專利名稱：反相柱分離純化硫肽類抗生素諾卡沙星i的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反相柱分離純化硫肽類抗生素諾卡沙星I的方法，屬于抗生素分離純化和精制技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素和1942年瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來，抗生素為人類的健康事業(yè)做出了卓越的貢獻(xiàn)。在人們應(yīng)用抗生素治療疾病的同時，也鍛煉了細(xì)菌的耐藥能力，于是隨著抗生素的濫用以及病原性細(xì)菌的快速進(jìn)化，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了越來越多的耐藥菌株，特別是對多種抗生素都有抗性的菌株如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)，人們面對這類菌株的快速感染率往往顯得束手無策。隨著臨床上耐萬古霉素的革蘭氏陽性菌的逐漸增多，萬古霉素等糖肽類的抗生素一直以來被作為抗耐藥菌的最后防線的地位也變得岌岌可危。于是，尋求并且開發(fā)一些結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的新型抗耐藥菌的藥物已經(jīng)成為新藥研究的熱點和難點。諾卡沙星I是由諾卡氏菌屬或擬無枝酸菌發(fā)酵獲得的新型硫肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)如式I所示，諾卡沙星I獨特結(jié)構(gòu)使其能夠通過與核糖體50S大亞基的23S rRNA以及LI I蛋白形成復(fù)合物從而影響Lll蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成而達(dá)到殺菌的作用(參見:Nat Prod Rep, 1999，16(2):249 263)。其在ng/ml的水平便對絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌特別是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)、耐萬古霉素的腸球菌(VRE)以及具有耐藥性的結(jié)核桿菌有著超強(qiáng)的殺菌活性，并且有報道指出其對金黃色葡萄球菌感染的小鼠模型也展現(xiàn)出了顯著的治愈效果(參見:Antimicrob AgentsChemother, 2004, 48(10):3697 3701)。因此，在多重耐藥菌頻繁出現(xiàn)的今天，諾卡沙星I十分具有研究前景及臨床應(yīng)用價值。諾卡沙星I結(jié) 構(gòu)復(fù)雜，主要通過微生物發(fā)酵提取的方法獲得，此途徑獲得的諾卡沙星I純度低，無法滿足臨床前及臨床研究的需要，目前主要通過正相硅膠柱層析的方法對諾卡沙星I進(jìn)行純化，但這種方法純化能力有限、回收率低、工作量大、成本高(參見:專利號99898680.0的中國發(fā)明專利)。因此，為滿足研究及工業(yè)化的需要，開發(fā)一種便捷、高效、經(jīng)濟(jì)的諾卡沙星I純化方法勢在必行。
權(quán)利要求
1.一種純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，步驟如下: (1)將諾卡沙星I粗品溶解于二甲亞砜(DMSO)中； (2)將溶有諾卡沙星I粗品的DMSO溶液，利用反相硅膠柱梯度洗脫，收集僅有諾卡沙星I的組分，除去有機(jī)溶劑，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到高純度諾卡沙星I產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述諾卡沙星I的純化方法，其特征在于，步驟(I)中諾卡沙星I粗品溶解于DMSO中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述諾卡沙星I的純化方法，其特征在于，諾卡沙星I粗品溶于DMSO后其濃度為25-150mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述諾卡沙星I的純化方法，其特征在于，步驟(2)的反相硅膠柱純化步驟是將溶有樣品的DMSO溶液加入已平衡的反相色譜柱頂端，打開色譜柱閥門，待樣品液進(jìn)入色譜柱材后加入一定量的洗脫液I進(jìn)行淋洗，再換成洗脫液II繼續(xù)淋洗，分段收集洗脫液II的流出液，并用薄層色譜監(jiān)測，合并含有諾卡沙星I的組分，除去有機(jī)相，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，諾卡沙星I粗品上樣量與反相硅膠的質(zhì)量比為1:2000—1:12000。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，洗脫液I是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述純 化諾卡沙星I的方法，其特征在于，當(dāng)洗脫液I為乙腈和水混合液時，乙腈體積分?jǐn)?shù)為10-60%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，當(dāng)洗脫液I為甲醇和水混合液時，甲醇體積分?jǐn)?shù)為10-60%。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，洗脫液II是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，當(dāng)洗脫液II為乙腈和水混合液時，乙腈體積分?jǐn)?shù)為10-50%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反相柱層析純化硫肽類抗生素諾卡沙星I的方法，包括用二甲亞砜(DMSO)溶解諾卡沙星I粗品，再用反相柱層析通過梯度洗脫的方法純化諾卡沙星I，收集僅有諾卡沙星I的洗脫液，減壓蒸出有機(jī)溶劑，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，分離并蒸干萃取劑得到產(chǎn)品。本方法操作簡單，僅通過一步柱層析的方法即可得到高純度諾卡沙星I，純度達(dá)98.0%以上，產(chǎn)率高達(dá)85.0%，且在多個步驟中采用的溶劑均可回收再利用。
文檔編號C07K1/16GK103232524SQ20131016235
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者陳依軍, 朱天翼 申請人:中國藥科大學(xué)