一種合成胸腺法新的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，公開了一種合成胸腺法新的方法。本發(fā)明所述方法按照胸腺法新肽鏈C端至N端的氨基酸順序，合成1-8、9-19和20-28片段，然后再將這3個(gè)多肽片段偶聯(lián)得到胸腺法新，本發(fā)明多個(gè)片段合成同時(shí)進(jìn)行，合成周期減少了2/3，中間體易純化，成本低，最終產(chǎn)品純度高，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于胸腺法新的大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種合成胸腺法新的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成胸腺法新的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺法新(Thymosin α 1，也稱胸腺肽α I)是胸腺素主要的生物活性成分，為體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，是N端乙?；?8個(gè)氨基酸組成的多肽，其肽序如下:
[0003]Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-LyS-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH
[0004]本品治療慢性乙型肝炎和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)反應(yīng)性的作用機(jī)制雖尚未完全闡明，但多項(xiàng)體外試驗(yàn)顯示，本品通過刺激外周血液淋巴細(xì)胞絲裂原來促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟，增加抗原或絲裂原激活后T細(xì)胞分泌的干擾素α、干擾素Y以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同時(shí)增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體水平。本品還可通過對(duì)CD4細(xì)胞的激活，增強(qiáng)異體和自體的人類混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本品可能增加前NK細(xì)胞的聚集，而干擾素可使其細(xì)胞毒性增強(qiáng)。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，本品可以提高經(jīng)刀豆蛋白A激活后小鼠淋巴細(xì)胞白介素2受體的表達(dá)水平，同時(shí)提高白介素2的分泌水平。
[0005]目前胸腺法新制備工藝有基因工程法(如CN1431311)和固相合成法(如CN102199205)，其中基因工程法因工藝繁瑣、三廢多的不利因素不如固相合成法應(yīng)用普遍。專利CN102199205公開了一種多肽胸腺法新的合成方法，其采用逐個(gè)偶聯(lián)的合成方式。然而，用逐個(gè)偶聯(lián)法在制備胸腺法新的過程中，合成周期長，雜質(zhì)較多(在長肽的合成中容易產(chǎn)生缺省肽等雜質(zhì))，大部分雜質(zhì)和目的`多肽相似導(dǎo)致后續(xù)的純化難以進(jìn)行，收率和純度無法達(dá)到較高水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成胸腺法新的方法，使得本發(fā)明所述方法能夠提高其純度和合成重量收率。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]一種合成胸腺法新的方法，包括以下步驟:
[0009]步驟1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在Lys側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基且在C端偶聯(lián)有樹脂的多肽樹脂I ;
[0010]固相合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Ser側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上、Thr側(cè)鏈上、Lys側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段I ;
[0011]固相合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列N端偶聯(lián)有乙酰基、在Ser側(cè)鏈上、Thr側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段2 ；
[0012]步驟2、將多肽片段I的C段與多肽樹脂I的N端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)獲得多肽樹脂2 ；
[0013]步驟3、脫去多肽樹脂2的N端保護(hù)基并與多肽片段2的C段進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)獲得多肽樹脂3，加入裂解液去除多肽樹脂3的樹脂以及所有保護(hù)基得到胸腺法新粗品；[0014]步驟4、胸腺法新粗品微濾、RP-HPLC純化后獲得胸腺法新純品。
[0015]其中，作為優(yōu)選，步驟2和步驟3所述偶聯(lián)反應(yīng)以HOBt/DIC雙試劑偶聯(lián)體系、 PyBOP/HOBt/DIPEA三試劑偶聯(lián)體系或HBTU/HOBt/DIPEA三試劑偶聯(lián)體系進(jìn)行偶聯(lián)。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟2所述偶聯(lián)反應(yīng)以HBTU/HOBt/DIPEA三試劑偶聯(lián)體系進(jìn)行偶聯(lián)，步驟3所述偶聯(lián)反應(yīng)以PyBOP/HOBt/DIPEA三試劑偶聯(lián)體系進(jìn)行偶聯(lián)；
[0016]步驟2和步驟3所采用的偶聯(lián)體系各偶聯(lián)試劑之間的摩爾比優(yōu)選為:
[0017]PyBOP:HOBt:DIPEA 為 1:1:2, HBTU:HOBt:DIPEA % 1: 1:2，HOBt:DIC 為 1:1。
[0018]作為優(yōu)選，步驟3所述裂解液為體積比TFA:苯酚:苯甲硫醚:乙二硫醇:水為 80-85:1-5:1-5:1-5:1-5 的混合裂解液。
[0019]作為優(yōu)選，步驟2和步驟3所述偶聯(lián)反應(yīng)以DCM、NMP, DMF、DMSO中的一種或兩種以上為溶劑，其中，作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟2和步驟3均為體積比DMF:DMS0為1:1的混合溶劑。
[0020]作為優(yōu)選，步驟I所述固相合成多肽樹脂I為:
[0021]步驟Al、Fmoc-0-Asp (OtBu)-OH在偶聯(lián)體系作用下與氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到 Fmoc- 3 -Asp (OtBu)-氨基樹脂；
[0022]步驟A2、脫除Fmoc保護(hù)基得到H-@ -Asp (OtBu) _氨基樹脂，F(xiàn)moc-Glu (OtBu)-OH在偶聯(lián)體系作用下與H-0 -Asp (OtBu)-氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Glu (OtBu) - ^ -Asp (OtBu)-氨基樹脂;
[0023]步驟A3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH按照步驟A2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián), 最后脫除 N 端 Fmoc 保護(hù)基得到 H-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu)-^-Asp (OtBu)-氨基樹脂，即多肽樹脂 I ；
[0024]其中，所述Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，所述OtBu、Boc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
[0025]在固相合成多肽樹脂I的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述氨基樹脂為
0.2-1.0mmol /g 的 Rink amide 樹脂、Rink amide AM 樹脂或 Rink amide MBHA 樹脂；
[0026]在固相合成多肽樹脂I的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述偶聯(lián)體系為HOBt/DIC 雙試劑偶聯(lián)體系、PyBOP/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系、HATU/H0AT雙試劑偶聯(lián)體系或TBTU/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系，所采用的偶聯(lián)體系各偶聯(lián)試劑之間的摩爾比優(yōu)選為:
[0027]PyB0P:H0Bt 為 1: 1，TBTU:H0Bt 為 1: 1，H0Bt:DIC 為 1: 1，HATU:H0AT 為 1:1。
[0028]在固相合成多肽樹脂I的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述偶聯(lián)反應(yīng)以DCM、NMP, DMF, DMSO中的一種或兩種以上為溶劑，優(yōu)選為體積比DCM =DMF為1:1的混合溶劑。
[0029]作為優(yōu)選，步驟I所述固相合成多肽片段I為:
[0030]步驟B1、Fmoc-Lys (Boc)-0H在DIPEA作用下與2-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到 Fmoc-Lys (Boc) -CTC 樹脂；
[0031]步驟B2、脫除 Fmoc 保護(hù)基得到 H-Lys (Boc)-CTC 樹脂，F(xiàn)moc-Glu (OtBu)-OH 在偶聯(lián)體系作用下與H-Lys (Boc)-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-CTC 樹脂；
[0032]步驟B3、按照SEQ ID N0:2所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將Fmoc-Lys (Boc) -OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH> Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc_Glu (OtBu) -0H>Fmoc-Ser (tBu) -OH,按照步驟B2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián),得到Fmoc-Ser (tBu) -Glu (OtBu) -1le-Thr(tBu)-Thr (tBu) -Lys (Boc)-Asp (OtBu) -Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu) -Lys (Boc)-CTC樹脂，加入裂解液去除 2-CTC 樹脂，獲得 Fmoc-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu) -Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Leu-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Lys (Boc) -OH,即為多肽片段I;
[0033]其中，所述Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，所述OtBu、tBu、Boc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
[0034]在固相合成多肽片段I的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述偶聯(lián)體系為HOBt/DIC雙試劑偶聯(lián)體系、PyBOP/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系、HATU/H0AT雙試劑偶聯(lián)體系或TBTU/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系，所采用的偶聯(lián)體系各偶聯(lián)試劑之間的摩爾比優(yōu)選為:
[0035]PyB0P:H0Bt 為 1: 1，TBTU:H0Bt 為 1: 1，H0Bt:DIC 為 1: 1，HATU:H0AT 為 1:1。
[0036]在固相合成多肽片段I的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述偶聯(lián)反應(yīng)以DCM、NMP,DMF, DMSO中的一種或兩種以上為溶劑，優(yōu)選為體積比DCM =DMF為1:1的混合溶劑。
[0037]在固相合成多肽片段I的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述裂解液為體積比TFE: DCM為1:4的混合裂解液。
[0038]作為優(yōu)選，步驟I所述固相合成多肽片段2為:
[0039]步驟Cl、Fmoc-Ser (tBu)-OH在DIPEA作用下與2-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Ser (tBu) -CTC 樹脂；
[0040]步驟C2、脫除 Fmoc 保護(hù)基得到 H-Ser (tBu)-CTC 樹脂，F(xiàn)moc-Thr (tBu)-OH 在偶聯(lián)體系作用下與H-Ser (tBu)-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Thr (tBu)-Ser (tBu)-CTC樹脂；
[0041]步驟C3、按照SEQ ID N0:3所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將Fmoc-Asp (OtBu) -OH> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH,按照步驟C2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián),得到Fmoc-Ser (tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-CTC 樹脂，脫除 N 端 Fmoc 保護(hù)基后得到 H-Ser (tBu)-Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -CTC樹脂，然后在N端進(jìn)行乙?；磻?yīng)得到Ac-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp(OtBu )-Thr( tBu )-Ser( tBu )_CTC 樹脂，加入裂解液去除 2-CTC 樹脂，獲得 Ac-SeK tBu )_Asp(OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu)-OH,即為多妝片段 2 ;
[0042]其中，所述Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，所述OtBu、tBu為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
[0043]在固相合成多肽片段2的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述偶聯(lián)體系為HOBt/DIC雙試劑偶聯(lián)體系、PyBOP/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系、HATU/H0AT雙試劑偶聯(lián)體系或TBTU/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系，所采用的偶聯(lián)體系各偶聯(lián)試劑之間的摩爾比優(yōu)選為:
[0044]PyB0P:H0Bt 為 1: 1，TBTU:H0Bt 為 1: 1，H0Bt:DIC 為 1: 1，HATU:H0AT 為 1:1。
[0045]在固相合成多肽片段2的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述偶聯(lián)反應(yīng)以DCM、NMP,DMF, DMSO中的一種或兩種以上為溶劑，優(yōu)選為體積比DCM =DMF為1:1的混合溶劑。
[0046]在固相合成多肽片段2的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述裂解液為體積比TFE: DCM為1:4的混合裂解液。[0047]在固相合成多肽片段2的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述乙?；磻?yīng)通過乙酸酐在堿性條件下和N端氨基進(jìn)行乙?；磻?yīng)。
[0048]在本發(fā)明技術(shù)方案中，所述2-CTC樹脂替代度優(yōu)選為0.2-1.0mmol/g。在本發(fā)明步驟I優(yōu)選的合成步驟中，除本發(fā)明所限定的保護(hù)基外，也可以采用其他合適的保護(hù)基對(duì)氨基酸N端和側(cè)鏈加以保護(hù)。
[0049]在步驟I優(yōu)選的合成步驟中，延伸偶聯(lián)的單個(gè)保護(hù)氨基酸與偶聯(lián)體系中的偶聯(lián)劑的摩爾比優(yōu)選為1:1-1.2。
[0050]作為優(yōu)選，步驟2所述多肽片段I和多肽樹脂I的摩爾比為2-5:1，步驟3所述多肽片段2和多肽樹脂2的摩爾比為2-5:1。
[0051]在本發(fā)明所述方法中，首先按照胸腺法新肽序合成1-8、9_19和20-28片段，然后再將這3個(gè)多肽片段偶聯(lián)得到胸腺法新，以胸腺法新主鏈N端到C端的氨基酸順序編號(hào)，如下式:
[0052]Ac-Serl-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Gluio-1le11-Thr12-Thr13-Lys14-Aspi5-Leul6-Lysi7-Glul8-Lysi9-Lys2o-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH
[0053]SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即為上式中編號(hào)20_28的多肽序列。本發(fā)明在步驟I中固相合成的多肽樹脂I是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在其Lys側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基且在C端偶聯(lián)有樹脂；SEQ ID N0:2所示氨基酸序列即為上式中編號(hào)9-19的多肽序列，多肽片段I是在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在其N端、Ser側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上、Thr側(cè)鏈上、Lys側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基；SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列即為上式中編號(hào)1-8的多肽序列，多肽片段2是在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在其N端偶聯(lián)有乙?；?、在Ser側(cè)鏈上、Thr側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基；以上在本【技術(shù)領(lǐng)域】可以通過保護(hù)氨基酸合`成原料進(jìn)行合成。
[0054]本發(fā)明所述保護(hù)基是在氨基酸合成領(lǐng)域中用以保護(hù)氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、羧基、巰基等干擾合成的基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，防止氨基、羧基等在制備目標(biāo)產(chǎn)物過程中發(fā)生反應(yīng)，生成雜質(zhì)。在本【技術(shù)領(lǐng)域】，對(duì)于氨基酸側(cè)鏈需要保護(hù)的基團(tuán)、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)以及如何偶聯(lián)保護(hù)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。本發(fā)明中對(duì)偶聯(lián)有保護(hù)基的氨基酸表示形式也是本領(lǐng)域常用表示形式，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，如Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，括號(hào)里的OtBu為Asp側(cè)鏈保護(hù)基，本發(fā)明其他保護(hù)氨基酸合成原料除非特殊說明均可參照此解釋。
[0055]特殊的情況，對(duì)于本發(fā)明在合成中采用的Fmoc-β -Asp (OtBu)-OH保護(hù)氨基酸,其具有兩個(gè)羧基，即主鏈的a -COOH和側(cè)鏈的β -C00H, Fmoc- β -Asp (OtBu) -OH中OtBu保護(hù)的是主鏈α-COOH，而側(cè)鏈的β-COOH用于和氨基樹脂偶聯(lián)成酰胺鍵，在最后裂解除去氨基樹脂時(shí)，裂解液并不是切除酰胺鍵，而是將氨基從氨基樹脂上切下，如此便使Asp形成了Asn，和胸腺法新第28個(gè)氨基酸一致。
[0056]本發(fā)明所述延伸偶聯(lián)是指在第一個(gè)氨基酸與樹脂偶聯(lián)后，剩余氨基酸按照各自序列的順序逐個(gè)和前一個(gè)偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)(主鏈氨基和羧基的縮合反應(yīng))進(jìn)行偶聯(lián)。在延伸偶聯(lián)中，由于每個(gè)氨基酸N端都有保護(hù)基，因此需要先脫除N端Fmoc保護(hù)基再偶聯(lián)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知常識(shí)，本發(fā)明優(yōu)選用DBLK (即20%哌啶的DMF溶液，體積比)脫除N端保護(hù)基。由于不斷有氨基酸和樹脂偶聯(lián)，所合成的多肽片段樹脂是不斷變化的，作為優(yōu)選，每個(gè)待偶聯(lián)的保護(hù)氨基酸合成材料與之前已經(jīng)合成的多肽片段樹脂的摩爾比為2-3:1，此優(yōu)選比例適用于本發(fā)明所有方案中。
[0057]作為優(yōu)選，所述RP-HPLC純化具體為:
[0058]將胸腺法新粗品用體積百分?jǐn)?shù)為10%的乙腈水超聲溶解后，采用RP-HPLC系統(tǒng)，波長214nm，色譜柱為50 X 250mm反相C18柱，常規(guī)0.1%TFA/乙腈流動(dòng)相純化，收集目的峰餾分得到胸腺法新純品。
[0059]在臨床應(yīng)用中，胸腺法新本身不太穩(wěn)定，需要以醋酸鹽形式存在，故本發(fā)明還包括將胸腺法新純品用RP-HPLC系統(tǒng)轉(zhuǎn)鹽步驟，具體為:
[0060]將胸腺法新純品溶液采用RP-HPLC系統(tǒng)，色譜柱為50 X 250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流動(dòng)相轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到胸腺法新醋酸鹽。
[0061]由本發(fā)明所述方法合成的胸腺法新經(jīng)RP-HPLC檢測，粗品純度為78.6%左右，合成重量收率為100%，純化后純品純度大于99%，總收率為42%左右。而專利CN102199205中胸腺法新粗品純度最高為69.6%，合成重量收率最高為63.7%，均明顯低于本發(fā)明合成的胸腺法新。此外，本發(fā)明為了進(jìn)一步驗(yàn)證只有適宜的片段合成方法才能夠達(dá)到本發(fā)明的純度以及收率，分別按照不同于本發(fā)明的片段數(shù)進(jìn)行固相合成，結(jié)果顯示，其合成的胸腺法新的純度和總收率均低于本發(fā)明。
[0062]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明按照胸腺法新肽序合成1-8、9_19和20-28片段，然后再將這3個(gè)多肽片段偶聯(lián)得到胸腺法新，本發(fā)明多個(gè)片段合成同時(shí)進(jìn)行，合成周期減少了 2/3，中間體易純化，成本低，最終產(chǎn)品純度高，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于胸腺法新的大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0063]本發(fā)明公開了一種合成胸腺法新的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的的化合物和制備方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0064]在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，所有偶聯(lián)由保護(hù)基的氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā)明中的保護(hù)氨基酸購自于吉爾生化有限公司，所用樹脂購自于天津南開和成有限公司，申請(qǐng)文件中所用英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文含義見表1。
[0065]表1英文縮寫釋義
【權(quán)利要求】
1.一種合成胸腺法新的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在Lys側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基且在C端偶聯(lián)有樹脂的多肽樹脂I ; 固相合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Ser側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上、Thr側(cè)鏈上、Lys側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段I ; 固相合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列N端偶聯(lián)有乙?；⒃赟er側(cè)鏈上、Thr側(cè)鏈上、Asp側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基的多肽片段2 ； 步驟2、將多肽片段I的C段與多肽樹脂I的N端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)獲得多肽樹脂2 ； 步驟3、脫去多肽樹脂2的N端保護(hù)基并與多肽片段2的C段進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)獲得多肽樹脂3，加入裂解液去除多肽樹脂3的樹脂以及所有保護(hù)基得到胸腺法新粗品； 步驟4、胸腺法新粗品微濾、RP-HPLC純化后獲得胸腺法新純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽樹脂I為: 步驟Al、Fmoc- β -Asp (OtBu)-OH在偶聯(lián)體系作用下與氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc- β -Asp (OtBu)-氨基樹脂； 步驟Α2、脫除Fmoc保護(hù)基得到H- β -Asp (OtBu)-氨基樹脂,Fmoc-Glu (OtBu)-OH在偶聯(lián)體系作用下與Η-β -Asp (OtBu)-氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Glu (OtBu)-β -Asp(OtBu)-氨基樹脂；` 步驟A3、按照SEQ ID Ν0:1所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH按照步驟A2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián)，最后脫除 N 端 Fmoc 保護(hù)基得到 H-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Val-Val-Glu (OtBu) -Glu(OtBu) -Ala-Glu (OtBu)-^-Asp (OtBu)-氨基樹脂，即多肽樹脂 I ； 其中，所述Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，所述OtBu、Boc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述氨基樹脂為0.2-1.0mmol/g的Rinkamide 樹脂、Rink amide AM 樹脂或 Rink amide MBHA 樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段I為: 步驟B1、Fmoc-Lys(Boc)-0H在DIPEA作用下與2-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Lys(Boc)-CTC 樹脂； 步驟B2、脫除Fmoc保護(hù)基得到H-Lys (Boc) -CTC樹脂，F(xiàn)moc-Glu (OtBu) -OH在偶聯(lián)體系作用下與H-Lys (Boc)-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-CTC樹脂； 步驟B3、按照SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc_Leu-0H、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H>Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Ser (tBu)-OH,按照步驟B2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián),得到Fmoc-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys (Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-CTC 樹脂，加入裂解液去除 2-CTC 樹脂,獲得 Fmoc-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc) -Asp (OtBu) -Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu) -Lys (Boc)-0H,即為多妝片段 I ; 其中，所述Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，所述OtBu、tBu、Boc為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段2為:步驟Cl、Fmoc-Ser( tBu)-0H在DIPEA作用下與2-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Ser (tBu)-CTC 樹脂；步驟C2、脫除Fmoc保護(hù)基得到H-Ser (tBu)-CTC樹脂，F(xiàn)moc-Thr (tBu)-OH在偶聯(lián)體系作用下與H-Ser (tBu)-CTC樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Thr (tBu)-Ser (tBu)-CTC樹步驟C3、按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的順序,依次逐個(gè)將Fmoc-Asp (OtBu) -OH> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Ser (tBu) -OH,按照步驟C2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián)，得到Fmoc-Ser (tBu) -Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-CTC 樹脂，脫除 N 端 Fmoc 保護(hù)基后得到 H-Ser (tBu)-Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu) -CTC 樹脂，然后在N端進(jìn)行乙酰化反應(yīng)得到Ac-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu )-Thr( tBu )_Ser(tBu )_CTC 樹脂，加入裂解液去除 2-CTC 樹脂，獲得 Ac-SeK tBu )_Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -Ser (tBu)-OH,即為多妝片段 2 ;其中，所述Fmoc為氨基酸N端保護(hù)基，所述OtBiutBu為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、4或5任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述偶聯(lián)體系為HOBt/DIC 雙試劑偶聯(lián)體系、PyBOP/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系、HATU/H0AT雙試劑偶聯(lián)體系或TBTU/HOBt雙試劑偶聯(lián)體系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述偶聯(lián)反應(yīng)以DCM、 NMP, DMF, DMSO中的一種或兩種以上為溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述裂解液為體積比TFE:DCM 為1:4的混合裂解液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2和步驟3所述偶聯(lián)反應(yīng)以HOBt/DIC 雙試劑偶聯(lián)體系、PyBOP/HOBt/DIPEA三試劑偶聯(lián)體系或HBTU/HOBt/DIPEA三試劑偶聯(lián)體系進(jìn)行偶聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述 方法，其特征在于，步驟3所述裂解液為體積比TFA:苯酚:苯甲硫醚:乙二硫醇:水為8085:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解。
【文檔編號(hào)】C07K14/575GK103497245SQ201310256576
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月25日
【發(fā)明者】肖慶, 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司