專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抑菌性鐵蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種抑菌性鐵蛋白及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鐵蛋白(ferritin)廣泛存在于各種生物體中，具有很強(qiáng)的鐵結(jié)合能力，其主要功能是將細(xì)胞中過(guò)剩的鐵以一種可以重新利用的形式儲(chǔ)存起來(lái)，從而避免游離鐵引起的各種對(duì)細(xì)胞有損傷作用的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體缺乏鐵時(shí)，儲(chǔ)存于鐵蛋白中的鐵離子即可釋放出來(lái)，供機(jī)體使用。因此，鐵蛋白在維持生物體鐵平衡中具有重要作用。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)半滑舌鰨鐵蛋白不僅具有螯合鐵的功能，而且具有廣譜的抑菌效應(yīng)，能夠抑制多種魚(yú)類(lèi)重要致病性細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此在病害防治中具有良好的應(yīng)用潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鐵蛋白及其制備和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種鐵蛋白鐵蛋白為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。鐵蛋白的制備1)質(zhì)粒 pETCsFer2 的構(gòu)建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pBSCsFer2 ；將上述質(zhì)粒PBSCsFer2和質(zhì)粒pET259分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切，回收 0. 5kb和5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pETCsFer2 ；2)鐵蛋白的表達(dá)和制備將上述步驟1)的質(zhì)粒pETCs!^r2轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Rosetta (DE!3)，在含有卡那霉素的LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子即為Rosetta(DEIBVpETCsi^erf ；將轉(zhuǎn)化子Rosetta (DE3) /PETCsFer2用終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)后，采用親和層析柱純化重組蛋白，即為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示的鐵蛋白。所述步驟1)中 Fl 為 5' -GATATCATGGAGTCTCAAGTGCG-3 ‘ ；Rl 為 5’ -GATATCGCTCTTGCCACCGT-3’。鐵蛋白的應(yīng)用所述序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的鐵蛋白可作為抑菌劑。 所述鐵蛋白可作為遲緩愛(ài)德華氏菌、哈氏弧菌、海豚鏈球菌、熒光假單胞菌或副溶血弧菌的抑菌劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.廣譜、高效抑菌作用。本發(fā)明的鐵蛋白可以有效抑制多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌，因而可以用于防控細(xì)菌性疾病。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化得到的鐵蛋白電泳圖譜(其中，純化得到的鐵蛋白為泳道2 ；泳道1 分子量marker。)。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的鐵蛋白的抑菌效應(yīng)檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母轉(zhuǎn)化按 hvitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照 Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannua1. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001。3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。實(shí)施例1本發(fā)明的鐵蛋白為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No. 1 為:MESQVRQNYHRDCEAAVNRMINMELFASYNYTSMAFHFSRDDVALPGFAHFFKENSHEEREHAEKLLSFQNKRGGRIFLQDIKKPERDEWVNGLDAMEHALQLEKTVNQALLDLHKLASEHGDPHMCDFLETHYLNEQVEAIKKLGDYITNLKRLDPANNKMAEYLFDKHTLHGGKS(a)序列特征 長(zhǎng)度177 類(lèi)型氨基酸序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源半滑舌鰨空間結(jié)構(gòu)該蛋白預(yù)期含有一個(gè)真核鐵蛋白結(jié)構(gòu)域，由氨基酸14-155，構(gòu)成，另外，氨基酸89-118預(yù)期形成一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2鐵蛋白的制備方法1)質(zhì)粒 pETCsFer2 的構(gòu)建
以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94°C 60s 預(yù)變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s，5 個(gè)循環(huán)后改為 94°C 40s, 58°C 60s， 72°C 60s，30個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)7-lOmin。PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS_T (購(gòu)于 “天根生化科技(北京)有限公司”)于室溫連接4-6小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在含安卡青霉素(100ug/ml)、Xgal (40ug/ml)、異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(Mug/ml)的LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18- 小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSCsFer2。將pBSCsFer2和質(zhì)粒 pET259(質(zhì)粒 pET259 構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn) Zheng, W. J.，Hu, Y. H.，Sun, L.，2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28,829-836)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后回收0. 5kb和5. 4kb片段， 將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-M小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為PETCsFer2。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 % 氯化鈉,97. 5 % 蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCATGGAGTCTCAAGTGCG-3，；Rl 為 5’ -GATATCGCTCTTGCCACCGT-3’。2)鐵蛋白的表達(dá)和制備將步驟1)的質(zhì)粒PETCsFer2轉(zhuǎn)化R0Setta(DE3)(購(gòu)于“百泰克生物技術(shù)(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子即為 Rosetta(DE3)/pETCsFer2。將 Rosetta(DE3)/pETCsFer2 在含有卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中于 37°C培養(yǎng)至0D_為0. 6，加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷使其終濃度達(dá)到ImM，18°C繼續(xù)搖動(dòng)培養(yǎng) 4-5 小時(shí)，而后用 GE Healthcare (美國(guó))公司的 nickel-nitrilotriacetic acid 親和層析柱純化重組蛋白(層析條件用4-5ml Wash buffer洗柱兩次，隨后用0. 5-lml Elution buffer洗柱，收集所有洗脫液)。將洗脫液中的重組蛋白進(jìn)行N-端氨基酸測(cè)序， 證實(shí)其為序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的鐵蛋白。將重組蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，發(fā)現(xiàn)其分子量與表SEQ ID No. 1中序列的分子量一致(參見(jiàn)圖1)。上述Wash buffer 成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8. O ； 上述 Elution buffer 成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH 8. 0.實(shí)施例3鐵蛋白的抑菌效應(yīng)檢測(cè)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛(ài)德華氏菌(保存于CGMCC，編號(hào)為CGMCC 2330)、哈氏弧菌(保存于CGMCC，編號(hào)為CGMCC 1985)、海豚鏈球菌(保存于CGMCC，編號(hào)為CGMCC 1984)、 熒光假單胞菌(保存于CGMCC，編號(hào)為CGMCC 23 )、副溶血弧菌(保存于CGMCC，編號(hào)為 CGMCC 1. 2164)至OD6c 為0. 5，將其稀釋1000倍。將上述純化的鐵蛋白在PBS中稀釋至^ig/ ml。取IOOul稀釋菌液，加入395ul LB培養(yǎng)基，再加入5ul稀釋后的鐵蛋白或5ul PBS (對(duì)照組)。將混合液在LB培養(yǎng)基中于培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量細(xì)菌濃度。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，加入鐵蛋白組的細(xì)菌生長(zhǎng)完全被抑制(參見(jiàn)圖幻。因此本發(fā)明的鐵蛋白具有強(qiáng)性抑菌效應(yīng)，可作為廣譜抑菌劑用于細(xì)菌性病害的防治。
權(quán)利要求
1.一種鐵蛋白，其特征在于鐵蛋白為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的鐵蛋白的制備，其特征在于1)質(zhì)粒pETCsFer2的構(gòu)建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載體 PBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pBSCsFer2 ；將上述質(zhì)粒pBSCsFer2和質(zhì)粒pET259分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切，回收0. 5kb和 5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PETCsi^erf ；2)鐵蛋白的表達(dá)和制備將上述步驟1)的質(zhì)粒pETCs!^r2轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Rosetta(DEiB)，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng),篩選轉(zhuǎn)化子即為Rosetta(DE3)/pETCsFer2 ；將轉(zhuǎn)化子Rosetta (DE3) /PETCsFer2用終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)后，采用親和層析柱純化重組蛋白，即為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示的鐵蛋白。
3.按權(quán)利要求2所述的鐵蛋白的制備，其特征在于所述步驟1)中Fl為 5，-GATATCATGGAGTCTCAAGTGCG-3，；Rl 為 5’ -GATATCGCTCTTGCCACCGT-3，。
4.一種權(quán)利要求1所述的鐵蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的鐵蛋白可作為抑菌劑。
5.按權(quán)利要求1所述的鐵蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述鐵蛋白可作為遲緩愛(ài)德華氏菌、哈氏弧菌、海豚鏈球菌、熒光假單胞菌或副溶血弧菌的抑菌劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種抑菌性鐵蛋白及其制備和應(yīng)用。鐵蛋白為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制備方法以半滑舌鰨cDNA為模板PCR擴(kuò)增鐵蛋白基因，構(gòu)建質(zhì)粒pETCsFer2，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)后回收重組蛋白。所述鐵蛋白能夠抑制多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C07K14/46GK102241759SQ20111009318
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者孫黎, 張敏, 汪瑋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所