專利名稱：一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化分離提純，特別是涉及一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法。
背景技術(shù)：
鶴去氧膽酸(3α，7 α - 二輕基 _5 β -膽燒酸，Chenodeoxycholie Acid,簡稱 CDCA)具有糾正膽固醇飽和膽汁的作用。1972年由英國正式開辟了溶解膽固醇類結(jié)石的治療，鵝去氧膽酸作為第一個糾正飽和膽汁和溶解膽石的藥物被應(yīng)用。現(xiàn)在已知在很多動物和人的膽汁、肝、腎等組織中都含有鵝去氧膽酸。鵝去氧膽酸還可作為合成熊去氧膽酸(3 α，7 β - 二羥基_5 β -膽烷酸)和其他甾體化合物的中間體。熊去氧膽酸能促進(jìn)膽汁固體成分的分泌，是一種強(qiáng)有力的利膽藥物，用 于治療各種膽疾及消化道疾病，研究發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸能溶解X射線可透射的膽石，而且毒性小，用量少，市場前景廣闊。鵝去氧膽酸主要動物膽汁中提取，目前大多數(shù)廠家都是從雞膽汁中和豬膽汁中提取，還缺少利用鴨膽汁中鵝去氧膽酸的工藝方法，而我國鴨養(yǎng)殖量巨大，可作為鵝去氧膽酸的原料的新的來源。雞膽汁中鵝去氧膽酸約為80%，含量高，提取簡單，利用傳統(tǒng)的溶媒提取法即可獲得較高純度(96%以上)的鵝去氧膽酸，而鴨膽汁中鵝去氧膽酸含量大約為4(Γ50%，傳統(tǒng)的溶媒提取法不能得到較高純度的鵝去氧膽酸，需要針對其特點開發(fā)新的提純方法。

發(fā)明內(nèi)容
為擴(kuò)大鵝去氧膽酸的原料來源，提高家禽膽汁資源的利用效率，本發(fā)明旨在提供一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法。本發(fā)明提供一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，具體步驟如下I)溶解萃取在鴨膽膏粗品中加入萃取劑，具體為鴨膽膏粗品5倍重量的氯仿、5 20倍重量的甲醇、5 10倍重量的水，加熱回流f 2小時，冷卻至2(T25°C，靜置分層，得到氯仿相和甲醇/水相，蒸發(fā)回收甲醇，剩下的水相以質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸(用質(zhì)量百分含量為38%的濃鹽酸與水的體積比為1:1配得的鹽酸)調(diào)pH至2，結(jié)晶，離心，得到鵝去氧膽酸A品；2)乙酸乙酯萃取將鵝去氧膽酸A品用5 10倍質(zhì)量的氫氧化鈉溶液溶解，溶液中氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量為5 10%，冷卻至2(T25°C，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5 10ml，調(diào)pH至7. 2 . 6，分層得到乙酸乙酯相，向水層中繼續(xù)加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5 10ml，調(diào)pH至6. 8 7. 2，分層得到乙酸乙酯相，合并兩次乙酸乙酯相，加入鵝去氧膽酸A品5%重量的活性炭回流脫色f 2小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙酸乙酯，剩下即為鵝去氧膽酸B品；3)超濾除雜取鵝去氧膽酸B品溶解到1(Γ20倍重量的水中，以過截留分子量為3K-100K的超濾膜后，用質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2 3，過濾干燥得到白色的鵝去氧膽酸。其中，鴨膽膏粗品的制備方法為新鮮的鴨膽汁，按50g/L加入氫氧化鈉，煮沸24小時進(jìn)行皂化，以質(zhì)量百分含量38%的濃鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，得到膏狀物，將膏狀物用1(Γ20倍質(zhì)量的乙醇溶解，加入膏狀物重量10%的活性炭脫色2小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙醇，濃縮得到鴨膽膏粗品。其中，鴨膽膏粗品可用同質(zhì)量鈣鹽法制備得到的鵝去氧膽酸粗品替代。鈣鹽法制備得到的鵝去氧膽酸粗品的方法為新鮮的鴨膽汁，按膽汁量50g/L加入氫氧化鈉，煮沸24小時進(jìn)行皂化，后加入膽汁重量5%的氯化鈣，析出總膽酸鈣鹽沉淀，離心棄去濾液，總膽酸鈣鹽用40倍質(zhì)量的水清洗，棄去不溶物，水溶液用用質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，析出鵝去氧膽酸粗品，過濾，干燥，得到鵝去氧膽酸粗品。其中，步驟I)所述的在鴨膽膏粗品中加入萃取劑，優(yōu)選為鴨膽膏粗品5倍重量的氯仿、10倍重量的甲醇、5倍重量的水；所述的加熱回流，優(yōu)選為2小時。 其中，步驟2)所述的將鵝去氧膽酸A品用氫氧化鈉溶液溶解，優(yōu)選為加入鵝去氧膽酸A品5倍質(zhì)量的氫氧化鈉溶液，冷卻至25 °C。其中，步驟2)先后兩次加入乙酸乙酯的量分別為每克鵝去氧膽酸A品的加入IOml乙酸乙酯和每克鵝去氧膽酸A品的加入5ml乙酸乙酯。其中，步驟2)所述的調(diào)pH，優(yōu)選用醋酸，先后兩次分別調(diào)pH為7. 5和6. 8。其中，步驟2)所述的活性碳活性炭回流脫色，回流脫色時間優(yōu)選I小時。其中，步驟3)所述的取鵝去氧膽酸B品溶解到水中，水量優(yōu)選為鵝去氧膽酸B品重量的15倍。其中，步驟3)所述的超濾膜，優(yōu)選截留分子量為IOK的超濾膜。本發(fā)明的藥物組合物具有以下優(yōu)點I)擴(kuò)大鵝去氧膽酸的原料來源，提供了一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法。2)利用傳統(tǒng)方法從鴨膽汁中提取出的鵝去氧膽酸含量很低，只有60%左右，利用本發(fā)明的方法得到的鵝去氧膽酸HPLC含量達(dá)96%以上，提高了鵝去氧膽酸的提取效率。


圖I為鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品核磁共振氫譜圖。圖2為鵝去氧膽酸制備樣品的核磁共振氫譜圖。圖3為鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品紅外吸收圖譜圖。圖4為鵝去氧膽酸制備樣品的紅外吸收圖譜圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I從鴨膽汁制備鴨膽膏粗品取新鮮的鴨膽汁50kg (體積為50L)置于不銹鋼反應(yīng)釜內(nèi)，按膽汁量50g/L加入氫氧化鈉，即加入2. 5kg氫氧化鈉，加熱煮沸24小時進(jìn)行皂化，以質(zhì)量百分含量38%的濃鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，得到褐色膏狀物大約5kg，將膏狀物用50kg的乙醇溶解，加入O. 5kg的活性炭回流脫色2小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)濃縮回收乙醇，濃縮得到鴨膽膏粗品5kg。實施例2鈣鹽法制備鵝去氧膽酸粗品新鮮的鴨膽汁IOOkg置于不銹鋼反應(yīng)釜內(nèi)，按膽汁量50g/L加入氫氧化鈉，即加入5kg氫氧化鈉，加熱煮沸24小時進(jìn)行皂化，而后加入膽汁重量5%的氯化鈣，即5kg的氯化鈣，析出總膽酸鈣鹽沉淀，離心棄去濾液，得到總膽酸鈣鹽?？偰懰徕}鹽利用40kg的水清洗，棄去水不溶物，水溶液用17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，即析出鵝去氧膽酸粗品，過濾，干燥，得到鵝去氧膽酸粗品。 實施例3分離提純鵝去氧膽酸I)溶解萃取稱取實施例I中得到的鴨膽膏粗品100g，加入氯仿500g、甲醇500g、水500g，加熱回流I小時，待其完全溶解后，冷卻至25°C，靜置分層，得到氯仿相和甲醇/水相，蒸發(fā)回收甲醇，剩下的水相以質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，離心，得到鵝 去氧膽酸A品；2)乙酸乙酯萃取將鵝去氧膽酸A品用5倍質(zhì)量的5%氫氧化鈉溶液溶解，冷卻至20°C，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5ml，調(diào)pH至7. 2，分層得到乙酸乙酯相，向水層中繼續(xù)加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5ml，調(diào)pH至6. 8，分層得到乙酸乙酯相，合并兩次乙酸乙酯相，加入鵝去氧膽酸A品5%重量的活性炭，回流脫色I(xiàn)小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙酸乙酯，得到鵝去氧膽酸B品；3)超濾除雜取鵝去氧膽酸B品溶解到15倍重量的水中，通過截留分子量為3K的超濾膜后，用質(zhì)量百分含量17%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，過濾干燥得到白色的鵝去氧膽酸。上述方法得到的鵝去氧膽酸，經(jīng)HPLC含量測定為96. 9%。繪制了本實施例所得鵝去氧膽酸的核磁共振氫譜(見圖I、圖2)，圖I為鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品核磁共振氫譜，其中標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供，本實施例的鵝去氧膽酸的核磁共振氫譜見圖2，由此可見，本實施例鵝去氧膽酸的核磁共振氫譜特征峰與鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰基本相同，說明得到的物質(zhì)即高含量的鵝去氧膽酸。還繪制了本實施例所得鵝去氧膽酸的紅外吸收圖譜(見圖3、圖4)，圖3為鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品紅外吸收圖譜，其中標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供，本實施例的鵝去氧膽酸的紅外吸收圖譜見圖4，由此可見本實施例鵝去氧膽酸的紅外吸收圖譜特征峰與鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰基本相同，說明得到的物質(zhì)即高含量的鵝去氧膽酸。實施例4分離提純鵝去氧膽酸I)溶解萃取稱取實施例2中鈣鹽法制備的鵝去氧膽酸粗品100g，加入氯仿500g、甲醇IOOOgdK 500g，加熱回流2小時，待其完全溶解后，冷卻至25°C，靜置分層，得到氯仿相和甲醇/水相，蒸發(fā)回收甲醇，剩下的水相以質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，離心，得到鵝去氧膽酸A品；2)乙酸乙酯萃取將鵝去氧膽酸A品用5倍質(zhì)量的10%氫氧化鈉溶液溶解，冷卻至25°C，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加10ml，調(diào)pH至7. 5，分層得到乙酸乙酯相，向水層中繼續(xù)加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5ml，調(diào)pH至6. 8，分層得到乙酸乙酯相，合并兩次乙酸乙酯相，加入鵝去氧膽酸AS 5%重量的活性炭，回流脫色I(xiàn)小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙酸乙酯，得到鵝去氧膽酸B品；
3)超濾除雜取鵝去氧膽酸B品溶解到15倍重量的水中，通過截留分子量為IOK的超濾膜后，用質(zhì)量百分含量20%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，過濾干燥得到白色的鵝去氧膽酸。經(jīng)上述方法得到的鵝去氧膽酸，經(jīng)HPLC含量測定為98. 2%。實施例5分離提純鵝去氧膽酸I)溶解萃取稱取實施例2中鈣鹽法制備的鵝去氧膽酸粗品，加入氯仿500g、甲醇IOOOgdK 500g，加熱回流2小時，待其完全溶解后，冷卻至25°C，靜 置分層，得到氯仿相和甲醇/水相，蒸發(fā)回收甲醇，剩下的水相以質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，離心，得到鵝去氧膽酸A品；2)乙酸乙酯萃取將鵝去氧膽酸A品用5倍質(zhì)量的氫氧化鈉溶液溶解，溶液中氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量為10%，冷卻至25°C，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加10ml，調(diào)pH至7. 5，分層得到乙酸乙酯相，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5ml，調(diào)pH至6. 8，分層得到乙酸乙酯相，合并兩次乙酸乙酯相，加入鵝去氧膽酸A品5%重量的活性炭，回流脫色I(xiàn)小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙酸乙酯，得到鵝去氧膽酸B品；3)超濾除雜取鵝去氧膽酸B品溶解到15倍重量的水中，通過截留分子量為IOK的超濾膜后，用質(zhì)量百分含量20%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，過濾干燥得到白色的鵝去氧膽酸。經(jīng)上述方法得到的鵝去氧膽酸H，經(jīng)HPLC含量測定為98. 5%。實施例6分離提純鵝去氧膽酸I)溶解萃取稱取實施例I中得到的鴨膽膏粗品100g，加入氯仿500g、甲醇2000g、水lOOOg，加熱回流2小時，待其完全溶解后，冷卻至25°C，靜置分層，得到氯仿相和甲醇/水相，蒸發(fā)回收甲醇，剩下的水相以質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，離心，得到鵝去氧膽酸A品；2)乙酸乙酯萃取將鵝去氧膽酸A品用10倍質(zhì)量的5%氫氧化鈉溶液溶解，冷卻至25°C，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加10ml，調(diào)pH至7. 6，分層得到乙酸乙酯相，向水層中繼續(xù)加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加10ml，調(diào)pH至7. 2，分層得到乙酸乙酯相，合并兩次乙酸乙酯相，加入鵝去氧膽酸AS 5%重量的活性炭，回流脫色2小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙酸乙酯，得到鵝去氧膽酸B品；3)超濾除雜取鵝去氧膽酸B品溶解到15倍重量的水中，通過截留分子量為100K的超濾膜后，用質(zhì)量百分含量17%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，過濾干燥得到白色的鵝去氧膽酸。經(jīng)上述方法得到的鵝去氧膽酸，經(jīng)HPLC含量測定為96. 2%。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，具體步驟如下 1)溶解萃取在鴨膽膏粗品中加入萃取劑，具體為鴨膽膏粗品5倍重量的氯仿、5 20倍重量的甲醇、5 10倍重量的水，加熱回流f 2小時，冷卻至2(T25°C，靜置分層，得到氯仿相和甲醇/水相，蒸發(fā)回收甲醇，剩下的水相以質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，離心，得到鵝去氧膽酸A品； 2)乙酸乙酯萃取將鵝去氧膽酸A品用5 10倍質(zhì)量的氫氧化鈉溶液溶解，溶液中氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量為5 10%，冷卻至2(T25°C，加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5 10ml，調(diào)pH至7. 2 . 6，分層得到乙酸乙酯相，向水層中繼續(xù)加入乙酸乙酯，加入量為每克鵝去氧膽酸A品加5 10ml，調(diào)pH至6. 8 7. 2，分層得到乙酸乙酯相，合并兩次乙酸乙酯相，加入鵝去氧膽酸A品5%重量的活性炭回流脫色f 2小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙酸乙酯，剩下即為鵝去氧膽酸B品； 3)超濾除雜取鵝去氧膽酸B品溶解到1(Γ20倍重量的水中，以過截留分子量為3Κ-100Κ的超濾膜后，用質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至疒3，過濾干燥得到白色的鵝去氧膽酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟I)所述的鴨膽膏粗品的制備方法為新鮮的鴨膽汁，按50g/L加入氫氧化鈉，煮沸24小時進(jìn)行皂化，以質(zhì)量百分含量38%的濃鹽酸調(diào)pH至2，結(jié)晶，得到膏狀物，將膏狀物用1(Γ20倍質(zhì)量的乙醇溶解，加入膏狀物重量10%的活性炭脫色2小時，過濾除去活性炭，蒸發(fā)回收乙醇，濃縮得到鴨膽膏粗品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，所述鴨膽膏粗品可用同質(zhì)量鈣鹽法制備得到的鵝去氧膽酸粗品替代，其制備方法為新鮮的鴨膽汁，按膽汁量50g/L加入氫氧化鈉，煮沸24小時進(jìn)行皂化，后加入膽汁重量5%的氯化鈣，析出總膽酸鈣鹽沉淀，離心棄去濾液，總膽酸鈣鹽用40倍質(zhì)量的水清洗，棄去不溶物，水溶液用用質(zhì)量百分含量17 20%的鹽酸調(diào)pH至2，析出鵝去氧膽酸粗品，過濾，干燥，得到鵝去氧膽酸粗品。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟1)所述的在鴨膽膏粗品中加入萃取劑，為加入鴨膽膏粗品5倍重量的氯仿、10倍重量的甲醇、5倍重量的水；所述的加熱回流，時間為2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟2)所述的將鵝去氧膽酸A品用氫氧化鈉溶液溶解，為加入鵝去氧膽酸A品5倍質(zhì)量的氫氧化鈉溶液，冷卻至25 °C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟2)先后兩次加入乙酸乙酯的量分別為每克鵝去氧膽酸A品的加入IOml乙酸乙酯和每克鵝去氧膽酸A品的加入5ml乙酸乙酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟2)所述的調(diào)pH為用醋酸調(diào)節(jié)，先后兩次分別調(diào)pH為7. 5和6. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟2)所述的活性碳活性炭回流脫色，回流脫色時間為I小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，其特征在于，步驟3) 所述的取鵝去氧膽酸B品溶解到水中用水量為鵝去氧膽酸B品重量的15倍；所述的超濾膜截留分子量為IOK的超濾膜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法，具體是以溶解萃取鴨膽膏粗品后進(jìn)行乙酸乙酯萃取、超濾除雜。本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點1)擴(kuò)大鵝去氧膽酸的原料來源，提供了一種從鴨膽汁中分離提純鵝去氧膽酸的方法；2)利用傳統(tǒng)方法從鴨膽汁中提取出的鵝去氧膽酸含量很低，只有60%左右，利用本發(fā)明的方法得到的鵝去氧膽酸HPLC含量達(dá)96%以上，提高了鵝去氧膽酸的提取效率。
文檔編號C07J9/00GK102827234SQ201210314089
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者陸其華, 周大海 申請人:蘇州天綠生物制藥有限公司, 山東天綠制藥有限公司