專利名稱：一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是當(dāng)今世界首屈一指的農(nóng)業(yè)大國，但由于多方面的原因，重大病害出現(xiàn)的頻率和面積明顯增加，造成的產(chǎn)量損失都在10%左右。河北省主要農(nóng)作物、經(jīng)濟作物如小麥、玉米、棉花等和大棚蔬菜每年因病蟲害的損失也是巨大的，據(jù)估計可達數(shù)十億元。為了對付嚴重的農(nóng)作物病害，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者大量使用化學(xué)農(nóng)藥?；瘜W(xué)農(nóng)藥的施用也確實對農(nóng)作物病害的控制做出了巨大的貢獻。但是，化學(xué)農(nóng)藥的大量施用也正在顯示著嚴重的負面影響。因此，在全球范圍內(nèi)研究、開發(fā)和生產(chǎn)安全、無毒副作用、對環(huán)境友好的生物制劑成為新產(chǎn)業(yè)的發(fā)展重點。隨著生物防治、綠色農(nóng)業(yè)等呼聲日益高漲，植物抗病免疫技術(shù)的研究成為近年興起的重要研究領(lǐng)域。植物免疫抗病激活劑是一些生物和非生物因子，能夠誘導(dǎo)植物獨特的生理狀態(tài)，植物能夠更好或更快或者既好又快的調(diào)配防衛(wèi)反應(yīng)的生理狀態(tài)，使植物防御病蟲害的狀態(tài)處在臨界，達到一觸即發(fā)，當(dāng)病害在侵染植物時，植物會在短時間內(nèi)借助于誘導(dǎo)因子激發(fā)植物整體的抗性水平，調(diào)動整個植物的免疫能力，激活植物自身抗病相關(guān)基因的表達，抵抗病原物的侵染，自身不對病原菌起作用，不會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，用量低、高效、誘導(dǎo)的植物抗病譜廣、抗病持續(xù)時間長，這對于植物病害的可持續(xù)控制具有重要的意義。軟腐歐文氏菌是一種廣泛的致病菌，主要發(fā)生在大白菜、卷心菜、菜花、馬鈴薯等作物上，主要為害葉、莖及塊莖。葉染病近地面老葉先發(fā)病，病部呈不規(guī)則暗褐色病斑，濕度大時腐爛。莖部染病多始于傷口，再向莖干蔓延，后莖內(nèi)髓組織腐爛，具惡臭，病莖上部枝葉萎蔫下垂，葉變黃。塊莖染 病多由皮層傷口引起，初呈水浸狀，后薯塊組織崩解，發(fā)出惡臭。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明采取的技術(shù)方案
一種具有植物免疫激活作用的胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種份carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601,于 2012 年 8 月 15 日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 6433。所述的軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其提取方法如下
(I)將 min1-Tn5_Km 轉(zhuǎn)座子插入軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601中，篩選出不能使煙草葉片出現(xiàn)過敏反應(yīng)即葉片上出現(xiàn)壞死斑的突變菌；
(2)利用轉(zhuǎn)座子min1-Tn5-Km上的Km標(biāo)簽，通過RACE-PCR擴增上述突變菌中轉(zhuǎn)座子插入點兩端的DNA片段，經(jīng)過測序拼接后，獲得DNA序列；
(3)將步驟(2)得到的DNA序列連接到pET30a(+)上，并將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌E.coliBL21 中，獲得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR);
(4)將工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白。所述的免疫激活蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明得到的軟腐歐文氏菌能夠誘導(dǎo)植物本身產(chǎn)生抗性反應(yīng)，對植物起到免疫激活作用。經(jīng)驗證，該軟腐歐文氏菌中起免疫激活作用的物質(zhì)是其產(chǎn)生的一種蛋白，將其命名為EccPR蛋白，該蛋白用于植物免疫激活，能使植物體內(nèi)抗性基因表達明顯提高，從而有效地誘導(dǎo)植物對病原菌起到抗性作用。
具體實施例方式本發(fā)明篩選得到一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌^nrifliacarotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601,該菌株作為病原菌侵染擬南芥時,不能使擬南芥染病，而且將這種菌接種于煙草葉片，煙草葉片能夠過敏反應(yīng)，出現(xiàn)壞死斑。本發(fā)明從軟腐歐文氏菌iZnfiflia car ο tovora subsp. Caro tovora strain Ecc601中提取EccPR蛋白的過程如下
(1)將min1-Tn5_Km 轉(zhuǎn)座子插入軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601 中獲得突變菌種庫,篩選出不能使煙草葉片出現(xiàn)過敏反應(yīng)的突變菌carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 仰27淑，即在該菌株中轉(zhuǎn)座子的插入破壞了軟腐歐文氏菌份carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中能使植物對病原菌產(chǎn)生抗性的功能單元的結(jié)構(gòu)；
(2)利用轉(zhuǎn)座子min1-Tn5-Km上的Km標(biāo)簽，通過RACE-PCR擴增轉(zhuǎn)座子插入點兩端的DNA片段，經(jīng)過測序拼接后，獲得DNA序列；
(3)將步驟(2)得到的DNA序列連接到pET30a(+)上，并將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌E.coliBL21 中，獲得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR);
(4)將工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白EccPR，其具體過程為
將工程菌E. coli BL21 (pET30a-EccPR)單菌落挑起于LB培養(yǎng)基中在37°C下進行過夜培養(yǎng)，將其作為母種，第二天將母種以1%接種量接種于液體LB培養(yǎng)基中，在37°C下進行培養(yǎng)5-7小時，在其培養(yǎng)液中加入0. 4mM的IPTG進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)6_8小時后，將該培養(yǎng)液進行離心，獲得的菌體然后將其水懸浮并煮沸10-15分鐘，離心后將上清冷凍干燥，獲得含有70-80%發(fā)酵免疫激活蛋白EccPR的粗蛋白，如果要獲得純免疫激活蛋白EccPR，則將其過層析柱即可得到純品免疫激活蛋白EccPR。本發(fā)明得到的EccPR蛋白在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性中應(yīng)用
將濃度為lmg/ml的EccPR免疫激活蛋白溶液分別噴施到擬南芥、黃瓜和煙草上，每7天噴施一次，每次噴施蛋白總量為20-25mg/株，總共噴施3次。最后一次噴施20天后，分別在擬南芥上接種丁香假單胞桿菌DC3000，在黃瓜上接種枯萎病菌，在煙草上接種軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc。同時用不噴施 EccPR 免疫激活蛋白溶液的植物個體做對照。培養(yǎng)72小時后，發(fā)現(xiàn)在沒有噴施激活蛋白EccPR的植物上都染病，而噴施的植物上染病率是20%，而且這些染病的植物都產(chǎn)生了過敏反應(yīng)。用激活蛋白EccPR處理過的植物葉片中的病原菌數(shù)目比未處理的降低了 45%，而且相應(yīng)的抗性基因表達都有明顯的提高PR1提高7. 3倍，PR5提高1. 8倍，PDF1. 2提高11. 7倍，Thi2.1提高21.1倍，VSP2.1提高43. 4倍。這些說明EccPR免疫激活蛋白是一種有效的誘抗劑，能夠有效的誘導(dǎo)植物對病原菌起到抗性作用，而且這種使用方法能夠最佳誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。EccPR蛋白還具有促進種子萌發(fā)和促進植物生長的作用 將免疫激活蛋白EccPR純品溶解在水中，分別配制不同濃度的溶液，溶液濃度分別為O. O lmg/ml、O. lmg/ml、lmg/ml、10mg/ml、100mg/ml。將這些不同濃度的免疫激活蛋白EccPR分別浸泡擬南芥、黃瓜和煙草種子2個小時后，正常培養(yǎng)種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫激活蛋白EccPR的濃度大于或等于O.1 mg/ml時,能夠促進這三種種子的萌發(fā)速度,提高這三種種子的萌發(fā)率。而且發(fā)現(xiàn)lmg/ml提高種子的萌發(fā)率達到21%。將擬南芥、黃瓜和煙草幼苗分別在含有終濃度為lmg/ml的EccPR免疫激活蛋白的MS液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后，擬南芥、黃瓜和煙草的根長分別增加12%、5%、10%，鮮重分別增加16%、8%、12%。這些說明EccPR蛋白能夠促進植物的生長。
權(quán)利要求
1.一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601,其特征在于其于2012年8月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 6433。
2.由權(quán)利要求1所述的軟腐歐文氏菌Erwiniacarotovora subsp. Carotovorastrain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其特征在于其提取方法如下 (1)將min1-Tn5_Km 轉(zhuǎn)座子插入軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601中，篩選出不能使煙草葉片出現(xiàn)過敏反應(yīng)即葉片上出現(xiàn)壞死斑的突變菌； (2)利用轉(zhuǎn)座子min1-Tn5-Km上的Km標(biāo)簽，通過RACE-PCR擴增上述突變菌中轉(zhuǎn)座子插入點兩端的DNA片段，經(jīng)過測序拼接后，獲得DNA序列； (3)將步驟(2)得到的DNA序列連接到pET30a(+)上，并將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌E.coliBL21 中，獲得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR); (4)將工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的免疫激活蛋白的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有植物免疫激活作用的軟腐歐文氏菌、從其中提取的免疫激活蛋白及其應(yīng)用。該軟腐歐文氏菌于2012年8月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo.6433。本發(fā)明得到的軟腐歐文氏菌能夠誘導(dǎo)植物本身產(chǎn)生抗性反應(yīng)，對植物起到免疫激活作用。經(jīng)驗證，該軟腐歐文氏菌中起免疫激活作用的物質(zhì)是其產(chǎn)生的一種蛋白，將其命名為EccPR蛋白，該蛋白用于植物免疫激活，能使植物體內(nèi)抗性基因表達明顯提高，從而有效地誘導(dǎo)植物對病原菌起到抗性作用。
文檔編號C07K14/27GK103045497SQ20121033191
公開日2013年4月17日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者賈振華, 宋水山, 劉方, 馬宏, 趙芊, 黃亞麗 申請人:河北省科學(xué)院生物研究所