Fc變體及其生成方法
【專(zhuān)利摘要】本文中描述了Fc變體及用于有效生成抗體和其它多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物（在本文中統(tǒng)稱(chēng)為異多聚體蛋白質(zhì)）的方法。異多聚體蛋白質(zhì)可能能夠特異性結(jié)合超過(guò)一個(gè)靶物。靶物可以是例如單一分子上的或位于不同分子上的不同表位。該方法組合了異多聚體蛋白質(zhì)的有效高基因表達(dá)水平、適宜的裝配、及容易的純化。本發(fā)明還提供了使用這些異多聚體蛋白質(zhì)的方法，及包含這些抗體的組合物、試劑盒和制品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】Fe變體及其生成方法
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年2月4日提交的、題為“Fe變體及其生成方法”的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)流水號(hào)61/439，750的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及Fe變體、其生成方法、及包含F(xiàn)e變體的抗體和Fe融合物。
[0004]發(fā)明背景
[0005]IgG型的單克隆抗體含有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合臂和一個(gè)恒定域(Fe)。在它們的結(jié)合臂中具有不同特異性的抗體通常不天然存在，因此不得不借助化學(xué)工程(例如化學(xué)交聯(lián)、等)、重組DNA和/或細(xì)胞融合技術(shù)來(lái)創(chuàng)建。[0006]雙特異性抗體能同時(shí)結(jié)合兩種不同抗原。這種特性能夠開(kāi)發(fā)對(duì)于常規(guī)單克隆抗體不可能的治療策略。已經(jīng)開(kāi)發(fā)的一大組想象出來(lái)的雙特異性抗體形式反映對(duì)這些分子的強(qiáng)烈興趣。參加 Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., “Bispecific antibodiesthat mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus ofany strain, jTroc Natl Acad Sci USA (1991) 88 (11): 4723-4727及Fischer N and Leger0., “Biospecific Antibodies:Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies，”P(pán)athobiology(2007)74:3-14。
[0007]另一類(lèi)多特異性分子是重組融合蛋白。由免疫調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)的胞外域和免疫球蛋白(Ig)的恒定(Fe)域組成的重組融合蛋白代表一類(lèi)發(fā)展中的人治療劑。免疫粘附素組合具有期望特異性的蛋白質(zhì)序列的結(jié)合區(qū)與抗體的效應(yīng)域。免疫粘附素具有兩項(xiàng)對(duì)于它們作為治療劑的潛力有重大意義的重要特性:靶特異性，和藥動(dòng)學(xué)穩(wěn)定性(體內(nèi)半衰期與抗體的相當(dāng))。免疫粘附素可作為拮抗劑用于抑制或阻斷有害相互作用，或者可作為激動(dòng)劑用于模擬或增強(qiáng)生理應(yīng)答。參見(jiàn)Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al.，“A humanized, bispecificimmunoadhesin-antibody that retargets CD3+effectors to kill HlV—l—infectedcells, ”J Hematotherl995;4(5):439-446。
[0008]其它地方已經(jīng)討論了其它多特異性分子。例子包括但不限于:Fisher etal.,Pathobiology (2007) 74:3-14 (各種雙特異性形式的綜述)；2003年12月9日公告授予Feige等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.6，660, 843 (肽體(peptibody) ) ；2002年I月10日公布的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文本N0.2002-004587 (多特異性抗體)；2009年11月3日公告授予Wu等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.7612181 (雙重可變域形式)；美國(guó)專(zhuān)利N0.6，534，628 ;Nord Ket al.,Prot Eng (1995)8:601-608 ；Nord K et al.，Nat Biotech(1997) 15:772-777 ;及
Gronwall et al., Biotechnol Appl Biochem.(2008) Jun; 50 (Pt2):97-112 (Affibodies)；Martens et al., Clin Cancer Res (2006)，12:6144-6152 及 Jin et al., CancerRes (2008) 68 (I I):4360-4368 (單臂抗體);Bostrom et al.，Science (2009) 323:1610-1614(雙重作用Fab，aka混合效價(jià)抗體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它形式。
[0009]臨床級(jí)材料的制造對(duì)于一般的抗體，尤其對(duì)于上文所述多特異性分子仍然是挑戰(zhàn)。如上所述，有多種路徑生成具有混合結(jié)合臂(即彼此不同的結(jié)合臂)的分子。這些方法均具有其缺點(diǎn)。
[0010]化學(xué)交聯(lián)費(fèi)力，因?yàn)榭赡苋孕枰酝垠w和其它不想要的副產(chǎn)物純化有關(guān)種類(lèi)。另外，化學(xué)修飾步驟會(huì)改變蛋白質(zhì)的完整性，如此導(dǎo)致較差的穩(wěn)定性。如此，這種方法常常無(wú)效且會(huì)導(dǎo)致抗體活性損失。
[0011]細(xì)胞融合技術(shù)(即雜合雜交瘤)表達(dá)兩種重鏈和兩種輕鏈，它們隨機(jī)裝配導(dǎo)致產(chǎn)生10種抗體組合。期望的異多聚體抗體只是如此生成的抗體中的一小部分。期望異多聚體蛋白質(zhì)的純化顯著降低生產(chǎn)產(chǎn)量并提高制造成本。
[0012]重組DNA技術(shù)已經(jīng)用于生成不包含F(xiàn)e域的各種異多聚體形式，例如單鏈Fv、雙抗體、等。這種類(lèi)型的抗體分子的主要缺點(diǎn)是缺乏Fe域和因此抗體觸發(fā)效應(yīng)器功能(例如補(bǔ)體活化、Fe受體結(jié)合等)的能力。如此，想要包含功能性Fe域的雙特異性抗體。
[0013]重組DNA技術(shù)還已經(jīng)用于生成“節(jié)入穴”雙特異性抗體。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20030078385 (Arathoon等人-Genentech)。這種策略的一項(xiàng)約束是兩種親本抗體的輕鏈必須相同以防止錯(cuò)配和形成不想要的和/或無(wú)活性的分子(由于在同一細(xì)胞中表達(dá))。
[0014]另外，退火和純化期間的限制性事件是氧化還原效率。氧化的異二聚體通常只占這個(gè)步驟后蛋白質(zhì)的70-80% (BioAnalyzer和MS-T0F)。剩余20-30%的抗體是二聚體且缺乏共價(jià)連接(SEC-LLS)。這可以消除但顯著影響總體產(chǎn)量。如此，仍然需要改進(jìn)抗體生成，尤其是異二聚體的總體產(chǎn)量。本文中描述了可改進(jìn)抗體、異二聚體諸如此類(lèi)的總體產(chǎn)量的Fe變體以及用于生成它們的方法。本發(fā)明的這些和其它方面和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)對(duì)本文中提供的發(fā)明的描述會(huì)是明顯 的。
[0015]發(fā)明概述
[0016]使用當(dāng)前技術(shù)生成異多聚體蛋白質(zhì)(例如多特異性抗體)具有一些缺點(diǎn)，包括生成產(chǎn)物混合物、產(chǎn)量降低和效應(yīng)器功能降低/消除等等。如此，期望高效且高水平生成異多聚體蛋白質(zhì)。
[0017]通過(guò)各種手段生成抗體分子一般得到較好理解。例如，美國(guó)專(zhuān)利6331415(Cabilly等人)記載了一種用于重組生成免疫球蛋白的方法，其中同時(shí)自單一載體或自?xún)蓚€(gè)分開(kāi)的載體(在單一細(xì)胞中)表達(dá)重和輕鏈。Wibbenmeyer等人(1999，Biochim BiophysActal430 (2): 191-202)及 Lee 和 KwakC2003, J.BiotechnologylOl: 189-198)記載了自使用在分開(kāi)的大腸桿菌培養(yǎng)物中表達(dá)的質(zhì)粒分開(kāi)生成的重和輕鏈生成單克隆抗體。與抗體生成有關(guān)的各種其它技術(shù)記載于例如 Harlow, et al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)及 W02006028936。這些均仍存在缺點(diǎn)，諸如低產(chǎn)量、使用化學(xué)品、等。
[0018]本文中公開(kāi)了在為改進(jìn)異多聚體蛋白質(zhì)生成中的總體產(chǎn)量提供基礎(chǔ)的氨基酸殘基處包含至少兩處突變的Fe變體。
[0019]本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單且有效的生產(chǎn)工藝/方法，其容許經(jīng)濟(jì)地生成包含變體Fe多肽的異多聚體蛋白質(zhì)(例如多特異性抗體)。
[0020]在第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了變體異多聚體蛋白質(zhì)，其包含野生型Fe多肽的Fe變體。在各種實(shí)施方案中，F(xiàn)e變體在所述野生型Fe多肽的Fe區(qū)中包含至少一處、兩處、三處、四處、五處、六處、七處、八處、九處或十處氨基酸修飾，導(dǎo)致與野生型Fe多肽相比展現(xiàn)降低的錯(cuò)配(例如節(jié)/節(jié)配對(duì))、降低的頭-尾形成或升高的總體產(chǎn)量的變體蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的是Fe變體包含兩處、三處或四處能夠破壞同二聚體形成的氨基酸修飾，如本文中描述的。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e變體包含至少一條重鏈上殘基241和243處用與野生型Fe多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸進(jìn)行的替代。在一些實(shí)施方案中，至少一條重鏈上的突變選自F241R/F243S和F241R/F243S。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e變體進(jìn)一步包含節(jié)-入-穴修飾(knob-1nto-hole modification) ?
[0021]在第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種分離的核酸，其編碼本文中描述的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體。
[0022]在第三個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種表達(dá)載體，其編碼本文中描述的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體 。
[0023]在第四個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種宿主細(xì)胞，其包含本文中描述的核酸分子或包含該核酸分子的表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，生成本文所述變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體的方法包括:
[0025](a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并
[0026](b)自細(xì)胞培養(yǎng)物回收變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體。
[0027]在一些實(shí)施方案中，所述回收包含裂解細(xì)胞。
[0028]在一些實(shí)施方案中，制備異多聚體蛋白質(zhì)(包括包含具有第一異二聚化域的含第一 Fe多肽和具有第二異二聚化域的第二含F(xiàn)e多肽的異多聚體蛋白質(zhì))的方法，其中第二異二聚化域與第一異二聚化域相互作用，且其中第一和第二含F(xiàn)e多肽通過(guò)至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接，該方法包括下述步驟:
[0029](a)提供純化的具有第一異二聚化域的第一含F(xiàn)e多肽；
[0030](b)提供純化的具有第二異二聚化域的第二含F(xiàn)e多肽；
[0031](c)組合第一和第二含F(xiàn)e多肽；
[0032](d)將第一含鉸鏈多肽與第二含鉸鏈多肽重折疊；并
[0033](e)回收所述異多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0034]在一些實(shí)施方案中，第一和第二含F(xiàn)e多肽進(jìn)一步包含便于含F(xiàn)e多肽相對(duì)于彼此正確取向的突變。在一些實(shí)施方案中，突變包含至少一條重鏈上殘基241和243處用與野生型Fe多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸進(jìn)行的替代。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過(guò)本文所述方法生成的異多聚體蛋白質(zhì)。
[0036]要理解，本發(fā)明的方法可包括其它步驟，它們一般是對(duì)于啟動(dòng)和/或完成本文所述發(fā)明的方法涵蓋的過(guò)程而言明顯的例行步驟。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的步驟(a)之前有這樣的步驟，其中將編碼Fe變體多肽的核酸導(dǎo)入第一宿主細(xì)胞，并將編碼第二含鉸鏈多肽的核酸導(dǎo)入第二宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法進(jìn)一步包含純化對(duì)至少兩種不同靶物具有結(jié)合特異性的異多聚體蛋白質(zhì)的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，在純化異多聚體蛋白質(zhì)的步驟之前不超過(guò)約10%、15%、20%或30%的分離的多肽以單體和/或重-輕鏈二聚體存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，單體可以少于約30%的不想要的多肽污染物，該污染物需要在純化異多聚體蛋白質(zhì)之前除去。[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二含F(xiàn)e多肽是抗體重鏈。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體重鏈與抗體輕鏈配對(duì)以提供重-輕鏈對(duì)。在一些實(shí)施方案中，重-輕鏈對(duì)共價(jià)連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重-輕鏈對(duì)定義靶物結(jié)合臂。在一些實(shí)施方案中，靶物結(jié)合臂是相同的。在一些實(shí)施方案中，靶物結(jié)合臂各識(shí)別兩種不同靶物。
[0038]在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二含F(xiàn)e多肽包含可變重鏈域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二含F(xiàn)e多肽包含受體結(jié)合域。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二含F(xiàn)e多肽是基本上相同的(即異二聚化域可以是不同的，而異二聚化域以外的區(qū)域是相同的)。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二含F(xiàn)e多肽是不同的。
[0039]在一些實(shí)施方案中，異多聚體蛋白質(zhì)選自下組:抗體，雙特異性抗體，多特異性抗體，單臂抗體，單特異性單價(jià)抗體，多特異性單價(jià)抗體，雙特異性聚體(maxibody)，免疫粘附素，肽體(peptibody),雙特異性肽體,單價(jià)肽體,親合體(affibody)和受體融合蛋白。 [0040]在一些實(shí)施方案中，所述異多聚體蛋白質(zhì)包含具有至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、或任何整數(shù)直至所有在正常情況下能夠形成重鏈間二硫化物連接的半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。在一些實(shí)施方案中，將別的半胱氨酸引入鉸鏈區(qū)中。
[0041]本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)也可以是抗體片段，諸如例如Fe或Fe融合多肽，只要它包含免疫球蛋白的Fe區(qū)。Fe融合多肽一般包含融合至異源多肽序列(諸如抗原結(jié)合域)的Fe多肽(或其片段)，諸如融合至免疫球蛋白Fe多肽的受體胞外域(ECD)(例如融合至IgG2Fc的Flt受體E⑶)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e融合多肽包含VEGF結(jié)合域，其可以是VEGF受體，其包括fit、flk、等。本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)一般包含重鏈恒定域和輕鏈恒定域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)包含修飾(例如但不限于插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如為了形成二聚化序列諸如亮氨酸拉鏈)，用于形成重鏈間二聚化或多聚化。在這些實(shí)施方案的一些中，異多聚體蛋白質(zhì)包含二聚化域(諸如亮氨酸拉鏈序列)，例如融合至重鏈片段的C端。在這些實(shí)施方案的一些中，異多聚體蛋白質(zhì)包含二聚化域，其包含突變以提供“節(jié)入穴”二聚化域(如下文進(jìn)一步定義的)。
[0042]在本發(fā)明的方法和異多聚體蛋白質(zhì)的一些實(shí)施方案中，含F(xiàn)e多肽包含至少一項(xiàng)特征，其促進(jìn)含F(xiàn)e多肽相對(duì)于彼此正確取向，同時(shí)改進(jìn)第一和第二含F(xiàn)e多肽的總體產(chǎn)量。此類(lèi)特征改進(jìn)通過(guò)本文中描述的發(fā)明的方法可獲得的異多聚體蛋白質(zhì)群體的產(chǎn)量和/或純度和/或同質(zhì)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一含F(xiàn)e多肽和第二含F(xiàn)e多肽的Fe多肽在界面處相遇/相互作用。在其中第一和第二含F(xiàn)e多肽的Fe多肽在界面處相遇的一些實(shí)施方案中，第二 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第一 Fe多肽的界面中的空腔中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼空腔，或者第二 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼隆起，或二者兼之。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼空腔且第二 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼隆起，或二者兼之。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第一 Fe多肽的界面中的，其中空腔或隆起或二者已經(jīng)分別引入第一和第二 Fe多肽的界面中。在其中第一和第二Fe多肽在界面處相遇的一些實(shí)施方案中，第一 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第二 Fe多肽的界面中的空腔中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼空腔，或者第一 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼隆起，或二者兼之。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼空腔且第一 Fe多肽已經(jīng)自模板/初始多肽改變以編碼隆起，或二者兼之。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第二 Fe多肽的界面中的空腔中，其中隆起或空腔或二者已經(jīng)分別引入第一和第二 Fe多肽的界面中。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，隆起和空腔各自包含天然存在氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含隆起的Fe多肽如下生成，即將來(lái)自模板/初始多肽的界面的初始?xì)埢镁哂斜瘸跏細(xì)埢蟮膫?cè)鏈體積的輸入殘基替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含隆起的Fe多肽通過(guò)如下方法生成，其包括其中將編碼來(lái)自所述多肽的界面的初始?xì)埢暮怂嵊镁幋a具有比初始更大的側(cè)鏈體積的輸入殘基的核酸替換的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，初始?xì)埢鶠樘K氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為精氨酸(R)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為酪氨酸(Y)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為色氨酸(W)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為R、F、Y或W。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)替換模板/初始多肽中的兩個(gè)或更多個(gè)殘基來(lái)生成隆起。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含隆起的Fe多肽包含將第366位蘇氨酸用色氨酸替換，氨基酸編號(hào)方式依照Kabat et al.(pp.688_696in Sequences ofproteins of immunological interest, 5th ed.，Vol.1(1991;NIH, Bethesda, MD))的EU編號(hào)方案。
[0044]在一些實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽如下生成，即將模板/初始多肽的界面中的初始?xì)埢镁哂斜瘸跏細(xì)埢〉膫?cè)鏈體積的輸入殘基替換。例如，包含空腔的Fe多肽可以通過(guò)如下方法生成，其包括其中將編碼來(lái)自所述多肽的界面的初始?xì)埢暮怂嵊镁幋a具有比初始更小的側(cè)鏈體積的輸入殘基的核酸替換的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，初始?xì)埢鶠樘K氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，初始?xì)埢鶠榱涟彼?。在一個(gè)實(shí)施方案中，初始?xì)埢鶠槔野彼帷Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中 ，輸入殘基不是半胱氨酸(C)。在一個(gè)實(shí)施方案中,輸入殘基為丙氨酸(A)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為絲氨酸(S)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為蘇氨酸(T)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基為纈氨酸(V)?？梢酝ㄟ^(guò)替換模板/初始多肽的一個(gè)或多個(gè)初始?xì)埢鶃?lái)生成空腔。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含替換兩個(gè)或更多個(gè)選自下組的初始氨基酸:蘇氨酸，亮氨酸和酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)選自下組的輸入殘基:丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和纈氨酸。在一些實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含替換兩個(gè)或更多個(gè)選自下組的初始氨基酸:蘇氨酸，亮氨酸和酪氨酸，且其中所述初始氨基酸用選自下組的輸入殘基替換:丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含將第366位蘇氨酸用絲氨酸替換，氨基酸編號(hào)方式依照Kabat等人，見(jiàn)上文的EU編號(hào)方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含將第368位亮氨酸用丙氨酸替換，氨基酸編號(hào)方式依照Kabat等人，見(jiàn)上文的EU編號(hào)方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含將第407位酪氨酸用纈氨酸替換，氨基酸編號(hào)方式依照Kabat等人，見(jiàn)上文的EU編號(hào)方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含空腔的Fe多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)選自下組的氨基酸替換:T366S，L368A和Y407V，氨基酸編號(hào)方式依照Kabat等人，見(jiàn)上文的EU編號(hào)方案。在這些抗體片段的一些實(shí)施方案中，包含隆起的Fe多肽包含將第366位蘇氨酸用色氨酸替換，氨基酸編號(hào)方式依照Kabat等人，見(jiàn)上文的EU編號(hào)方案。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fe多肽和/或第二 Fe多肽的界面已經(jīng)突變以包含至少一條重鏈上殘基241和243處用與野生型Fe多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸進(jìn)行的替代。在一些實(shí)施方案中，至少Fe多肽(例如一條重鏈)上的突變選自F241R/F243S和F241R/F243S。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e變體進(jìn)一步包含節(jié)-入-穴修飾。
[0046]在各種實(shí)施方案中，第一和第二重鏈多肽的Fe多肽可以相同或不同，前提是它們能夠二聚化以形成Fe區(qū)(如本文中定義的)。第一 Fe多肽一般連續(xù)連接至單一多肽中的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白重鏈域，例如具有鉸鏈、恒定和/或可變域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fe多肽包含鉸鏈序列的至少一部分(包括整個(gè))、Ch2域的至少一部分(包括整個(gè))和/或Ch3域的至少一部分(包括整個(gè))。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fe多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列和Ch2和Ch3域。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 Fe多肽包含鉸鏈序列的至少一部分(包括整個(gè))、Ch2域的至少一部分(包括整個(gè))和/或G3域的至少一部分(包括整個(gè))。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 Fe多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列和Ch2和Ch3域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含第一和第二 Fe多肽，它們各自包含至少一個(gè)抗體恒定域的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體恒定域是Ch2和/或Ch3域。在本發(fā)明抗體包含恒定域的任何實(shí)施方案中，抗體恒定域可以來(lái)自任何免疫球蛋白類(lèi)別，例如IgG。免疫球蛋白來(lái)源可以是任何合適物種來(lái)源(例如IgG可以是人IgG1)或合成形式。
[0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，分別在本發(fā)明抗體的第一和第二靶物分子結(jié)合臂中的第一輕鏈多肽和第二輕鏈多肽包含不同/獨(dú)特抗原結(jié)合決定簇(例如不同/獨(dú)特可變域序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分別在本發(fā)明抗體的第一和第二靶物分子結(jié)合臂中的第一輕鏈多肽和第二輕鏈多肽包含相同(即共同)抗原結(jié)合決定簇(例如相同可變域序列)。
[0048]本發(fā)明的方法能夠以高同質(zhì)性生成異多聚體分子。因而，本發(fā)明提供了方法，其中至少約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的多肽在包含第一重和輕鏈多肽對(duì)和第二重和輕鏈多肽對(duì)的復(fù)合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，其中介于約60和99%、70和98%、75和97%、80和96%、85和96%、或90和95%之間的多肽在包含第一重和輕鏈多肽對(duì)和第二重和輕鏈多肽對(duì)的復(fù)合物中。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體選自下組:IgG，IgE，IgA，IgM和IgD。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的鉸鏈區(qū)優(yōu)選為選自下組的免疫球蛋白的:IgG，IgA和IgD。例如，在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體鉸鏈區(qū)是IgG的，其在一些實(shí)施方案中是IgGl或IgG2 (例如IgG2a或IgG2b)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體選自下組:IgG，IgA和IgD。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是人、人源化、嵌合或非人(例如鼠)起源的。
[0050]本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)一般能夠結(jié)合(優(yōu)選特異性地)抗原。此類(lèi)抗原包括例如腫瘤抗原、細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子、與(例如知道或懷疑在功能上有助于)組織發(fā)育或分化的相關(guān)的分子、細(xì)胞表面分子、淋巴因子、細(xì)胞因子、涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的分子、涉及脈管發(fā)生(vasculogenesis)的分子和與(例如知道或懷疑在功能上有助于)血管發(fā)生(angiogenesis)相關(guān)的分子。本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)能夠結(jié)合的抗原可以是上述范疇之一的子集的成員，其中所述范疇的其它子集包含具有不同特征(就感興趣抗原而言)的其它分子/抗原。也可以認(rèn)為感興趣抗原屬于兩個(gè)或更多個(gè)范疇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合(優(yōu)選特異性地)并非細(xì)胞表面分子的腫瘤抗原的異多聚體蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原是細(xì)胞表面分子，諸如受體多肽。在另一個(gè)例子中，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合(優(yōu)選特異性地)并非簇分化因子的腫瘤抗原。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)能夠結(jié)合(優(yōu)選特異性地)促分化因子，其在一些實(shí)施方案中不是例如CD3或CD4。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是抗VEGF抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是選自下組的雙特異性抗體:IL-1 a/IL-1β，IL-12/IL-18;IL-13/IL_9;IL-13/IL_4 ;IL-13/IL_5 ;IL-5/IL_4 ;IL_13/IL-1β ；IL-13/IL-25 ;IL_13/TARC ;IL_13/MDC ;IL_13/MEF ；IL-13/TGF-^ ;IL_13/LHR 激動(dòng)劑；IL-12/TWEAK, IL-13/CL25 ;IL_13/SPRR2a ;IL_13/SPRR2b ；IL-13/ADAM8, IL-13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20 ;CD138/CD40 ;CD19/CD20 ；CD20/CD3 ；CD38/CD 138 ；CD38/CD20 ;CD38/CD40 ;CD40/CD20 ;CD-8/IL_6 ;CD20/BR3，TNF a /TGF- β , TNF a /IL-1 β ；TNFa /IL-2，TNF a /IL-3，TNF a /IL-4，TNF a /IL-5，TNF a /IL6,TNF a /IL8,TNF a /IL-9, TNF a /IL-10,TNF a /IL-ll,TNFa /IL-12, TNF a /IL-13, TNFa /IL-14, TNFa /IL-15,TNF a /IL-16, TNF a /IL-17，TNF a /IL-18，TNF a /IL-19，TNF a /IL-20，TNF a /IL-23，TNF a /IFN a , TNF a /CD4，TNF a /VEGF, TNF a /MIF, TNF a /ICAM-1, TNF a /PGE4, TNF a /PEG2, TNF a /RANK 配體，TNF a /Te38 ；TNF a /BAFF ；TNF a /CD22 ；TNF a /CTLA-4 ；TNF a /GPI30 ；TNFa /IL-12p40 ；VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, HER2/DR5, VEGF/IL-8，VEGF/MET, VEGFR/MET 受體，VEGFR/EGFR,HER2/CD64，HER2/CD3，HER2/CD16，HER2/HER3 ；EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R， TNFR1/IL-18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28,EGFR/CD64， CSPGs/RGM A ;CTLA_4/BTN02 ；IGF1/IGF2 ；IGFl/2/Erb2B ；MAG/RGM A ；NgR/RGMA；NogoA/RGM A；OMGp/RGM A;PDL-1/CTLA_4 ；和 RGMA/RGM B, ILlβ /IL18, NRP1/VEGFA,VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEGFA/ a 5 β 1，HER1/HER3-BU，和 CMV。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合至少兩種選自下組的靶物分子:α 5β 1，ALKl, ΒΜΡ9,IL-1 a，IL-1 β，TARC, MDC, MEF, TGF- β，LHR 激動(dòng)劑，TWEAK, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM8,PED2, CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD-8, BR3, TNFa，TGF-β ， IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-8， IL-9， IL-10， IL-11， IL-12， IL-13, IL-14，IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-23, IL-25, IFNa ， MIF,ICAM-1，PGE4，PEG2, RANK 配體，Te38, BAFF, CTLA-4, GP130, IL_12p40，VEGF, VEGF-A, PDGF,HERl，HER2, HER3, HER3-BU，HER4, VEGF-C, VEGF-D, DR5, cMET, MET, MET 受體，VEGFR, EGFR,CD40L，TNFRl，IL-1R，IL-6R，IL-18R，EpCAM，MAPG，CSPGs，BTN02，IGFl，IGF2,IGF1/2,Erb2B,MAG, NgR, NogoA, NRP1, NRP2, OMGp, PDL-1, RGM A 和 RGM B0 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合 CD3 和至少一種選自 BLRl、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180 (RP105)、CR2、FcRHl、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-D0B、和 NAG14 的別的靶物分子。
[0051]本發(fā)明的方法中的第一和第二宿主細(xì)胞可以以任何允許表達(dá)和分離感興趣多肽的設(shè)置來(lái)培養(yǎng)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中的第一宿主細(xì)胞和第二宿主細(xì)胞作為分開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中的第一宿主細(xì)胞和第二宿主細(xì)胞作為包含這兩種宿主細(xì)胞的混合培養(yǎng)物來(lái)培養(yǎng)。
[0052]異多聚體蛋白質(zhì)可以進(jìn)行修飾以增強(qiáng)和/或添加別的期望特征。此類(lèi)特征包括生物學(xué)功能諸如免疫效應(yīng)器功能、期望的體內(nèi)半衰期/清除、生物利用度、生物分布或其它藥動(dòng)學(xué)特征。此類(lèi)修飾是本領(lǐng)域公知的且也可以憑經(jīng)驗(yàn)確定，而且可以包括通過(guò)可以基于或不基于肽的模塊進(jìn)行的修飾。例如，抗體可以是糖基化的或無(wú)糖基化的，一般至少部分取決于宿主細(xì)胞的性質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是無(wú)糖基化的。通過(guò)本發(fā)明的方法生成的無(wú)糖基化抗體可以隨后糖基化，例如通過(guò)使用本發(fā)明公知的體外糖基化方法。如上文和本文所述，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)可以在原核細(xì)胞中生成，諸如例如大腸桿菌。大腸桿菌生成的異多聚體蛋白質(zhì)一般是無(wú)糖基化且缺乏在正常情況下與在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如CHO)生成的異多聚體蛋白質(zhì)中找到的糖基化概況相關(guān)的生物學(xué)功能。
[0053]本發(fā)明還提供了免疫綴合物，其包含與異源模塊綴合的本發(fā)明異多聚體蛋白質(zhì)。任何異源模塊會(huì)是合適的，只要它與抗體的綴合沒(méi)有實(shí)質(zhì)性降低期望的抗體功能和/或特征。例如，在一些實(shí)施方案中，免疫綴合物包含的異源模塊是細(xì)胞毒劑。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒劑選自下組:放射性同位素，化療劑和毒素。在一些實(shí)施方案中，所述毒素選自下組:加利車(chē)霉素(calichemicin),美登素(maytansine)和單端孢菌素(trichothene)。在一些實(shí)施方案中，免疫綴合物包含的異源模塊是可檢測(cè)標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)標(biāo)志物選自下組:放射性同位素，配體-受體對(duì)的成員，酶-底物對(duì)的成員和熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)的成員。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含本發(fā)明異多聚體蛋白質(zhì)和載體，載體在一些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。[0055]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含本文所述免疫綴合物和載體，載體在一些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含一群本發(fā)明多特異性異多聚體蛋白質(zhì)。正如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是明顯的，一般此類(lèi)組合物不會(huì)是完全(即100%)均質(zhì)。然而，如本文中描述的，本發(fā)明的方法能夠生成基本上同質(zhì)的一群多特異性異多聚體蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明提供了包含異多聚體蛋白質(zhì)的組合物，其中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的所述異多聚體蛋白質(zhì)是本文所述發(fā)明的多特異性抗體(例如雙特異性抗體、等)。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制品，其包括容器和其中裝的組合物，其中該組合物包含本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制品，其包括容器和其中裝的組合物，其中該組合物包含本文所述免疫綴合物。在一些實(shí)施方案中，這些制品進(jìn)一步包含使用所述組合物的用法說(shuō)明書(shū)。
[0058]在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多核苷酸，其編碼本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多核苷酸，其編碼本文所述免疫綴合物。在一些實(shí)施方案中，核酸(即多核苷酸)是分離的。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組載體，其用于表達(dá)本發(fā)明的分子(例如抗體)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組載體，其用于表達(dá)本發(fā)明的免疫綴合物。
[0060]本發(fā)明的方法中可以使用多種宿主細(xì)胞任一。此類(lèi)細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的(本文中描述了其中一些)，或者可以關(guān)于使用本領(lǐng)域已知的例行技術(shù)在本發(fā)明的方法中使用的合適性憑經(jīng)驗(yàn)確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核的。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌是脂蛋白缺陷(Λ?ρρ)菌株的。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌宿主細(xì)胞的基因型缺乏degP和prc基因且包含突變型spr基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸或重組載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其在一些實(shí)施方案中是大腸桿菌。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步包含編碼如下分子的多核苷酸或重組載體，該分子在宿主細(xì)胞中的表達(dá)提高異多聚體蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。例如，此類(lèi)分子可以是伴侶蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子是選自下組的原核多肽:DsbA，DsbC, DsbG和FkpA。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸或重組載體編碼DsbA和DsbC 二者。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌宿主細(xì)胞是內(nèi)源蛋白酶活性缺陷的菌株的。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌宿主細(xì)胞的基因型為缺乏degP和prc基因且包含突變型spr基因的大腸桿菌菌株的。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌宿主細(xì)胞的基因型為Λ?ρρ。
[0062]本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)在多種設(shè)置中找到多種用途。在一個(gè)例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是治療性抗體。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是激動(dòng)性抗體。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是拮抗性抗體。本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)也可以是診斷性抗體。在還有另一個(gè)例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是阻斷性抗體。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)是中和性抗體。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中治療或延遲疾病的方法，所述方法包括將本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)施用于所述受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病是癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疾病與血管發(fā)生失調(diào)相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疾病是免疫病癥，諸如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、等。[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病(諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥、免疫(諸如自身免疫)病癥和/或血管發(fā)生相關(guān)病癥)的藥物中的用途。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病(諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥、免疫(諸如自身免疫)病癥和/或血管發(fā)生相關(guān)病癥)的藥物中的用途。
[0066]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達(dá)載體在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病(諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥、免疫(諸如自身免疫)病癥和/或血管發(fā)生相關(guān)病癥)的藥物中的用途。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病(諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥、免疫(諸如自身免疫)病癥和/或血管發(fā)生相關(guān)病癥)的藥物中的用途。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病(諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥、免疫(諸如自身免疫)病癥和/或血管發(fā)生相關(guān)病癥)的藥物中的用途。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的試劑盒在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病(諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥、免疫(諸如自身免疫)病癥和/或血管發(fā)生相關(guān)病癥)的藥物中的用途。
[0070]根據(jù)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)會(huì)變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例雖然指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是僅僅作為例示給出，因?yàn)楦鶕?jù)此詳細(xì)描述，本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)變得明顯。[0071]附圖簡(jiǎn)述
[0072]圖1A圖示完全氧化的半抗體。未顯示“節(jié)”或“穴”或其它異二聚化域。此圖中描繪的半抗體是IgGl同種型。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，其它免疫球蛋白同種型可作為具有對(duì)應(yīng)鏈間鍵和鏈內(nèi)鍵的半抗體來(lái)設(shè)想。在完整抗體中，鉸鏈半胱氨酸會(huì)形成鏈間二硫鍵。
[0073]圖1B圖示全長(zhǎng)雙特異性抗體。沒(méi)有描繪鉸鏈區(qū)中的重鏈間二硫鍵。
[0074]圖2A和B圖示分別編碼節(jié)和穴半抗體的質(zhì)粒。
[0075]圖3圖示使用分開(kāi)改造和表達(dá)的半抗體生成異多聚體蛋白質(zhì)，例如雙特異性抗體。生成的BsAb通常具有兩條不同的重鏈，各自與其關(guān)聯(lián)輕鏈配對(duì)。在這種方法中，每種半抗體的每條輕鏈不必相同。
[0076]圖4A是使用分開(kāi)改造和表達(dá)的半抗體生成雙特異性抗體的流程圖。在這種方法中，使用氧化還原化學(xué)。
[0077]圖4B顯示考馬斯染色的凝膠。在還原性和非還原性條件下通過(guò)SDS-PAGE分析兩種半抗體。在非還原性條件下每種半抗體的主要級(jí)分是75kD輕鏈-重鏈對(duì)。在還原性條件(例如用DTT處理)下，每條鏈作為分開(kāi)的條帶可見(jiàn)。
[0078]圖4C顯示有和無(wú)ImM N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)處理下半抗體的ES1-TOF質(zhì)譜術(shù)結(jié)果。在用NEM處理時(shí)沒(méi)有觀察到半抗體的質(zhì)量變化，指示所有半胱氨酸被完全氧化。氧化型鉸鏈半胱氨酸在所描繪的氨基酸序列中作為環(huán)狀二硫化物呈現(xiàn)。半抗體的預(yù)期質(zhì)量為72，548道爾頓，這是通過(guò)質(zhì)譜術(shù)觀察到的，指示沒(méi)有共價(jià)加合物。
[0079]圖4D顯示抗EGFR/抗c_met雙特異性抗體生成的羧甲基(CM)層析圖、SDS-PAGE凝膠的照片和去卷積質(zhì)量。CM層析生成單峰，其隨后通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析。凝膠上的主要條帶是全長(zhǎng)(即完整)雙特異性抗體。在75kD范圍處還能看到次要條帶。隨后通過(guò)質(zhì)譜術(shù)分析主要條帶，并指示唯一可檢測(cè)到的完整抗體產(chǎn)物符合抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體的理論麗。
[0080]圖5是使用分開(kāi)改造和表達(dá)的半抗體大規(guī)模生成雙特異性抗體的流程圖。
[0081]圖6是節(jié)-入-穴Fe異二聚體的圖示。在min1-Z域肽存在下使異二聚體結(jié)晶(未顯示)。使min1-Z肽結(jié)合至Ch2-Ch3界面，并推測(cè)幫助穩(wěn)定Fe的CH2區(qū)。節(jié)和穴結(jié)構(gòu)與兩個(gè)Ch3域接觸，而且與無(wú)糖基化野生型IgG1Fc沒(méi)有顯著差異。
[0082]圖7是Fe晶體結(jié)構(gòu)分析提示的頭-尾配對(duì)的圖示。該配對(duì)可能是氧化還原無(wú)效的部分原因。Fe的頭-尾配對(duì)引起一部分抗體逃脫鉸鏈二硫化物配對(duì)。雖然是二聚體，但是它們真正身份的不確定性要求清除它們。這影響退火過(guò)程的總體產(chǎn)量/效率，而且仍然是平臺(tái)改進(jìn)的靶。
[0083]圖8A-D顯示不同F(xiàn)e變體的二聚體含量。Fe的凝膠過(guò)濾分析顯示不同的二聚化含量。節(jié)突變體展現(xiàn)與節(jié)和穴二者的野生型形式相比減少的非共價(jià)同二聚化。
[0084]圖9顯示節(jié)-節(jié)Fe之間的接觸區(qū)域。小圖A顯示疏水性接觸。節(jié)-節(jié)Fe同二聚體作為卡通畫(huà)著色，其中鏈A為淺色陰影，鏈B為深色陰影。鏈A的CH2域中的疏水性殘基 Y349、L368、K370、F405 和 Y407 與鏈 B 的 CH3 域中的殘基 F241、F243、V262、和 V264 聯(lián)合。P395和P396創(chuàng)建兩個(gè)CH2域之間的疏水性口袋。小圖B顯示親水性接觸。節(jié)-節(jié)Fe同二聚體作為卡通畫(huà)著色，其中鏈A為淺色陰影，鏈B為深色陰影。鏈A的CH2域中的殘基T350、K370、和 D399 與鏈 B 的 CH3 域中的殘基 S239、V240、R301、和 Κ334 聯(lián)合。Ν389、Υ391和Κ392形成兩個(gè)CH2域之間的相互作用。
[0085]圖10是柱形圖，顯示二硫化物形成，產(chǎn)生正確節(jié)-入-穴異二聚體的比率。當(dāng)將半抗體初始混合在一起時(shí)，在時(shí)間零看到低水平的同二聚體。隨著還原型谷胱甘肽開(kāi)始還原鉸鏈二硫化物，同二聚體開(kāi)始消失。隨著時(shí)間過(guò)程前行，谷胱甘肽開(kāi)始氧化過(guò)程，而且看到完整IgG形成的增多。
[0086]圖11是來(lái)自使用固定化配體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的一系列表面等離振子共振(SPR)譜曲線(xiàn)。使分析物在配體上通過(guò)，并監(jiān)測(cè)同二聚化。在6.25ηΜ、12.5ηΜ、25ηΜ、50ηΜ、100ηΜ和200ηΜ測(cè)試分析物濃度。配體是:(A)節(jié)野生型，(B)穴野生型，(C)節(jié)F241R/F243S，(D)節(jié)F241S/F243R，和(E)穴F241S/F243R。y軸顯示響應(yīng)單位，而x周是時(shí)間(秒)。
[0087]縮寫(xiě)
[0088]ADCC=抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性
[0089]API=抗病原體免疫粘附素
[0090]BPI=殺菌/通透性提高蛋白
[0091]Clq=補(bǔ)體因子Iq
[0092]⑶=分化簇
[0093]⑶C=補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性
[0094]CHl或ChI=重鏈第一恒定域
[0095]CH2或Ch2=重鏈第二恒定域
[0096]CH3或Ch3=重鏈第三恒定域
[0097]CH4或Ch4=重鏈第四恒定域
[0098]CL或Cl=輕鏈恒定域
[0099]CTLA=細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)分子
[0100]Fc=可結(jié)晶片段
[0101]Fe Y R=IgG的Fe部分的受體伽馬
[0102]HIV=人免疫缺陷病毒
[0103]ICAM=細(xì)胞間粘附分子
[0104]BsAb=雙特異性抗體
[0105]BsDb=雙特異性雙抗體
[0106]dsFv= 二硫化物穩(wěn)定化Fv
[0107]Fc=抗體的恒定片段
[0108]Fd=抗體的 VH+CH1
[0109]FcR=Fc 受體
[0110]Fv=抗體的可變片段
[0111]IgG=免疫球蛋白G
[0112]mAb=單克隆抗體
[0113]PBL=外周血淋巴細(xì)胞
[0114]ScDb=單鏈雙抗體[0115]scFv=單鏈 Fv
[0116](scFv)2=scFv_scFv 串聯(lián)物
[0117]Tandab=串聯(lián)雙抗體
[0118]VH或Vh=抗體的重鏈可變域
[0119]VL或Vf抗體的可變域輕鏈
[0120]發(fā)明詳述
[0121]現(xiàn)在會(huì)通過(guò)提述來(lái)詳細(xì)描述本發(fā)明，只使用下面的定義和實(shí)施例。通過(guò)述及明確收錄本文中述及的所有專(zhuān)利和出版物，包括此類(lèi)專(zhuān)利和出版物內(nèi)公開(kāi)的所有序列。
[0122]除非本文中另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同的含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York(1994)及 Hale&Marham, THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)給技術(shù)人員提供了本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般詞典。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但是描述了優(yōu)選方法和材料。數(shù)值范圍包括限定范圍的數(shù)值。除非另有說(shuō)明，核酸從左到右以5’至3’方向書(shū)寫(xiě)；氨基酸序列從左到右以氨基至羧基方向書(shū)寫(xiě)。對(duì)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語(yǔ)，特別地，實(shí)施者可見(jiàn)Sambrook et al.，1989及Ausubel FM et al.，1993。要理解，本發(fā)明不限于描述的特定方法、方案、和試劑，因?yàn)檫@些可以變化。
[0123]數(shù)值范圍包括限定范圍的數(shù)值。
[0124]除非另有說(shuō)明，核酸從左到右以5’至3’方向書(shū)寫(xiě)；氨基酸序列從左到右以氨基至羧基方向書(shū)寫(xiě)。
[0125]本文中提供的標(biāo)題不是對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗疲@可以通過(guò)述及完整說(shuō)明書(shū)而得到。因而，緊接著的下文定義的術(shù)語(yǔ)更加完整地通過(guò)述及完整說(shuō)明書(shū)來(lái)定義。
[0126]1.定義
[0127]“異多聚體”、“異多聚體復(fù)合物”、或“異多聚體蛋白質(zhì)”指至少包含第一含F(xiàn)e多肽和第二含F(xiàn)e多肽的分子，其中第二含F(xiàn)e多肽在氨基酸序列方面與第一含F(xiàn)e多肽相差至少一個(gè)氨基酸殘基。異多聚體可包含由第一和第二含F(xiàn)e多肽形成的“異二聚體”，或者可形成更高等級(jí)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其中存在除第一和第二含F(xiàn)e多肽外的多肽。異多聚體的多肽可通過(guò)非肽、共價(jià)鍵(例如二硫鍵)和/或非共價(jià)相互作用(例如氫鍵、離子鍵、范德華力、和/或疏水性相互作用)彼此相互作用。
[0128]如本文中使用的，“異多聚化域”指對(duì)生物學(xué)分子的改變或添加，從而促進(jìn)異多聚體形成及阻礙同多聚體形成。任何較之同二聚體對(duì)形成異二聚體具有強(qiáng)偏好的異二聚化域在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例示性例子包括但不限于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20030078385 (Arathoon
等人-Genentech ;描述節(jié)入穴)；W02007147901 (Kjaergaard等人- Novo Nordisk ;描述
離子相互作用);W02009089004 (Kannan等人-Amgen ;描述靜電轉(zhuǎn)向效應(yīng)(electrostaticsteering effect));美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng) 61/243, 105 (Christensen 等人-Genentech ;描述卷曲螺旋)。還可參見(jiàn)例如 Pack, P.&Plueckthun, A., Biochemistry31，1579-1584 (1992)，其描述亮氨酸拉鏈或Pack et al.,Bio/Technologyll, 1271-1277 (1993)，其描述螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序。短語(yǔ)“異多聚化域”和“異二聚化域”在本文中可互換使用。
[0129]術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中以最廣義使用，指任何包含兩條重鏈和兩條輕鏈的免疫球蛋白(Ig)分子，及其任何片段、突變體、變體或衍生物，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性(例如表位結(jié)合活性)?？贵w的例子包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，如本文中描述的?？贵w可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。
[0130]作為述及的框架，如本文中使用的，抗體會(huì)指免疫球蛋白G(IgG)的結(jié)構(gòu)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解/認(rèn)識(shí)到任何免疫球蛋白類(lèi)別的抗體均可用于本文所述創(chuàng)造性方法。為清楚起見(jiàn)，IgG分子含有一對(duì)相同的重鏈(HC)和一對(duì)相同的輕鏈(LC)。每條LC具有一個(gè)可變域(\)和一個(gè)恒定域(C)而每條HC具有一個(gè)可變(Vh)和三個(gè)恒定域(CH1、CH2、和Ch3)。ChI和(^2域通過(guò)鉸鏈區(qū)連接。這種結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域公知的。見(jiàn)圖1B。 [0131]如本文中使用的，“半抗體”指聯(lián)合的一條免疫球蛋白重鏈和一條免疫球蛋白輕鏈。圖1A中描繪了一種例示性半抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地領(lǐng)會(huì)半抗體也可具有由單個(gè)可變域組成的抗原結(jié)合域。
[0132]術(shù)語(yǔ)“大抗體(maxibody) ”指包含融合的scFv和Fe多肽的融合蛋白。見(jiàn)W02009089004的圖8a。雙特異性大抗體見(jiàn)W02009089004的圖2。
[0133]人IgG Fe區(qū)的術(shù)語(yǔ)“Ch2結(jié)構(gòu)域”通常依照EU編號(hào)系統(tǒng)自IgG的大約殘基231延伸至大約340。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特之處在于它沒(méi)有與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。而是，有兩個(gè)N-連接的分支的碳水化合物鏈介于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。推測(cè)該碳水化合物可能提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對(duì)的替代且有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton, Molec.1mmunol.22:161-206 (1985)。
[0134]術(shù)語(yǔ)“Ch3結(jié)構(gòu)域”包含F(xiàn)e區(qū)中Ch2結(jié)構(gòu)域C-端的一段殘基(即依照EU編號(hào)系統(tǒng)自IgG的大約氨基酸殘基341至大約氨基酸殘基447)。
[0135]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”一般指包含免疫球蛋白重鏈C端多肽序列的二聚體復(fù)合物，其中C端多肽序列是通過(guò)木瓜蛋白酶消化完整抗體可獲得的。Fe區(qū)可包含天然或變異Fe序列。雖然免疫球蛋白重鏈的Fe序列的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fe序列通常定義為自Fe序列大約位置Cys226處的氨基酸殘基或自大約位置Pro230至羧基端的區(qū)段。除非本文另有規(guī)定，F(xiàn)e區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號(hào)依照EU編號(hào)系統(tǒng)，也稱(chēng)作EU索引，如記載于 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。免疫球蛋白的Fe序列一般包含兩個(gè)恒定域，即Ch2域和Ch3域，且任選包含Ch4域?！癋e多肽”在本文中表示構(gòu)成Fe區(qū)的多肽之一，例如單體Fe。Fe多肽可以自任何合適的免疫球蛋白獲得，諸如IgG1^ IgG2、IgG3、或IgG4亞型,IgA, IgE, IgD或IgM。Fe區(qū)包含兩條H鏈的、通過(guò)二硫化物保持在一起的羧基端部分?？贵w的效應(yīng)器功能由Fe區(qū)中的序列決定；這個(gè)區(qū)也是在某些類(lèi)型的細(xì)胞上找到的Fe受體(FcR)識(shí)別的部分。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e多肽包含部分或整個(gè)野生型鉸鏈序列(一般在它的N端)。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列。
[0136]“功能性Fe區(qū)”擁有天然序列Fe區(qū)的“效應(yīng)器功能”。例示性的“效應(yīng)器功能”包括Clq結(jié)合；CDC ;Fc受體結(jié)合；ADCC ;吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)下調(diào)等。此類(lèi)效應(yīng)器功能一般要求Fe區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變域)聯(lián)合，而且可以使用多種測(cè)定法來(lái)評(píng)估，例如本文定義中所公開(kāi)的。
[0137]“天然序列Fe區(qū)”包含與在自然界中找到的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe區(qū)包括天然序列人IgG1Fc區(qū)(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc區(qū)；天然序列人IgG3Fc區(qū)；和天然序列人IgG4Fc區(qū)；及其天然存在變體。
[0138]“變異Fe區(qū)”包含由于至少一處氨基酸修飾(優(yōu)選一處或多處氨基酸替代)而與天然序列Fe區(qū)有所不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fe區(qū)具有與天然序列Fe區(qū)或與親本多肽的Fe區(qū)相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fe區(qū)中或在親本多肽的Fe區(qū)中具有約I處至約10處氨基酸替代，優(yōu)選約I處至約5處氨基酸替代。變異Fe區(qū)在本文中將優(yōu)選與天然序列Fe區(qū)和/或親本多肽的Fe區(qū)擁有至少約80%的同源性，且最優(yōu)選至少約90%的同源性，更優(yōu)選至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的同源性。
[0139]如本文中使用的，“Fe成分”指Fe區(qū)的鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域。
[0140]在某些實(shí)施方案中，含F(xiàn)e多肽包含IgG Fe區(qū)，優(yōu)選自野生型人IgG Fe區(qū)衍生的?！耙吧汀比薎gG Fe表示氨基酸序列天然存在于人群內(nèi)。當(dāng)然，正如Fe序列在個(gè)體間可略微變化，可以對(duì)野生型序列進(jìn)行一處或多處改變且仍然保留在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，F(xiàn)e區(qū)可含有與本發(fā)明無(wú)關(guān)的別的改變，諸如糖基化位點(diǎn)中的突變或包括非天然氨基酸。在與節(jié)(knob)、穴(hole)或節(jié)/穴聯(lián)合使用時(shí)，“野生型”意指只引入節(jié)、穴或節(jié)/穴突變但在其它方面包含人群內(nèi)天然存在序列的蛋白質(zhì)序列。
[0141]術(shù)語(yǔ)“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重或輕鏈中牽涉抗體結(jié)合抗原的域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別 為VH和VL) —般具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu),其中每個(gè)域包含4個(gè)保守的框架區(qū)(FR)和3個(gè)高變區(qū)(HVR)。(見(jiàn)例如Kindt等Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman和C0.，第91頁(yè)(2007))。單個(gè)VH或VL域可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分別使用來(lái)自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL域篩選互補(bǔ)VL或VH域的文庫(kù)來(lái)分離結(jié)合特定抗原的抗體。見(jiàn)例如，Portolano 等,J.1mmunol.150:880-887 (1993) ；Clarkson等，Nature352:624-628 (1991)。
[0142]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“Fab”指抗體的抗原結(jié)合片段。如上所述，可使用木瓜蛋白酶消化完整抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(即“Fab”片段)和一個(gè)殘余的“Fe”片段(即Fe區(qū)，見(jiàn)上文)。Fab片段由完整L鏈及H鏈的可變域(Vh)和重鏈第一恒定域(ChI)組成。
[0143]如本文中使用的，短語(yǔ)“抗原結(jié)合臂”、“靶物分子結(jié)合臂”、“靶物結(jié)合臂”及其變化形式指本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)中有能力特異性結(jié)合感興趣靶物的組成部分。一般且優(yōu)選地，抗原結(jié)合臂是免疫球蛋白多肽序列，例如免疫球蛋白輕和重鏈CDR和/或可變域序列的復(fù)合物。
[0144]“靶物”或“靶物分子”指異多聚體蛋白質(zhì)的結(jié)合臂識(shí)別的模塊。例如，如果異多聚體蛋白質(zhì)是抗體，那么靶物可以是單一分子上的或不同分子上的表位，或病原體或腫瘤細(xì)胞，這取決于上下文。類(lèi)似地，如果異多聚體蛋白質(zhì)是受體-Fe融合蛋白，那么靶物會(huì)是受體的關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，靶物由靶物結(jié)合臂的結(jié)合特異性決定，而且不同革巴物結(jié)合臂可識(shí)別不同祀物。祀物優(yōu)選以高于IuM Kd (依照Scatchard分析)的親和力結(jié)合本發(fā)明的異多聚體蛋白質(zhì)。靶物分子的例子包括但不限于血清可溶性蛋白質(zhì)和/或其受體，諸如細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子受體、粘附素、生長(zhǎng)因子和/或其受體、激素、病毒顆粒(例如RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感、丙型肝炎病毒)、微生物(例如細(xì)菌細(xì)胞蛋白質(zhì)、真菌細(xì)胞)、粘附素、CD蛋白和其受體。
[0145]“完整”或“全長(zhǎng)”抗體的一個(gè)例子是包含抗原結(jié)合臂以及Q和至少重鏈恒定域ChU Ch2、和Ch3的抗體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。
[0146]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)”指彼此連接第一和第二含F(xiàn)e多肽，例如形成共價(jià)鍵必需的步驟。此類(lèi)步驟包括還原、退火和/或氧化第一和第二含F(xiàn)e多肽的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基以形成鏈間二硫鍵。偶聯(lián)可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或使用氧化還原系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)例如 Humphreys et al.，J.1mmunol.Methods (1998) 217:1-10 及 Zhu et al., CancerLett.， (1994)86:127-134。 [0147]術(shù)語(yǔ)“多特異性抗體”以最廣義使用，具備涵蓋具有多表位特異性的抗體。此類(lèi)多特異性抗體包括但不限于包含重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(')的抗體，其中Vh'單元具有多表位特異性，具有兩個(gè)或更多個(gè)\和Vh域的抗體，其中每個(gè)Vh'單元結(jié)合不同表位，具有兩個(gè)或更多個(gè)單一可變域的抗體，其中每個(gè)單一可變域結(jié)合不同表位，全長(zhǎng)抗體，抗體片段諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙抗體、雙特異性雙抗體和三抗體,共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體片段?！岸啾砦惶禺愋浴敝柑禺愋越Y(jié)合相同或不同靶物上的兩種或更多種不同表位的能力。“單特異性”指只結(jié)合一種表位的能力。依照一個(gè)實(shí)施方案，多特異性抗體是以5 μ M至0.001ρΜ、3 μ M 至 0.0OlpM, I μ M 至 0.001ρΜ、0.5 μ M 至 0.0OlpM、或 0.1 μ M 至 0.0OlpM 的親和力結(jié)合每種表位的IgG抗體。圖1B中提供了雙特異性的一種例示性圖示。
[0148]“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F (ab，)2、和Fv片段；雙抗體(Db);串聯(lián)雙抗體(taDb)，線(xiàn)性抗體(例如美國(guó)專(zhuān)利 N0.5，641，870 ；Zapata et al., Protein Eng.8 (10): 1057-1062 (1995));單臂抗體，單可變域抗體，微型抗體(minibodies),單鏈抗體分子；和自抗體片段形成的多特異性抗體(例如包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb_CH3和(scFV)4_Fc)。
[0149]表述“單域抗體”(SdAb )或“單可變域(SVD )抗體”一般指其中單一可變域(Vh或')能賦予抗原結(jié)合的抗體。換言之，單一可變域不需要與另一可變域相互作用來(lái)識(shí)別靶抗原。單域抗體由每個(gè)抗原結(jié)合臂上的單一單體可變抗體域(Vh或')組成。單域抗體的例子包括那些自駝?lì)?美洲駝和駱駝)和軟骨魚(yú)(例如鉸口鯊)衍生的和那些通過(guò)重組方法自人和小鼠抗體衍生的(Ward et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley and Flajnik, Dev Comp Immunol(2006)30:43-56;Muyldermans et al., Trend Biochem Sci(2001)26:230-235;Holtet al., Trends Biotechnol(2003):21:484-490;W02005/035572;W003/035694;Davies andRiechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290; W000/29004; W002/051870 )。單可變域抗體可以存在于具有其它可變區(qū)或可變域的抗原結(jié)合臂(例如同或異多聚體)中，在這種情況中它不是單域抗體。
[0150]如本文所述，術(shù)語(yǔ)“節(jié)-入-穴”或“KnH”技術(shù)指通過(guò)在兩條多肽相互作用的界面處將隆起(節(jié))引入一條多肽并將空腔(穴)引入另一條多肽中，在體外或在體內(nèi)將兩條多肽配對(duì)在一起的技術(shù)。例如，已經(jīng)在抗體的Fe:Fe結(jié)合界面、CL:ChI界面或VH/\界面中引入 KnH (例如 US2007/0178552, W096/027011, W098/050431and Zhu et al.(1997) ProteinScience6:781-788)。這在制造多特異性抗體期間驅(qū)動(dòng)兩條不同重鏈配對(duì)在一起中尤其有用。例如，在它們的Fe區(qū)中具有KnH的多特異性抗體可進(jìn)一步包含連接至每個(gè)Fe區(qū)的單一可變域，或進(jìn)一步包含與相似或不同輕鏈可變域配對(duì)的不同重鏈可變域。KnH技術(shù)還可用于將兩個(gè)不同受體胞外域配對(duì)在一起或包含不同靶物識(shí)別序列的任何其它多肽序列(例如包括親和抗體(affibody)、肽體(peptibody)和其它Fe融合物) 。
[0151]“Fv”由緊密、非共價(jià)聯(lián)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊結(jié)果散發(fā)出六個(gè)高變環(huán)(H和L鏈各3個(gè)環(huán))，其貢獻(xiàn)出供抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單一可變域(或只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管常常處于比完整結(jié)合位點(diǎn)要低的親和力。
[0152]“單鏈Fv”，也縮寫(xiě)成“sFv”或“scFv”，指包含連接成單一多肽鏈的Vh和\抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽進(jìn)一步包含Vh和Vlj域之間的多肽接頭,其使得sFv能夠形成抗原結(jié)合所期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述,參見(jiàn)Pluckthun, The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlagj NewYork, pp.269-315(1994);Malmborg et al.，J.1mmunol.Methodsl83:7-13，1995。
[0153]術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指通過(guò)在Vh和\域之間用短接頭(約5-10個(gè)殘基)構(gòu)建sFv片段(見(jiàn)前一段)制備的小型抗體片段，短接頭使得實(shí)現(xiàn)V域的鏈間而非鏈內(nèi)配對(duì)，導(dǎo)致二價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙抗體是兩個(gè)“交叉”sFv片段的異二聚體，其中兩種抗體的Vh和\域存在于不同多肽鏈上。雙抗體更完整地描述于例如EP404，097 ；W093/11161 ;及 Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。
[0154]術(shù)語(yǔ)“單臂抗體”指包含下述的抗體:(I)通過(guò)肽鍵連接至包含Ch2域、Ch3域或Ch2-Ch3域的多肽的可變域和(2)第二 Ch2、Ch3或CH2_CH3域，其中可變域沒(méi)有通過(guò)肽鍵連接至包含第二 Ch2、Ch3或Ch2-Ch3域的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，單臂抗體包含3條多肽:(I)包含可變域(例如Vh)、Ch1、Ch2和Ch3的第一多肽，(2)包含可變域(例如\)和Q域的第二多肽，和(3)包含Ch2和Ch3域的第三多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單臂抗體具有部分鉸鏈區(qū)，其含有兩個(gè)半胱氨酸殘基，它們形成連接恒定重鏈的二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，單臂抗體的可變域形成抗原結(jié)合區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單臂抗體的可變域是單一可變域，其中每個(gè)單一可變域是一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單臂抗體是單可變域抗體。
[0155]本發(fā)明的抗體可以是“嵌合”抗體，其中重和/或輕鏈的一部分與自特定物種衍生的或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與自另一物種衍生的或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，以及此類(lèi)抗體的片段，前提是它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利N0.4，816，567 ;及Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括靈長(zhǎng)類(lèi)化(primatized)抗體，其包含自非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如舊世界猴、猿、等)衍生的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
[0156]非人(例如嚙齒類(lèi))抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗體的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變區(qū)，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Joneset al., Nature321:522-525 (1986) ；Riechmann et al., Nature332:323-329 (1988);Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0157]“肽體”指隨機(jī)生成肽與Fe域的融合物。參見(jiàn)2003年12月9日公告授予Feige等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.6，660，843(通過(guò)述及完整收錄)。它們包括連接至N端、C端、氨基酸側(cè)鏈、或超過(guò)一個(gè)這些位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)肽。肽體技術(shù)使之能夠設(shè)計(jì)摻有靶向一種或多種配體或受體、腫瘤歸巢肽、膜運(yùn)輸肽、等等的肽的治療劑。肽體技術(shù)已經(jīng)證明可用于設(shè)計(jì)多種此類(lèi)分子，包括線(xiàn)性的和二硫化物約束的肽、“串聯(lián)肽多聚體”(即單鏈Fe域上超過(guò)一個(gè)肽)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利N0.6，660，843 ；2003年10月16日公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.2003/0195156(對(duì)應(yīng)于2002年11月21日公布的W002/092620) ;2003年9月18日公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.2003/0176352 (對(duì)應(yīng)于 2003 年 4 月 17 日公布的 TO03/031589) ；1999 年 10 月 22 日公布的美國(guó)流水號(hào)09/422，838 (對(duì)應(yīng)于2000年5月4日公布的W000/24770) ；2003年12月11日公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.2003/0229023 ;2003年7月17日公布的W003/057134 ;2003年12月25日公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.2003/0236193(對(duì)應(yīng)于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989);2003年9月18日提交的美國(guó)流水號(hào)10/666,480 (對(duì)應(yīng)于2004年4月I日公布的W004/026329)，通過(guò)述及將每一篇完整收入本文。
[0158]“親和抗體(affibody) ”指使用通過(guò)肽鍵連接至Fe區(qū)的蛋白質(zhì),其中該蛋白質(zhì)用作支架來(lái)提供靶分子的結(jié)合表面。該蛋白質(zhì)常常是天然發(fā)生蛋白質(zhì)，諸如葡萄球菌蛋白A或IgG結(jié)合B域、或自其衍生的Z蛋白(參見(jiàn)Nilsson et al (1987), Prot Engl, 107-133及美國(guó)專(zhuān)利N0.5，143，844)或其片段或衍生物。例如，可以自對(duì)靶分子具有改變的結(jié)合親和力的Z蛋白變體創(chuàng)建親和抗體，其中通過(guò)隨機(jī)誘變突變Z蛋白的一個(gè)區(qū)段以創(chuàng)建能夠結(jié)合靶分子的變體文庫(kù)。親和抗體的例子包括美國(guó)專(zhuān)利N0.6，534，628，Nord K et al, ProtEng8:601-608(1995)及 Nord K et al, Nat Biotechl5:772-777(1997).Biotechnol ApplBiochem.2008Jun;50(Pt2):97_112。
[0159]在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”指將異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來(lái)的分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括氨基酸序列不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即與抗體的恒定區(qū)相比是“異源的”)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列與免疫球蛋白恒定域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合物。例示性的粘附素序列包括包含受體或配體中與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的那部分的連續(xù)氨基酸序列。粘附素序列還可以是與目的蛋白質(zhì)結(jié)合但不是受體或配體序列的序列(例如肽體(肽體y)中的粘附素序列)。此類(lèi)多肽序列可通過(guò)多種方法來(lái)選擇或鑒定，包括噬菌體展示技術(shù)和高通量分揀方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以自任何免疫球蛋白獲得，諸如IgGU IgG2、IgG3、或 IgG4 亞型、IgA (包括 IgAl 和 IgA2)、IgE、IgD、或 IgM。
[0160]如本文中使用的，“復(fù)合物”或“復(fù)合的”指經(jīng)由不是肽鍵的鍵和/或力(例如范德華、疏水、親水力)彼此相互作用的兩個(gè)或更多個(gè)分子的聯(lián)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合物是異多聚體。應(yīng)當(dāng)理解，如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)復(fù)合物”或“多肽復(fù)合物”包括如下的復(fù)合物，其具有綴合至蛋白質(zhì)復(fù)合物中蛋白質(zhì)的非蛋白質(zhì)實(shí)體(例如包括但不限于化學(xué)分子,諸如毒素或檢測(cè)劑)。
[0161]結(jié)合感興趣抗原的本發(fā)明異多聚體蛋白質(zhì)指以足夠親和力結(jié)合靶物使得異多聚體蛋白質(zhì)可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向蛋白質(zhì)或表達(dá)靶物的細(xì)胞或組織，且與其它蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著交叉相互作用的異多聚體蛋白質(zhì)。在此類(lèi)實(shí)施方案中，異多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合“非靶”蛋白質(zhì)的程度會(huì)小于抗體對(duì)其特定靶蛋白的結(jié)合的約10%，如通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA測(cè)定的。關(guān)于異多聚體蛋白質(zhì)對(duì)靶分子的結(jié)合，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合(特定多肽或特定多肽靶上的表位)”或“特異性結(jié)合至(特定多肽或特定多肽靶上的表位)”或“對(duì)(特定多肽或特定多肽靶上的表位)特異性的”表示結(jié)合可測(cè)量地不同于非特異性相互作用(例如，非特異性結(jié)合可以是結(jié)合牛血清清蛋白或酪蛋白)。特異性結(jié)合可以例如通過(guò)測(cè)定分子的結(jié)合，與對(duì)照分子的結(jié)合比較來(lái)測(cè)量。例如，特異性結(jié)合可以通過(guò)與類(lèi)似靶物的對(duì)照分子(例如過(guò)量的未標(biāo)記靶物)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定。在這種情況中，如果經(jīng)標(biāo)記靶物對(duì)探針的結(jié)合受到過(guò)量未標(biāo)記靶物競(jìng)爭(zhēng)性抑制，那么指示特異性結(jié)合。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合(特定多肽或特定多肽靶物上的表位)”或“特異性結(jié)合至(特定多肽或特定多肽靶物上的表位)”或“對(duì)(特定多肽或特定多肽靶物上的表位)特異性的”可以例如由對(duì)靶物具有至少約200nM、或者至少約150nM、或者至少約ΙΟΟηΜ、或者至少約60nM、或者至少約50nM、或者至少約40nM、或者至少約30nM、或者至少約20nM、或者至少約ΙΟηΜ、或者至少約8nM、或者至少約6nM、或者至少約4nM、或者至少約2nM、或者至少約InM、或更大的Kd的分子展現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指如下的結(jié)合，其中異多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合特定多肽或特定多肽上的表位且沒(méi)有實(shí)質(zhì)性結(jié)合任何其它多肽或多肽表位。[0162]“結(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說(shuō)明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來(lái)表述。例如，Kd可以是約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、InM、或更強(qiáng)。親和力可通過(guò)本領(lǐng)域知道的常用方法來(lái)測(cè)量，包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢的結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。
[0163]在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”是通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定法使用 BIAcore?-2000 或 BIAcore?-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)于 25°C使用固定化靶物(例如抗原)CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)用鹽酸N-乙基-N’ - (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉PH4.8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約0.2 μ Μ)，然后以5 μ I/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，于25°C以約25 μ I/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab (例如0.78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore? Evaluation Software version3.2)通過(guò)同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(km)和解離速率(kj。平衡解離常數(shù)“心以比率匕^/^^計(jì)算。參見(jiàn)例如Chenet al., J Mol Biol293:865-881 (1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過(guò)IO6M-1S-1,那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來(lái)測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(a stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量,在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)于25°C的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ;發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。
[0164]關(guān)于本發(fā)明異多聚體蛋白質(zhì)(諸如抗體、片段、或其衍生物)的“有生物學(xué)活性的”和“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)特征”指具有結(jié)合生物學(xué)分子的能力，除非另有說(shuō)明。
[0165]在用于描述各種異多聚體多肽時(shí)，“分離的”表示已經(jīng)與/自表達(dá)它的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物分開(kāi)和/或回收的異多聚體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾異多聚體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，將異多聚體純化至(I)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，蛋白質(zhì)重量超過(guò)95%且最優(yōu)選重量超過(guò)99%，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。然而，分離的多肽通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
[0166]本發(fā)明的異多聚體一般純化至基本上均質(zhì)。短語(yǔ)“基本上均質(zhì)的”、“基本上均質(zhì)的形式”和“基本上均質(zhì)”用于指示產(chǎn)物基本上沒(méi)有源自不想要的多肽組合(例如同多聚體)的副產(chǎn)物。
[0167]在純度方面的表述，基本上均質(zhì)表示副產(chǎn)物的量不超過(guò)10%、9%、8%、7%、6%、4%、3%、2%或1% (以重量計(jì))或少于1% (以重量計(jì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，副產(chǎn)物低于5%。
[0168]“生物學(xué)分子”指核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)分子在自然界中存在。
[0169]如本文中使用的，“連接”表示第一和第二氨基酸序列之間的直接肽鍵連接或涉及第三氨基酸序列(即與第一和第二氨基酸序列成鍵且在第一和第二氨基酸序列之間的肽)的連接。例如，與一條氨基酸序列的C末端且與另一條氨基酸序列的N末端成鍵的接頭肽。
[0170]如本文中使用的，“接頭”表示長(zhǎng)度為兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。接頭可以由中性極性或非極性氨基酸組成。接頭的長(zhǎng)度可以是例如2-100個(gè)氨基酸，諸如長(zhǎng)度為2-50氨基酸，例如長(zhǎng)度為3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50個(gè)氨基酸。接頭可以是“可切割的”，例如通過(guò)自切割、或酶促或化學(xué)切割。氨基酸序列中的切割位點(diǎn)和切割此類(lèi)位點(diǎn)的酶和化學(xué)品是本領(lǐng)域公知的，而且本文中也有描述。
[0171]如本文中使用的，“栓系(tether) ”表示連接兩個(gè)其它氨基酸序列的氨基酸接頭。如本文中描述的，栓系可連接免疫球蛋白重鏈可變域的N端與免疫球蛋白輕鏈恒定域的C端。在特定實(shí)施方案中，栓系的長(zhǎng)度為約15-50個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度為20-26個(gè)氨基酸(例如長(zhǎng)度為20、21、22、23、24、25、或26個(gè)氨基酸)。栓系可以是“可切割的”，例如通過(guò)自切割、或酶促或化學(xué)切割，使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑。
[0172]對(duì)“接頭”或“栓系”的酶促切割可涉及使用內(nèi)肽酶，諸如例如LyS-C、ASp-N、Arg-C、V8、Glu-C、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子X(jué)a、TEV (煙草蝕紋病毒半胱氨酸蛋白酶)、腸激酶、HRV C3 (人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶、以及枯草桿菌蛋白酶樣蛋白質(zhì)原轉(zhuǎn)化酶(例如弗林蛋白酶(PCI)、PC2、或PC3)或N-精氨酸二元(dibasic)轉(zhuǎn)化酶?；瘜W(xué)切割可涉及使用例如羥胺、N-氯琥珀酰亞胺、N-溴琥珀酰亞胺、或
溴化氰。
[0173]如本文中使用的，“Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)”指能在C端側(cè)被Lys-C內(nèi)肽酶切割的氨基酸序列中的賴(lài)氨酸殘基。Lys-C內(nèi)肽酶在賴(lài)氨酸殘基的C端側(cè)切割。
[0174]“離液劑”表示通過(guò)干擾穩(wěn)定化分子內(nèi)相互作用(例如氫鍵、范德華力、或疏水效應(yīng))破壞蛋白質(zhì)(例如抗體)三維結(jié)構(gòu)的水溶性物質(zhì)。例示性離液劑包括但不限于脲、胍-HC1、高氯酸鋰、組氨酸、和精氨酸。
[0175]“溫和去污劑”表示通過(guò)干擾穩(wěn)定化分子內(nèi)相互作用(例如氫鍵、范德華力、或疏水效應(yīng))破壞蛋白質(zhì)(例如抗體)三維結(jié)構(gòu)，但不會(huì)永久破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從而引起生物學(xué)活性喪失(即不使蛋白質(zhì)變性)的水溶性物質(zhì)。例示性溫和去污劑包括但不限于Tween (例如Tween_20)、Triton (例如 Triton X-100)、NP_40 (壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、和十二烷基硫酸鈉(SDS)。
[0176]抗體“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括:Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。
[0177]“抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合至某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fe受體(FcR)的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒劑殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體“武裝”(臂)細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且是此類(lèi)殺傷作用絕對(duì)要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)Fe Y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fe y R1、Fc Y RII和Fe Y RIIIο Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.1mmunol.9:457-92 (1991)第 464 頁(yè)表 3 總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專(zhuān)利N0.5，500, 362或5，821，337中所記載的?？捎糜诖祟?lèi)測(cè)定法的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:652-656(1998)中所披露的。
[0178]“Fe受體”或“FcR”描述結(jié)合抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR ( Y受體)，包括Fe Y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII亞類(lèi)的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA (“活化受體”)和Fe Y RIIB (“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中。活化受體Fe Y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(Ι--Μ)(參見(jiàn)綜述 M.Daeron, Annu.Rev.1mmunol.15:203-234 (1997))。FcR 的綜述參見(jiàn) Ravetch 和Kinet,Annu.Rev.1mmunol.9:457-492 (1991) ；Capel 等，Immunomethods4:25-34 (1994)；de Haas 等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41 (1995)。術(shù)語(yǔ) “FcR” 在本文中涵蓋其它 FcR，包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer 等，J.1mmunol.117:587 (1976)及 Kim 等，J.1mmunol.24:249 (1994))。
[0179]“人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)Fe Y RIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源例如血液分離。
[0180]“補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性”或“CDC”指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類(lèi)的)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行⑶C測(cè)定法,例如如Gazzano-Santoro et al., J.1mmunol.Methods202:163 (1996)中所記載的。 [0181]術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指抗體、抗體片段或衍生物在受試者中治療疾病或病癥的量。在腫瘤(例如癌性腫瘤)的情況中，治療有效量的抗體或抗體片段(例如多特異性抗體或抗體片段)可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小原發(fā)性腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入周?chē)鞴?；抑?即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥狀。根據(jù)抗體或抗體片段可阻止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥療法，體內(nèi)功效可以通過(guò)例如評(píng)估存活持續(xù)時(shí)間、距疾病進(jìn)展的時(shí)間(TTP)、響應(yīng)率(RR)、響應(yīng)持續(xù)時(shí)間、和/或生活質(zhì)量來(lái)測(cè)量。
[0182]“降低或抑制”指引起優(yōu)選20%或更多、更優(yōu)選50%或更多、且最優(yōu)選75%、85%、90%、95%、或更多的總體降低的能力。降低或抑制可以指所治療的病癥的癥狀、轉(zhuǎn)移的存在或大小、原發(fā)性腫瘤的大小、或血管發(fā)生性病癥中血管的大小或數(shù)目。
[0183]術(shù)語(yǔ)“癌(癥)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳動(dòng)物中典型的以不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)/增殖為特征的生理疾患。此定義中包括良性和惡性癌癥。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。此類(lèi)癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(例如腎細(xì)胞癌)、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門(mén)癌、陰莖癌、黑素瘤、及各種類(lèi)型的頭和頸癌?！霸缙诎┌Y”指非侵入性的或轉(zhuǎn)移性的，或者歸為O期、I期、或II期癌癥的癌癥。術(shù)語(yǔ)“癌前”指典型地在癌之前或發(fā)展成癌的疾患或生長(zhǎng)。“非轉(zhuǎn)移的”指良性的或保留在原發(fā)部位且尚未滲透入淋巴或血管系統(tǒng)或滲透至原發(fā)部位以外的組織的癌癥。一般而言，非轉(zhuǎn)移性癌癥指作為O期、I期、或II期癌癥和偶爾的III期癌癥的任何癌癥。
[0184]“變應(yīng)性或炎性病癥”在本文中指源自個(gè)體免疫系統(tǒng)過(guò)度激活的疾病或病癥。例示性的變應(yīng)性或炎性病癥包括但不限于哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、全身性狼瘡、全身性紅斑狼瘡、濕疹、器官移植、年齡相關(guān)黃斑變性、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、嗜曙紅細(xì)胞性食管炎、與炎癥有關(guān)的自身免疫病。
[0185]“自身免疫病”在本文中指因個(gè)體自身組織引起的和針對(duì)個(gè)體自身組織的疾病或病癥或其共分離(co-segregate)或表現(xiàn)或者由此產(chǎn)生的疾患。自身免疫性疾病或病癥的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎諸如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆(Lyme)關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎和幼發(fā)型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎(arthritis chronica progrediente),變形性關(guān)節(jié)炎,慢性原發(fā)性多關(guān)節(jié)炎，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，和強(qiáng)直性脊柱炎)，炎性過(guò)度增殖性皮膚病，銀屑病諸如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和指甲銀屑病，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎，X連鎖的高IgM綜合征，蕁麻疹諸如慢性變應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹包括慢性自身免疫性蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮壞死松解癥，硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)，硬化諸如系統(tǒng)性硬化、多發(fā)性硬化(MS)諸如脊髓-眼(spino-optical) MS、原發(fā)性進(jìn)行性MS (PPMS)和復(fù)發(fā)性消退性(relapsing remitting) MS (RRMS)、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、播散性硬化(sclerosis disseminata)和共濟(jì)失調(diào)性(ataxic)硬化,炎性腸病(IBD)(例如克羅恩氏(Crohn)病，自身免疫介導(dǎo)的胃腸病，結(jié)腸炎諸如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis, colitis ulcerosa)、微觀(microscopic)結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎，和自身免疫性炎性腸病)，壞疽性膿皮癥，結(jié)節(jié)性紅斑，原發(fā)性硬化性膽管炎，鞏膜外層炎)，呼吸窘迫綜合征包括成人型或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎， 整個(gè)或部分葡萄膜的炎癥，虹膜炎，脈絡(luò)膜炎，自身免疫性血液學(xué)病癥，類(lèi)風(fēng)濕性脊椎炎,突發(fā)性聽(tīng)覺(jué)喪失，IgE介導(dǎo)的疾病諸如過(guò)敏反應(yīng)和變應(yīng)性和特應(yīng)性鼻炎，腦炎諸如拉斯默森氏(Rasmussen)腦炎和邊緣系和/或腦干腦炎，葡萄膜炎諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和沒(méi)有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)諸如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN (膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜性或膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急進(jìn)性GN，變應(yīng)性疾患，變應(yīng)性反應(yīng)，濕疫包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕疫，哮喘諸如支氣管哮喘(asthma bronchiale, bronchialasthma)和自身免疫性哮喘，涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎性應(yīng)答的疾患，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) (systemic lupuserythematosus, systemic lupus erythematodes)諸如皮膚 SLE、亞急性皮膚紅斑狼瘡、新生兒狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括狼瘡腎炎、狼瘡腦炎、兒科狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤(pán)狀狼瘡、狼瘡脫發(fā))，幼發(fā)型(I型)糖尿病包括兒科胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)、成人期發(fā)作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答，結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納氏(Wegener)肉芽腫病，粒細(xì)胞缺乏，血管炎病包括血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏(Takayasu))動(dòng)脈炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)，微觀(microscopic)多動(dòng)脈炎，CNS血管炎，壞死性、皮膚性或超敏感性血管炎，系統(tǒng)性壞死性血管炎，和ANCA相關(guān)血管炎諸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或綜合征(CSS)),顳動(dòng)脈炎,再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，庫(kù)姆斯(Coombs)陽(yáng)性貧血,戴-布二氏(Diamond Blackfan)貧血,溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血(perniciousanemia, anemia perniciosa),阿狄森氏(Addison)病，單純紅細(xì)胞性貧血或再生障礙(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥，全血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，涉及白細(xì)胞滲出的疾病，CNS炎性病癥，多器官損傷綜合征諸如那些敗血癥、外傷或出血繼發(fā)的，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，貝切特氏(Bechet或Behcet)病,卡斯?fàn)柭?Castleman)綜合征,古德帕斯丘氏(Goodpasture )綜合征,雷諾氏(Reynaud)綜合征,斯耶格倫氏(Sjogren )綜合征,史-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征，類(lèi)天皰瘡諸如大皰性類(lèi)天皰瘡和皮膚類(lèi)天皰瘡，天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、粘膜類(lèi)天皰瘡型天皰瘡和紅斑性天皰瘡)，自身免疫性多內(nèi)分泌病，萊特氏(Reiter)病或綜合征，免疫復(fù)合物腎炎，抗體介導(dǎo)的腎炎，視神經(jīng)脊髓炎，多神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病諸如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，血小板減少癥(例如心肌梗死患者發(fā)生的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥，甲狀旁腺功能減退，自身免疫性?xún)?nèi)分泌病包括甲狀腺炎諸如自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏(Hashimoto)病、慢性甲狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎，自身免疫性甲狀腺病，特發(fā)性甲狀腺功能減退癥，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性綜合征諸如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺性?xún)?nèi)分泌病綜合征)，瘤外綜合征包括神經(jīng)學(xué)瘤外綜合征諸如蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無(wú)力綜合征或伊頓-蘭伯特(Lambert-Eaton)綜合征,僵體或僵人綜合征，腦脊髓炎諸如變應(yīng)性腦脊髓炎(變應(yīng)性encephalomyelitis, encephalomyelitis變應(yīng)性a)和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，重癥肌無(wú)力諸如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無(wú)力，小腦變性，神經(jīng)性肌強(qiáng)直，視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(0MS)，和感覺(jué)神經(jīng)病，多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病，席漢氏(Sheehan)綜合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類(lèi)狼瘡肝炎、巨細(xì)胞性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎，淋巴樣間質(zhì)性肺炎，梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)對(duì)NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barr6)綜合征，貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病),特發(fā)性IgA腎病，線(xiàn)性IgA皮膚病，原發(fā)性膽汁性肝硬化，肺硬變，自身免疫性腸病綜合征，乳糜瀉，腹部疾病，口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)，頑固性口炎性腹瀉，特發(fā)性口炎性腹瀉，冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)(盧格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠狀動(dòng)脈病，自身免疫性耳病諸如自身免疫性?xún)?nèi)耳病 (AIED)，自身免疫性聽(tīng)覺(jué)喪失，視性眼陣攣肌陣攣綜合征(0MS)，多軟骨炎諸如頑固性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎，肺泡蛋白沉著癥，淀粉樣變，鞏膜炎，非癌性淋巴細(xì)胞增多，原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如良性單克隆丙種球蛋白病和性質(zhì)未確定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS))，周?chē)窠?jīng)病，瘤外綜合征，通道病諸如癲癇、偏頭痛、心率失常、肌肉病癥、失聰、失明、周期性癱瘓和CNS的通道病，孤獨(dú)癥，炎性肌病，局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，內(nèi)分泌性眼病，葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫性肝臟病學(xué)病癥，纖維肌痛，多發(fā)性?xún)?nèi)分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)綜合征，腎上腺炎，胃萎縮，早老性癡呆，脫髓鞘病諸如自身免疫性脫髓鞘病，糖尿病腎病，德雷斯勒氏(Dressier)綜合征，斑秀，CREST綜合征(|丐質(zhì)沉著癥、雷諾氏(Raynaud)現(xiàn)象、食道運(yùn)動(dòng)功能障礙、指端硬化和毛細(xì)管擴(kuò)張)，男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性結(jié)締組織病，恰加斯氏(Chagas)病，風(fēng)濕熱，習(xí)慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形紅斑，心臟切開(kāi)術(shù)后綜合征，柯興氏(Cushing)綜合征，養(yǎng)鳥(niǎo)者肺，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，良性淋巴細(xì)胞性血管炎，阿爾波特氏(Alport)綜合征，肺泡炎諸如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎，間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風(fēng)，瘧疾，利什曼病，錐蟲(chóng)病(kypanosomiasis),血吸蟲(chóng)病，蛔蟲(chóng)病，曲霉病，Sampter氏綜合征，卡普蘭氏(Caplan)綜合征，登革，心內(nèi)膜炎，心內(nèi)膜心肌纖維化，彌漫性肺間質(zhì)纖維化，間質(zhì)性肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，囊性纖維化，眼內(nèi)炎，持久隆起性紅斑(erythema elevatum etdiutinum),胎兒成紅細(xì)胞增多癥，嗜曙紅細(xì)胞性筋膜炎(faciitis)、舒爾曼氏(Shulman)綜合征，費(fèi)爾提氏(Felty)綜合征，flariasis，睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異時(shí)性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或Fuch氏睫狀體炎，亨諾-許蘭二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿爾茨海默氏(Alzheimer)病，細(xì)小病毒感染，風(fēng)疹病毒感染，種痘后綜合征，先天性風(fēng)疹感染，愛(ài)潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)綜合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，鏈球菌后腎炎，閉塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans),甲狀腺毒癥，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細(xì)胞性多肌痛，內(nèi)分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜結(jié)膜炎，流行性角膜結(jié)膜炎，特發(fā)性腎炎綜合征，微小病變腎病，良性家族性和缺血-再灌注損傷，視網(wǎng)膜自身免疫，關(guān)節(jié)炎癥，支氣管炎，慢性阻塞性氣道疾病，硅沉著病，口瘡，口瘡性口炎，動(dòng)脈硬化性病癥，無(wú)精子發(fā)生(aspermiogenese),自身免疫性溶血,伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血癥，杜普伊特倫氏(Dupuytren)攣縮，晶體過(guò)敏性眼內(nèi)炎(endophthalmiaphacoanaphyIactica),變應(yīng)性小腸炎(enteritis變應(yīng)性a),麻風(fēng)節(jié)結(jié)性紅斑，特發(fā)性面癱，慢性疲乏綜合征，風(fēng)濕熱(febris rheumatica),哈-里二氏(Hamman-Rich)病,感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)覺(jué)喪失，陣發(fā)性血紅蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica),性腺功能減退,局限性回腸炎(ileitis區(qū)alis),白細(xì)胞減少癥,傳染性單核細(xì)胞增多癥,橫貫性(traverse)脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液水腫，腎病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica),肉芽腫性睪丸炎(orchitis granulomatosa),胰腺炎，急性多神經(jīng)根炎，壞疽性膿皮癥，奎爾萬(wàn)氏(Quervain)甲狀腺炎，獲得性脾萎縮，由于抗精蟲(chóng)抗體的不育癥，非惡性胸腺瘤，白癜風(fēng)，SCID和愛(ài)潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒相關(guān)疾病，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，寄生蟲(chóng)病諸如利什曼蟲(chóng)，中毒性休克綜合征，食物中毒，涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)的疾患，白細(xì)胞粘附缺陷，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答，涉及白細(xì)胞滲出的疾病，多器官損傷綜合征，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，變應(yīng)性神經(jīng)炎，自身免疫性多內(nèi)分泌病，卵巢炎，原發(fā)性粘液水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風(fēng)濕病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌衰竭，周?chē)窠?jīng)病，自身免疫性多腺性綜合征I型，成人期發(fā)作的特發(fā)性甲狀旁腺功能減退(A0IH)，全禿，擴(kuò)張型心肌病，獲得性大皰性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita, EBA),血色素沉著，心肌炎，腎病綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎，化膿性或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩竇炎，額竇炎，上頜竇炎或蝶竇炎，嗜曙紅細(xì)胞相關(guān)病癥諸如嗜曙紅細(xì)胞增多癥、肺嗜曙紅細(xì)胞增多性浸潤(rùn)、嗜曙紅細(xì)胞增多-肌痛綜合征、呂弗勒氏(Loffler)綜合征、慢性嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、熱帶肺嗜曙紅細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉腫、或含有嗜曙紅細(xì)胞的肉芽腫，過(guò)敏反應(yīng)，血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎病，多內(nèi)分泌自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜、鞏膜外層、慢性粘膜皮膚假絲酵母病，布魯頓氏(Bruton)綜合征，嬰兒期一過(guò)性低丙種球蛋白血癥，威斯科特-奧爾德里齊(Wiskott-Aldrich)綜合征，共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)管擴(kuò)張，與以下各項(xiàng)有關(guān)的自身免疫性病癥:膠原病、風(fēng)濕病、神經(jīng)病學(xué)疾病、 缺血再灌注紊亂、血壓應(yīng)答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障礙、毛細(xì)管擴(kuò)張(antgiectasis)、組織損傷、心血管缺血、痛覺(jué)過(guò)敏、腦缺血和伴隨血管化的疾病，變應(yīng)性超敏感性病癥，腎小球腎炎病，再灌注損傷，心肌或其它組織的再灌注損傷，具有急性炎性成分的皮膚病，急性化膿性腦膜炎或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病癥，眼和眼窩的炎性病癥，粒細(xì)胞輸血相關(guān)綜合 征，細(xì)胞因子誘發(fā)的中毒，急性重度炎癥，慢性頑固性炎癥，腎盂炎，肺硬變，糖尿病性視網(wǎng) 膜病，糖尿病性大動(dòng)脈病癥，動(dòng)脈內(nèi)增生，消化性潰瘍，心瓣炎，和子宮內(nèi)膜異位癥。
[0186]術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起對(duì)細(xì)胞的 破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、 Bi212、Ra223、P32、和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤（methotrexate)、阿霉素 (adriamycin)、長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)（vinca alkaloids)(長(zhǎng)春新堿（vincristine)、長(zhǎng)春堿 (vinblastine)、依托泊苷（etoposide))、多柔比星（doxorubicin)、美法侖（melphalan)、 絲裂霉素（mitomycin) C、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、柔紅霉素（daunorubicin)或其它嵌 入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或 動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及本文中披露的各種抗腫瘤藥、抗癌藥、和 化療劑。本文中記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細(xì)胞的破壞。
[0187]“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎?類(lèi)（alkylating agents),諸如塞替派（thiotepa)和 CYTOXAN? 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide);磺酸焼基酯類(lèi)（alkyl sulfonates),諸如白消安（busulfan)、英丙 舒凡（improsulfan)和哌泊舒凡（piposulfan);氮丙卩定類(lèi)（aziridines)，諸如苯佐替派 (匕61120(16口3)、卡波醌（031'1309110116)、美妥替派（1116加代(16口3)和烏瑞替派（1^6(16口3);乙撐亞 胺類(lèi)（ethylenimines)和甲基蜜胺類(lèi)（methylamelamines)，包括六甲蜜胺（altretamine)、 三乙撐蜜胺（tri ethyl enemelamine)、三乙撐憐酉先胺（tri ethyl enephosphoramide)、三乙撐 硫代憐酸胺（triethylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺（trimethylolomelamine)； 番蒸枝內(nèi)酯類(lèi)（acetogenins)(尤其是布拉他辛（bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone))； 6 -9—四氫大麻酌?（tetrahydrocannabinol)(屈大麻酌?（dronabinol)， MARINOL? ); 0 -拉帕醒（lapachone);拉帕醇（lapachol);秋水仙素類(lèi)（colchicines); 白樺脂酸（betulinic acid);喜樹(shù)堿（camptothecin)(包括合成類(lèi)似物托泊替康 (topotecanX HYCAMTIN? )、CPT-11 (伊立替康（irinotecan)，CAMPTOSAR?
)、乙酰喜樹(shù)堿、東莨菪亭（scopoletin)和9_氨基喜樹(shù)堿）；苔蘚抑素（biyostatin)； callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來(lái)新（adozelesin)、卡折來(lái)新（carzelesin)和比折 來(lái)新（bizelesin)合成類(lèi)似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin);鬼臼酸（podophyllinic acid);替尼泊苷（teniposide);隱藻素類(lèi)（cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素 8);多拉司他汀(dolastatin) ；duoc臂ycin (包括合成類(lèi)似物，KW-2189和CB1-TM1);艾 植塞洛素（eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海綿抑素（spongistatin);氮 芥類(lèi)(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥（chlorambucil)、萘氮芥（chlornaphazine)、 膽磷酰胺（cholophosphamide)、雌莫司汀（estramustine)、異環(huán)磷酰胺（ifosfamide)、雙 氯乙基甲胺（mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥（mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法侖（melphalan)、新氮芥（novembichin)、苯芥膽留醇（phenesterine)、潑尼莫司 ?。╬rednimustine)、曲憐胺（trofosfamide)、尿啼卩定氮芥（uracil mustard)；亞硝服 類(lèi)（nitrosoureas)，諸如卡莫司?。╟臂ustine)、氯脲菌素（chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、洛莫司?。╨omustine)、尼莫司?。╪imustine)和雷莫司汀（ranimustine);抗生素類(lèi)，諸如烯二炔類(lèi)抗生素(enediyne)(例如加利車(chē)霉素(calicheamicin)，尤其是加利車(chē)霉素 Y I (參見(jiàn)例如 Agnew，Chem.1ntl.Ed.Engl.33:183-186 (1994));蒽環(huán)類(lèi)抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類(lèi)抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線(xiàn)菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線(xiàn)菌素 C (cactinomycin)、 carabicin、洋紅霉素(c臂inomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線(xiàn)菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN?客柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔
比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcel 1mycin )、絲裂霉素類(lèi)(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酷酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potf iromycin)、呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類(lèi)，諸如甲氨噪呤(methotrexate)和5_氟尿啼卩定(5-FU);葉酸類(lèi)似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨噪呤(methotrexate)、蝶酉先三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；P票呤類(lèi)似物，諸如氟達(dá)拉濱(fIudarabine)、6-巰基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鳥(niǎo)_呤(thioguanine)；啼卩定類(lèi)似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(c臂ofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(6110(3；^313；!_116)、氟尿苷(:[101111^(1；!_116);雄激素類(lèi)，諸如卡魯睪酮(031118七61'0116)、丙酸屈他 雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類(lèi)，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(tri1stane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinic acid);醋葡醒內(nèi)酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 P定(eniIuraciI)；安口丫 P定(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate)；地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone);elfornithine ;依禾[|醋韋安(elliptiniumacetate);依托格魯(etoglucid) ；epothilone ;硝酸鎵；輕脲(hydroxyurea);香燕多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(1nidamine);美登木素生物堿類(lèi)(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(mopidamol) ;二胺硝卩丫唳(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet)；批柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1soxantrone) ；2~ 乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴餅(procarbazine) ; PSK? 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺方定錯(cuò)(spirogermanium);細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ;2，2，，2，，-三氯三乙胺；單端孢菌素類(lèi)(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、撫孢菌素(verrucarin) A、桿孢菌素(roridin)A 和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine) ( ELDISINE? ，
FILDESIN? );達(dá)卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴焼(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；塞替派(thiotepa);類(lèi)紫杉醇類(lèi)(taxoids)，例如TAXOL? 帕利他賽(pacIitaxeI) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANE?不含克列莫佛(CremophOT)、清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他賽(American Ph 臂 aceutical Partners, Schaumbergj IL)和 TAXOTERE? 多西他賽
(doxetaxel) (Rhone -Poulenc Rorerj Antony, France);苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR? )； 6_ 硫鳥(niǎo) _ 呤(thioguanine);巰基票呤(mercaptopurine);甲氨噪呤(methotrexate)；鉬類(lèi)似物，諸如順鉬(cisplatin)和卡鉬(carboplatin)；長(zhǎng)春堿(vinblastine) ( VELB AN? )；鉬(platinum)；依托泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng)春新堿(vincristine) ( ONCOVIN? );奧沙利鉬(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長(zhǎng)春瑞
濱(vinorelbine) ( NAVELBINE? );能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道
諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);類(lèi)視黃酸類(lèi)(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic
acid);卡培他濱(capecitabine) ( XELODA? );任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍
生物；以及兩種或更多上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫(xiě))和FOLFOX (奧沙利鉬(EL0XATIN?)聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫(xiě))。
[0188]該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進(jìn)癌生長(zhǎng)的激素效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實(shí)例包括抗雌激素類(lèi)和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(lèi)(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX?他莫昔芬)、EVISTA?雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON?托瑞米芬(toremifene);抗孕酮類(lèi)；雌激素受體下調(diào)劑類(lèi)(ERD);功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如LUPRON?和ELIGARD?醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類(lèi)，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE? 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN? 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR?伏羅唑(vorozole)、FEMARA? 來(lái)曲唑(Ietrozole)和'ARIMIDEX?阿那曲唑(anastrozole)。另外,化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(lèi)(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(Clodronate)(例如 B0NEF0S'? 或 0STAC? )、DIDR0CAL? 依替膦酸鈉(etidronate)、NE-58095、Z0META? 唑來(lái)膦酸 / 唑來(lái)膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX? 阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA? 帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKEL.1D? 替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL? 利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戍環(huán)核苷胞嘧唳類(lèi)似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE?疫
苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN?疫苗、LEUVECTIN?疫苗和VAJQD?.疫苗；LURTOTECAN?.拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑；ABARELIX?: rmRH ; Iapatinibditosylate (ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱(chēng)為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。 [0189]“生長(zhǎng)抑制劑”在用于本文時(shí)指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(lèi)(vincas)(例如長(zhǎng)春新堿(vincristine)和長(zhǎng)春堿(vinblastine))、紫杉燒類(lèi)(taxanes)、和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來(lái)霉素(bleomycin)。阻滯Gl的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯,例如DNA燒化劑類(lèi)諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5_ 氟尿喃唳(5-fIuorouracil)和 ara_C。更多信息可參見(jiàn)《The Molecular Basis of Cancer)),Mendelsohn 和 Israel 編，第 I 章，題為 “Cell cycle regulation, oncogenes, andantieioplastic drugs，，，Murakaini 等人，WB Saunders, Philadelphia, 1995,尤其是第13頁(yè)。紫杉燒類(lèi)(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹(shù)的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(IAXO rERE?, Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇
(TAXOL?, Bristol-Myers Squibb)的半合成類(lèi)似物。紫杉醇和多西他賽促進(jìn)由微管蛋
白二聚體裝配成微管并通過(guò)防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞中有絲分裂的抑制。
[0190]如本文中使用的，“抗癌療法”指減輕或抑制受試者中的癌癥的治療?？拱┋煼ǖ睦影?xì)胞毒性放療以及對(duì)受試者施用治療有效量的細(xì)胞毒劑、化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、癌癥疫苗、血管發(fā)生抑制劑、前體藥物、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇、免疫抑制劑、止吐劑、抗體或抗體片段、或止痛劑。
[0191]術(shù)語(yǔ)“前體藥物”在用于本申請(qǐng)時(shí)指與母藥(parent drug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降那绑w或衍生物形式藥用活性物質(zhì)。參見(jiàn)例如 Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy，，，Biochemical Society Transactions,14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)和 Stella et al., “Prodrugs:AChemical Approach to Targeted Drug Delivery，，，Directed Drug Delivery, Borchardtet al., ed., pp.247-267，Humana Press (1985)。前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚远鵁o(wú)細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。
[0192]術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一種細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱(chēng)。此類(lèi)細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長(zhǎng)激素，諸如人生長(zhǎng)激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類(lèi)，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);表皮生長(zhǎng)因子(EGF);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF);促乳素；胎盤(pán)催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β ;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-β ;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β ;胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和-1I ;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor);干擾素,諸如干擾素_ α、-β和-y ;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細(xì)胞CSF (M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF (GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF (G-CSF);白介素(IL)，諸如 IL-U IL-1 a、IL-1 β、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7、IL-8, IL-9, IL-10, IL-1UIL-12、IL-18 ;腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β ;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。
[0193]“細(xì)胞因子拮抗劑”表示部分或完全阻斷、抑制、或中和至少一種細(xì)胞因子的生物學(xué)活性的分子。例如，細(xì)胞因子拮抗劑可通過(guò)抑制細(xì)胞因子表達(dá)和/或分泌或通過(guò)結(jié)合細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體來(lái)抑制細(xì)胞因子活性。細(xì)胞因子拮抗劑包括結(jié)合細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體的抗體、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗劑。細(xì)胞因子拮抗劑任選綴合或融合至細(xì)胞毒劑。例示性TNF拮抗劑是依那西普(etanercept, ENBREL? )、英夫利昔單抗(infliximab, REMICADE ⑧)、和阿達(dá)木單抗(adalimumab, HUMI RA? )?
[0194]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫抑制劑”指起抑制或掩蓋所治療受試者的免疫系統(tǒng)作用的物質(zhì)。這包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。免疫抑制劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶類(lèi)(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利N0.4，665，077)；霉酌.酸酯(mycophenolate mofetil)諸如 CELLCE丨〕?;硫唑嘌呤(azathioprine)
(IMURAN?, AZASAN*?,/6-疏基嘿呤；漠隱亭(bromocryptine);達(dá)那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone);戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如美國(guó)專(zhuān)利N0.4，120, 649中所記載的)；MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢霉素A ;類(lèi)固醇類(lèi)，諸如皮質(zhì)類(lèi)固醇和糖皮質(zhì)類(lèi)固醇，例如潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)諸如PEDIAPRED'? (潑尼松龍磷酸鈉)或ORAPRED? (潑尼松龍磷酸鈉口服液)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、和地塞米松(dexamethasone);甲氨蝶呤(methotrexate) (口服或皮下)(RHEUMATREX?,TREXALL?);輕氯喹(hydroxycloroquine) / 氯喹(chloroquine)；柳氮石黃吡 P定(sulfasalazine);來(lái)氟米特(Ieflunomide);細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑,包括抗干擾素-Υ、-β或-α抗體,抗腫瘤壞死因子-α抗體(英夫利昔單抗(infliximab)或阿達(dá)木單抗(adalimumab)),抗TNF-α免疫粘附素(ENBREL?,依那西普(etanercept)),抗腫瘤壞死因子-β抗體，抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗⑶I Ia和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；多克隆或泛(pan)T抗體,或單克隆抗⑶3或抗⑶4/⑶4a抗體；包含LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(W090/08187);鏈激酶；TGF-β ；鏈道酶；來(lái)自宿主的RNA或DNA ；FK506 ;RS_61443 ;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin) ;T細(xì)胞受體(Cohen et al.,美國(guó)專(zhuān)利N0.5，114，721) ;T細(xì)胞受體片段(Offner et al.Science251:430-432(1991);W090/11294;Ianeway, Nature341:482(1989)
;W091/01133) ;T 細(xì)胞受體抗體(ΕΡ340，109)，諸如 Τ10Β9 ;環(huán)磷酰胺(CYTOXAN?);氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE?);血漿交換；或靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVlG)。這些可以單獨(dú)或彼此組合使用，特別是類(lèi)固醇和另一種免疫抑制劑的組合或此類(lèi)組合繼以維持劑量的非類(lèi)固醇劑以降低對(duì)類(lèi)固醇的需要。
[0195]“止痛劑”指起抑制或遏制受試者中的疼痛的作用的藥物。例示性止痛劑包括非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID),包括布洛芬(ibuprofen, MOTRIN? )、萘普生(naproxen,
NAPROSYN?)、乙酰水楊酸、卻甲新(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、和托美
汀(tolmetin)，包 括它們的鹽和衍生物，以及用于減輕可能發(fā)生的刺痛的各種其它藥療，包括抗驚厥劑(gabapentin、phenyloin、卡馬西平(carbamazepine))或三環(huán)抗抑郁劑。具體例子包括醋胺酹、阿司匹林、阿米替林(amitriptyline, ELAVIL?)、卡馬西平(carbamazepine, TEGRETOL? )、phenyltoin (DILANTIN?)、gabapentin(NEURONTIN? )、(E)-N-香草基-8-甲基-6-noneamid ( CAPSAICIN? ),或神經(jīng)阻斷劑。
[0196]“皮質(zhì)類(lèi)固醇”指具有類(lèi)固醇的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)、模擬或提升天然存在皮質(zhì)類(lèi)固醇的效果的數(shù)種合成或天然存在物質(zhì)中的任一種。合成皮質(zhì)類(lèi)固醇的例子包括潑尼松、潑尼松龍(包括甲潑尼龍)、地塞米松、曲安西龍、和倍他米松。
[0197]如本文中使用的，“癌癥疫苗”指在受試者中刺激針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的組合物。癌癥疫苗通常由癌癥相關(guān)材料或細(xì)胞(抗原)的來(lái)源(對(duì)受試者可以是自體的(來(lái)自自己)或同種異體的(來(lái)自他人))以及用于進(jìn)一步刺激和強(qiáng)化針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的其它成分(例如佐劑)組成。癌癥疫苗可導(dǎo)致刺激受試者的免疫系統(tǒng)生成針對(duì)一種或數(shù)種特定抗原的抗體，和/或生成殺傷T細(xì)胞以攻擊具有那些抗原的癌癥細(xì)胞。
[0198]如本文中使用的，“細(xì)胞毒性放療”指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的放射療法。放射療法可包括例如外線(xiàn)束輻照或使用經(jīng)過(guò)放射性標(biāo)記的藥劑(諸如抗體)的療法。該術(shù)語(yǔ)意圖包括使用放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P'和Lu的放射性同位素)。
[0199]“受試者”指脊椎動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物，例如人。哺乳動(dòng)物包括但不限于家畜(諸如牛)、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物、寵物(諸如貓、犬和馬)、靈長(zhǎng)類(lèi)、小鼠、和大鼠。[0200]除非上下文另外指明，術(shù)語(yǔ)“第一”多肽和“第二”多肽及其變化形式僅僅是一般標(biāo)識(shí)符，不要理解為標(biāo)示本發(fā)明抗體的特定或具體多肽或成分。[0201]除非另有說(shuō)明，實(shí)施例中提到的商品化試劑依照制造商的用法說(shuō)明書(shū)來(lái)使用。下面的實(shí)施例中及貫穿說(shuō)明書(shū)以ATCC登錄號(hào)標(biāo)示的那些細(xì)胞的來(lái)源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA)0 除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，諸如上文及下面的教科書(shū)中描述的那些:Sambrook et al., supra;Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NYj 1989);Inniset al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(AcademicPress, Inc., NYj 1990);Harlow et al.，Antibodies: A Laboratory Manual (Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor， 1988);Gait，Oligonucleotide Synthesis(IRL Press，Oxford,1984);Freshneyj Animal Cell Culture,1987;Coligan et al.，CurrentProtocols in Immunology, 1991。
[0202]貫穿本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，用詞“包含”或其變化形式會(huì)理解為暗示包括所述整數(shù)或整數(shù)群但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)群。
[0203]I1.異多聚體蛋白質(zhì)的構(gòu)建
[0204]典型地，本文所述異多聚體蛋白質(zhì)會(huì)包含抗體Fe區(qū)的顯著部分。
[0205]異多聚化域
[0206]異多聚體蛋白質(zhì)包含異多聚化域。為了生成基本上同質(zhì)的異二聚體分子群體，異二聚化域必須具有超過(guò)同二聚體形成異二聚體的強(qiáng)偏愛(ài)。雖然本文中例示的異多聚體蛋白質(zhì)利用節(jié)入穴技術(shù)來(lái)便于異多聚化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)可用于本發(fā)明的其它異多聚化域。
[0207]節(jié)入穴
[0208]作為生成多特異性抗體的方法，節(jié)入穴的使用是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利N0.5，731，168 (1998 年 3 月 24 日公告，轉(zhuǎn)讓給 Genentech)、PCT 公開(kāi) N0.W02009089004(2009年7月16日公布，轉(zhuǎn)讓給Amgen)、和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)N0.20090182127 (2009年7月16 日公布,轉(zhuǎn)讓給 Novo Nordisk Α/S)。還可參見(jiàn) Marvin and Zhu, Acta PharmacologicaSincia (2005) 26 (6): 649-658 及 Kontermann (2005) Acta Pharacol.Sin., 26:1-9。本文提供了簡(jiǎn)要討論。
[0209]“隆起”指至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈自第一多肽的界面凸出并因此可放置在鄰近界面(即第二多肽的界面)的補(bǔ)償空腔中，從而穩(wěn)定異多聚體，并由此例如有利于異多聚體形成，超過(guò)同多聚體形成。隆起可存在于初始界面中或可通過(guò)合成而引入(例如通過(guò)改變編碼界面的核酸)。在正確情況下，改變編碼第一多肽的界面的核酸以編碼隆起。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將編碼第一多肽的界面中的至少一個(gè)“初始”氨基酸殘基的核酸用編碼至少一個(gè)側(cè)鏈體積比初始氨基酸殘基要大的“輸入”氨基酸殘基的核酸替換。會(huì)領(lǐng)會(huì)可以有超過(guò)一個(gè)初始和對(duì)應(yīng)輸入殘基?？商鎿Q的初始?xì)埢臄?shù)目的上限是第一多肽的界面中的殘基的總數(shù)。下表顯示了各種氨基酸殘基的側(cè)鏈體積。
[0210]表2
[0211]氨基酸殘基的特性
【權(quán)利要求】
1.一種變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體，其包含野生型Fe多肽的Fe變體，所述Fe變體包含所述野生型Fe多肽的Fe區(qū)中的至少一處氨基酸修飾，其中與野生型Fe多肽相比，所述變體蛋白質(zhì)展現(xiàn)降低的錯(cuò)配、降低的頭-尾形成或升高的總體產(chǎn)量。
2.—種變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體，其包含野生型Fe多肽的Fe變體，所述Fe變體包含所述野生型Fe多肽的Fe區(qū)中的至少兩處氨基酸修飾，其中與野生型Fe多肽相比，所述變體蛋白質(zhì)展現(xiàn)降低的錯(cuò)配、降低的頭-尾形成或升高的總體產(chǎn)量。
3.權(quán)利要求1或2的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體，其進(jìn)一步包含節(jié)-入-穴修飾。
4.一種變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體，其包含野生型Fe多肽的Fe變體，其中所述Fe變體包含至少一條重鏈上的殘基241和243處用與野生型Fe多肽中存在的不同的氨基酸進(jìn)行的替代，由此引起與包含野生型Fe多肽的IgG抗體相比降低的錯(cuò)配、降低的頭-尾形成或升高的總體產(chǎn)量。
5.權(quán)利要求4的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體，其包含至少一條重鏈上選自 F241R/F243S 和 F241R/F243S 的突變。
6.權(quán)利要求4或5的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體,其進(jìn)一步包含節(jié)-入-穴修飾。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體,其中該蛋白質(zhì)或抗體是多特異性抗體。
8.一種分離的核酸，其編碼前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體。
9.一種表達(dá)載體，其編碼權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體。
10.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8的核酸分子或包含該核酸分子的表達(dá)載體。
11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其生成前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體。
12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其為CHO細(xì)胞。
13.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞,其為大腸桿菌細(xì)胞。
14.一種生成前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求10的細(xì)胞并自細(xì)胞培養(yǎng)物回收變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體。
15.—種組合物，其包含前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的變體異多聚體蛋白質(zhì)或經(jīng)過(guò)修飾的IgG抗體以及載體。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK103649117SQ201280016878
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月4日
【發(fā)明者】J.M.埃利奧特, J.希爾 申請(qǐng)人:基因泰克公司