duì)應(yīng)的人源化抗體顯示出極低的免疫原性。因此，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選包括那些抗體，其顯示出與包含SEQ ID NO:9和10或包含SEQ ID N0:7和8的抗體相同的特異性。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體綴合于效應(yīng)子部分(effector moiety)、治療部分或可檢測(cè)部分。在該情境下，術(shù)語“綴合”是指用于功能性連接蛋白結(jié)構(gòu)域的本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于使用或不使用居間結(jié)構(gòu)域的重組融合、intein介導(dǎo)的融合、非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)鍵合，例如ニ硫鍵合、肽鍵合、氫鍵合、靜電鍵合和構(gòu)象鍵合，例如生物素-親和素結(jié)合。與效應(yīng)子部分的綴合可以通過化學(xué)或重組方式進(jìn)行。化學(xué)方式是指抗體與效應(yīng)子部分之間的反應(yīng)，從而在兩個(gè)分子之間形成共價(jià)鍵以形成ー個(gè)分子。術(shù)語“效應(yīng)子部分”意思是對(duì)于抗體所靶向的細(xì)胞具有效應(yīng)的化合物。效應(yīng)子部分可以是例如治療部分或可檢測(cè)部分。“治療部分”是用作治療劑的化合物，例如細(xì)胞毒性試劑或藥物。下文給出了用于藥物組合物的化合物的實(shí)例?！翱蓹z測(cè)部分”包括可通過分光檢查、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方式檢測(cè)的任何化合物或蛋白標(biāo)簽，例如熒光標(biāo)記物。 抗體的特異性可以由CDR表示或由抗體所結(jié)合的表位來表示。因此，在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及與第一方面的抗體識(shí)別相同表位的抗體。如實(shí)施例部分所示以及如圖13A和13B所例示,該表位是不連續(xù)的或假連續(xù)(pseudocontinuous)的表位,對(duì)于變性具有部分抗性，位于HSVl和HSV2的糖蛋白B的氨基酸172-195和295-313。在本申請(qǐng)的上下文中，mAb 2c抗體的表位可以位于gB蛋白的前487個(gè)氨基末端殘基內(nèi)。優(yōu)選地，表位可以包含位于gB蛋白的位置172和307之間的氨基酸序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸序列。表位可以包含gB蛋白的連續(xù)氨基酸序列3。JGYRE3tl5,優(yōu)選地，包含連續(xù)氨基酸序列301ygyreg306或3Q(ifygyre3Q5，更優(yōu)選地，所述序列可以在末端進(jìn)ー步延伸(即，299pfygyre3Q5或300FYGYREGS307)。本發(fā)明的抗體的表位可以包含gB的連續(xù)氨基酸序列298-313 (298SPFYGYRE
Gshtehts313)。 或者，表位可以位于連續(xù)氨基酸序列172qvwfghrysqfmgifed188中。表位可以包含連續(xù)氨基酸序列 172qvwfghrysqfmg184。優(yōu)選地，表位可以由ー個(gè)以上的連續(xù)氨基酸序列組成。表位可以部分地是非連續(xù)表位。更優(yōu)選地，表位可以包含兩個(gè)連續(xù)氨基酸序列。此類由兩個(gè)氨基酸序列組成的表位可以被稱作“雙表位(duotope)”?？贵w可以與兩個(gè)氨基酸序列結(jié)合。更優(yōu)選地，雙表位的氨基酸序列可以包含氨基酸序列，F(xiàn)YGYRE3tl5和位于氨基酸位置172與188之間的氨基酸序列。更優(yōu)選地，表位可以包含gB蛋白的氨基酸序列3(i(iFYGYRE3Q5和氨基酸序列179YSQFMG184?；蛘?，表位或雙表位可以是化學(xué)合成的。表位可以是具有序列YSQFMG- ^ A-FYGYRE的化學(xué)合成的表位。如本文使用的縮寫P A是指P -丙氨酸。最優(yōu)選地，表位可以包含gB蛋白的氨基酸序列FYGYRE和氨基酸序列FED。表位可以是具有序列FED- ^ A-^ A-FYGYRE或PFYGYREGFEDF的化學(xué)合成的表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解表位可以包含于gB蛋白中，但是也可以包含于其降解產(chǎn)物中，或者可以是化學(xué)合成的肽。指明氨基酸位置僅僅是為了顯示gB蛋白的序列中的 相應(yīng)的氨基酸序列的位置。本發(fā)明包括包含該表位的所有的肽。肽可以是長度為大于100個(gè)氨基酸的多肽的一部分，或者可以是小于100、優(yōu)選小于50、更優(yōu)選小于25個(gè)氨基酸、再更優(yōu)選小于16個(gè)氨基酸的小肽。此類肽的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸(例如^ -氨基酸、Y -氨基酸、D-氨基酸)或其組合。此外，本發(fā)明可以包括表位的各自的逆反肽(retro-inverso peptide)。肽可以是未結(jié)合的或結(jié)合的。其可以結(jié)合至例如小分子(例如藥物或熒光團(tuán))，或結(jié)合至高分子量的聚合物(例如聚こニ醇(PEG)、聚こ烯亞胺(PEI )、羥丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)等)，或結(jié)合至蛋白質(zhì)、脂肪酸、糖部分，或者可以插入膜中。與本領(lǐng)域已知的抗體H126不同，由本發(fā)明的mAb 2c抗體識(shí)別的表位不是本質(zhì)上非連續(xù)的。與Hl26不同，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合連續(xù)表位，因此結(jié)合連續(xù)氨基酸序列，或可以結(jié)合非連續(xù)表位。因此，本發(fā)明的抗體的性質(zhì)是改進(jìn)的。例如，mAb 2c抗體可用于其中靶蛋白為變性狀態(tài)的方法(例如SDS-PAGE電泳)或用于檢測(cè)小的線性肽。為了測(cè)試待測(cè)抗體與第一個(gè)方面的抗體是否識(shí)別相同表位，可以進(jìn)行如下的競爭性研究以3moi (感染復(fù)數(shù))感染20小時(shí)之后的Veix)細(xì)胞與不同濃度的待測(cè)抗體(作為競爭者)一起溫育I小吋。在另ー個(gè)溫育步驟中，以IOOnM的恒定濃度施用第一個(gè)方面的抗體，使用針對(duì)第一個(gè)方面的抗體的恒定域的熒光標(biāo)記的抗體通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其結(jié)合(另見實(shí)施例部分和圖6)。與待測(cè)抗體的濃度成反比例關(guān)系的結(jié)合表示這兩種抗體識(shí)別相同的表位。然而，也可以使用很多本領(lǐng)域已知的其它測(cè)定法。第二個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方式與第一個(gè)方面相同，如上文所述。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)第一個(gè)或第二個(gè)方面的抗體和至少ー種藥學(xué)上可接受的賦形劑。然而，術(shù)語“藥物組合物”在本文中可以與術(shù)語“藥物”相互替換地使用。藥物組合物中的抗體的含量沒有限制，只要其對(duì)于治療或預(yù)防是有用的，但是優(yōu)選包含0.0000001-10%重量/總組合物。此外，本文描述的抗體優(yōu)選在載體中使用。載體的選擇可以取決于施用途徑和活性試劑的濃度，載體可以是凍干成分或含水溶液的形式。一般地，在載體中使用適當(dāng)量的藥學(xué)上可接受的鹽以賦予組合物等滲性。載體的實(shí)例包括但不限于鹽水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。優(yōu)選地，可接受的賦形劑、載體或穩(wěn)定劑是所應(yīng)用的劑量和濃度是非毒性的，包括緩沖劑，例如檸檬酸鹽，磷酸鹽和其它有機(jī)酸；成鹽反離子，例如鈉和鉀；低分子量(>10個(gè)氨基酸殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白或明膠；親水性聚合物，例如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸，例如組氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ;非離子表面活性劑，例如Tween、Pluronics或聚こニ醇；抗氧化劑,包括甲硫氨酸、抗壞血酸和生育酹；和/或防腐剤，例如十八烷基ニ甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙胺；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；尼鉬金酯類，例如尼鉬金甲酯或尼鉬金丙酯；兒茶酚；雷瑣酚；環(huán)己醇；3-戍醇；間-甲酹。適宜的載體及其配制更詳細(xì)地描述于Remington’s PharmaceuticalSciences,17th ed.，1985，Mack Publishing Co。組合物還可以包含ー種以上的活性化合物，例如化療劑或病毒抑制試劑，包括阿昔洛韋，噴昔洛韋，碘苷和膦甲酸。阿昔洛韋，也稱作無環(huán)鳥苷(ACV)或2-氨基-9-(2-羥基こ氧基甲基)-3H-嘌呤-6-酮，是鳥苷類似物抗病毒藥物，以下列商品名上市，例如ACERPES' Acic' AcieIobetai, AcicloCTAciclostad Aciclovir, Acic*, Ophtal \ Acivilへ AciVisionj A c y c 10 V ir , Avlral ,Cyclovir, Heivt'vir% Herpex, SupraviriHiVinicalmK, Virupos#
Virzin, Zoliparinw,Zovir和Zovirax*。噴昔洛韋(2_氨基_9_[4_羥基_3_(羥基甲基)丁基]-6，9-ニ氫-3H-嘌呤-6-酮)是鳥嘌呤類似物抗病毒藥物，以下列商品名上市，例如Denavir和Fenistil。泛昔洛韋(2-[(こ酰氧基)甲基]-4-(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)こ酸丁酷)是噴昔洛韋的前藥，具有改善的ロ的生物可獲得性。碘苷(2’_脫氧-5-碘-尿苷)是核苷“尿苷”的生物化學(xué)類似物，以下列商品名上市，例如=Virunguenr和/^tfum'膦甲酸是具有化學(xué)式HO2CPO3H2的化合物的綴合物基底，以下列商品名上市Tosea和Triapten'優(yōu)選地，以有效量包括抗體和/或活性化合物。術(shù)語“有效量”是指足以在藥物組合物所要施用至的受試者中誘導(dǎo)可檢測(cè)的治療性應(yīng)答的量。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了表達(dá)載體，其包含編碼本發(fā)明的抗體的核酸序列。一般地，表達(dá)載體是用于將目標(biāo)基因?qū)氚屑?xì)胞的質(zhì)粒，從而導(dǎo)致該基因編碼的蛋白即抗體的轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此，表達(dá)載體包含調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域，以及多腺苷化信號(hào)位點(diǎn)，以指導(dǎo)該表達(dá)載體攜帯的基因的有效轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體也可以包含另外的必需的或有用的區(qū)域，例如用于在真核或原核細(xì)胞中選擇的可選擇標(biāo)志物，復(fù)制起始點(diǎn)，等等。因此，本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明的抗體的核苷酸序列。宿主細(xì)胞可以是適合用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的任何細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞、更優(yōu)選永生化細(xì)胞系，例如骨髄瘤細(xì)胞系。合適的細(xì)胞系可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC獲得。此外，在第六個(gè)方面，提供了能夠產(chǎn)生第一個(gè)/第二個(gè)方面的抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞是能夠迅速和無限復(fù)制的工程化的細(xì)胞，其大量產(chǎn)生所需的抗體。雜交瘤細(xì)胞是這樣制備的從經(jīng)過相關(guān)抗原刺激的動(dòng)物的脾臟取出產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，然后將其與永生化的骨髓瘤腫瘤細(xì)胞融合。
在非常重要的第七個(gè)方面，本發(fā)明涉及用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的抗體。更具體地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體在制備用于預(yù)防性或治療性處理受試者中與HSV相關(guān)的疾病的藥物中的用途。同樣，本發(fā)明涉及用于預(yù)防性或治療性處理受試者中與HSV相關(guān)的疾病的本發(fā)明的抗體。此外，本發(fā)明涉及預(yù)防性或治療性處理受試者中與HSV相關(guān)的疾病的方法，其中以治療有效量向受試者施用本發(fā)明的抗體。HSV感染可以引發(fā)數(shù)種不同疾病。皮膚或粘膜的常見感染可以影響面部和ロ( ロ面皰疹)、生殖器(生殖器皰疹)，或手(皰疹性瘭疽)。當(dāng)病毒感染并損傷眼睛(皰疹性角膜炎)或侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)(損傷腦(皰疹性腦炎))，會(huì)發(fā)生更嚴(yán)重的病癥。具有不成熟或受抑制的免疫系統(tǒng)的患者，例如新生兒、移植受體或AIDS患者對(duì)于來自HSV感染的嚴(yán)重并發(fā)癥易感。HSV相關(guān)的疾病還包括外傷性皰疹、莫拉雷特腦膜炎、可能的貝爾麻痹、與雙相型障礙(bipolar disorder)的認(rèn)知缺陷相關(guān)的病癥,也稱作躁狂憂郁、躁郁癥或雙相情感障礙，和阿爾茨海默病。就阿爾茨海默病而言，最近的科學(xué)出版物證明了 I型單純皰疹病毒DNA驚人地定位于￠-淀粉樣蛋白斑內(nèi)，這說明該病毒可能是所述斑的誘因。最后，如果觀察到出現(xiàn)針對(duì)常見的化療病毒抑制試劑的抗性株系，例如，在長期預(yù)防性和治療性處理免疫抑制患者吋，則根據(jù)本發(fā)明的抗體是有用的。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，與HSV相關(guān)的疾病伴隨著ー項(xiàng)或多項(xiàng)下列特征存在ロ的復(fù)發(fā)、存在生殖器的復(fù)發(fā)、皰疹性濕疹、新生兒皰疹、免疫缺陷(免疫障礙的患者)、免疫抑制、腦炎、腦膜炎、腦膜腦炎、眼睛感染，泛發(fā)的HSV感染和/或?qū)τ诓《疽种苿┑目剐?。在備選的優(yōu)選實(shí)施方式中，與HSV相關(guān)的疾病伴隨著對(duì)于化療病毒抑制試劑的不耐性。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，藥物包含至少ー種另外的活性試劑，優(yōu)選地，其中所述另外的活性試劑是化療試劑或病毒抑制試劑，更優(yōu)選地，其中所述另外的活性試劑選自阿昔洛,、噴昔洛,、鵬昔和勝甲酸，如上文所述。在最后的優(yōu)選實(shí)施方式中，受試者是哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、豬、牛、綿羊、馬、嚙齒 類，例如大鼠、小鼠和豚鼠，或靈長類，例如大猩猩、黒猩猩和人，優(yōu)選地，所述受試者是人。


圖I顯示了在陰道粘膜中建立感染之后，通過施用單克隆抗體(mAb)2c而在體內(nèi)減少HSV的復(fù)制。在感染后第3天和第11天(箭頭)，通過腹膜內(nèi)注射(i.p.)方式使用多克隆HSV免疫血清(三角形)、mAb 2c (圓形)或?qū)φ张囵B(yǎng)基(方框)處理免疫活性的(實(shí)心符號(hào))和⑶4+耗竭(空心符號(hào))小鼠。圖2顯示了 mAb 2c對(duì)于免疫抑制的(⑶4_/⑶8_)小鼠中的HSV感染進(jìn)展的效應(yīng)。在感染后第I天和第3天(通過箭頭指示)，通過i. p.方式向動(dòng)物施用對(duì)照培養(yǎng)基(實(shí)心方框)、多克隆HSV免疫血清(空心方框)或mAb 2c (實(shí)心圓圈)。(A)顯示了存活率；(B)顯示了陰道粘膜中的病毒復(fù)制。圖3是衍生自mAb 2c的抗體和抗體片段的示意圖。(A)完整抗體鼠可變區(qū)(VL, Vh;左側(cè))與人恒定域(CUCH1，CH2，CH3;中間)的遺傳融合產(chǎn)生嵌合抗體。在人源化的IgG抗體(右側(cè))中，鼠單克隆抗體的高變區(qū)被接枝至人抗體的框架。(B)抗體片段單價(jià)Fab片段(Fab)，其由輕鏈(VjCJ和重鏈的2個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域(VH+CH1)組成；ニ價(jià)的F(ab’)2片段，其由2個(gè)非配對(duì)的C末端半胱氨酸殘基共價(jià)連接，可以通過常規(guī)的蛋白酶消化的方式來產(chǎn)生。為了產(chǎn)生鼠scFv抗體(“單鏈片段可變”)，從2c雜交瘤細(xì)胞系分離編碼可變域Vh和\的基因，并通過編碼柔性連接肽(“連接子”)的基因區(qū)段連接。圖4顯示了重鏈和輕鏈可變域(Vh和VJ的序列比對(duì)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)根據(jù)Chothia (Chothia and Lesk, 1987; Chothia et al.，1989)(點(diǎn)劃線)和 Kabat (Kabat andWu, 1991)(虛線)定義。人種系序列DP28和DPK13來自V-Base數(shù)據(jù)庫(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)并作為鼠 mAb 2c 的 CDR 的受:體序列。(A) “不變殘基”(Kabat andWu, 1991) ; (B) “關(guān)鍵殘基”(Chothia et al.，1989)和(C) VH/\ 交界處的殘基(Chothia etal.，1985)分別以(+)(代表在鼠和人序列之間匹配的殘基)或(_)(代表在鼠和人序列之間不匹配的殘基)標(biāo)示。(D)核心位點(diǎn)處的殘基,如Chothia (Chothia et al.，1998)定義為不變的(i)殘基位點(diǎn)；相似的(r)殘基位點(diǎn)；表面的(s)殘基1 ，1(3，0，0，ル中性的(n)殘基P，H，Y，G, A，S，T;和埋藏的(b)殘基C，V, L, I, M, F，W ;埋藏的中性殘基由x標(biāo)示；表面的中性殘基由y標(biāo)示；在鼠與人序列之間非匹配的殘基位點(diǎn)以粗體標(biāo)示；以鼠CDR殘基特異性接枝的序列VHhum2c和VLhum2c以粗體標(biāo)示。所有殘基以單字符顯示，并根據(jù)Kabat (Kabatet al. , 1991)編號(hào)。

圖5顯示了單克隆抗體2c、ch2c和人源化變體hu2c-Vl_V4的平衡結(jié)合曲線。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定與HSV-IF感染的Vero細(xì)胞表面上的糖蛋白B的特異性結(jié)合。在所標(biāo)示的濃度的結(jié)合活性以中值熒光強(qiáng)度(MFI)減掉背景熒光表示。以一式三份進(jìn)行測(cè)定；標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示為條棒。根據(jù)Levenberg-Marquard方法,通過將抗原結(jié)合數(shù)據(jù)擬合至非線性回歸模型而確定結(jié)合親和常數(shù)KD。圖6顯示了競爭性研究，其證明了嵌合和人源化抗體與親代鼠mAb2c的相同的表位特異性。嵌合mAb ch2c (空心圓圈)和人源化的mAb變體hu2c-Vl (方框)，-V2(三角形)，-V3 (星號(hào))，-V4 (菱形)與親代mAb 2c競爭與存在于HSV-I感染的Vero細(xì)胞表面上的gB的結(jié)合。經(jīng)感染的Vero細(xì)胞首先與濃度漸增的mAb ch2c或人源化mAb hu2c_Vl至V4溫育，然后與IOOnM mAb 2c(作為競爭者)溫育。中值熒光強(qiáng)度(MFI)顯示了所施用的競爭者的結(jié)合。圖7顯示親代mAb 2c和人源化mAb hu2c_Vl的HSV中和活性是補(bǔ)體非依賴性的。將 HSV-I 與培養(yǎng)基(對(duì)照)、多克隆 IgG ( ’ytoteet (120 u g/ml)、mAb 2c (2 u g/ml)或mAb hu2c-Vl(2u g/ml)在存在或不存在10%人補(bǔ)體的情況下進(jìn)行預(yù)溫育，然后施用至Veix)細(xì)胞。2天后對(duì)產(chǎn)生的斑進(jìn)行評(píng)分。圖8 顯示了 相對(duì)于非抗性實(shí)驗(yàn)室株系(HSV-1F，HSv_1324hv，HSV_117syn+，HSV-2G)、ACV抗性實(shí)驗(yàn)室株系HSV-1TK_和未研究過其抗性的臨床分離體，人源化mAb h2c_Vl中和源自阿昔洛韋抗性(ACV)、ACV和膦甲酸抗性(PFA)或ACV，PFA和Cidovir抗性(CDV)的臨床患者分離體的HSV-I和HSV-2的效率。為了測(cè)定mAb h2c_Vl對(duì)于完全病毒中和的效價(jià)，將數(shù)種濃度的抗體在37°C與IOOTCID5ci的HSV-I或HSV-2分離體溫育I小時(shí)，并與Vero細(xì)胞溫育3天。MAbhu2c-Vl在濃度為7. 8-15. 6nM時(shí)完全中和HSV-1實(shí)驗(yàn)室株系HSV-1F，HSV-1324hv, HSV-117syn+，HSV-ITK' HSV-1 臨床分離體被 mAbh2c_Vl 類似地中和，與它們的抗性譜無關(guān)。此外，對(duì)于株系HSV-2G和ACV抗性HSV-2分離體，mAb hu2c_Vl在濃度為31. 3-62. 5nM時(shí)顯示出相同的中和效率。圖9顯示了本發(fā)明的抗HSV抗體對(duì)于病毒的細(xì)胞至細(xì)胞的傳播的抑制。洗滌2次以HSV-IF感染4小時(shí)的Vero細(xì)胞，并與含有過量的人多克隆抗HSV對(duì)照血清(I :20)、鼠mAb 2c (500nM)、2c衍生的抗體片段F (ab’ )2(500nM)或Fab (3000nM)(通過酶促消化而制備)、嵌合mAb ch2c (500nM)或與人源化的mAb變體1，hu2c_Vl (500nM)的培養(yǎng)基溫育。感染2天之后，使用熒光標(biāo)記的多克隆山羊抗HSV血清，使用Leica DM IRE2共聚焦顯微鏡在40倍的放大倍數(shù)下檢測(cè)病毒的傳播。之前使用體積為100 ill的IOOTCID5ci測(cè)定了人多克隆抗HSV的中和效價(jià)是1:160。稀釋度為1:20的抗HSV血清不能阻止病毒向鄰近細(xì)胞的傳播。500nM的鼠mAb 2c、2c_F(ab’)2_抗體片段、嵌合和人源化的mAb能夠成功抑制細(xì)胞至細(xì)胞的傳播。在所測(cè)的最高濃度即3. OOOnM時(shí)，單價(jià)的2c-Fab片段不能完全抑制細(xì)胞至細(xì)胞的傳播。圖10顯示了以抗HSV mAb被動(dòng)免疫之后，陰道內(nèi)感染HSV-I的N0D/SCID小鼠的存活。在感染之前24小時(shí)，小鼠靜脈內(nèi)經(jīng)受PBS (叉號(hào))，2. 5mg/kg (方框)，5mg/kg (三角形)或15mg/kg(圓圈)的親代mAb2c (空心的符號(hào))或人源化的mAb hu2c_Vl (實(shí)心的符號(hào))。以lxl06TCID50/20iil的神經(jīng)毒性的HSV-I株系F陰道內(nèi)感染小鼠。殺死具有體重下降、外陰炎/明道炎或神經(jīng)疾病的癥狀的被感染的小鼠，按照之前的描述，通過在Veix)細(xì)胞單層上滴定，就感染性病毒檢查它們的器官。在第30天時(shí)殺死未被感染的小鼠。每組有 7只動(dòng)物。圖11顯示了通過全身施用抗體而保護(hù)N0D/SCID小鼠抵抗HSV-I的傳播。從感染后24小時(shí)開始,在箭頭所標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)(24小時(shí)、40小時(shí)、56小時(shí))，小鼠通過靜脈內(nèi)方式接受3次15mg/kg mAb 2c或人源化mAb hu2c_Vl。姆組有7只被感染的動(dòng)物。圖12顯示在感染后24小時(shí)、40小時(shí)和56小時(shí)，通過靜脈內(nèi)方式以15mg/kg人源化mAb hu2c-Vl處理之后，通過陰道內(nèi)感染了源自患者的對(duì)于阿昔洛韋、膦甲酸和Cidovovir有抗性的HSV-I分離體的N0D/SCID小鼠顯示出免于致死性腦炎的顯著性保護(hù)。毎日接受2次標(biāo)準(zhǔn)阿昔洛韋治療的小鼠在28天內(nèi)全部死亡。圖13顯示了 mAb 2c的表位定位于gB。⑷顯示了 HSV I和HSV2的糖蛋白B(gB)的氨基酸序列比對(duì)。顯示了下列株系(對(duì)應(yīng)于括號(hào)內(nèi)的NCBI登記號(hào))的gB蛋白氨基酸序列的比對(duì)HSV1 株系 K0S(P06437)，F(xiàn)(P06436), gC-39-R6(ABM66850)和 HSV2 株系333 (ABU45423), HG52 (P08666)和MMA (AAB60547)。gB的信號(hào)序列以下劃線標(biāo)示。成熟的gB起始于位置31，氨基酸AP。顯示了 gB的氨基酸編號(hào)，包括信號(hào)肽序列。相應(yīng)地進(jìn)行表位編號(hào)。MAb 2c結(jié)合至gB內(nèi)的兩個(gè)分開的區(qū)域(加框的序列區(qū)域)，如通過肽微陣列所顯示。已經(jīng)顯示了氨基酸299PFYGYRE3(I5對(duì)于mAb 2c的結(jié)合是必不可少的。(B):根據(jù)mAb 2c與重組gB在不同的蛋白印跡條件下的反應(yīng)活性而表征mAb 2c。在天然(N)或變性(D)條件下在8%的SDS-PAGE上分離重組gB (730t)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜并在含有2%牛奶的TNT封閉緩沖液中溫育I小吋。以gB特異性單克隆抗體mAb H1817,mAb H126或mAb 2c探測(cè)該膜，通過HRP綴合的多克隆山羊抗小鼠血清和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)與gB的結(jié)合。使用mAb H1817和H126作為對(duì)照，它們分別識(shí)別連續(xù)表位(Bender et al. , 2007)和非連續(xù)表位(Kousoulaset al.，1988)。在使用 AUMiI進(jìn)行的蛋白印跡分析中獲得了線性表位的典型染色式樣，這顯示在非還原條件下檢測(cè)到単體和三聚體形式的gB，在還原條件下為唯一的主要為gB單體染色。如所預(yù)期，mAb H126與姐僅在天然條件下反應(yīng)。僅識(shí)別上面的大于170kDa的gB蛋白帶，這表明mAb H126與三聚體的gB特異性結(jié)合。MAb 2c與天然和變性的詘反應(yīng)，然而，在變性條件下的反應(yīng)活性比mAb H1817弱得多,這說明mAb 2c結(jié)合至不連續(xù)的表位，該表位在SDS-PAGE電泳中對(duì)于變性或重折疊具有抗性，因此被稱作“假連續(xù)”表位(Benderet al. , 2007) 在左側(cè)標(biāo)明了分子量(kDa)，在右側(cè)標(biāo)明了 gB三聚體和單體的遷移。圖14顯示了 mAb 2c與gB的肽圖分析(peptidemapping)。(A):在跨越gB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸31至505的肽文庫中鑒定的結(jié)合區(qū)A和B的圖示定位。在連續(xù)纖維素膜上合成了 13個(gè)氨基酸的肽，偏移3個(gè)氨基酸，使用過氧化物酶綴合的ニ抗通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)合的mAb2c。功能性結(jié)構(gòu)域I-V對(duì)應(yīng)于gB的晶體結(jié)構(gòu)(根據(jù)Heldwein等人)，在晶體結(jié)構(gòu)中未解決的區(qū)域以灰色顯示(24)，S :信號(hào)序列。(B):來自高分辨率激光掃描的熒光信號(hào)強(qiáng)度，13個(gè)氨基酸的肽通過柔性連接子固定于玻片上。圖15顯示了中和性mAb 2c的表位在gB晶體結(jié)構(gòu)上的定位(PDB-ID 2GUM)。顯示了 gB三聚體的帶狀圖。星號(hào)表示2個(gè)原體(protomer)的融合環(huán),第三個(gè)原體的融合環(huán)不可見。在表面圖示中標(biāo)示了非連續(xù)的mAb 2c表位的定位的殘基F175至A19c!和F■至E3tl5,對(duì)于ー個(gè)原體以深灰色表示，對(duì)于另兩個(gè)原體以淺灰色表示。

圖16顯示了 mAb 2c的雙表位掃描。mAb 2c結(jié)合區(qū)A和B (陰影條柱)的共有序列(下劃線)合成為雙表位(白色和黑色條柱)，直接連接或通過I或2個(gè)P -丙氨酸間隔子(B，B-B)分開。通過來自高分辨率激光掃描的熒光信號(hào)強(qiáng)度記錄mAb 2c與雙表位的反應(yīng)活性。圖17顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的mAb 2c, 2c_F(ab’ )2, 2c_Fab和2c_scFv的平衡-結(jié)合曲線。以相對(duì)于最大中值熒光強(qiáng)度的百分率顯示了在指定濃度時(shí)與(A)HSV-IF或(B) HSV-2G感染的Vero細(xì)胞的結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)按照一式三份進(jìn)行2次，條柱代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖18顯示了 mAb 2c對(duì)于HSV-I病毒粒子與靶細(xì)胞的附著的抑制。在以iootcid50hsv-i預(yù)溫育之后(附著前的中和)或iootcid5(ihsv-i吸附至靶細(xì)胞之后(附著后的中和)，將連續(xù)稀釋的(A)mAb 2c (0. 98-125nM)或(B)多價(jià)人y球蛋白(IlltrateCt )(0. 33-42 ilM)加入到96孔微量滴定板中的Vero細(xì)胞單層中。在37° C溫育72小時(shí)后(并認(rèn)為是末端點(diǎn))，測(cè)定在10個(gè)單ー的接種的細(xì)胞單層中，相對(duì)于對(duì)照而言，100%和50%地阻止病毒誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的最高抗體效價(jià)和多價(jià)人IgG效價(jià)。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差小于0. I。圖19顯示了抗gB抗體的價(jià)數(shù)對(duì)于體外中和HSV的影響。(A):將ニ價(jià)抗體mAb2c (IgG)和 2c-F(ab’)2 和單價(jià) 2c-Fab 的稀釋物與 100TCID5(IHSV_1F 或 HSV-2G 溫育 I 小時(shí)，然后接種至Vero細(xì)胞。72小時(shí)后，對(duì)CPE進(jìn)行評(píng)分，如對(duì)于圖3所描述。顯示了來自三次代表性重復(fù)實(shí)驗(yàn)之一的中和100%病毒接種物所需的抗體濃度。(B):與鼠抗Fab IgG交聯(lián)的2c-Fab片段的抗病毒活性。圖20顯示了 mAb 2c處理的免疫缺陷小鼠的劑量依賴性存活。N0D/SCID小鼠靜脈內(nèi)接受不同的單ー劑量的mAb 2c, 24小時(shí)后，以IxIO6TCID5qHSV-I進(jìn)行陰道內(nèi)刺激。對(duì)于PBS每組有7只動(dòng)物，對(duì)于所有其它組每組有9只動(dòng)物。圖21顯示在N0D/SCID小鼠中通過系統(tǒng)性施用mAb 2c或人源化mAb hu2c_Vl(抵抗HSV-I傳播)而從生殖器粘膜消除已經(jīng)建立的HSV-I感染。從感染后24小時(shí)開始，小鼠在箭頭指定的時(shí)間點(diǎn)(24小吋、40小吋、56小吋)靜脈內(nèi)接受15mg/kg mAb 2c (空心符號(hào))或人源化mAbhu2c-Vl (實(shí)心符號(hào))3次。從培養(yǎng)于Vero細(xì)胞單層上的陰道沖洗物測(cè)定經(jīng)抗體或?qū)φ仗幚淼男∈蟮年幍啦《拘r(jià)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖22顯示了 HSV-IgB序列上從氨基酸31至505的肽掃描。與纖維素膜結(jié)合的15個(gè)氨基酸的肽(重疊12個(gè)氨基酸)(15/12掃描)總共產(chǎn)生155種不同的肽斑點(diǎn),將它們與MAb 2c溫育。使用過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG Fab片段和魯米諾樣化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)與肽結(jié)合的MAb 2c。發(fā)現(xiàn)MAb 2c結(jié)合連續(xù)gB肽的三元組(肽49-51)和ニ元組(肽90-91)稱作結(jié)合位點(diǎn)A和B。以粗體(下面的)高亮標(biāo)示了每個(gè)位點(diǎn)的肽的共同的gB序列，它們代表gB序列的殘基181至189和殘基301至312。圖23顯示了 HSV-IgB序列上從氨基酸296至315的肽掃描。將與纖維素膜結(jié)合的13個(gè)氨基酸的肽[每個(gè)肽沿序列移動(dòng)I個(gè)氨基酸(13/12掃描)并按一式兩份合成]與MAb 2c溫育，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光蛋白印跡檢測(cè)。觀察到MAb 2c結(jié)合連續(xù)的5個(gè)肽。這5個(gè)反應(yīng)性肽的共同序列是3(i(iFYGYREGSH3Q8。圖24顯示了 gB序列上從殘基295至315的關(guān)鍵基序。將HSV-IgB序列的氨基酸295至315分解為6個(gè)氨基酸的肽，每個(gè)肽沿序列移動(dòng)I個(gè)氨基酸，總共產(chǎn)生16種肽。源自 gB的序列在N和C末端各有4個(gè)隨機(jī)堿基。鑒定出2個(gè)連續(xù)肽結(jié)合MAb 2c,它們代表gB序列3(i(iFYGYRE3(i5和3(llYGYREG3tl6。這些肽的共同序列以粗體高亮標(biāo)示(肽6和7)。圖25顯示了在病毒接種前24小時(shí)接受被動(dòng)轉(zhuǎn)移的多克隆免疫血清(空心方框，實(shí)心方框)，MAb 2c(空心圓圈，實(shí)心圓圏)或作為對(duì)照的沉淀的培養(yǎng)基(空心三角形，實(shí)心三角形)的C57BL/6小鼠的生殖器粘膜中的HSV-I消除動(dòng)力學(xué)?？招姆?hào)表示來自接種了野生型(wt)株系F及其突變衍生物R126 (Y303N)，R1375 (R304Q)，R1435 (H308Y)和R233(R328H)的小鼠的數(shù)據(jù)，實(shí)心符號(hào)表示接種了野生型株系KOS 321及其突變衍生物B4. 1(E305K)的小鼠的數(shù)據(jù)。接種的小鼠的S.E. (Iog10)的范圍和數(shù)目wt株系F，空心方框，±1.5至0，12只小鼠；空心圓圈，±0. 4至0，7只小鼠；空心三角形，±1.3至0，9只小鼠；wt株系K0S，實(shí)心方框，土 I. 4至0，8只小鼠；實(shí)心圓圈，土 0. 6至0，8只小鼠；實(shí)心三角形，±1. 4至0，8只小鼠；F突變株系R126(Y303N)，空心方框，±0.6至0，5只小鼠；空心圓圈，土0. 6至0，6只小鼠；空心三角形，土0. 5至0，6只小鼠；F突變株系R1375(R304Q),空心方框，±1. 2至0，11只小鼠；空心圓圈，±1. 3至0，10只小鼠；空心三角形，±1.2至0，11只小鼠；K0S突變株系B4. 1(E305K)，實(shí)心方框，±0. 9至0，12只小鼠；實(shí)心圓圈，土0. 7至0，12只小鼠；實(shí)心三角形，土0. 9至0，10只小鼠；F突變株系R1435(H308Y)，空心方框，± I. 4至0. 6，6只小鼠；空心圓圈，0，5只小鼠；空心三角形，±1.0至0.6，6只小鼠；F突變株系R233(R328H)，空心方框，±1.0至0，5只小鼠;空心圓圈，土0. I至0，5只小鼠；空心三角形，土 I. I至0，6只小鼠。圖26 顯示了 MAb 2c 與肽 90 (見圖 22，gB 序列 298SPFYGYREGSHTEHT312;左側(cè))以及設(shè)計(jì)為包含位點(diǎn)B的關(guān)鍵殘基、甘氨酸連接子和源自位點(diǎn)A的基序FEDF的肽(PFYGYRE-G-FEDF;右側(cè))的反應(yīng)活性的比較。
實(shí)施例通過以下實(shí)施例進(jìn)ー步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I具有針對(duì)I型和2型單純皰疹病毒(HSV1、HSV2)的糖蛋白B(gB)的特異性的鼠單克隆抗體(mAb) 2c的制備為了產(chǎn)生抗HSV特異性mAb，使用UV滅活的HSV-I株系342hv免疫BALB/c小鼠。然后，通過體細(xì)胞融合使鼠脾細(xì)胞永生化為骨髓瘤細(xì)胞系X63-Ag8. 653,通過使用酶免疫測(cè)定法、免疫熒光測(cè)定法以及HSV中和測(cè)定法篩選單細(xì)胞克隆的上清液而分離分泌抗HSV特異性mAb 2c(IgG2a)的雜交瘤細(xì)胞系。結(jié)合研究掲示mAb 2c識(shí)別HSVl和HSV2的糖蛋白gB的共有的、不連續(xù)的表位。糖蛋白B長度約為904個(gè)氨基酸，其在病毒膜和HSV1/2感染的細(xì)胞的膜中整合為三聚體。mAb 2c不僅中和細(xì)胞外病毒顆粒的傳播，而且有效抑制從最初感染的細(xì)胞至鄰近的未被感染的細(xì)胞的直接感染途徑(細(xì)胞至細(xì)胞的傳播)(這是HSV的特性)，這具有特別重要的意義。后一個(gè)過程通常不被人體內(nèi)天然產(chǎn)生的HSV特異性抗體庫抑制。為了檢測(cè)mAb2c的體內(nèi)功效，選擇了小鼠模型中的感染途徑，其非常近似人類中 的天然感染。因此，通過在完整的陰道粘膜施用HSVl株系342hv而感染C57BL/6J小鼠。為了在體內(nèi)抑制HSV復(fù)制，通過腹膜內(nèi)(i.p.)方式在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)向小鼠施用mAb2c。在免疫活性小鼠和CD4+T細(xì)胞耗竭的動(dòng)物中，mAb 2c均能夠抑制陰道粘膜中的病毒繁殖以及短期內(nèi)的炎性損傷的形成(圖I)。與多克隆HSV血清不同，mAb 2c能夠在完全耗竭T細(xì)胞(⑶4+和⑶8+)的免疫抑制動(dòng)物中高效抑制病毒復(fù)制以及阻止一般化的致死的進(jìn)展性疾病(圖2)。在病毒接種之前24小時(shí)施用mAb 2c有效地保護(hù)了動(dòng)物免受感染(Eis-Hiibinger et al.，1993)。為了檢測(cè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目(價(jià)數(shù))和Fe部分對(duì)于中和性質(zhì)的影響，通過常規(guī)蛋白酶消化產(chǎn)生了 mAb 2c的Fab-片段和F(ab’)2-片段，并使用本領(lǐng)域熟知的方法克隆、產(chǎn)生和純化了 mAb 2c的重組的“單鏈Fv” (scFv)(圖3)。作為本領(lǐng)域熟知的方法，使用在天然HSV復(fù)制周期中在細(xì)胞表面表達(dá)gB蛋白(作為與膜結(jié)合的糖蛋白)的HSV感染的Veix)細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定親和常數(shù)(Kd)。結(jié)果如下表I所示。表I.鼠mAb 2c和所產(chǎn)生的2c抗體片段的親和常數(shù)(Kd)
權(quán)利要求
1.抗體，其包含SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6所示的互補(bǔ)決定區(qū)。
2.與根據(jù)權(quán)利要求I的抗體識(shí)別相同表位的抗體。
3.權(quán)利要求I或2任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體能夠抑制HSV從被感染的細(xì)胞至鄰近的另一個(gè)未被感染的細(xì)胞的傳播(細(xì)胞至細(xì)胞的傳播)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體,其中所述抗體具有至多40nM,優(yōu)選至多30nM,更優(yōu)選至多20nM，再更優(yōu)選至多15nM，至多13nM，至多ΙΟηΜ，最優(yōu)選至多7nM的解離常數(shù)KD。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的抗體，其中濃度為至多20nM，優(yōu)選至多16nM，更優(yōu)選至多12nM，至多ΙΟηΜ，至多8nM，至多6nM，最優(yōu)選至多4nM的所述抗體能夠中和IOOTCID5ci的確定量的HSV。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含與SEQID NO:9的位置I至30，38至 51，68 至 99，和 112 至 122 以及 SEQ ID NO: 10 的位置 I 至 23，40 至 54，62 至 93，和 103至113所示的氨基酸殘基具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含與SEQID NO:7的位置I至30，38至 51，68 至 99，和 112 至 122 以及 SEQ ID NO:8 的位置 I 至 23，41 至 55，63 至 94，和 104至114所示的氨基酸殘基具有至少80%、優(yōu)選100%序列同一性的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是二價(jià)抗體或多價(jià)抗體。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體綴合至效應(yīng)子部分、治療部分或可檢測(cè)標(biāo)記物。
10.藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的抗體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
11.表達(dá)載體，其包含編碼權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗體的核酸序列。
12.宿主細(xì)胞，其包含編碼權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗體的核苷酸序列。
13.雜交瘤細(xì)胞,其能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的抗體，其用作藥物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的抗體，其用于預(yù)防性或治療性處理受試者中與HSV相關(guān)的疾病的方法。
16.用于權(quán)利要求15的用途的抗體，其中所述與HSV相關(guān)的疾病伴隨下列一項(xiàng)或多項(xiàng)特征 (a)存在口的復(fù)發(fā)， (b)存在生殖器的復(fù)發(fā)， (c)皰疹性濕疹， (d)新生兒皰疹， (e)免疫缺陷，免疫障礙的患者， (f)對(duì)于病毒抑制劑的抗性， (g)腦炎， (h)腦膜炎， (i)腦膜腦炎， (j)眼睛感染，和/或(k)泛發(fā)的 HSV感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及如權(quán)利要求中定義的抗HSV抗體，包含有效量的所述抗體的藥物組合物，包含編碼所述抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體，包含所述核苷酸序列的宿主細(xì)胞，能夠產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞和所述抗體作為藥物的用途，特別涉及用于制備用于預(yù)防性或治療性處理受試者中的HSV相關(guān)疾病的藥物的用途；如權(quán)利要求中所定義。
文檔編號(hào)C07K14/035GK102791733SQ201080052679
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2010年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月1日
發(fā)明者A·克勞茨科, A-M·埃伊斯-胡伊賓格, E·艾科斯納, J·克勞斯, K·E·施內(nèi)維斯, M·羅根多夫, M·道莫, M·阿德特 申請(qǐng)人:公眾權(quán)益基金會(huì)德國癌癥研究中心